CN114107165B - 一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 - Google Patents
一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107165B CN114107165B CN202111369469.9A CN202111369469A CN114107165B CN 114107165 B CN114107165 B CN 114107165B CN 202111369469 A CN202111369469 A CN 202111369469A CN 114107165 B CN114107165 B CN 114107165B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- cells
- ecs
- banana
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 title description 35
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 27
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000007769 metal material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000234295 Musa Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 67
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 27
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 22
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 22
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 22
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 20
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005266 casting Methods 0.000 claims description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 18
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 abstract 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 241000234615 Musaceae Species 0.000 description 2
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256852 Aculeata Species 0.000 description 1
- 235000005273 Canna coccinea Nutrition 0.000 description 1
- 240000008555 Canna flaccida Species 0.000 description 1
- 241001089921 Eumusa Species 0.000 description 1
- 244000291473 Musa acuminata Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法，包括预培养、装载、脱水、液氮保存、解冻和再培养五个步骤；采用香蕉ECS作为实验材料，冷冻面积小，玻璃化彻底冷冻速度快，利于细胞内结构保护及恢复后细胞活性的保持；采用小液滴冷冻法，将香蕉ECS细胞加入冷冻保护剂后在0～4℃条件下将ECS细胞滴到灭菌后的金属材料上，然后将金属材料快速投入液氮中冷冻，再装入预冷后的离心管置于液氮中保存2h以上，保存后的细胞在26～28℃处理10～12s即可解冻，既保证了解冻速度，又不会影响ECS的生长，保存后的细胞存活率高。
Description
技术领域
本发明涉及种质资源保存技术领域，特别涉及一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法。
背景技术
香蕉(Musa spp.)是芭蕉科(Musaceae)植物，属于芭蕉属(Musa)中的真蕉组(Eumusa)。是全世界贸易量最大的水果，也是发展中国家继水稻、小麦、玉米之后的第4大食物来源。但栽培香蕉起源于尖叶蕉(M.Acuminata colla AA)和长梗蕉(M.BalbisianaColla BB)这两个原始野生种，果实含有大量种子，可食用部分少。进过长期进化及杂交，产生了果实无种子且风味香甜的三倍体栽培香蕉品种，但三倍体香蕉存在单性结实和雌雄高度不育的情况，给新品种创制及种质资源保存工作带来巨大挑战。
胚性悬浮细胞系(ECS)是研究细胞周期、细胞代谢影响因素的重要工具，是香蕉建立植物高效稳定的遗传转化体系及进行体细胞无性系突变体的筛选的重要材料。但受基因型、外植体、培养基组成的因素影响，胚性悬浮系的建立困难重重，且建立好的ECS连续继代易产生细胞活力下降、胚性丢失、细胞死亡等现象。
超低温保存方法是指在-80℃以下超低温条件中保存生物种质的一套生物学技术，是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法。在超低温条件下，细胞内的一切物质代谢和生长活动几乎停止，植物材料在快速降温过程中处于相对稳定的生物学状态，使被保存材料终止代谢衰老过程，变异频率降低，达到长期保存种质的目的。因此，目前超低温保存被认为是长期香蕉种质保存最好且最稳定的方法。但是香蕉超低温保存还存在以下问题：1.香蕉种质资源超低温保存主要采以茎尖及丛生芽等作为保存材料，利用快速冷冻玻璃化法对植物材料进行保存。实验材料体积较大，玻璃化时间越长，对细胞造成的损伤越大，冷冻后的恢复率低。2.在冷冻过程中，将盛有茎尖或丛生芽的离心管直接冻于液氮中，离心管及冷冻保护液拖慢了液氮的冷冻速度，也会对冷冻效果造成影响，影响其恢复率。3.传统解冻方法即将冷冻管放入40℃恒温水浴中解冻90S，对于小液滴法保存香蕉ECS来说，温度过高，时间过长，影响细胞回复生长。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法，解决香蕉种子育种的萌发率低、污染率高的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
(1)预培养：将香蕉ECS细胞置于M2培养基中培养，待细胞生长达到指数期，离心，去除上清，将悬浮细胞置于预培养培养基中培养2～3d；
(2)装载：将预培养好的ECS细胞，离心，去除上清液，在25±2℃下加入装载液进行装载；
(3)脱水：取装载好的ECS细胞，离心，去除上清装载液，加入玻璃化溶液，于0～4℃条件下脱水处理40～50min，离心，去除上清液，再向离心管中加入玻璃化溶液，取离心管中的ECS细胞滴于灭菌后的金属材料上，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻；
(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存；
(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的金属材料，迅速投入解冻培养基中解冻8～10s，离心，吸弃上清，洗涤，转移到过渡培养基中过渡培养24～26h，然后转移到M2培养基中进行恢复培养，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体细胞胚的发生或M2培养基中重新进行悬浮培养。
优选的，所述M2培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1～1.2mg/L2.4-D、1～1.2mg/LBIO(生物素)+l00～110mg/L谷氨酰胺+l00～110mg/LME(麦芽提取物)、30～35g/L糖，pH5.3～5.5。
优选的，所述预培养培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1～1.2mg/L2,4-D、1～1.2mg/LBIO、100～110mg/L谷氨酞胺、100～110mg/LME、0.4～0.45mol/L糖，pH5.3～5.5。
优选的，所述装载液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0～2.4mol/L甘油、0.4～0.45mol/L蔗糖，pH5.3～5.5。
优选的，所述装载液的加入量为预培养好的ECS细胞体积的1～1.1倍。
优选的，所述装载的处理时间为40～45min。
优选的，所述玻璃化溶液为在0～4℃预冷后的PVS2玻璃化溶液。
优选的，所述PVS2玻璃化溶液的加入量为预培养好的ECS细胞体积的1～1.1倍。
优选的，所述PVS2玻璃化溶液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4～0.45mol/L蔗糖，pH5.3～5.5。
优选的，所述金属材料为锡箔纸或铝箔纸。
优选的，所述步骤(3)的整个处理过程在0～4℃条件下进行。
优选的，所述液氮保存的时间≧2h。
优选的，所述解冻培养基，以M2培养基为基本培养基，包括：1.2～1.4mol/L蔗糖；所述解冻培养基的温度为26～28℃。
优选的，所述洗涤的次数为3次；所述洗涤的时间为10min/次。
优选的，所述过渡培养基，以M2培养基为基本培养基，包括：0.5～0.6mol/L糖。
优选的，所述1500～1800rpm离心12～15min。
优选的，所述体细胞胚诱导培养基为常规可诱导香蕉体细胞胚发生的培养基，本发明一实施例使用的体细胞胚诱导培养基为MS+100mg/L ME(麦芽提取物)+4mg/L 2.4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L BIO+l00mg/L Gln(谷氨酰胺)+30g/L糖+7g/L琼脂，pH5.8。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明采用香蕉ECS作为实验材料，冷冻面积小，玻璃化彻底冷冻速度快，利于细胞内结构保护及恢复后细胞活性的保持。
2.本发明采用小液滴冷冻法，将香蕉ECS细胞加入冷冻保护剂后在0～4℃条件下将ECS细胞滴到灭菌后的金属材料上，然后将金属材料快速投入液氮中冷冻，再装入预冷后的离心管置于液氮中保存2h以上。
3.本发明采用小液滴冷冻法进行低温保存，在温度为26～28℃的条件下处理10～12s即可解冻，既保证了解冻速度，又不会影响ECS的生长，保存后的细胞存活率高。
附图说明
图1为本发明实施例1香蕉胚性细胞悬浮系低温保存过程中各阶段细胞状态示意图；图1A为体细胞胚；图1B为体细胞胚悬浮培养；图1C为香蕉悬浮细胞系；图1D为台盼蓝染色结果，图中显示白色的细胞为活细胞；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
(1)预培养：将巴西蕉的ECS细胞置于M2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ECS细胞置于预培养培养基中培养2d；所述M2培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：lmg/L2.4-D、1mg/LBIO、l00mg/L谷氨酰胺、l00mg/LME和30g/L糖；所述预培养培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1mg/L 2,4-D、1mg/LBIO、100mg/L谷氨酞胺、100mg/LME和0.4mol/L糖，pH5.3；
(2)装载：取10mL预培养好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10mL装载液进行装载；所述装载液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(3)脱水：取装载好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，将离心管中的ECS细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述PVS2玻璃化溶液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的M2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/L糖的M2培养基中过渡培养24h，然后更换新的M2培养基，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或M2培养基中重新进行悬浮培养。
体细胞胚诱导培养基：MS+100mg/L ME+4mg/L 2.4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L BIO+l00mg/L Gln+30g/L糖+7g/L琼脂，pH5.8。
实施例2
一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
(1)预培养：将粉蕉的ECS细胞置于M2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ECS细胞置于预培养培养基中培养2d；所述M2培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：lmg/L2.4-D、1mg/LBIO、l00mg/L谷氨酰胺、l00mg/LME和30g/L糖；所述预培养培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1mg/L 2,4-D、1mg/LBIO、100mg/L谷氨酞胺、100mg/LME和0.4mol/L糖，pH5.3；
(2)装载：取10mL预培养好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10mL装载液进行装载；所述装载液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(3)脱水：取装载好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，将离心管中的ECS细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述PVS2玻璃化溶液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的M2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/L糖的M2培养基中过渡培养24h，然后更换新的M2培养基，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或M2培养基中重新进行悬浮培养。
体细胞胚诱导培养基：MS+100mg/L ME+4mg/L 2.4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L BIO+l00mg/L Gln+30g/L糖+7g/L琼脂，pH5.8。
实施例3
一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
(1)预培养：将桂抗2号香蕉的ECS细胞置于M2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ECS细胞置于预培养培养基中培养2d；所述M2培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：lmg/L2.4-D、1mg/LBIO、l00mg/L谷氨酰胺、l00mg/LME和30g/L糖；所述预培养培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1mg/L 2,4-D、1mg/LBIO、100mg/L谷氨酞胺、100mg/LME和0.4mol/L糖，pH5.3；
(2)装载：取10mL预培养好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10mL装载液进行装载；所述装载液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(3)脱水：取装载好的ECS细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10mL在0℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，将离心管中的ECS细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述PVS2玻璃化溶液，以M2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的M2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/L糖的M2培养基中过渡培养24h，然后更换新的M2培养基，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或M2培养基中重新进行悬浮培养。
体细胞胚诱导培养基：MS+100mg/L ME+4mg/L 2.4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L BIO+l00mg/L Gln+30g/L糖+7g/L琼脂，pH5.8。
对比例1
一种香蕉胚性细胞悬浮系的保存方法，包括以下步骤：
(1)预处理：用指数生长期即在培养基中继代培养的细胞为材料，在预培养培养基中培养2d；所述预培养培养基，以MS为基本培养基，包括以下组分：1mg/L 2,4-D、1mg/LBIO、100mg/L谷氨酞胺、100mg/LME和0.4mol/L糖，pH5.3；
(2)装载：将10mL预培养好的细胞，静置使细胞沉淀，去除上部上清液，在室温下加入10mL装载液进行装载40min；所述装载液以ML培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(3)脱水：去除上清液，加入10mLPVS2，于0℃条件下脱水处理40min，完毕后将离心管中的细胞分装于冷冻管；所述PVS2以ML培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，pH5.3；
(4)液氮保存：将冷冻管装在金属套上,套上一根细线，将材料迅速投入液氮中保存，保存时间2h以上。
(5)解冻处理和再培养：将保存材料从液氮中取出，快速投入37℃水浴中解冻，然后吸去PVS2，用ML培养基+1.2mol/L蔗糖的洗涤培养基洗涤三次，每次10min，再转移到ML培养基+0.5mol/L蔗糖的液体培养基中过渡培养24h，然后更换新鲜ML培养液，待恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或ML培养基中重新起动悬浮培养。
体细胞胚诱导培养基：MS+100mg/L ME+4mg/L 2.4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L BIO+l00mg/L Gln+30g/L糖+7g/L琼脂，pH5.8。
采用MTT试剂盒，按照使用说明书测定实施例1-3和对比例1冷冻后过渡培养24h的ECS细胞的吸光值，结果见表1-3；在恢复培养第0d和30d后，记录SCV(settled cellvolume，简称SCV，是指悬浮细胞静置后所得的细胞沉淀体积)；
表1巴西蕉ESC细胞的低温保存处理结果
表2粉蕉ESC细胞的低温保存处理结果
表3桂抗2号香蕉ECS细胞的低温保存处理结果
结果显示，本发明低温保存方法冷冻保存三个品种香蕉ECS均可存活，在恢复培养30d后，其SCV从初始的0.5mL恢复增长到0.5-0.7mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基因型为ABB的香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预培养：将香蕉ECS细胞置于M2培养基中培养，待细胞生长达到指数期，离心，去除上清，将悬浮细胞置于预培养基中培养2～3d；所述M2培养基以MS为基本培养基，还包括以下组分：1～1.2mg/L 2.4-D、1～1.2mg/L生物素、100～110mg/L谷氨酰胺、100～110mg/L麦芽提取物和30～35g/L蔗糖，pH5.3～5.5；所述预培养培养基以MS为基本培养基，还包括以下组分：1～1.2mg/L 2,4-D、1～1.2mg/LBIO、100～110mg/L谷氨酞胺、100～110mg/LME、0.4～0.45mol/L蔗糖，pH5.3～5.5；
(2)装载：将预培养好的ECS细胞，离心，去除上清液，在25±2℃下加入装载液进行装载；所述装载液以M2培养基为溶剂，还包括以下组分：2.0～2.4mol/L甘油、0.4～0.45mol/L蔗糖，pH5.3～5.5；所述装载液的加入量为预培养好的ECS细胞体积的1～1.1倍；
(3)脱水：取装载好的ECS细胞，离心，去除上清装载液，加入在0～4℃预冷后的PVS2玻璃化溶液，于0～4℃条件下脱水处理40～50min，离心，去除上清液，再向离心管中加入玻璃化溶液，取离心管中的ECS细胞滴于灭菌后的金属材料上，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻；所述PVS2玻璃化溶液的加入量为预培养好的ECS细胞体积的1～1.1倍；所述PVS2玻璃化溶液以M2培养基为溶剂，还包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜和0.4～0.45mol/L蔗糖，pH5.3～5.5；所述金属为锡箔纸或铝箔纸；
(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存；
(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的金属材料，迅速投入解冻培养基中解冻8～10s，离心，吸弃上清，洗涤，转移到过渡培养基中过渡培养24～26h，然后转移到M2培养基中进行恢复培养，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体细胞胚胎的发生或转移到M2培养基中重新进行悬浮培养；
所述解冻培养基，以M2培养基为基本培养基，还包括：1.2～1.4mol/L蔗糖；所述解冻培养基的温度为26～28℃；
所述过渡培养基，以M2培养基为基本培养基，还包括：0.5～0.6mol/L蔗糖；
所述ECS代表胚性细胞悬浮系。
2.根据权利要求1所述的香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，其特征在于，步骤4中的所述液氮保存的时间≧2h。
3.根据权利要求1所述的香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，其特征在于，步骤1-3和5中的所述离心为1500～1800rpm离心12～15min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111369469.9A CN114107165B (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111369469.9A CN114107165B (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107165A CN114107165A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114107165B true CN114107165B (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=80397624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111369469.9A Active CN114107165B (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107165B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175189C2 (ru) * | 1999-12-14 | 2001-10-27 | Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока | Способ регенерации растений сорго в культуре in vitro |
| CN101139582A (zh) * | 2007-08-10 | 2008-03-12 | 中山大学 | 利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法 |
| CN101180948A (zh) * | 2007-12-14 | 2008-05-21 | 中山大学 | 一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法 |
| CN102634540A (zh) * | 2002-07-03 | 2012-08-15 | 中佛罗里达大学 | 经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程 |
| CN103283597A (zh) * | 2013-05-13 | 2013-09-11 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法 |
| CN112029795A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-12-04 | 广东省农业科学院果树研究所 | MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用 |
-
2021
- 2021-11-15 CN CN202111369469.9A patent/CN114107165B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175189C2 (ru) * | 1999-12-14 | 2001-10-27 | Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока | Способ регенерации растений сорго в культуре in vitro |
| CN102634540A (zh) * | 2002-07-03 | 2012-08-15 | 中佛罗里达大学 | 经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程 |
| CN101139582A (zh) * | 2007-08-10 | 2008-03-12 | 中山大学 | 利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法 |
| CN101180948A (zh) * | 2007-12-14 | 2008-05-21 | 中山大学 | 一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法 |
| CN103283597A (zh) * | 2013-05-13 | 2013-09-11 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法 |
| CN112029795A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-12-04 | 广东省农业科学院果树研究所 | MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 玻璃化法超低温保存技术及其研究进展;石茹等;《北方园艺》(第24期);第231-235页 * |
| 贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和植株再生;魏岳荣等;《生物工程学报》(第01期);第58-65页 * |
| 香蕉离体茎尖超低温保存研究;李俊慧等;《植物遗传资源学报》;第11卷(第01期);第34-39页 * |
| 香蕉种质资源超低温保存技术研究进展;李羽佳等;《中国热带农业》(第2期);第51页左栏，第52页左栏 * |
| 香蕉种质超低温保存技术研究进展;张守梅等;《果树学报》(第05期);第537-541页 * |
| 香蕉胚性细胞悬浮培养方法的改进;李敬阳等;《热带作物学报》;第33卷(第5期);第876-880页 * |
| 香蕉胚性细胞悬浮系玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性分析;李艳娜等;《园艺学报》;第37卷(第6期);摘要，方法1.1-1.4，结果2.1-2.5 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107165A (zh) | 2022-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kartha et al. | Freeze-preservation of pea meristems in liquid nitrogen and subsequent plant regeneration | |
| Sakai et al. | Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb.) by a simple freezing method | |
| Galdiano Jr et al. | Cryopreservation of Dendrobium hybrid seeds and protocorms as affected by phloroglucinol and Supercool X1000 | |
| Malik et al. | The cryopreservation of embryonic axes of two wild and endangered Citrus species | |
| Yuan-Long et al. | Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of papaya (Carica papaya L.) by vitrification | |
| Mandal et al. | Cryopreservation of in vitro shoot tips of Dioscorea deltoidea Wall., an endangered medicinal plant: effect of cryogenic procedure and storage duration | |
| Thammasiri | Cryopreservation of some Thai orchid species | |
| CN114107165B (zh) | 一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法 | |
| KR20100110525A (ko) | 국화 신초의 초저온동결보존방법 및 재생 방법 | |
| Mukherjee et al. | Cryopreservation of Asian Dioscorea bulbifera L. and D. alata L. by vitrification: importance of plant growth regulators | |
| Yamada et al. | Cryopreservation of apical meristems of white clover (Trifolium repens L.) | |
| CN109984123B (zh) | 抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法 | |
| Dixit et al. | Cryopreservation: a potential tool for long-term conservation of medicinal plants | |
| Reed | Choosing and applying cryopreservation protocols to new plant species or tissues | |
| Coelho et al. | Approaches for the cryopreservation of Plantago algarbiensis, a rare endemic species of the Algarve | |
| Chaudhury et al. | Genetic conservation of plantation crops and spices using cryopreservation | |
| CN111802380B (zh) | 一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法 | |
| Zhang et al. | Cryopreservation of gametophytes of Laminaria japonica (Phaeophyta) using encapsulation-dehydration with two-step cooling method | |
| Scocchi et al. | Cryopreservation of somatic embryos of paradise tree (Melia azedarach L.) | |
| Santos et al. | Viability assessment of Genipa americana L.(Rubiaceae) embryonic axes after cryopreservation using in vitro culture | |
| Ping et al. | Development of a PVS2 droplet-vitrification cryopreservation technique for Aranda Broga Blue orchid protocorm-like bodies (PLBS) | |
| Miaja et al. | Low temperature storage and cryopreservation of a Vitis vinifera L. germplasm collection: first results | |
| Shimonishi¹ et al. | Cryopreservation of somatic embryos of sweet potato by slow prefreezing method | |
| MOHAJERI et al. | Seed germination of Lilium ledebourii (Baker) Boiss. after cryopreservation | |
| Gupta | Cryopreservation of germplasm through encapsulation-dehydration technique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20231227 Address after: 571100 Xueyuan Road, Longhua District, Haikou, Hainan Province, No. 4 Applicant after: TROPICAL CROPS GENETIC RESOURCES INSTITUTE OF CHINESE ACADEMY OF TROPICAL AGRICULTURAL SCIENCES Applicant after: HAIKOU EXPERIMENTAL STATION, CHINESE ACADEMY OF TROPICAL AGRICULTURAL SCIENCES Address before: 570102 No. 4 Xueyuan Road, Longhua District, Haikou City, Hainan Province Applicant before: HAIKOU EXPERIMENTAL STATION, CHINESE ACADEMY OF TROPICAL AGRICULTURAL SCIENCES Applicant before: Hainan Rezuo Liangyuan Seed Industry Technology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |