CN109984123B - 抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法。通过适当的预培养与采用混合型冷冻保护剂有助于提升超低温保存效果，经32℃解冻后，冷冻90d的愈伤组织1个月后可恢复再生，胚性愈伤组织的再生率最高达100％，再生愈伤组织生长状态良好并依然保持分化成熟体胚的能力。本申请初步建立了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。

Description

抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法

技术领域

本发明涉及植物愈伤组织的保存，具体涉及抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法。

背景技术

湿地松(Pinus elliottii)为松科松属的速生常绿乔木，原产于美国东南部，是我国南方重要造林绿化树种。1978年起，松针褐斑病在我国南方引种的湿地松上陆续发生，严重限制了湿地松的发展(李传道等,1987)。因此，开展湿地松抗病育种研究具有极为重要的经济意义与生态意义。1986年，叶建仁等在福建建立了湿地松抗病种子园，但传统育种方法难以在短期内达到规模化量产的要求(叶建仁等,1991)。植物组织培养技术为快速大量繁殖优良抗病基因型以在短周期内实现生产增益提供了捷径(黄健秋和卫志明,1994)。其中，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，成为松属树种离体组织培养的常用方法(黄健秋和卫志明,1995)。前期研究中，程芳(2010)、戴蓓(2014)、张彩云(2016)、方珞(2018)等针对抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生植株再生途径进行了大量研究，获得了不同家系的胚性愈伤组织。由于胚性愈伤组织的长期继代易造成体细胞变异并导致其胚性丧失，因此筛选可靠长久的低温保存方法至关重要(Ulrich et al.,1979；Mustafa et al.,2011；王艳丽等,2019)。

超低温冷冻保存是利用植物在超低温环境下，细胞中各种生物酶类的活性受到环境抑制，其新陈代谢几乎停止，而恢复到常温环境下又能正常进行生长发育的原理，从而实现种质资源的长期保存(Kaviani,2011)。通常需要根据不同的植物材料来选择不同的冷冻处理程序，主要包括慢速冷冻法或两步冷冻法，包埋-干燥法、玻璃化法和滴冻法(Reinhoudet al.,2000)，其中慢速冷冻法最常用来保存针叶树胚胎培养物。1988年Kartha(1988)等通过慢速冻结法成功冷冻保存了青海云杉细胞悬浮培养物，此方法已成功运用于多种针叶树种包括火炬松(Pinus taeda)、挪威云杉(Picea abies)(Gupta et al.,1987)、红豆杉(Taxus cuspidate)(叶芳等,2001)、红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc)(王高等,2009)、欧洲黑松(Pinus nigra)(Salaj et al.,2012)、湿加松(Pinus elliottii xP.caribaea)(Nunes et al.,2017)和辐射松(Pinus radiate)(Lineros et al.,2018)等树种的超低温保存。本申请在前人研究的基础上对影响湿地松胚性愈伤组织超低温保存的各种因素进行探究，旨在建立一个长期有效的冷冻保存程序，为抗性湿地松胚性愈伤组织胚性的长期维持提供技术参考。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，以期建立适宜抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，包括以下步骤：

1)湿地松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预培养；

2)预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至-80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；其中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为2.5～15％，蔗糖浓度为0～0.6mol/L，PEG4000浓度为0～15％，蔗糖和PEG4000的组分浓度不同时为0；

3)使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴条件下进行解冻，待冰完全溶化后立即将冷冻管取出。

步骤1)中，湿地松细胞系为湿地松27-1系。

步骤1)中，预培养时间为12～48h。

进一步的，步骤1)中，预培养时间为36h。

步骤2)中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为5％，蔗糖浓度0.5mol/L，PEG4000浓度为15％。

步骤2)中，将加入冷冻保护剂的冷冻管置于程序降温盒中，先从室温降至0℃，然后以-1℃/min的速率降温至-80℃，-80℃保存30分钟后立即投入液氮罐中保存。

步骤3)中，解冻温度为32℃～40℃。

进一步的，步骤3)中，解冻温度为32℃。

步骤3)中，胚型愈伤组织解冻后，恢复培养和成熟分化培养条件为：培养温度23±2℃，暗培养；增殖培养基为LP+1.0mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L 6-BA+15g/L麦芽糖+6.5g/L琼脂，pH＝5.8；成熟培养基为LP+10mg/L NAA+130g/L PEG8000+60g/L麦芽糖+3g/L植物凝胶，pH＝5.8。

步骤1)中，蔗糖浓度为0.5mol/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过适当的预处理与采用混合型冷冻保护剂有助于提升超低温保存效果。继代培养10-12d生长状态良好的愈伤组织，在添加0.5mol/L蔗糖的高渗培养基预培养36h；5％DMSO，15％PEG4000，0.5mol/L蔗糖三种冷冻保护剂组合使用，程序降温至-80℃停留30min后投入液氮罐中保存；32℃水浴解冻，蔗糖溶液清洗后转接至LP培养基上恢复生长。在此程序处理下，冷冻90d的愈伤组织1个月后可恢复再生，再生率最高达100％，再生愈伤组织生长状态良好并依然保持分化成熟体胚的能力。本申请初步建立了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。

附图说明

图1是各因素对湿地松愈伤组织细胞活力的影响图；图中，数据采集于解冻后7d，同一因素中不同字母表示差异显著，p＜0.05；

图2是解冻后湿地松胚性愈伤组织的恢复生长图；图中，A-P为1-16号处理；

图3是解冻后湿地松胚性愈伤组织的增殖与成熟图；图中，A：未冷冻的愈伤组织；B：冷冻10d后恢复生长的愈伤组织；C：冷冻40d后恢复生长的愈伤组织；D：冷冻90d后恢复生长的愈伤组织；E：未冷冻的愈伤组织显微结构；F：冷冻90d后恢复生长愈伤组织的显微结构；G：未冷冻的愈伤组织成熟；H：冷冻90d后恢复生长愈伤组织的成熟。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料如下：

湿地松27#家系未成熟球果采自福建华安西陂国有林场的抗松针褐斑病湿地松种子园。超低温保存材料为2017年6-7月方珞采集未成熟合子胚诱导获得的胚性愈伤组织，编号为27-1，在LP培养基上进行继代培养，每15d继代一次(方珞，2018)。

实施例1抗性湿地松胚性愈伤组织的超低温保存

1超低温保存预处理

继代(第24次)后10-12d，称取0.3g湿地松胚性愈伤组织，置于添加了0.5mol/L蔗糖的高渗培养基上进行预培养，设置不同培养时间(12、24、36、48h)。然后，使用不同浓度的DMSO(2.5、5、10、15％)，不同浓度的PEG4000(0、5、10、15％)和不同浓度的蔗糖(0、0.4、0.5、0.6mol/L)作为冷冻保护剂对愈伤组织进行预处理。具体见表1。

2超低温保存

将预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，将加入冷冻保护剂的冷冻管置于程序降温仪内，设定降温程序，先从室温降至0℃，然后以-1℃/min的速率降温至-80℃，-80℃保存30分钟后立即投入液氮罐中保存。将低温保存的胚性愈伤组织在不同冻存时间后进行解冻，设置不同冻存时间10d、40d、90d。

3解冻

从液氮中取出材料后立即投入水浴锅中进行水浴解冻，设置不同解冻温度32℃、35℃、37℃和40℃，见表1。待冻存管内的冰完全融化后，吸出冷冻保护液，并立即用0.5mol/L的蔗糖溶液进行冲洗，重复三次。

表1 L16(4⁵)正交试验设计

4细胞存活率检测

TTC法检测细胞活性：将解冻并洗涤的愈伤组织放入10mL试管中，加入0.1％TTC溶液(用0.2mol/L磷酸缓冲液配制成pH＝7.0)5mL，在25℃恒温条件下培育24h，吸去TTC溶液，用蒸馏水清洗2-3次；加入95％酒精5mL，在60℃恒温水浴中保温30min，抽提被脱氢酶还原后生成的红色TTF，冷却后取上清液，用UV2102型分光光度计在485nm下测定光密度值(OD)，每个处理均作3次重复。用光密度OD值表示各处理愈伤组织在超低温保存后的细胞活力(简令成,1987)。

5各因子对抗性湿地松胚性愈伤组织超低温保存的影响

以下数据采用Excel处理，用SPSS19.0软件进行方差分析和差异显著性检验。

首先对影响愈伤组织细胞活力的各因素进行极差分析，由表2可以看出，各因子中蔗糖浓度对愈伤组织超低温保存效果的影响最大，极差可达0.0109；其次是DMSO浓度和PEG4000浓度，极差分别为0.0094和0.0089。5个因素对低温保存效果影响程度：蔗糖浓度＞DMSO浓度＞PEG4000浓度＞预培养时间＞解冻温度。

表2各因子对湿地松胚性愈伤组织超低温保存影响的极差分析

方差分析发现，各因子均对湿地松愈伤组织的超低温保存效果产生了影响。如表3所示，预培养时间、DMSO浓度、PEG4000浓度、蔗糖浓度和解冻温度这5个影响因子对超低温保存效果的影响均达到了极显著的水平。

表3方差分析表

因素	平方和	df	均方	F	Sig.
						预培养时间	0.000	3	8.74747E-05	523.539	﹤0.01
DMSO	0.001	3	0.000229761	1375.131	﹤0.01
						PEG4000	0.000	3	0.000161578	967.051	﹤0.01
蔗糖	0.001	3	0.000310929	1860.923	﹤0.01
						解冻温度	0.000	3	3.93919E-05	235.762	﹤0.01
误差	0.000	32	1.67083E-07

1)预培养时间对愈伤组织细胞活力的影响

抗性湿地松胚性愈伤组织27-1在添加了0.5mol/L蔗糖的高渗培养基上预培养。预培养时间对超低温保存效果有显著影响，如图1所示，预培养24h和36h时细胞活力较高，达到了显著水平；预培养12h解冻后细胞活力较低，可能是处理时间较短，细胞内自由水含量较高造成冻害；预培养时间增至48h，细胞活力显著性降低；24h和36h的预培养时间都可适用于湿地松愈伤组织的超低温保存。

2)冷冻保护剂对愈伤组织细胞活力的影响

在选取的三种冷冻保护剂中，对愈伤组织超低温保存效果的影响程度依次为：蔗糖浓度＞DMSO浓度＞PEG4000浓度。从图1中可以看出随着DMSO浓度的升高，细胞活性呈下降趋势。DMSO浓度为2.5％，愈伤组织细胞活力显著性较高，即使用2.5％的DMSO冷冻保存效果最好。当PEG4000浓度逐渐升高时，各水平间的细胞活力有波动变化，但整体上细胞活力呈上升趋势，当浓度为15％时，细胞活性显著性较高，即使用15％的PEG4000冷冻保存效果最好，浓度较低发挥的作用较小。当提高蔗糖的浓度时，细胞活力随之升高，并且每个水平之间的细胞活力均具有显著性差异，但当浓度升到0.6mol/L时，细胞活力降低，即蔗糖浓度过高会对细胞造成不良影响，0.5mol/L最佳。

3)解冻温度对愈伤组织细胞活力的影响

选取水浴解冻法进行解冻，以防止快速化冻过程中细胞内次生结冰和化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。如图1所示，细胞活力随着温度升高而升高，但存在波动，出现两个峰值，都显著性较高，分别是35℃和40℃，可能由于各因素的交互作用产生的。最佳解冻温度需结合不同处理的愈伤组织解冻后的恢复情况确定。

实施例2解冻后湿地松胚性愈伤组织的恢复测定

1解冻后愈伤组织的增殖及成熟

将洗涤后的愈伤组织转接于LP增殖培养基上，在黑暗，室温23±2℃的条件下恢复生长，每7d观察愈伤组织恢复生长状况。将恢复生长的湿地松愈伤组织转接至成熟培养基上，观察愈伤组织体胚成熟情况。

2培养条件及数据分析

增殖培养基为LP+1.0mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L 6-BA+15g/L麦芽糖+6.5g/L琼脂，pH＝5.8。成熟培养基为LP+10mg/L NAA+130g/L PEG8000+60g/L麦芽糖+3g/L植物凝胶，pH＝5.8。暗培养，培养温度23±2℃。

3解冻后愈伤组织的恢复

由表4可以看出，将处理后的愈伤组织冷冻10d后取出解冻，在16个处理中共有14个处理恢复生长，恢复天数最长24d，最短13d；再生率最高为100％，并且大部分处理的再生率都为100％，只有一个处理的再生率为67％。而冷冻40d后解冻的愈伤组织，有13个处理恢复生长，恢复天数最长26d，最短9d；大部分处理的再生率都为100％，仅有一个处理的再生率为67％，恢复最快的是2号和10号处理的愈伤组织，在9d就全部恢复，并且愈伤组织的生长状态良好，如图1所示；冷冻90d后解冻的愈伤组织，16个处理中恢复生长的处理较少，仅有4个处理恢复生长，并且5号处理的再生率仅为33％，7号处理和10号处理恢复速度较快。结合三次不同冻存时间解冻后愈伤组织的再生率与恢复时间来看，10号处理恢复较好。10号处理的各因素水平为预培养时间36h，5％DMSO，15％PEG4000，0.5mol/L蔗糖，解冻温度32℃，与不同因素对细胞活力的影响的分析结果相近。

表4解冻后湿地松胚性愈伤组织恢复情况

4解冻后愈伤组织的增殖与成熟

将解冻后的愈伤组织与未进行冷冻处理的愈伤组织都置于LP增殖培养基上进行继代培养。从外部形态来看，恢复生长的愈伤组织白色透明，有黏性，表面些许颗粒感，与未冷冻处理的愈伤组织无较大差别，都可稳定增殖。冷冻处理10d、40d、90d的愈伤组织在形态上也无差异。

同时进行了愈伤组织的显微结构观察，如图3所示，未进行低温处理过的愈伤组织胚头胚柄结构完整，未出现胚头分散，胚柄液泡化畸形等现象，冷冻后恢复的愈伤组织结构也一致。解冻后恢复正常生长的愈伤组织与未经过冷冻保存而长期继代的愈伤组织在成熟培养基上有不同的表现。长期继代的愈伤组织在成熟培养基上出现了褐化现象，愈伤组织水渍化塌陷，有抽丝现象但未能分化出完整体胚；而冷冻后的愈伤组织在成熟培养基上正常增殖，未出现褐化，分化出完整成熟体胚。

Claims (5)

1.抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）湿地松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预培养；预培养时间为36h；

2）预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至-80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；其中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为5%，蔗糖浓度0.5mol/L，PEG4000浓度为15%；

3）使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴条件下进行解冻，解冻温度为32℃；待冰完全溶化后立即将冷冻管取出。

2.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）中，湿地松细胞系为湿地松27-1系。

3.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤2）中，将加入冷冻保护剂的冷冻管置于程序降温盒中，先从室温降至0℃，然后以-1℃/min的速率降温至-80 ℃，-80℃保存30分钟后立即投入液氮罐中保存。

4.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤3）中，胚型愈伤组织解冻后，恢复培养和成熟分化培养条件为：培养温度23±2℃，暗培养；增殖培养基为LP+1.0mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L 6-BA+15g/L麦芽糖+6.5g/L琼脂，pH=5.8；成熟培养基为LP+10mg/L NAA+130g/L PEG8000+60g/L麦芽糖+3g/L植物凝胶，pH=5.8。

5.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）中，蔗糖浓度为0.5mol/L。

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