CN112029795A - MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用。MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用，所述的MpICE1转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现超表达MpICE1转录因子可以提高植物的抗病性，因此可以将其用于植物，特别是一些作物，例如香蕉的抗病性，为后续香蕉抗枯萎病分子育种提供参考。

Description

MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用

技术领域：

本发明属于植物抗病领域，具体涉及MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用。

背景技术：

香蕉(Musa spp)不仅是世界大宗水果作物之一，也是非洲、美洲和亚洲等130多个国家4亿多人的主食，具有重要经济价值(Dale et al.,2017；Dou et al.,2016；Ghag etal., 2014)。但上世纪90年代爆发的由尖孢镰刀菌古巴专化型真菌(Fusariumoxy sporumf.sp. cubense,Foc)热带4号生理小种(Foc TR4)引起的新一波香蕉枯萎病(又称巴拿马病) 对全球香蕉产业造成了极大危害(Portal et al.,2018；Warman and Aitken,2018；Zheng et al., 2018)。由于该病原菌致病力强、分布广、存活时间长以及化学农药难以防治等特点，迄今尚无有效的防控手段(Yang et al.,2016)。该病1996年在中国广州市番禺首次发现，传播速度迅猛，广东、海南、福建等传统香蕉产区受到重创，三地超过一半以上的传统香蕉产区遭受灭顶之灾(邓秀新等，2018)。

发明内容：

本发明的目的是提供MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用。

本发明通过实验发现，超表达MpICE1，可显著提高Cavendish香蕉的抗枯萎病能力，因此，推测MpICE1转录因子可能作为抗病相关基因的上游转录因子，激活下游抗病靶标基因的表达，提高香蕉对枯萎病菌的防御能力，进而提高香蕉的抗病性。

因此，本发明提供MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用，所述的MpICE1转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的抗病性，其可以是植物的各种疾病，例如小麦赤霉病、水稻白粉病、柑橘黄龙病、香蕉枯萎病，特别是提高香蕉抗香蕉枯萎病中的应用。

具体的提高抗病性的方法可以是在植物中超表达MpICE1转录因子，以提高植物对病害的抵抗力。

本发明发现超表达MpICE1转录因子可以提高植物的抗病性，因此可以将其用于植物，特别是一些作物，例如香蕉的抗病性，为后续香蕉抗枯萎病分子育种提供参考。

附图说明：

图1是pOx载体的图谱；

图2是pOx-MpICE1载体T-DNA区域；

图3是部分抗性株系PCR与RT-PCR检测，M:1000bp Marker；p:质粒DNA；1-13:抗性株系； WT:未转基因株系；-:清水，其中B中第一横条为MpICE1，第二横条为MaACT1；

图4是接种病原菌后抗病表型图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：材料与方法

1材料

1.1植物材料

大蕉(Musa spp.cv.Lingchuan Dajiao；ABB group)来自广东省农业科学院果树研究所香蕉资源圃。Cavendish香蕉(Musa spp.cv.Brazil；AAA Group)胚性细胞悬浮系由广东省农业科学院果树研究所香蕉组保存，属于现有技术公开的。

1.2菌株与载体

大肠杆菌菌株E.coli DH5α、农杆菌EHA105、植物双元表达载体pOx由本实验室保存备用；基础载体pMD-19T购自TaKaRa公司(TaKaRa,Dalian,China)。

所述的pOx的载体图谱如图1所示，其由组成型启动子P_Ubi控制，在启动子后面紧接着是多克隆位点1(MCS1)、多克隆位点2(MCS2)，右边界(RB)序列；在启动子P_Ubi前方是潮霉素基因(HPT)和左边界(LB)序列。本载体的特点是利用通用引物MluI-F和PstI- R扩增已经装到MCS1上的目的片断后将其反向装到MCS2上，从而形成“正向目的片断+i ntron+反向目的片断结构”。

2实验方法

2.1灵川大蕉总RNA的提取和cDNA第一条链的合成

取新鲜的灵川大蕉叶片，根据北京天恩泽基因科技有限公司的植物RNA OUT试剂盒C AT﹟:71203-50说明书提取RNA，1％凝胶检测RNA质量，测定RNA浓度。参照TaKaRa Code：RR047A PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书：取1μg总R NA为模板，加4μL 5×gDNA Eraser Buffer和1μL gDNA Eraser用RNase Free dH₂O补齐至10μL，混匀，42℃变性2min，立即冰浴中放置至PCR管无余温，短暂离心后依次加入：4μL 5×PrimerScript Buffer，1μL PrimeScript RT Enzyme Mix 1，1μL RT Primer M ix 4，4μLRNase Free dH2O，混匀后于37℃15min，85℃5s，4℃冰浴，最后将反转录产物于-20℃保存备用，得到cDNA。

2.2 MpICE1基因的克隆和序列分析

以上述cDNA为模板，依据大蕉转录组数据中编码MpICE1的cDNA序列，设计出扩增MpICE1转录因子基因完整开放阅读框引物，包含Spe I和BamH I酶切位点：GSP1-F:5’ -CGCACTAGTATGCTCTCGGGGATCAATGG-3’(Spe I)，GSP1-R:5’-GTGGGATCCTCATGACACTGTATTATC-3’(BamH I)。使用TAKARA高保真酶ExTaq，采用下列反应体系进行扩增：50μL反应体系包括5μL 10×ExTaq Buffer，1μL cDNA，0.2mM dNTPs，1.5m M MgSO4，1mM上、下游引物，0.25μL ExTaq酶，无菌水补充至50μL。为了避免扩增后期发生严重的错配，本实验使用28个循环，根据扩增片段长度设定循环参数，PCR反应条件如下：94℃3min变性；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，2 8个循环；最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物经TaKaRa公司凝胶回收试剂盒回收，与PMD19-T载体(TaKaRa公司)连接后转化大肠杆菌DH5α，取鉴定为阳性克隆的重组子菌液500μL由上海生工测序公司进行测序，克隆分离的MpICE1转录因子基因ORF为1680 bp，编码一个由559个氨基酸组成的蛋白质，推测分子量为59kD，pI＝5.09，MpICE1转录因子基因ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为MpICE1(Genbank登陆号：K M379133)。

2.3 MpICE1超表达载体的构建及遗传转化

pOx载体经Spe I和BamH I双酶切后，回收大片段。然后将从大蕉cDNA克隆得到的MpICE1基因经Spe I和BamH I双酶切消化后连接到pOx表达载体。构建的超表达MpICE 1植物表达载体命名为pOx-MpICE1(结构如图2所示)。

构建好的质粒pOx-MpICE1经热激法转化到感受态农杆菌EHA 105，采用菌液浓度OD 值0.2、侵染时间6h、共培养时间2d的试验条件对Cavendish香蕉细胞悬浮系细胞进行遗传转化，经过侵染与共培养，然后在含50mg/L潮霉素的M2液体培养基中继续筛选2个月，期间按时更换新鲜的M2培养基(含50mg/L潮霉素)；液体培养基筛选后在M3固体培养基(含50mg/L潮霉素)上进行筛选和在M4固体培养基(含50mg/L潮霉素)上进行抗性胚的诱导，本研究共获得51棵抗性株系，将所得到的抗性株系在MZ培养基上进行增殖和在RM培养基生根后，移至温室大棚定植备用。

培养基配方：

2.4转基因香蕉植株的阳性验证

A、

试验方法：分别抽提转化的香蕉叶片与野生型香蕉叶片基因组DNA。根据双元表达载体 Pubi启动子序列和MpICE1目的基因序列设计包含Pubi启动子和MpICE1目的基因一对引物，其扩增产物为384bp。引物序列为：GSP5-F:5’-GTTTCGTTGCATAGGGTTTGGT-3’，GSP5 -R：5’-TGTCTGGAACGCCTGAAAGGAAT-3’。PCR反应体系为包含：1×PCR buffer，MgCl ₂1.5mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，引物0.5μmol/L，Taq酶1.5U，模板约50～100ng，无菌水补充至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测并在紫外凝胶成像系统上观察。有明显目的条带的初步鉴定为阳性植株，拍照并记录实验结果。

试验结果：

提取转化植株与未转化的香蕉植株叶片总DNA，采用特异引物GSP5：GSP5-F:5’-GTT TCGTTGCATAGGGTTTGGT-3’，GSP5-R：5’-TGTCTGGAACGCCTGAAAGGAAT-3’进行PC R阳性检测(扩增产物大小为384bp)，PCR扩增后凝胶电泳发现，大部分抗性植株均能扩增出一条大小为400bp左右的目的片段，而野生对照植株与空白对照均不能扩增出目的条带 (如图3A)。由此获得PCR呈阳性株系，初步表明我们已经获得了超表达MpICE1的香蕉植株。

B、

试验方法：MpICE1转录水平的RT-PCR检测。根据测序得到的MpICE1序列，设计荧光定量PCR引物：GSP2-F：5’-TGGGTTTGCCATGGATGTTT-3’，GSP2-R:5’-AGAACACCAGGGCCTTCCTT-3’。qPCR反应体系包括10μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，200nM 上、下游引物，2μL 1:40稀释后的cDNA模板，无菌水补充至20μL。RT-PCR反应程序为：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸60s，40个循环；最后72℃终延伸5min。以MaACT1基因为内参对照。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上跑电泳并在紫外凝胶成像系统上成像拍照，记录实验结果。

试验结果：

为了进一步检查阳性株系中MpICE1表达量，我们将阳性的株系全部进行半定量分析(R T-PCR)。结果表明，DX-1、DX-5、DX-10、DX-11、DX-13个株系有较高的MpICE1表达量，其中DX-11和DX-13两个株系MpICE1表达量最高(图3-B)，这两个转基因香蕉株系进行后续抗病性测试。

2.5转基因香蕉植株抗病性表型评价

为了方便对转基因与对照香蕉植株进行抗病性测试及观察，我们采用FOC TR4病因菌菌株GD-13(ACCC 37969,VCG 01213/16)进行接种实验(陈石，2009)。解冻的甘油菌首先在PDA平板上划线涂板，28℃生长7d左右至长出菌丝。然后用无菌接种环挑取菌丝加入到含有50mL PDA液体培养基的锥形瓶中，28℃200rpm震荡48h。在超净工作台用无菌纱布过滤掉菌丝，无菌水重新调整至分生孢子浓度为2×10⁶conidia.mL-1备用(Zuo et al.,2015)。

将生长状态一致的五叶期转基因香蕉植株与野生对照香蕉植株根组织完全浸入上述浓度 的香蕉枯萎病菌菌液中，浸根30min后取出沥干，种植于口径为14cm的小盆中，放于适 宜的自然环境中，温度控制在25～30℃，正常的肥水管理。14d后统计并记录接种后转基 因香蕉植株与野生对照香蕉植株的发病情况，每个转基因株系至少选取20棵植株进行接种， 重复三次实验。结果如图4所示，从图可以看出，11号和13号转基因香蕉植株相比于野生 对照香蕉植株具有更好的抗病性，野生对照香蕉植株黄叶比较多。

转基因香蕉植株与野生对照香蕉植株接种14d后，将植株从小盆取出，沿根系基部纵向 剖开，观察转基因与野生植株球茎和假茎病原菌侵染情况是否不同，拍照并记录实验结 果。每个转基因株系选取10棵植株，实验重复三次。结果如图4所示，从图可以看出， 温室接种Foc TR4病原孢子14d后，转基因植株球茎感染程度显著低于野生对照植株， 这预示着抗寒相关转录因子MpICE1的表达可能激活下游抗病相关的靶标基因，从而引起 香蕉植株对枯萎病菌的防御反应，进而提高了香蕉的抗病性。

序列表

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> 灵川大蕉(Musa spp. cv. Lingchuan Dajiao)

<400> 1

atgctctcgg ggatcaatgg cggggtgtgg acggaaggag gaggcgacga ggacgacgcc 60

gcgtcgtgga cgagagcgaa cgcgtccaac gccagtagcg gggtgatggg agggcgcagg 120

gacgagctcg gcctcctcag cttcaagtcc atgctggacg acgacgacga caacgactgg 180

tacctgggca gcgccgctgc ctccaacccc gtgccgcctg ccgcctccca ccattccttt 240

caggcgttcc agacacatca ggagctcacg gacgtggcct ttccctcgaa tgtttcgccg 300

cacgaggccc tgatgctccc acccgtcgtc aacctcgatc aaaaccagcc atttttcact 360

gcaaaatcag ccctttcctc tctcttcgtc tcggttagct ccaacccctt cgacaccggg 420

tttggtgtcg gctgcgacgc cccggggttt ctccaggctt cccaagtgtc caatttcccg 480

gtcatgatga acagaggttg tggcggggga ggagtccttg gttttgcagg aatgggggcg 540

ggcgagcagc ttggttgtcc cgatctgagc tccggagccg cattctctgg tgaccatctg 600

ctgccctcgt ccgggcactg ttctggttcc agctccggtg ccgccttcgg ccccatgggc 660

ttcgacggct tcgagagttc tccatttctc aaccggccca aggtgttgag gcctctggag 720

atcttcccgc ccgtgggtgc gcagcccact ctgttccaga agcgggcggc cgccgctctt 780

cggcagaatt catcagtttc cggcgaaaaa ggtggtctct tggggctttg ggagtgggaa 840

ggggtggtgc cggggaaccg tgggaagact gagttggaag aagagagcaa caagaggagg 900

aaggggaatg aggaggatga gatggacgac gggagcatcg acgcatcggg attgaattat 960

gacacggatg atgctgcagc ggagaatgtc ataggtgagg agaacgcaaa tggcggcggc 1020

ggttgtggag gtagcaactc ttatgccaac agcacggtga ccggaggtgg agatcagaaa 1080

gggaagaaga agggcctgcc tgcgaagaac ttgatggccg agaggaggag aaggaagaag 1140

ctcaatgacc ggctttacat gcttaggtct gttgttccca agatcagcaa gatggacaga 1200

gcatccattc ttggtgatgc aattgagtac ctgaaagagc ttttgcgaag gatcaacgac 1260

cttcacaatg aactcgaatc gacaccttcc agttcttcgg tgcctgttac aagtgcaaca 1320

agctttcacc cgttgacgcc aacactaccc actttatcat gccgtgtgaa ggaggagctc 1380

tgcccaagtt ctgtaccaag cccaaatgct cagccagcaa gagttgaggt cagggtaaga 1440

gaaggccgag cagttaacat tcatatgttt tgtgcccgaa gacctggcct attgctctcc 1500

actatgaggg cactcgatgg ccttggaatt gacatccagc aggctgtcat cagctgtttc 1560

aatgggtttg ccatggatgt tttccgagct gagcaatcca aggaaggtcc tggtgttctg 1620

ccagaagata tcaaggcggt gctcttaaac tctgccggct tcgataatac agtgtcatga 1680

Claims (4)

1.MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用，所述的MpICE1转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗病性是抗小麦赤霉病、水稻白粉病、柑橘黄龙病或香蕉枯萎病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，MpICE1转录因子在提高香蕉在抗香蕉枯萎病中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在植物中超表达MpICE1转录因子，提高植物对病害的抵抗力。

Images