CN111763683A - 一种柳杉CfICE1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柳杉基因CfICE1及其应用，属于基因工程技术领域。本发明从柳杉组织中克隆得到一个新的ICE基因，命名为CfICE1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过构建表达载体PBI‑CfICE1转拟南芥进行功能验证，发现CfICE1在拟南芥中超表达促使拟南芥抗寒性增强；通过qRT‑PCR技术对CfICE1基因在不同柳杉组织及不同低温胁迫下表达量进行分析，结果表明4℃时CfICE1在柳杉的种子和幼叶中表达量最高。以上结果表明CfICE1基因参与柳杉生长发育和低温胁迫的响应，并可应用在植物的抗逆基因工程改良中，应用前景广阔。

Description

一种柳杉CfICE1基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种柳杉基因CfICE1及其应用。

背景技术

柳杉(Cryptomeria fortunei)是一种亚热带针叶树种，为中国特有树种，主要分布在沿海山区或高海拔地区，对二氧化硫、氯气、氟化氢等有较好的抗性，因其珍贵的木材和观赏价值而被优先广泛栽培。然而，柳杉的生产经常受到各种生物和非生物胁迫的严重限制。低温是影响其生长发育、生产力和生态分布的重要环境因子之一。在全球范围内，由于低温或低温伤害导致的农林生产减少，每年损失数千亿美元。因此，研究低温对植物生长的影响，提高植物对低温的耐受性具有重要意义。

自Chinnusamy等人从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中成功分离出ICE1基因，其同源性的研究主要集中在小麦、番茄、水稻等多种作物上，而其在多年生木本植物，特别是裸子植物中的作用尚不清楚。此外，在转基因植物中过表达的ICE1蛋白已经被证明可以提高植物的耐逆性。对柳杉的CfICE1基因研究有助于加深对柳杉抗寒分子机制的认识，并有助于提高柳杉的抗寒性。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种柳杉CfICE1基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述柳杉CfICE1基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种柳杉CfICE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的柳杉CfICE1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的柳杉CfICE1基因的载体、宿主细胞或组织。

进一步地，所述的含有柳杉CfICE1基因的载体是植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体是PBI121-CfICE1。

所述的柳杉CfICE1基因在提高植物耐寒性中的应用。

进一步地，所述的柳杉CfICE1基因在提高植物耐寒性中的应用，包括以下步骤：

1)构建柳杉CfICE1基因的载体；

2)将所构建的柳杉CfICE1基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到耐寒性提高的转基因植物。

进一步地，所述的应用中所述的植物为拟南芥。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了柳杉的抗寒基因CfICE1，该基因可调控柳杉的抗寒性，在拟南芥中超表达促使拟南芥抗寒性增强，从而可应用于转基因改良植物的抗逆性；

(2)本发明构建了柳杉CfICE1基因的表达谱，公开了柳杉不同组织中CfICE1基因表达量及柳杉不同低温胁迫下叶片中CfICE1基因表达量，加深对CfICE1基因在柳杉抗寒性中的认知，提供了新的基因资源。

附图说明

图1为4℃下拟南芥CfICE1转基因植物的抗寒性表型图；

图2为0℃下拟南芥CfICE1转基因植物的抗寒性表型图；

图3为不同温度下柳杉叶片的表型图；

图4为不同温度下柳杉叶片CfICE1的表达量柱状图；

图5为柳杉不同组织CfICE1的表达量柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：柳杉CfICE1基因克隆

实验材料：采集状况良好、无病虫害的柳杉无性系枝条为插穗。通过平切上切口和斜切下切口收集10-15cm的插条(含2或3个芽)。在清水中浸泡一夜后，第二天加入6号ABT生根粉(0.10mg mL^-1)诱导生根4h。2015年6月30日，扦插于南京林业大学白马实验基地扦插池中，第二年春季进行移栽。2年生幼苗在培养箱中培养，在15℃下预冷1d，在4℃下培养3d后，取幼嫩叶片于液氮中，并迅速放入-80℃超低温冰箱中保存。

基因来源：根据柳杉的高通量转录组测序结果，从拟南芥数据库(TAIR)下载了ICE1基因(AT1G12860)序列，利用NCBI在线工具Blast比对筛选出ICE1的同源序列，进行引物设计。

CfICE1基因克隆，具体步骤为：

1)总RNA提取：用RNA制备纯植物试剂盒(富含多糖和多酚类物质)(天根)提取。RNA浓度和完整性分别用分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳测定。

2)用Takara公司的PrimeScript^TM RT Master Mix进行合成cDNA，存于20℃备用。

反转录体系(20μL)：4μL 5×PrimeScript RT Master Mix，1μL总RNA，15μL RNaseFree dH₂O。

反转录条件：37℃孵育15min，85℃加热5s，4℃。

3)以反转录合成的第一链互补DNA(cDNA)为模板，进行LA Taq PCR扩增。

Oligo7.0软件设计扩增引物，引物如下：上游引物CfICE1-F：5′-CTCTACATGCTTCGCTCT-3′，下游引物CfICE1-R：5′-AACATTAAATGGAACCCCTC-3′。

LA Taq扩增反应体系(50μL)：2μL cDNAtemplate，32.5μL dH₂O，8μL dNTPMixture，5μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺+)，1μL Forward Primer(10μM)，1μL ReversePrimer(10μM)，0.5μL LA Taq

LATaq PCR扩增条件：94℃、4min；94℃、30s，56℃、1min，72℃、2min，35个循环；72℃，10min；4℃，∞。

4)1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段并利用Axygen公司的AxyPrep DNA GelExtraction Kit试剂盒进行PCR产物回收，将检测为阳性的单克隆送入金斯瑞生物技术公司测序。

5)目的片段的连接转化：回收并克隆到pMD19-T载体(TaKaRa)中，最终转化为大肠杆菌DH5α(TaKaRa)的感受态细胞，阳性克隆检测后并被送到金斯瑞公司测序。

6)柳杉CfICE基因全长克隆

3′、5′Race反转录：Race的反转录试剂运用Takara公司的

RACE5′/3′Kit试剂盒：5.5μL体系(4μL 5×First-Strand Buffer，0.5μL DTT，1.0μL dNTPs混合下列试剂，在微型离心机上短暂旋转，室温放置)；5′-RACE-Ready cDNA11μL(1μL RNA，1μL 5′-CDSPrimerA，9μL Sterile H₂O)；3′-RACE-Ready cDNA12μL(1μL RNA，1μL 3′-CDS Primer A，10μL Sterile H₂O)；分别混匀上述试剂后，3000r离心10s，PCR反应。

利用Oligo 7，按照RACE引物设计原则，分别设计一对3′，5′端RACE特异性引物，上游引物，CfICE1-5：5′-CACATCAAGTCCAAGTCCATCCAGTGCC-3′；下游引物，CfICE1-3：5′-GTTCCCAAGATCAGCAAGATGGACCGTG-3′，Race接头引物：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

PCR扩增：94℃、3min；94℃、30s，70℃、1min，72℃、1min/kb，35个循环；72℃，10min；4℃，∞。

7)连接转化测序

根据测序获得的基因中间片段序列和3′和5′序列，利用BioXM 2.6软件(南京农业大学，南京，江苏)获得CfICE7基因的全长cDNA(SEQ ID NO.1)，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施案例2：构建拟南芥超表达载体及功能验证

真核表达载体构建：以柳杉cDNA为模板，根据已经扩增得到的CfICE1基因编码区，利用Oligo7设计引物，上游引物XbaI-ICE-F：5′-GCTCTAGAATGTTCTCGAGAATGAACACTG-3′，下游引物BamHI-ICE-R：5′-CGCGGATCCCATTGCAGAATGACAGCTTGCAG-3′，利用上述带有酶切位点的引物进行编码区扩增。同时将PBI121表达载体也用BamH I酶、XbaI酶进行双酶切，再用T4连接酶将两个酶切产物连接、转化、挑取单克隆测序，将测序结果正确的菌液用来提取重组表达载体质粒，将重组表达载体质粒命名为PBI121-CfICE1。

拟南芥的种植：

1)在无菌操作台中，将拟南芥种子用75％酒精处理30s；

2)用移液枪吸取酒精，加入84处理2min 30s后，吸去；

3)用无菌水将拟南芥种子清洗2～3遍，用0.1％琼脂糖溶液悬浮种子；

4)将悬浮的种子于4℃避光春化2d，播于1/2MS培养基，于23℃，相对湿度80％，光周期为16h/8h的光照培养箱中培养；

5)当培养7～10d左右，将拟南芥幼苗移栽于泥炭土中培养；

6)待刚刚形成花序时，去除花序，用于浸染，待种荚变黄开裂时，收取种子。

农杆菌花序浸染：

电击法转化农杆菌：农杆菌感受态从-80℃冰箱中取出，于冰上解冻，加入5μL质粒PBI121-CfICE1混合转入电击杯电击转化。加入600μL LB液体培养基，28℃、150rpm摇2～3h，3000rpm、4℃离心10min，将菌液涂布于LB平板(K+)，28℃暗培养30～48h，挑取单克隆进行扩大培养以及菌液PCR检测。

花序浸染：配制浸染液，去拟南芥顶生花序、已授粉的花与果荚，将扩大培养后的菌液，4000rpm离心10min，收集沉淀，用配制好的浸染液重悬；将拟南芥花序浸入浸染液中30s，之后用保鲜膜包裹花序以保持水分，放入黑暗环境中培养24h取出，去保鲜膜；每4d重复浸染一次，直至花期结束，继续培养至收获转基因T1代拟南芥种子。

转基因拟南芥的筛选：将T1代拟南芥种子点播到含有卡那霉素的1/2MS培养基中，经筛选获得T2代转基因植株。待拟南芥植株长到10片叶子左右时，转基因植株的PCR检测。

表型观察：将转基因拟南芥和野生型拟南芥分别置于4℃、0℃的环境下，观察其表型变化，并将0℃处理过后的转基因植株和野生型放到23℃中进行恢复试验，结果如图1、2所示，在4℃环境下处理两周，图1中左图的野生拟南芥叶片出现黄褐色，而右图的转基因植株颜色依然青绿；图2中左上和左下分别为野生型拟南芥在0℃环境下低温胁迫处理1周和2d后放到23℃中进行恢复的结果，可见叶片随着低温胁迫时间延长有所萎蔫，而右上和右下是在同样处理条件下的转基因拟南芥，则依然生长茂盛。

实施案例3：柳杉不同组织及不同低温胁迫处理下CfICE1基因表达量。

柳杉不同组织(根、茎、叶、球果、茎、嫩叶)及不同低温胁迫处理的柳杉侧枝。低温处理：将柳杉三级侧枝分别置于室温(25℃)、4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃处理12h，4℃及以下的侧枝，先放在4℃，然后以4℃/h降至目标温度处理，每处理5个小枝，每处理3重复，立即液氮冷冻15min，置于-80℃超低温冰箱中保存。

表型观察：观察不同低温处理的表型变化(如图3所示)，随着温度的降低，从左到右，叶片也由绿转黄。

总RNA提取及逆转录同实施例1。将反转录产物稀释10倍作为模板，按照ChamQ^TMSYBR qPCR Master Mix试剂盒的说明书进行反应溶液的配制，在Applied Biosystems型实时荧光定量分析仪上运行PCR程序：95℃ 30min；95℃ 10s，60℃ 34s，循环40次；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

所选内参基因为Actin，其上游引物序列：5′-AATTACCCGATGGGCA-3′，下游引物序列：5′-TCATACTCGGCCTTGGA-3′。CfICE，其上游引物序列RT-ICE-F：5′-GCAGTTTGCTGGCTCTGAGAGT-3′，下游引物序列RT-ICE-R：5′-CCTGCTCCAGTGTTCATTCTCG-3′。

待反应结束，获得扩增曲线，通过StepOne Software v2.3导出数据，利用Excel进行数据分析，根据CT值用2^-ΔΔCq相对定量法计算相对表达量(如图4、5所示)。低温胁迫处理下，4℃时柳杉基因表达量最高，柳杉不同组织中发现种子中CfICE1基因表达量最高。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种柳杉CfICE1基因及其应用

<130> 100

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2579

<212> DNA

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 1

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacatg ggggagccac 60

aagcatttgc agctgcagca gcttcttcat ggtcctcagc acctgcggca actatattca 120

gaaacgatct aagacttgaa gttttgtcaa accactagaa atgggccaga tttagcagtt 180

tgctggctct gagagtagca tcctgagctc agttgagcga cacatataca cagagagtga 240

gatatacaga aaatatacac accacgatgt tctcgagaat gaacactgga gcaggtgtgt 300

gggaggatga gaatttgaat gcgtttaagg caatgctaga tgaggaatgg tatcctagta 360

atagcaacag taatggcaat gttgctaata atcttagtca taaccaagat gttggaggct 420

gttttagcat ggaaagtaag gattttgggt gttattctgg tcttgtgcag cagaatacag 480

aggccaacat tctgttgcag gccatgaatt ctaattcttc ctcacccacg tccattttta 540

gccttgatac ttccaatgta cagtctttta tctcagccca ccaaagccac cagcagcaga 600

accaccagaa tgcattgcct tcgctgtgtg atgtcgtggg ttcaagctcc tttgatgctg 660

ccagtagctg tgagggattt acaaacaaca gctatttgta tgggggaagc ctgtttaaca 720

tgagacctgg ggggttccag gtcccggggt cgagtccccg tagtagctcc acgcccagtc 780

ttagccccca cagccagctt tgcaccccta atcttagccc tcggttgatg cccaatacga 840

ccactggctc caatatgctg tttactaatg ctaatagtct cagcaacctt ctgggaatca 900

acagcaatgg cggcagcagc tgctgctctt taggcccaag caatgtgctg aatcctccat 960

ctcttggtgc ccctgcggct gctctgcagc ccgccaaggc tcgagtccca gtgctgaatt 1020

ttagcaggtc aaagacgctg agacctcttg aggtttatcc ttcggtgggt gcccagccta 1080

ctctgtttca gaagcgggct gctctcaggc atactagtgc tagtgcaggg agtcccaacc 1140

ccaataataa tagcaatact attggtccca atgggaaagg aaaaaggaag cttatggtat 1200

ctagtgctgc tgataataat gataggaata ctgtgaggga ggaagataag agagaagagg 1260

aagatatgga agagagcatt gatggctctg gatttcagta tgatacagat gatgccacca 1320

aggtcgagct tgaagctagt ggtgctgatg acggtggatt gggctctgca gggaataatg 1380

ctagcaataa caatagtctt ggtgtcgata aggggaagaa aaagggctta cctgctaaga 1440

accttatggc tgagaggagg agaaggaaga agctcaatga tcggctctac atgcttcgct 1500

ctgttgttcc caagatcagc aagatggacc gtgcctctat tctgggagat gcaattgact 1560

atttgaagga gcttctgcag aggatcaatg accttcacaa cgagcttgaa tctacctctc 1620

agggacctgc tttacctggg tcttctagct tccatcctct gacacctaca actcctgttt 1680

taccttgccg agtgaaagaa gaatgcccat cttcattgcc aagtcccaat ggacagcctg 1740

caagggtgga ggtgaggata aaagaagggc atgctctaaa tatccatatg ttttgtgcta 1800

ggcgacctgg attactgcta tccacaatga gggcactgga tggacttgga cttgatgtga 1860

agcaagctgt cattagctgc ttcaatgggt ttgcattaga tgtatttcga gcagagcaac 1920

ctaaaggaga aattgcgcct gaagagatta aagctctgct tctacacact gcaagctgtc 1980

attctgcaat gtagctcaag gagtatccat gcctgcagac tttgtatact atggccttat 2040

tactcacttc atactggctt ggtcccagaa aacgttatct aagctacagg aatcaaaact 2100

gttcattgtg gttgaaggag gggttccatt taatgttttc acgaaggctg aggctggaat 2160

atatgatggt ttcattatgt cttcttgaaa ggaagctaag cgtgcttcca acaattgaaa 2220

atgcaaatgg cacaaggaca gacttgcttg tgatactgct aacccaaatg ccagaagttt 2280

ggcattttca cccttggggg agtactttgt gagcaagtct ggaaatcatg taatatgttt 2340

attcattcca agtatcgttg gttttctgac ataaaattag atcactgtta cctttgtaaa 2400

tgtgttcttc gtaaagaagt tcactgttgc attcttttca tttcttaaat aggcatatct 2460

tcctttttac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag tactctgcgt tgataccact 2520

gcttgcccta tagtgagtcg tattaatctc tggaagatcc gcgcgtaccg agttctaat 2579

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 2

Met Phe Ser Arg Met Asn Thr Gly Ala Gly Val Trp Glu Asp Glu Asn

1 5 10 15

Leu Asn Ala Phe Lys Ala Met Leu Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Ser Asn

20 25 30

Ser Asn Ser Asn Gly Asn Val Ala Asn Asn Leu Ser His Asn Gln Asp

35 40 45

Val Gly Gly Cys Phe Ser Met Glu Ser Lys Asp Phe Gly Cys Tyr Ser

50 55 60

Gly Leu Val Gln Gln Asn Thr Glu Ala Asn Ile Leu Leu Gln Ala Met

65 70 75 80

Asn Ser Asn Ser Ser Ser Pro Thr Ser Ile Phe Ser Leu Asp Thr Ser

85 90 95

Asn Val Gln Ser Phe Ile Ser Ala His Gln Ser His Gln Gln Gln Asn

100 105 110

His Gln Asn Ala Leu Pro Ser Leu Cys Asp Val Val Gly Ser Ser Ser

115 120 125

Phe Asp Ala Ala Ser Ser Cys Glu Gly Phe Thr Asn Asn Ser Tyr Leu

130 135 140

Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asn Met Arg Pro Gly Gly Phe Gln Val Pro

145 150 155 160

Gly Ser Ser Pro Arg Ser Ser Ser Thr Pro Ser Leu Ser Pro His Ser

165 170 175

Gln Leu Cys Thr Pro Asn Leu Ser Pro Arg Leu Met Pro Asn Thr Thr

180 185 190

Thr Gly Ser Asn Met Leu Phe Thr Asn Ala Asn Ser Leu Ser Asn Leu

195 200 205

Leu Gly Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Ser Cys Cys Ser Leu Gly Pro

210 215 220

Ser Asn Val Leu Asn Pro Pro Ser Leu Gly Ala Pro Ala Ala Ala Leu

225 230 235 240

Gln Pro Ala Lys Ala Arg Val Pro Val Leu Asn Phe Ser Arg Ser Lys

245 250 255

Thr Leu Arg Pro Leu Glu Val Tyr Pro Ser Val Gly Ala Gln Pro Thr

260 265 270

Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Leu Arg His Thr Ser Ala Ser Ala Gly

275 280 285

Ser Pro Asn Pro Asn Asn Asn Ser Asn Thr Ile Gly Pro Asn Gly Lys

290 295 300

Gly Lys Arg Lys Leu Met Val Ser Ser Ala Ala Asp Asn Asn Asp Arg

305 310 315 320

Asn Thr Val Arg Glu Glu Asp Lys Arg Glu Glu Glu Asp Met Glu Glu

325 330 335

Ser Ile Asp Gly Ser Gly Phe Gln Tyr Asp Thr Asp Asp Ala Thr Lys

340 345 350

Val Glu Leu Glu Ala Ser Gly Ala Asp Asp Gly Gly Leu Gly Ser Ala

355 360 365

Gly Asn Asn Ala Ser Asn Asn Asn Ser Leu Gly Val Asp Lys Gly Lys

370 375 380

Lys Lys Gly Leu Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg

385 390 395 400

Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys

405 410 415

Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp Tyr

420 425 430

Leu Lys Glu Leu Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu

435 440 445

Ser Thr Ser Gln Gly Pro Ala Leu Pro Gly Ser Ser Ser Phe His Pro

450 455 460

Leu Thr Pro Thr Thr Pro Val Leu Pro Cys Arg Val Lys Glu Glu Cys

465 470 475 480

Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Asn Gly Gln Pro Ala Arg Val Glu Val

485 490 495

Arg Ile Lys Glu Gly His Ala Leu Asn Ile His Met Phe Cys Ala Arg

500 505 510

Arg Pro Gly Leu Leu Leu Ser Thr Met Arg Ala Leu Asp Gly Leu Gly

515 520 525

Leu Asp Val Lys Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Leu

530 535 540

Asp Val Phe Arg Ala Glu Gln Pro Lys Gly Glu Ile Ala Pro Glu Glu

545 550 555 560

Ile Lys Ala Leu Leu Leu His Thr Ala Ser Cys His Ser Ala Met

565 570 575

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> CfICE1-F(Artificial)

<400> 3

ctctacatgc ttcgctct 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> CfICE1-R(Artificial)

<400> 4

aacattaaat ggaacccctc 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> CfICE1-5(Artificial)

<400> 5

cacatcaagt ccaagtccat ccagtgcc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> CfICE1-3(Artificial)

<400> 6

gttcccaaga tcagcaagat ggaccgtg 28

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Race接头引物(Artificial)

<400> 7

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> XbaI-ICE-F(Artificial)

<400> 8

gctctagaat gttctcgaga atgaacactg 30

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> BamHI-ICE-R(Artificial)

<400> 9

cgcggatccc attgcagaat gacagcttgc ag 32

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> RT-ICE-F(Artificial)

<400> 10

gcagtttgct ggctctgaga gt 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> RT-ICE-R(Artificial)

<400> 11

cctgctccag tgttcattct cg 22

Claims (8)

1.一种柳杉CfICE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的柳杉CfICE1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的柳杉CfICE1基因的载体、宿主细胞或组织。

4.根据权利要求3所述的含有柳杉CfICE1基因的载体，其特征在于，所述的载体是植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的含有柳杉CfICE1基因的载体，其特征在于，所述的植物表达载体是PBI121-CfICE1。

6.权利要求1所述的柳杉CfICE1基因在提高植物耐寒性中的应用。

7.根据权利要求6所述的柳杉CffICE1基因在提高植物耐寒性中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建柳杉CfICE1基因的载体；

2)将所构建的柳杉CfICE1基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到耐寒性提高的转基因植物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。

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