CN110105438B

CN110105438B - 紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN110105438B
Application number: CN201910458023.XA
Authority: CN
Inventors: 张攀; 尹航; 柴华; 张亚玲; 袁玉莹; 项继红; 胡国富; 崔国文
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN110105438A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和应用。本发明应用PCR技术从紫花苜蓿基因组中克隆出了抗旱基因MsTHI1，其核苷酸序列如序列表ID NO.1所示，并构建了烟草瞬时表达载体、烟草过表达载体和紫花苜蓿过表达载体。本发明应用荧光定量PCR技术分析了MsTHI1基因再紫花苜蓿中的表达模式，以及基因与逆境胁迫之间的关系，发现该基因在烟草、苜蓿中的过表达可提高烟草植株的抗旱性，该基因可用于植物遗传转化，以提高植物的抗旱性。

Description

紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和应用。

背景技术

干旱作为制约农业生产的世界性难题，近年来一直被世人所关注。由于气候转暖、水资源匮乏、环境恶化等诸多原因，极端气候事件的频率和强度均呈显著增加趋势。因干旱所造成的损失占气象灾害的50％以上，这已成为影响作物产量和品质的主要限制条件。

干旱对植物的影响是广泛而又深远的。干旱主要会抑制叶片伸展，引起叶片气孔关闭，降低光合作用过程中多种酶的活性，影响二氧化碳的吸收与固定。同时干旱条件下，植株的超微结构也会发生改变，影响植物呼吸作用与光合作用。光合作用是植物主要的能量来源，可将从环境中吸收的无机物转化成有机物，供给植物体生命活动。干旱胁迫使光合作用减弱，从而导致作物减产。植株产量的减少是干旱胁迫影响最明显的生理过程之一。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科苜蓿属多年生草本植物，其抗逆性强、分布广、品质好、利用广泛、经济价值较高，有“牧草之王”的美称。苜蓿是我国畜牧业发展的重要植物资源，其蛋白质含量较其他牧草高出1-3倍左右，是我国栽培面积最大的人工牧草，在牧草中具有不可撼动的地位，对发展畜牧业生产、美化生活环境等方面具有重要的经济效益和社会价值。

我国苜蓿产量供不应求，国内苜蓿草产量仅能达到需求量的一半左右，大量苜蓿草产品依靠进口来满足市场需求。在我国的西北及华北地区，苜蓿种植面积最广。近年来，我国开展了一系列政策，使得牧草的种植面积呈上升趋势。但由于西北及华北地区自然条件的限制和人们传统观念的影响，真正用于种植牧草的耕地面积占总面积的比重仍旧很小。为了扩大苜蓿种植面积，盐碱地、非灌溉农田成为主要的可利用种植区域。一方面可以缓解粮食、经济作物与牧草产业争夺有限的耕地及淡水资源的矛盾，另一方面解决了我国草产量与需求量之间的矛盾。大部分栽培紫花苜蓿的抗旱能力较弱，只能在具备一定灌溉条件的土壤中才可维持良好的品质和较高的产量。因此，培育具有良好抗逆能力的紫花苜蓿新品种特别重要。深入开展紫花苜蓿抗旱机理研究，对水资源合理利用和生态环境的改善有着十分重要的意义。研究植物抗旱基因，提高植物抗旱性，对当前植物抗逆育种选种、生态环境恢复、减小抗旱条件下作物产量的损失作物抗旱性能评价以及寻找植物新的抗旱途径等具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和在烟草、紫花苜蓿抗旱的应用，为利用基因工程手段培育抗旱烟草、紫花苜蓿新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。

本发明的目的通过以下技术手段实现：

紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1，所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表ID NO.1所示。所述MsTHI1基因编码的蛋白的氨基酸序列序列表ID NO.2所示。MsTHI1基因能够显著提高烟草、紫花苜蓿的抗旱能力。

本发明以蒺藜苜蓿THI1基因(M.truncatula,Medtr4g081130.1)作为参考序列，通过同源克隆的方法获得紫花苜蓿MsTHI1基因序列(Gene Accession：MH206189)，生物信息学分析表明，该基因包含一个1052bp的开放阅读框，编码350个氨基酸，分子量为36.90kD，理论等电点为5.68，其核苷酸序列如序列表ID NO.1所示。其与蒺藜苜蓿、菜豆、大豆等蛋白高度相似。MsTHI1基因编码的蛋白序列α螺旋占32.86％，延伸链占18.57％，β转角占8.29％，无规则卷曲占40.29％；其编码的蛋白的氨基酸序列序列表ID NO.2所示。

另外，本发明还提供了包含紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1的烟草瞬时表达载体、烟草过表达载体、紫花苜蓿过表达载体，以及所述烟草瞬时表达载体、烟草过表达载体、紫花苜蓿过表达载体的构建方法：

烟草瞬时表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如序列表ID NO.5所示，下游引物序列如序列表ID NO.6所示；将PCR扩增产物回收后连接在pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体上，连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态上，选取阳性克隆进行测序，用BamHI、SacI进行双酶切，回收目的片段，重组连接到含有pCAMBIA1300质粒的BamHI、SacI位点中，构建得到MsTHI1基因的烟草瞬时表达载体。

烟草过表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如序列表ID NO.5所示，下游引物序列如序列表ID NO.6所示；将PCR扩增产物回收后连接在pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体上，连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态上，选取阳性克隆进行测序，用BamHI、PstI进行双酶切，回收目的片段，重组连接到含有pCAMBIA1300质粒的BamHI、PstI位点中，构建得到MsTHI1基因的烟草过表达载体。

紫花苜蓿过表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如序列表ID NO.5所示，下游引物序列如序列表IDNO.6所示；将PCR扩增产物回收后连接在pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体上，连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态上，选取阳性克隆进行测序，用SpeI、XbaI进行双酶切，回收目的片段，重组连接到含有pMDC123质粒的SpeI、XbaI位点中，构建得到MsTHI1基因的紫花苜蓿过表达载体。

最后，本发明还公开了所述的紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1或所述的过表达载体在提高植物抗旱性中的应用，构建烟草瞬时表达载体、烟草过表达载体、紫花苜蓿过表达载体。将烟草过表达载体在K326烟草中进行农杆菌遗传转化，得到过表达MsTHI1的转基因烟草植株，对其进行抗旱性鉴定，结果表明MsTHI1基因可以提高烟草的抗旱性。将苜蓿过表达载体在龙牧801紫花苜蓿中进行农杆菌遗传转化，得到过表达MsTHI1的转基因苜蓿植株，对其进行抗旱性鉴定，结果表明MsTHI1基因可以提高苜蓿的抗旱性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明首次公开了一种紫花苜蓿MsTHI1基因，并获得了该基因编码的蛋白质氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了紫花苜蓿MsTHI1基因可以提高植物的抗旱性。本发明还为揭示紫花苜蓿抗旱调控机理奠定基础，为紫花苜蓿的抗旱品种的选育提供理论依据和技术支持。

附图说明

图1是本发明MsTHI1基因的总RNA琼脂糖凝胶电泳图,其中，泳道M是2000bp DNAmarker的DNA分子量标准，泳道1-5是PCR扩增产物；

图2是本发明MsTHI1基因的cDNA质量评估琼脂糖凝胶电泳图,泳道M是2000bp DNAmarker的DNA分子量标准，泳道1-5是cDNA条带；

图3是本发明PCR方法获得的MsTHI1的电泳图片，其中泳道M是2000bp DNAmarker，泳道1、2为PCR扩增产物；

图4是本发明多种植物的同源的氨基酸序列进行比对图

图5是本发明紫花苜蓿THI1基因进化树分析图；

图6是本发明紫花苜蓿MsTHI1蛋白的三维模型；

图7是本发明紫花苜蓿MsTHI1基因不同胁迫下表达量变化图；

图8是本发明大肠杆菌检测电泳图，其中M:2000bp DNA marker；a:烟草瞬时表达载体；b:烟草过表达载体；c:苜蓿过表达载体；

图9是本发明pCAMBI1300质粒图谱；

图10是本发明紫花苜蓿MsTHI1基因在烟草中的瞬时表达，其中图a:叶绿体自发荧光、b:融合GFP荧光、c:亮野下被侵染叶片、d:融合图片；

图11是本发明pMDC123质粒图谱；

图12是本发明MsTHI1转基因烟草遗传转化植株；

图13是本发明MsTHI1过表达T0代烟草的PCR检测图，M:2000bp DNA marker；1-19：转基因烟草植株；

图14是本发明MsTHI1过表达T1代烟草筛选植株；

图15是MsTHI1过表达T1代烟草的PCR检测图，M:2000bp DNA marker；2、3、7为植株编号；

图16是本发明紫花苜蓿遗传转化植株；

图17是紫花苜蓿MsTHI1基因过表达植株的PCR检测图，其中，M:2000bp DNAmarker；1-9：转基因苜蓿植株；

图18是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下VB1含量的变化图；

图19是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下SPAD值的变化图；

图20是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下Fv/Fm的变化；

图21是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下MDA含量的变化；

图22是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下OFR含量的变化；

图23是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下SOD含量的变化；

图24是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下POD含量的变化；

图25是本发明实施例7中MsTHI1基因过表达烟草在干旱胁迫下Pro含量的变化。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：

本发明公开的一种新的抗旱基因MsTHI1，该基因是从紫花苜蓿中克隆得到的，是植物在干旱胁迫驯化下产生的高表达蛋白。本发明通过PCR的方法从紫花苜蓿中克隆得到了MsTHI1基因的全长cDNA序列，该基因的核苷酸序列如序列表ID NO.1所示，为：

其编码的氨基酸序列如序列表ID NO.2所示，为：

MASASTTITSSFLSTPSSLTEKPSSFNQTLSLGFKPKHSVSVSASAAPSPPPSYDLNAFKFAPIKESIVAREMTRRYMTDMVTHADTDVVIVGAGSAGLSCAYELSKNPNVKIAIIEQSVSPGGGAWLGGQLFSAMVVRKPAHHFLDELEIEYDEQDDYVVIKHAALFTSTIMSKLLARPNVKLFNAVAAEDLIVKNGRVGGVVTNWALVSMNHDTQSCMDPNVMESKVVVSSCGHDGPFGATGVKRLKSIGLIDTVPGMKALDMNTAEDAIVRLTREVVPGMIVTGMEVAEIDGAPRMGPTFGAMMISGQKAAHLALRALGLPNAVDHAGNVHPELVLAAADSADIAEA*

本发明中龙牧801紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Longmu 801)由东北农业大学黑龙江省牧草种质资源与育种重点试验室提供；本氏烟(Nicotiana tabacum L)由东北农业大学生物科学学院植物基因工程与分子生物学试验提供；烟草k326(Nicotianatabacum L.)由东北农业大学动物科学技术学院草业科学试验室提供。

本发明所使用的培养基配方如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。LB固体培养基：加15.0g琼脂粉于1L LB液体培养基。YEB液体培养基：1L蒸馏水、蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、酵母粉1.0g，硫酸镁0.497g，蔗糖5.0g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.2。YEB固体培养基：加15.0g琼脂粉于1L YEB液体培养基。

转化烟草所用培养基：

萌发培养基：MS培养基

共培养培养基：MS培养基

诱导培养基：MS+2mg/L 6-BA+30mg/L潮霉素+0.5mg/L IAA+400mg/L头孢霉素

分化培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+30mg/L潮霉素+2mg/L IAA+400mg/L头孢霉素

生根培养基：MS+30mg/L潮霉素+200mg/L头孢霉素

转化苜蓿所用培养基：

萌发培养基：1/2MS+15g/L蔗糖

预培养培养基：MS+30g/L蔗糖1.0mg/L 6-BA

共培养培养基：MS+30g/L蔗糖+1.0mg/L 6-BA+100μM/L乙酰丁香酮

不定芽诱导培养基：MS+30g/L蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L固沙草+100mg/L阿莫西林

不定芽伸长培养基：MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L固沙草+100mg/L阿莫西林

生根培养基：1/2MS+15g/L蔗糖+50mg/L阿莫西林

Hoagland营养液配方见表1。

表1 Hoagland营养液配方

以下是实例中荧光定量引物利用NCBI数据库设计，其余引物由primer 5软件设计完成。试验引物合成、菌液测序均由睿博兴科公司完成。

本发明所使用的试剂购置途径，RNA、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；荧光定量试剂盒、cDNA合成试剂盒，高保真酶，Taq酶均购自诺唯赞生物科技有限公司；胶回收试剂盒购自Promega；DNA Marker购于北京全式金生物科技有限公司；VB1、MDA、OFR、SOD、POD、Pro指标测定试剂盒均购于苏州科铭生物有限公司，其他试剂均为市售。

实施例1紫花苜蓿MsTHI1基因的获得

(1)总RNA的提取及其反转录

于蛭石中种植龙牧801号紫花苜蓿，用购于康为世纪生物科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取紫花苜蓿幼苗总RNA，琼脂糖凝胶检测其完整性，微量分光光度计测定浓度。RNA的反转录用的HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)试剂盒(Vazyme，中国)进行，cDNA质量用Taq酶(康为世纪)进行PCR鉴定，反应体系如表2。

表2反转录反应体系

反转录引物序列：

上游引物：5'-TTTGAGACTTTCAATGTGCCCGCC-3'(序列表ID NO.3)

下游引物5'-TAGCATGTGGGAGTGCATAACCCT-3'(序列表ID NO.4)

反转录反应程序为：92℃预变性2min，(92℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸40sec)35个循环，72℃终延伸2min，4℃终止反应。得到反应产物备用。

MsTHI1基因的总RNA琼脂糖凝胶电泳图见图1，MsTHI1基因的cDNA质量评估琼脂糖凝胶电泳图见图2。

(2)MsTHI1基因全长序列的扩增与回收。

根据模式植物蒺藜苜蓿的THI1同源序列设计引物：

上游引物：5'-ATGGCTTCAGCTTCCACCAC-3'(序列表ID NO.5)

下游引物：5'-TTAAGCTTCTGCAATATCAGCAGA-3'(序列表ID NO.6)

以步骤(1)中获得的反应产物cDNA为PCR反应的模板，利用诺唯赞的2×

Max Master Mix试剂对MsTHI1基因进行PCR扩增，反应体系如表3。

表3基因扩增反应体系

PCR扩增反应程序为：95℃3min，(95℃15sec，56℃15sec，72℃60sec)35个循环，72℃5min，4℃终止反应。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将具有目的条带的凝胶进行回收。

PCR成功扩增了1053bp长度的特异性片段，见图3。经序列比对发现该片段与蒺藜苜蓿的THI1基因序列同源性极高，高达97.44％，测序后，证明该基因是紫花苜蓿THI1基因的全长cDNA序列。

将上述基因其在NCBI登陆，命名为MsTHI1，GenBank登录号为MH206189，其核苷酸序列如序列表ID NO.1所示，该基因编码的氨基酸序列如序列表ID NO.2所示，利用DNAMAN软件对多种植物的同源氨基酸序列进行比对(见图4)可知，MsTHI1基因的氨基酸序列与蒺藜苜蓿、菜豆、大豆、拟南芥、水稻、玉米(Zea mays)的同源性分别为98.9％、82.7％、76.4％、76.1％、75.3％、75.1％。

利用Protparam对MsTHI1基因进行分析，表明该蛋白分子式为C_1623h2605N₄₄₁O₅₀₀S₁₉，分子量为36905.33，理论等电点(PI)为5.68，其中含有20种基本氨基酸，含量最高的为Ala(12.0％)，含量最低的为Trp(0.6％)，28个带正电荷个氨基酸残基(Arg、Lys)，36个带负电荷氨基酸残基(Asp、Glu)，该蛋白水溶液在280nm处的消光系数为18575，蛋白的不稳定系数为33.24，表明为稳定蛋白，脂肪系数是90.3，平均亲水系数是0.112。

利用CELLOv.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)对紫花苜蓿氨基酸序列进行亚细胞定位预测分析，表明：该蛋白质位于叶绿体的预测分值最高，为4.275。利用MEGA7进化树分析MsTHI1与蒺藜苜蓿、拟南芥、大豆(Glyma.10G251500，Glyma.10G251500，Glyma.12G135000，Glyma.20G142000)、玉米(GRMZM2G074097，GRMZM2G018375，GRMZM2G018375)(ZmaysPH207，Zm00008a014434，Zm00008a031964)、水稻(LOC_Os07g34570)和菜豆(Phvul.011G139100，Phvul.007G052900)的同源关系。紫花苜蓿THI1基因进化树分析图如图5所示。

为了进一步分析该基因的结构，利用SPOMA(http://pbil.ibcp.fr)在线软件对该蛋白二级结构预测表明，该蛋白质序列中α螺旋占32.86％，β-延伸链占18.57％，β转角占8.29％，无规则卷曲占40.29％；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对MsTHI1基因的氨基酸序列进行蛋白三维结构预测，该蛋白三维结构预测结果如图6所示。

实施例2实时荧光定量PCR检测基因在逆境胁迫条件下在紫花苜蓿中的表达特性

选取籽粒饱满紫花苜蓿种子，于蛭石中培养，用1/10Hoagland营养液浇灌。待种子生长4周龄时，对植株进行15％PEG-6000、150mmol/L NaCl、150mmol/L NaHCO₃、4℃胁迫处理，处理时间分别为0h(CK)、3h、6h、12h、24h、48h，每处理设3个重复。取植株叶片、茎及根部，置于液氮中速冻，-80℃保存。根据全长cDNA序列设计荧光定量表达引物：

上游引物5'-TGTGGCCATGATGGTCCTTT-3'(序列表ID NO.7)

下游引物5'-TCCTCGGCAGTGTTCATGTC-3'(序列表ID NO.8)

内参基因引物：

上游引物：5'-GGCTGCCATCAAGGAGGAAT-3'(序列表ID NO.9)

下游引物：5'-TCCAAGCTCAGCCTCATCAAG-3'(序列表ID NO.10)

实时荧光定量PCR反应体系如表4。

表4荧光定量反应体系

反应程序为：95℃3min，(95℃5sec，58℃15sec，72℃10sec)40个循环，60℃60sec，95℃15sec，4℃结束反应。

使用相对定量法公式(2-^ΔΔCt)计算MsTHI1基因的相对表达量。

相对比值＝2-^ΔΔCt，ΔΔCt＝(C_treat ^M-C_treat ^A)-(C_control ^M-C_control ^A)。

结果如图7可知，MsTHI1基因相对表达量在PEG、4℃、NaCl、NaHCO₃四种胁迫下均有响应，其中在NaCl胁迫处理12h其基因的相对表达量最高。

如图7a，在15％PEG胁迫下，MsTHI1基因在紫花苜蓿茎中表达量相对根部及叶片表达量变化较小，除6h时外其余时间基因相对表达量均与0h对比均差异显著(P＜0.05)。基因在根部的表达量变化呈现出先增加再减少的趋势，各时间点差异显著(P＜0.05)，在PEG胁迫处理12h时，MsTHI1基因相对表达量最低。基因在叶片中的表达变化明显，随着胁迫处理时间的增加，基因的表达量呈现出先增加然后减少再增加的波动变化趋势，各时间点间差异显著(P＜0.05)，处理3h与12h时基因相对表达量出现最大值与最小值。

如图7b在4℃胁迫下，MsTHI1基因在紫花苜蓿不同部位的表达量均低于0h对照的表达量。基因在紫花苜蓿根部的表达量呈现先减少然后增加再减少的波动趋势，在48h时其表达量最低，处理0h时基因表达量与其余处理时间点均差异显著(P＜0.05)。基因在紫花苜蓿茎中的表达量波动变化，除6h外其余时间点均与0h对照差异显著(P＜0.05)。叶中的表达量较低，呈现波动变化，在3h、6h、12h、24h、48h时其基因的表达量对比0h均差异显著(P＜0.05)，3h、12h、24h、48h之间差异不显著。

如图7c，在NaCl胁迫下，MsTHI1基因在紫花苜蓿根部的表达量呈现先减少然后增加再减少的变化趋势，12h时表达量最低，48h时表达量最高，各时间点之间表达量差异显著(P＜0.05)。基因在紫花苜蓿茎中的表达量变化与其在根部的变化有着相同的趋势，12h时表达量最高，3h时表达量最低，各时间点间差异显著(P＜0.05)。叶片中的表达量变化呈现增加然后减少再增加的变化趋势，胁迫3h时基因的表达量最高，胁迫12h基因的表达量最低，3h、6h、12h、24h、48h时其基因的表达量与0h时差异显著(P＜0.05)，但6h与12h差异不显著。

如图7d，在NaHCO₃胁迫下，MsTHI1基因在紫花苜蓿根部的表达量呈现增加然后减少再增加的变化，6h时基因的表达量最高，胁迫12h时基因的表达量最低，各时间点间差异显著(P＜0.05)。茎中的表达量呈现增加后减少的趋势，胁迫3h时表达量最高，胁迫48h时表达量最少，3h、12h、24h、48h时表达量与0h时差异显著(P＜0.05)，6h与0h差异不显著。基因在紫花苜蓿叶中的表达量呈现波动变化，胁迫3h时基因的表达量最多，3h、6h、12h、24h、48h时表达量与0h时差异显著(P＜0.05)。

实施例3MsTHI1基因的亚细胞定位

通过构建烟草瞬时表达载体，利用GV3101农杆菌(购自北京博迈德生物技术有限公司)注射到本氏烟(Nicotiana tabacum L，由东北农业大学生物科学学院植物基因工程与分子生物学试验提供)中，进行瞬时表达，在电子显微共聚焦下来观察MsTHI1基因的表达位置。

烟草瞬时表达载体的构建方法为：

以MsTHI1基因完整开放阅读框的基础设计引物：

上游引物：

5'-CGGGGGACTCTTGACGAGCTCATGACGACGTCGTTCGCC-3'(序列表ID NO.11)

下游引物：

5'-CATGTCGACTCTAGAGGATCCAAATTCACCTTTTCCATTTTGGTT-3'(序列表ID NO.12)

将实施例1中PCR扩增产物与北京全式金生物科技有限公司pEASY-Blunt ZeroCloning Kit进行连接。然后将连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态(购自北京全式金生物科技有限公司)，加连接产物于50ul刚刚解冻的Transl-T1感受态中，混匀，冰浴30min，42℃水浴进行热激30s，立即置放于冰上2min。加入500ul不含抗生素的LB液体培养基，200rpm，37℃培养1h。离心1min，用移液枪弃掉部分上清，轻弹悬浮菌体，保留200ul菌液，在含潮霉素的LB琼脂培养基上均匀涂开，倒置平板，37℃过夜培养。挑取状态正常的多个单菌落分别放入含有潮霉素的LB液体培养基中培养，37℃，200rpm，摇菌12h-16h到菌液浑浊，将3个独立克隆进行双向测序，存菌备用。

重摇测序正确的菌液并进行质粒的提取，质粒提取完成后进行浓度测定与琼脂糖凝胶电泳检测，见图8，选取浓度高、条带亮的质粒候选备用。以质粒为模板，与设计克隆引物进行PCR，PCR程序如下：95℃3min，(95℃10sec，58℃15sec，72℃40sec)30个循环，72℃5min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳后进行PCR产物回收，浓度测定后，-20℃备用。摇pCAMBIA1300表达载体(由西北农林科技大学惠赠，质粒图谱见图9)的菌液，提质粒，选取浓度高的进行酶切试验。酶切体系如表5。

表5酶切体系

37℃酶切6h，胶回收得酶切载体片段，测定浓度。将目的片段和线性化载体片段进行重组，得到烟草瞬时表达载体。通过构建烟草瞬时表达载体，利用GV3101农杆菌注射到本氏烟中，进行瞬时表达，在电子显微共聚焦下来观察MsTHI1基因的表达位置。由图10可知MsTHI1基因在细胞膜与叶绿体均有表达。

实施例4含MsTHI1基因烟草过表达载体的构建

(1)PCR产物与克隆载体的连接

将实施例1中PCR扩增产物与北京全式金生物科技有限公司pEASY-Blunt ZeroCloning Kit进行连接。

(2)连接产物转移至大肠杆菌感受态

将(1)中得到的连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态。具体操作方法为：加连接产物于50ul刚刚解冻的Transl-T1感受态中，混匀，冰浴30min，42℃水浴进行热激30s，立即置放于冰上2min。加入500ul不含抗生素的LB液体培养基，200rpm，37℃培养1h。离心1min，用移液枪弃掉部分上清，轻弹悬浮菌体，保留200ul菌液，在含潮霉素的LB琼脂培养基上均匀涂开，倒置平板，37℃过夜培养。挑取状态正常的多个单菌落分别放入含有潮霉素的LB液体培养基中培养，37℃，200rpm，摇菌12h-16h到菌液浑浊，将3个独立克隆进行双向测序，存菌备用。

(3)克隆载体的转化

具体操作方法为：重摇步骤(2)中测序正确的菌液并进行质粒的提取，质粒提取完成后进行浓度测定与琼脂糖凝胶电泳检测，见图8，选取浓度高、条带亮的质粒候选备用。以质粒为模板，与克隆引物进行PCR，克隆引物序列为：

上游引物：

5'-GAGCTCGGTACCCGGGGATCC ATGGCTTCAGCTTCCACCAC-3'(序列表ID NO.13)

下游引物：

5'-CCTTTAAGCTCGACCCTGCAGTTAAGCTTCTGCAATATCAGCAGA-3'(序列表ID NO.14)

PCR程序如下：

烟草过表达载体PCR程序：95℃3min，(95℃10sec，58℃15sec，72℃40sec)30个循环，72℃5min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳后进行PCR产物回收，浓度测定后，-20℃备用。摇pCAMBIA1300表达载体的菌液，提质粒，选取浓度高的进行酶切试验。酶切体系如表6：

表6酶切体系

37℃酶切6h，胶回收得酶切载体片段，测定浓度。将目的片段和线性化载体片段进行重组，根据试剂使用说明书中重组反应章节的计算公式计算重组反应所需的DNA量，按需要，对线性化载体和目的片段进行浓度稀释。重组反应体系如表7：

表7重组反应体系

体系配置完成后37℃反应30min，后将置于冰水浴中冷却5min，吸取10ul冷却反应液加入100ul T1感受态细胞中混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴2min，再42℃30s，最后冰水浴2min。后加900ul LB液体培养基，随后37℃、200rmp摇菌1h，12000rmp离心1min。去上清取重悬沉淀，涂于加有抗生素的LB固体平板，37℃过夜培养。菌落长出后再次挑菌摇菌并送测序。

菌液测序正确后进行质粒提取。转化对应的农杆菌感受态。对菌落进行PCR鉴定，正确后，存菌备用。

实施例5含MsTHI1基因的紫花苜蓿过表达载体的构建

(1)PCR产物与克隆载体的连接

(2)连接产物转移至大肠杆菌感受态

连接产物转化大肠杆菌Transl-T1感受态。具体操作方法为：加连接产物于50ul刚刚解冻的Transl-T1感受态中，混匀，冰浴30min，42℃水浴进行热激30s，立即置放于冰上2min。加入500ul不含抗生素的LB液体培养基，200rpm，37℃培养1h。离心1min，用移液枪弃掉部分上清，轻弹悬浮菌体，保留200ul菌液，在含固沙草的LB琼脂培养基上均匀涂开，倒置平板，37℃过夜培养。挑取状态正常的多个单菌落分别放入含固沙草的LB液体培养基中培养，37℃，200rpm，摇菌12h-16h到菌液浑浊，将3个独立克隆进行双向测序，存菌备用。

(3)克隆载体的转化

上游引物：

5'-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGATGGCTTCAGCTTCCACCAC-3'(序列表ID NO.15)

下游引物：

5'-GGCGGCCGCTCTAGAACTAGTTTAAGCTTCTGCAATATCAGCAGA-3'(序列表ID NO.16)

PCR程序如下：

紫花苜蓿过表达载体PCR程序：95℃3min，(95℃10sec，57℃15sec，72℃40sec)30个循环，72℃5min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳后进行PCR产物回收，浓度测定后，-20℃备用。摇pMDC123(由东北农业大学生物科学学院植物基因工程与分子生物学试验惠赠，质粒图谱见图11)表达载体的菌液，提质粒，选取浓度高的进行酶切试验。酶切体系如表8：

表8酶切体系

37℃酶切6h，胶回收得酶切载体片段，测定浓度。将目的片段和线性化载体片段进行重组，根据试剂使用说明书中重组反应章节的计算公式计算重组反应所需的DNA量，按需要，对线性化载体和目的片段进行浓度稀释。重组反应体系如表9：

表9重组反应体系

实施例6 MsTHI1基因转化烟草

烟草瞬时表达：将构建的烟草瞬时表达载体转化到农杆菌感受态中，将农杆菌转接于液体培养基培养至对数生长期，离心收集菌体沉淀，加入缓冲液，重悬至OD 600值约为0.1～1.5，农杆菌渗入法感染烟草。

烟草遗传转化：取适量种子于无菌水浸泡后，消毒，播种到播种培养基中，置于光下萌发生长。菌液准备：划板，挑取单菌落，检测阳性后，摇菌至合适浓度侵染。侵染：取生长旺盛的叶片，切成小块，侵染，侵染后吸干。将晾干的材料转移至共培培养基中，黑暗条件下培养。将共培材料转至筛选培养基，待不定芽长出后即可生根，见图12。

(1)MsTHI1过表达T0代烟草的PCR检测

生根苗生长稳定后取样对MsTHI1过表达T0代烟草进行PCR检测，随机选取1-19号转基因烟草，对转基因烟草进行潮霉素标记基因检测，可知2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19为过表达植株，而1、11、12基因表达量较少。pCR电泳图如图13所示。PCR中反应体系如表10。

表10反应体系

上游引物：5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’(序列表ID NO.17)

下游引物：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’(序列表ID NO.18)

反应程序为：95℃3min，(95℃10sec，57℃15sec，72℃40sec)30个循环，72℃5min，4℃终止反应。

(2)MsTHI1过表达T1代烟草筛选

为了获得稳定遗传株系，将T0代基因表达量较高的2号、3号、5号、6号、7号及10号烟草的种子置于含有潮霉素的培养基上进行筛选，最终选择长势较好的2号、3号及7号T1代烟草移栽至蛭石中培养。见图14。

(3)MsTHI1过表达T1代烟草的PCR检测

对种植在蛭石中的T1代烟草提取DNA，进行目的基因的抽样检测，由图可推测移栽蛭石中的2号、3号及7号T1代烟草阳性率100％。7号植株MsTHI1基因表达量高于2号、3号植株。见图15。

实施例7MsTHI1基因转化紫花苜蓿

苜蓿遗传转化：取适量紫花苜蓿种子进行消毒浸泡，播种于萌发培养基中进行萌发，7天后选取生长旺盛植株，切取子叶节浸泡于农杆菌菌液中，进行共培养，不定芽诱导，不定芽长大后即可生根。见图16。

(1)紫花苜蓿MsTHI1基因过表达植株的检测

利用康为DNA提取试剂盒，提取MsTHI1基因过表达苜蓿总DNA，进行pMDC123标记基因(固沙草)检测，可知1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号均为过表达植株。见图17。PCR中反应体系如表11。

表11反应体系

上游引物：5‘-ATGAGCCCAGAACGACGC-3’(序列表ID NO.19)

下游引物：5‘-CAAATCTCGGTGACGGGC-3’(序列表ID NO.20)

实施例8MsTHI1基因转化烟草阳性植株的功能分析

择长势较好的2号、3号及7号MsTHI1过表达T1代烟草蛭石培养植株，待生长稳定后采用20％PEG-6000浇灌，进行干旱胁迫。

生理指标测定采用苏州科铭生物有限公司试剂盒，分光光度计法测量。

叶片SPAD值测定：利用叶绿素计在每天12:00至13:00测定烟草叶片SPAD值，每组取三个叶片，三次测量取平均值。

PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)测定：用叶夹将叶片暗处理20min，依次测量暗处理部分Fv/Fm值，取三个叶片，每片测量三次取平均值。

如图18-图25所示，在干旱胁迫下，各时间点野生型植株维生素B1含量最低，说明MsTHI1基因可以提高烟草维生素B1含量。在长时间干旱胁迫情况下，MsTHI1基因过表达可以提高植株叶片SPAD值，在胁迫处理3d、5d时，2号、3号与7号转基因植株SPAD值均高于野生型植株SPAD值。处理时间点为5d时，野生型植株Fv/Fm最低，2号植株植株Fv/Fm最高，野生型植株与2号植株Fv/Fm之间差异显著(P＜0.05)，说明干旱胁迫下，MsTHI1基因不仅可以调控紫花苜蓿光合色素的合成，还可以保护其光化学效率，提高植株的抗旱性。在干旱胁迫下同一时间点，各植株之间比较可知在对照处理时间点、胁迫处理1d与胁迫处理3d三个时间点时，均是野生型植株MDA含量最高，说明转入MsTHI1基因植株的氧化防御系统有所增强。野生型植株OFR含量显著(P＜0.05)高于2号、3号、7号植株，7号与2号、3号植株OFR含量差异显著(P＜0.05)，证明MsTHI1基因过表达含量会降低植株体内OFR含量，可增加植物的耐逆性。野生型植株、2号、3号、7号植株SOD含量均呈现增加的趋势，在干旱胁迫下同一时间点，四种植株之间比较可知在处理时间点时，野生型植株SOD含量均最高。在对照处理条件下，野生植株POD含量显著低于2号、3号、7号植株，MsTHI1基因过表达POD含量会有所增加。随着胁迫处理时间的增加，野生型植株在胁迫处理3d时，Pro含量最高，随着Pro含量减少，2号、3号、7号植株Pro含量一直呈现增加趋势，说明MsTHI1基因过表达提高烟草的抗旱性。

利用灰色关联度方法对转基因烟草SPAD值、Fv/Fm、MDA、VB1、Pro、SOD、POD、OFR进行等权关联度分析可知：当转入MsTHI1基因较多植株其抗旱性较强，MsTHI1基因可以提高植物的抗旱性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 紫花苜蓿抗旱基因MsTHI1及其编码的蛋白和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 1

atggcttcag cttccaccac cattacctcc tccttcctct caaccccttc ttctcttaca 60

gagaaacctt cttcgttcaa ccaaacccta agcctcggtt tcaaaccaaa acactccgtc 120

tccgtttccg catcagctgc accttcacca ccaccttcct atgatctcaa cgccttcaaa 180

tttgctccga tcaaggagtc aattgtggca cgtgagatga ctcgtaggta catgacggac 240

atggtgactc atgccgatac cgacgtcgtc atcgttggtg ctggttctgc tggtttgtca 300

tgtgcttatg agctcagtaa gaatcctaac gtcaagatcg ctatcattga gcaatctgtt 360

agccctggtg gtggtgcttg gctcggtggc caactcttct ctgcaatggt tgtgcgtaag 420

ccagcacatc atttcttgga cgagcttgaa attgagtatg acgagcagga cgactatgta 480

gtgatcaagc atgctgctct cttcacttcc acaatcatga gcaagctact agcaaggcca 540

aacgtgaagc ttttcaatgc tgtagctgct gaggatttga tagtgaagaa tggaagagtt 600

ggtggtgttg tcactaactg ggctttggtt tcaatgaacc atgacacaca atcctgcatg 660

gacccaaatg ttatggagtc taaagttgtg gttagctctt gtggccatga tggtcctttt 720

ggagccactg gtgtgaagag gctcaagagt attggtttga ttgataccgt gcccggaatg 780

aaggccctcg acatgaacac tgctgaggat gctattgtta ggctcactag ggaggttgtt 840

cctggaatga ttgttactgg catggaggtt gctgagattg atggtgctcc aagaatgggt 900

ccaacatttg gagcaatgat gatttcagga cagaaggcag ctcatttggc cttgagagca 960

ctgggacttc ctaatgctgt tgatcatgca ggaaacgttc accctgagct tgtcctagct 1020

gctgctgatt ctgctgatat tgcagaagct taa 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 2

Met Ala Ser Ala Ser Thr Thr Ile Thr Ser Ser Phe Leu Ser Thr Pro

1 5 10 15

Ser Ser Leu Thr Glu Lys Pro Ser Ser Phe Asn Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Gly Phe Lys Pro Lys His Ser Val Ser Val Ser Ala Ser Ala Ala Pro

35 40 45

Ser Pro Pro Pro Ser Tyr Asp Leu Asn Ala Phe Lys Phe Ala Pro Ile

50 55 60

Lys Glu Ser Ile Val Ala Arg Glu Met Thr Arg Arg Tyr Met Thr Asp

65 70 75 80

Met Val Thr His Ala Asp Thr Asp Val Val Ile Val Gly Ala Gly Ser

85 90 95

Ala Gly Leu Ser Cys Ala Tyr Glu Leu Ser Lys Asn Pro Asn Val Lys

100 105 110

Ile Ala Ile Ile Glu Gln Ser Val Ser Pro Gly Gly Gly Ala Trp Leu

115 120 125

Gly Gly Gln Leu Phe Ser Ala Met Val Val Arg Lys Pro Ala His His

130 135 140

Phe Leu Asp Glu Leu Glu Ile Glu Tyr Asp Glu Gln Asp Asp Tyr Val

145 150 155 160

Val Ile Lys His Ala Ala Leu Phe Thr Ser Thr Ile Met Ser Lys Leu

165 170 175

Leu Ala Arg Pro Asn Val Lys Leu Phe Asn Ala Val Ala Ala Glu Asp

180 185 190

Leu Ile Val Lys Asn Gly Arg Val Gly Gly Val Val Thr Asn Trp Ala

195 200 205

Leu Val Ser Met Asn His Asp Thr Gln Ser Cys Met Asp Pro Asn Val

210 215 220

Met Glu Ser Lys Val Val Val Ser Ser Cys Gly His Asp Gly Pro Phe

225 230 235 240

Gly Ala Thr Gly Val Lys Arg Leu Lys Ser Ile Gly Leu Ile Asp Thr

245 250 255

Val Pro Gly Met Lys Ala Leu Asp Met Asn Thr Ala Glu Asp Ala Ile

260 265 270

Val Arg Leu Thr Arg Glu Val Val Pro Gly Met Ile Val Thr Gly Met

275 280 285

Glu Val Ala Glu Ile Asp Gly Ala Pro Arg Met Gly Pro Thr Phe Gly

290 295 300

Ala Met Met Ile Ser Gly Gln Lys Ala Ala His Leu Ala Leu Arg Ala

305 310 315 320

Leu Gly Leu Pro Asn Ala Val Asp His Ala Gly Asn Val His Pro Glu

325 330 335

Leu Val Leu Ala Ala Ala Asp Ser Ala Asp Ile Ala Glu Ala

340 345 350

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgagactt tcaatgtgcc cgcc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagcatgtgg gagtgcataa ccct 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcttcag cttccaccac 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttaagcttct gcaatatcag caga 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtggccatg atggtccttt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcctcggcag tgttcatgtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggctgccatc aaggaggaat 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaagctca gcctcatcaa g 21

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggggactc ttgacgagct catgacgacg tcgttcgcc 39

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgtcgact ctagaggatc caaattcacc ttttccattt tggtt 45

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagctcggta cccggggatc catggcttca gcttccacca c 41

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctttaagct cgaccctgca gttaagcttc tgcaatatca gcaga 45

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgactctaga ggatccccgg gatggcttca gcttccacca c 41

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcggccgct ctagaactag tttaagcttc tgcaatatca gcaga 45

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaaaaagc ctgaactcac c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctatttcttt gccctcggac 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgagcccag aacgacgc 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caaatctcgg tgacgggc 18

Claims

1.紫花苜蓿基因MsTHI1在提高烟草维生素B1含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

2.紫花苜蓿基因MsTHI1在提高烟草叶片叶绿素含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

3.紫花苜蓿基因MsTHI1在提高烟草PSII原初光能转化效率中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

4.紫花苜蓿基因MsTHI1在降低烟草丙二醛含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

5.紫花苜蓿基因MsTHI1在降低烟草超氧阴离子含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

6.紫花苜蓿基因MsTHI1在降低烟草超氧化物歧化酶含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

7.紫花苜蓿基因MsTHI1在提高烟草过氧化物酶含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。

8.紫花苜蓿基因MsTHI1在提高烟草脯氨酸含量中的应用，其特征在于：所述MsTHI1基因的核苷酸序列如序列表 ID NO.1所示。