CN1745172A

CN1745172A - 与ice1结合并调节cbf表达和拟南芥的耐冻性

Info

Publication number: CN1745172A
Application number: CN200480003201.1A
Authority: CN
Inventors: 朱健康; 马努·阿加瓦尔; 阿维尼什·卡普尔
Original assignee: University of Arizona
Current assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; University of Arizona
Priority date: 2003-10-06
Filing date: 2004-10-06
Publication date: 2006-03-08
Also published as: ZA200505260B; NO20053672D0; KR20060119699A; WO2005037991A3; EP1611240A2; EP1611240A4; US7378573B2; AU2004282490A1; BRPI0407124A; MXPA05008184A; JP2007507227A; WO2005037991A2; NO20053672L; CA2512431A1; US20050144671A1

Abstract

本发明涉及一种蛋白质(Snowl)，及其突变体，以及编码所述蛋白质的核酸，其与Icel相互作用并能够激活CBF3启动子活性从而调节植物的耐冻性。

Description

与ICE1结合并调节CBF表达和拟南芥的耐冻性

与本申请有关的参考

本申请以2003年10月6日递交的专利US 60/508,316为优先权，在此引入其全部内容作为参考。

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质，该蛋白的突变体以及编码所述蛋白质的核酸，这种蛋白质可以与Ice1相互作用并能够激活CBF3启动子活性进而调节植物的耐冻性。

背景技术：

不利的低温条件能够影响目前几乎所有生物的存活和分布。无柄植物已经进化到可以对不利的低温条件进行感知和对抗，这些植物对不利的低温的反应可以表现在生理，分子和生化水平上。许多温带的植物具有通过提前放置于一个非冷冻的低温下来提高其耐冻性的潜能，这就是被称为冷适应的过程(Guy 1990；Hughes and Dunn 1996；Browse and Xin 2001)。

分子水平上，一组特异性的蛋白质被诱导对低温进行响应，从而帮助植物在低温下维持生存。而且已经发现，在对低温的响应时，基因表达会有所变化，这种变化在植物对急剧冷却的耐性(Gong et al.2002；Hsieh et al.2002)和适冷性(Thomashow 1999；Knight et al.1999；Tahtiharju and Palva 2001)是十分重要的。能够在适冷过程中被诱导的蛋白质包括：呼吸作用和糖类、脂类、类苯丙醇和抗氧化物代谢过程中的酶，分子伴侣，抗冻蛋白质，以及许多其他的被认为对冷冻引起的脱水有抗性作用的蛋白质(Thomashow 1999；Guy1990；Mohapatra et al 1989)。这些基因及其基因产物被命名为CAPs(冷适应蛋白质)/CORs(冷响应)/LTIs(低温诱导)。

许多这些基因的启动子含有DRE/CRT(脱水应答元件/C-重复序列)区域，这种顺式应答元件对于由冷压力条件下的基因表达是必需的和充分的(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 1994；Stockinger et al 1997)。一小组同源转录因子(CBF/DREB)可以和这个序列结合进而激活冷调节基因的表达(Stockinger et al 1997；Liu et al 1998)。最近本发明的发明人鉴定了一种上游因子，其可以和CBF3启动子的Myc相似序列结合，并且是拟南芥CBF3表达和耐冻性的一个重要决定因素(Chinnusamy et al 2003)。除了CBF3启动子中Myc相似序列外，还有许多推测与Myb相似的序列(Shinwari et al 1998)。MYC相关的bHLH转录因子激活靶基因需要MYB作为共转录因子和(或)包含WD重复序列的因子(Spelt et al.2000；Walker et al.1999)。

Chinnusamy等人(2003)认为可能存在一种与Myb相似的转录因子通过与ICE1结合并引起CBF基因的冷激活表达。重要的是，微阵列分析结果显示，在冷压力下，Ice1突变体植物中的Snow1(参考本发明要求优先权的美国专利U.S.60/508,316中的AtMyb15，在此结合其整体作为参考)的表达水平要比野生植物的Snow1的表达水平要高(Chinnusamy et al 2003)。这表明在Ice1功能缺失的情况下，Snow1的表达水平会有所提高以弥补缺失的Ice1功能。

由于许多环境因素，例如寒冷，限制许多植物品种的地理分布和生长季节，而且通常会很不利地影响谷物生长的质量和产量，因此提高植物特别是那些作为有用农业作物的植物的耐冷性或者适冷性是非常必要的。

发明的简单描述

本发明的一个目的在于提供提高植物耐冷性或者适冷性(以下简称适冷性)的方法和组合物。

本发明的另一个目的在于提供转基因植物和植物细胞，其具有提高的适冷性。

本发明这些和其他目的可以通过一种提高植物适冷性的方法达到，这种方法包括在植物内过量表达Snow1基因。

本发明的目的也可以通过一种提高植物细胞适冷性的方法达到，这种方法包括在植物细胞内过量表达Snow1基因。

本发明的目的也可以通过用编码Snow1的核酸转化植物或者植物细胞来达到。

因此，本发明还提供了一种通过用编码Snow1的核酸转化植物或者植物细胞以得到上述植物或者植物细胞的方法。

本发明还提供了一种分离纯化的具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的Snow1。

本发明同时还提供了一种得到上述Snow1的方法，这种方法包括在Snow1表达的条件下，培养已经用编码Snow1的核酸转化的寄主细胞，以及分离Snow1。

在另一个具体实施例中，本发明提供了一种分离纯化的具有Snow1转录激活因子活性的酶，这种酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：2序列有从70％到小于100％的同源性。

本发明同时还提供了一种得到上述酶的方法，这种方法包括在该酶表达的条件下，培养已经用表达该酶的核酸转化的寄主细胞，以及分离该酶。

本发明还提供了一种提高植物适冷性的方法，其包括在植物内表达一种Snow1转录激活因子。

本发明还提供了一种提高植物的适冷性的方法，通过提高一种或者更多转录因子的表达，该转录因子选自CBF转录因子和DREB转录因子，和/或通过提高一种或者更多冷响应基因的表达。

本发明进一步还提供了一类前面所述的细胞和方法，其中Ice1基因与Snow1共表达以补充所获得的增强的适冷性。

在这里，本发明的发明人评价了Snow1改变CBF3表达水平的能力。微矩阵方法和RNA印迹方法分析确认了Snow1在Ice1显型细胞中会有所提高。Snow1是组成型，广泛表达以及核定位。通过酵母双杂交和蛋白质拖拉实验确定了Snow1可以与Ice1物理结合。Snow1蛋白质能够与CBF3启动子的Myb相似识别序列结合，并且它的瞬时表达可以提高CBF3控制的荧光素酶的活性，这就显示了其在适冷性和耐冷性中的作用。在冷压力的条件下，过表达Snow1的转基因植物(CBF-luc)可以表现出增强的荧光素酶活性。这些结果说明Snow1是CBF3表达的激活因子。

以上的目的只是描述本发明一些重要的方面，其他的目的、观点和实施例会在后面的详细描述中进行描述。附图的简要说明

对本发明及其优点更完整的评价，以及更好的理解，可以通过结合后面的详细描述参考下面的附图获得。

图1：Snow1在植物中组成型和广泛地表达。(A)Snow1在野生型(CBF3-luc)和Ice1植物中正常和冷压力的状态下的转录。微管蛋白作为加载对照(B)。Snow1在拟南芥植物的不同组织中的转录。反转录2μg总RNA并用Snow1的基因特异性引物进行PCR，并以微管蛋白作为对照。(C)Gus蛋白质在拟南芥秧苗不同组织中的组织化学定位。

图2：Snow1与Ice1特异地相互作用。(A)用来研究双杂交相互作用的诱饵和猎物的不同组合。(B)做为诱饵的Ice1不同区域，用来描绘Ice1与Snow1相互作用的结构域。这些区域会在A-F有所描述的。图中所框起来的区域代表Ice1蛋白质的bHLH区域。(C)所述Ice1描述的区域与Snow1诱饵之间的相互作用。(D)用GST标记蛋白质进行的体外拖拉实验。使用的组合物显示在图片顶部，分子量标记在左边显示。左面的图片表示用考马斯兰染色的纯化的带有GST标签的蛋白质，右面图片表示的是自显影结果。(E)用S标记的蛋白质进行的体外拖拉实验。使用的组合物显示在图片顶部，分子量标记在左边显示。(F)Ice1与Snow1在体内的相互作用。用Myc-Ice1和HA-Snow1转化拟南芥的原生质体。Myc标记的Ice1用抗c-Myc的抗体进行免疫沉淀。蛋白质在SDS-PAGE上进行溶解并转到硝酸纤维素膜上，并用带有抗HA的抗体的探针来检测这张膜。图片的左边说明的是蛋白质分子量标记。

图3：Snow1蛋白质与CBF启动子的不同部分结合。(A)Snow1蛋白质与CBF1启动子部分的相互作用。(B)Snow1蛋白质与CBF2启动子部分的相互作用。(C)Snow1蛋白质与CBF3启动子部分的相互作用。各图片的上方说明的是所用的不同片断。

图4：Snow1是一种核定位的转录激活因子，Snow1的过量表达可以提高CBF3的表达。(A)GFP-Snow1蛋白质在核内的定位。图片显示的是GFP-Snow1在转基因植物根部中共轭聚焦显微镜下观察的图片。(B)用CBF3-LUC和35S-Snow1和/或35S-Ice1转化后，荧光素酶的相对活性。来自ReLLina的荧光素酶的基因作为内部对照，使每次转化后获得的数值标准化。荧光素酶的活性是以相对于Renilla荧光素酶活性的任意单位来表达的(如Ohta等2001所述)。

图5：(A)野生型与Snow1过表达植物株(7号)的秧苗和荧光的图片。这是在冷处理12小时后的图片。(B)野生型与Snow1过表达植株(第4，7和15号)在冷压力下荧光强度的定量分析。

图6：Snow1过表达的第7号和第10号中Snow1和CBF3的稳定转录水平。图片的右边说明的是所用到的植物株，上方说明的是冷处理(0℃)的时间。以肌动蛋白作为内源对照。

图7：Snow1 T-DNA植株的分析。(A)说明Snow1基因中T-DNA所插入突变。(B)通过对纯合(28号)和杂合(30号)T-DNA植物株进行RT-PCR来确认基因敲除。以野生型和微管蛋白作为内部对照。(C)野生型(WT)和纯合T-DNA植物株(28号)中冷压力的条件下CBF基因的水平。

图8：在Snow1纯合过表达和T-DNA植株中的离子泄漏。检测了已适应的植物合没有适应的植物在冷压力下的电导率。(A)Snow1过表达植株的电导率。(B)Snow1 T-DNA植株的电导率。

发明的详细描述：

除非有特殊解释，这里所用到的科技术语和酶学、生化、细胞生物学、分子生物学、植物生物学和药学领域中的熟练的研究人员通常理解的意义相同。

所有与本发明所描述相似或者相当的方法和材料都可以应用于本发明的实践和测试中。这里所提到的所有出版物，专利申请，专利以及其他参考文献是在此引入整体作为参考。如果有冲突的地方，本说明书包括定义将会控制。进一步，材料、方法和实施例只是用于作为示范而不是限制，除非有特殊说明。

冷压力能够诱导表达许多由一系列冷诱导表达转录因子所依次调控的基因。CBF类转录因子包含许多重要的谷物冷响应决定因子。最近，本发明人报道了CBF基因是由另一种上游转录因子Ice1调控的。Ice1与CBF3启动子的MYC相似识别序列结合。除了MYC相似识别序列外，CBF3启动子还有MYB相似识别序列结合。Chinnusammy等人(2003)认为存在另外一种可以和MYB相似识别序列结合并调节CBF3表达的转录因子。本发明的发明人扫描了微阵列数据(Chinnusamy et al 2003)，发现Ice1突变体在冷压力下，一种MYB转录因子会有较高的转录水平。考虑到一种基因功能的缺失会通过提高另一种基因的表达来补偿，因此本发明的发明人研究了Snow1在调节CBF3表达中的功能。

RNA印迹分析结果显示Snow1可以被冷压力轻微诱导，这说明Snow1可能有对冷压力的对抗作用。RNA印迹分析结果与微矩阵分析的结果相一致，其结果显示Ice1突变株在低温压力下Snow1的表达水平会有所提高。Snow1表达的增强可能是为了补偿Ice1功能的缺失。Snow1是在植物所有组织中普遍表达的核定位蛋白质。凝胶滞留实验显示Snow1可以和CBF3的启动子结合，并需要CBF3启动子的myb相似识别序列。Snow1与CBF3启动子的结合说明了Snow1可以调控CBF3启动子的表达。

Snow1可以和Ice1有物理的相互作用。酵母双杂交分析显示Snow1可以和Ice1的C端(266-499位氨基酸)相互作用。Snow1和ICE1相互作用的区域也被限定在了Ice1的358-494段氨基酸序列。并且蛋白质拖拉实验显示Snow1和Ice1可以相互作用。一种关系较远的MYB转录因子(Myb79)不能够与Ice1结合，这说明Snow1和Ice1的结合是特异的。在转录因子中的连续相互作用已经在调节下游基因中显示出了重要的作用(Walker等1999，Spelt等2000，Grotewold等2000)。瞬时转化实验结果显示，Snow1的过量表达可以提高CBF3启动子控制的荧光素酶的表达。当Ice1与Snow1共同转化时，荧光素酶活性的变化不大。这说明，在体内Ice1和Snow1是独立激活CBF3的表达的，并且它们的相互作用并不能对CBF3有更强的激活。有可能是在冷压力持续期间的初始，分散了被这两个转录因子引导的CBF3的表达。与野生型植物相比，在CaMV35S启动子控制下稳定表达Snow1的转基因植物(CBF3-luc遗传背景)可以在冷压力下表现出增强的荧光。所有这些结果都说明Snow1是CBF3表达的转录激活因子。

相应地，本发明将在下面的描述和进一步解释以及举例中具体描述。

术语“植物”包括整个植物，植物组织(例如：叶，干，根等)，种子，和植物细胞以及它们的子代。能够在本发明的方法中使用的植物种类通常与能够应用转化技术的高等植物的类别一样宽广，包括单子叶植物，双子叶植物。优选植物包括稻子，玉米，小麦，棉花，花生和大豆。

术语“植物”包括整个植物，植物组织(例如：叶，干，根等)，种子，和植物细胞以及它们的子代。能够在本发明的方法中使用的植物种类通常与能够应用转化技术的高等植物的种类一样宽广，包括单子叶植物，双子叶植物。优选植物包括稻子，玉米，小麦，棉花，花生和大豆。

因此，在本发明的一项具体实施例中，可以通过提高植物中蛋白质的数量，尤其是植物中Snow1基因的增强，来提高或者增强抗冷性。

因此，在本发明的一项具体实施例是一种携带本发明中所述多聚核苷酸的植物细胞，优选携带本发明分离的多聚核苷酸的转基因植物。

在这里所使用的术语“增强”是指提高植物细胞或者植物相应的DNA编码的一种酶或者多种酶细胞内的活性。增强作用可以通过对细菌细胞的多种操作来辅助达到。为了实现增强，特别是过表达，可以提高相应基因的拷贝数，使用强启动子，或者位于结构基因上游的启动子和调节区域或者酶结合位点进行突变。定位于结构基因上游的表达框也可以通过同样的方法起作用。另外，还可以使用可诱导启动子来提高表达。也可以使用一种编码具有较高活性的酶的基因。还可以通过延长RNA的生命周期来提高表达。进一步，抑制酶的简并可以整体上提高酶的活性。而且这些检测可以与任何希望的方法相结合。这些或其他的改变植物基因活性的方法是已经描述过的，例如在Plant Molecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)。

在这里所使用的“表达框”包括一种在植物中发挥功能的启动子，连接于一段编码SEQ ID NO：2序列的Snow1蛋白的核酸(例如具有SEQID NO：1序列的多聚核苷酸)，其中蛋白质在植物细胞内的增强的表达可以提高所述植物的抗冻性。在一个本发明的一个优选的实施例中，所述启动子可以从下列启动子中选择：一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子球蛋白蛋白质启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子，一种膨胀诱导启动子。进一步，在本发明表达框的另一个实施例中，是用于Snow1，但更适合包含一种具有编码SEQ ID NO：4序列的Ice1基因的核酸(例如具有SEQ ID NO：3序列的多聚核苷酸)，其中植物细胞中蛋白质的增强表达说明了所述植物细胞增强的抗冻性。然而，在另一个本发明表达框的实施例中，表达框可以既包含编码Snow1的多聚核苷酸也包含编码Ice1的多聚核苷酸序列(这些多聚核苷酸以及它们的突变体将在后面描述)，在同一个启动子或者一个可以选择的可诱导型启动子的控制下，连接到同一个或者不同的质粒或者载体上。这里所述的术语“选择性诱导启动子”是指当两个或多个启动子出现在同一个质粒或者载体上，或者当这些启动子在不同的质粒或者载体上，但是这些质粒或者载体包含在相同的寄主细胞、植物细胞或者转基因植物时，这些启动子能够与寄主兼容(被寄主细胞、植物细胞或者转基因植物所稳定地支持)并可以被分别激活或者增强转录(例如，在一个启动子是通过加入IPTG，另一个是通过提高温度)。

也可以被应用一种编码具有相应或者突变的高活性的酶(例如Snow1和/或Ice1)的基因。优选的是相应的酶具有比酶的原始形式更高活性，更优选的是具有比原始状态高至少5，10，25％或者50％的更多活性，最优选的是能够比原始状态酶的活性高两倍以上。

在本发明中，如果一种多聚核酸序列至少70％的碱基组成和碱基序列相应于本发明，就被称为“同源的”，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的碱基组成和碱基序列相应于本发明的序列。根据本发明，“同源蛋白质”可以被理解为包括蛋白质，该蛋白质含有至少70％氨基酸序列相应于本发明的氨基酸序列，或者该蛋白质由前面所述的多聚核苷酸序列编码，优选至少80％，更优选至少90％，最优选95％，其中相应被理解为是指相应的氨基酸相同的或者互补的同源氨基酸。如这里所描述的，本发明的序列相应于SEQ ID NO：1(多聚核苷酸序列：Snow1)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列：Snow1)，SEQ ID NO：3(多聚核苷酸序列：Ice1)，SEQ ID NO：4(氨基酸序列：Ice1)。“同源氨基酸”的表述是指那些具有相应性能，特别地涉及它们的电荷，疏水特性，空间排列性质等。这样，蛋白质序列可以从70％最高到小于100％同源于SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：4。

同源性，氨基酸或核苷酸序列的序列的相似性或相同性，通常可以用已知的软件或者电脑程序来分析，例如：BestFit或者Gap配对比对软件(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。Bestfit是利用Smith和Waterman在发表在Advances inAppliedMatematics 2：482-489(1981)的局部同源性运算法则，来发现两条序列间相同性或相似性的最好片段。Gap是进行整体比对：利用Needleman和Wunsch发表在J.Mol.Biol.48：443-453(1970)的方法，每一序列与所有另一相似序列对比。在利用一种例如Bestfit的序列比对软件来进行检测序列同源性，相似性或相同性的程度时候，需要使用默认设置，或者选择适当的评估标准以优化相同性，相似性或同源性的数值。同样，当应用Bestfit的序列比对软件来检测两条不同氨基酸序列的序列相同性、相似性或同源性时，需要使用默认设置，或者选择适当的评估标准，例如blosum45或者blosum80以优化相同性，相似性，或同源性的数值。

本发明也涉及多聚核苷酸，其包含相应于SEQ ID NO：1序列的多聚核苷酸的全部基因或者其片断，其获得可以通过利用包含所述相应于SEQ IDNO：1序列的多聚核苷酸或者其片断的探针与相应的基因库进行杂交，进行筛选，然后分离所述的DNA序列。

本发明的多聚核苷酸序列可以适合作为RNA，cDNA，DNA的杂交探针以分离这些与Snow1基因有高度相似性的cDNA或者基因，尤其是SEQ IDNO：1序列的Snow1基因。

本发明的多聚核苷酸序列还可以适合作为聚合酶链式反应(PCR)的引物以获得编码具有Snow1转录激活因子活性的酶的DNA。

这些作为探针或引物的寡聚核苷酸序列包含多于30个，优选最多30个，更优选最多20个，最优选至少15个连续的核苷酸。具有至少40或者50个核苷酸的寡聚核苷酸也是适用的。

术语“分离”的意思是指从其自然环境中分离出来。可以认为本发明中“分离”的多聚核苷酸或者多肽可以进一步是实质上纯化的或纯化的(也就是说多聚核苷酸和多肽被纯化)。这里所使用的“实质上纯化的”意味着多聚核苷酸和多肽从自然环境中分离出后，达到了只含有很少的杂质的水平(例如：得到的多聚核苷酸和多肽产物至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％是纯化的)。这里所说的术语“纯化”是指多聚核苷酸和多肽不含有污染物(例如100％纯化)。

术语“多聚核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，可以表示未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。

术语“多肽”一般认为是指肽或者蛋白质，其包含通过肽键连接的两个或更多的氨基酸。

本发明的多肽包括相应于SEQ ID NO：2序列的多肽，特别是具有Snow1转录激活因子生物活性的多肽，还包括那些至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％与相应于SEQ ID NO：2序列的多肽同源的多肽，并且具有所述活性。因此，这些多肽与SEQ ID NO：2序列有从70％到最多100％的同源性。

本发明还涉及编码DNA序列，其由SEQ ID NO：1通过遗传密码子的简并而来。用同样的方式，本发明进一步涉及与SEQ ID NO：1或者部分SEQ IDNO：1序列杂交的DNA序列。而且本领域技术人员还知道保守氨基酸替换，例如在蛋白质中用丙氨酸替换甘氨酸或者谷氨酸替换天冬氨酸作为“同义突变”，其不会引起蛋白质活性的任何基本变化，例如功能中性的。同时知道蛋白质N端和/或C端的变化不会实质性破坏其功能，甚至可能使其功能更稳定。

用同样的方式，本发明进一步还涉及与SEQ ID NO：1或者部分SEQ IDNO：1序列杂交的DNA序列。本发明还涉及利用得自SEQ ID NO：1序列的引物通过聚合酶链式反应(PCR)得到的DNA序列。如前所述，这种形式的寡聚核苷酸通常至少有15个核苷酸的长度。

术语“严格条件”或者”严格杂交条件”包括这样的条件，在该条件下多聚核苷酸可以和靶基因结合，并达到了比其他序列高得多的可检测水平(例如，比背景至少要高2倍)。严格条件是依赖于序列的，并且根据不同的环境会不同。通过控制杂交和/或者清洗条件的严格性，与探针(同源探针)100％互补的靶序列可以被识别出来。替代地，通过调节严格条件以允许序列中出现某些误配，这样可以检测到更低程度的相似性(异源探针)。

通常，严格条件为盐浓度为低于大约1.5M钠离子浓度，一般为0.01-1.0M钠离子浓度(或者其他的盐)，pH值为7.0-8.3，对于短探针(例如：10-50个核苷酸)温度为至少大约30℃，对于长探针(例如50个以上核苷酸)温度大约至少为60℃。严格条件还可以通过添加例如甲酰胺的去稳定剂而获得。示例的低严格条件包括在30～50％的甲酰胺缓冲液，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸钠)，37℃的条件下进行杂交，接下来在1X～2X的SSC溶液(20X的SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)中在50-55℃下清洗。示例的中等严格条件包括在40～45％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸钠)37℃条件下进行杂交，接下来在0.5X到1X的SSC溶液中在55℃到60℃下清洗。典型的高严格条件包括在50％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸钠)，37℃条件下进行杂交，接下来在0.1X的SSC溶液中在60℃到65℃下清洗。

特点在于杂交后清洗的功能，其非常重要的因素是离子强度和最终清洗溶液的温度。对于DNA-DNA杂交，Tm值可以通过Meinkoth和Wahl在Anal.Biochem.，138：267-284(1984)上提供的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L来估计，其中，M代表单价阳离子的摩尔浓度，％GC代表鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form代表杂交溶液中甲酰胺的百分比，L代表碱基对的杂交长度。Tm是指50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交(在一定离子强度和pH下)时的温度。每当有1％的错配，Tm就降低1℃；因此，可以调节Tm值，杂交和/或清洗条件从而和具有所希望相同性的序列进行杂交。例如，如果要找到大约90％相同性的序列，Tm值可以降低10℃。通常，对于特异性序列与它的互补链，在特定离子强度和pH值下，严格条件会选择比热熔点(Tm)低5℃。然而，苛刻的严格条件会在比热熔点(Tm)低1，2，3，或4℃条件下杂交或者清洗；中等的压力条件会在比热熔点(Tm)低6，7，8，9或10℃杂交或者清洗；低的严格条件会在比热熔点(Tm)低11，12，13，14，15或者20℃条件下杂交或者清洗。使用这个方程式，杂交和清洗组合物，以及希望的Tm值，本领域技术人员将了解杂交和/或清洗溶液的严格性的变化是固有描述的。如果误配的程度导致Tm值低于45℃(水溶液)或者低于32℃(甲酰胺溶液)，优选提高SSC的浓度从而可以使用较高的温度。核酸杂交的详细指南在分子生物学现行草案(Current Protocols in Molecular Biology)第二章，Ausubel等，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2000)中可以找到。

因此，根据前面所述信息，本领域技术人员可以鉴定和分离与本发明多聚核苷酸实质上相似的多聚核苷酸。在分离这样的多聚核苷酸时，该多聚核苷酸也可以象本发明的多聚核苷酸一样，例如应用于提高植物的抗冻性。

本发明的一个实施例就是筛选多聚核苷酸的方法，其与本发明的多聚核苷酸具有实质的同源性，优选那些编码拥有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸。

本发明的多聚核苷酸序列可以被一种或者多种在植物学或类似领域中已知的质粒或载体携带。如前所述，多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3)被相同或者不同的质粒或者载体携带也仍然在本发明的范围内。在本发明的一个实施例中，这些多聚核苷酸可以在相同(或者不同)质粒或者载体上连接到单一启动子、相同类型的不同种启动子或者选择诱导型启动子上。

在一个实施例中，可以通过用于细胞类型的适合载体携带多聚核苷酸在细菌或者真菌中进行扩增，这是有利的。在这些细胞类型中扩增多聚核苷酸和获得蛋白质的常用方法在现有技术中已知并描述过，例如：Maniatis等，分子克隆(Molecular Cloning)：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1982)以及Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)。

在另一个优选的实施例中，多聚核苷酸包括SEQ ID NO：1序列，与SEQID NO：1互补的多聚核苷酸，与SEQ ID NO：序列至少70％、80％、90％或95％相同的多聚核苷酸；或者在严格条件下与SEQ ID NO：1序列杂交那些序列，严格条件下包括在5X的SSC和温度50℃-68℃下清洗。因此，该多聚核苷酸可以与序列SEQ ID NO：1有从70％最多到小于100％的相同。

在本发明的一个实施例中，本发明的多聚核苷酸(例如：如上所述，SEQID NO：1，及其变体，编码SEQ ID NO：2序列的多聚核苷酸，或其变体)会包含在一种质粒或者载体上，无论与Ice1相关的多聚核苷酸(例如：如上所述，SEQ ID NO：3及其变体，编码SEQ ID NO：4的多聚核苷酸，或者其变体)是否存在。

在本发明的另一个实施例中，本发明质粒或载体包含在寄主细胞、植物细胞或者转基因植物中。优选的，植物是拟南芥或者选自小麦，玉米，花生，棉花，燕麦，大豆植物。在一个优选的实施例中，多聚核苷酸(如上所述，编码Snow1和/或Ice1)连接于一种启动子，优选的，一种可诱导启动子。如前所述，多聚核苷酸可以在相同(或不同)质粒或者载体上，连接于单一启动子，同种类型的不同启动子，或者选择性诱导启动子。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供了一种方法，用于筛选编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白的多聚核苷酸，包括将本发明的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸杂交；表达多聚核苷酸，获得蛋白质；检测蛋白质中是否具有Snow1转录激活因子活性。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供了一种方法，用于检测与核苷酸SEQ ID NO：1有至少70％同源性的核酸，与SEQ ID NO：1互补和/或编码SEQ ID NO：2中氨基酸序列的蛋白质的序列，包括将一种核酸样品与探针或者引物接触，该探针或者引物包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供了一种方法，用于制备与本发明的多聚核苷酸有至少70％同源性的核酸，包括将核酸样品与引物接触，该引物包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供一种制备Snow1蛋白质的方法，包括在适合Snow1表达的条件下，培养携带本发明多聚核苷酸的寄主细胞一段时间，然后收集Snow1蛋白质。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供一种制备一种转基因植物的方法，包括将本发明的多聚核苷酸导入植物中。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供一种提高植物所需适冷性的方法，包括将本发明的多聚核苷酸(包括单独用于Snow1在此限定的多聚核苷酸或者在用于Ice1在此限定的多聚核苷酸存在的情况下)导入所述的植物中。

根据本发明的用于转化植物和植物细胞的方法，载体和成分对于本领域技术人员来说是已知的，而且没有特殊限定。描述性的例子可以参考Karimi等人在TRENDS in Plant Science，Vol.7，NO：5，May 2002，pp.193-195，的文章看到进一步的例子，在此引入作为参考。

在本发明的另一个优选的实施例中，本发明提供一种分离的多肽，包含SEQ ID NO：2中的氨基酸序列或者那些与SEQ ID NO：2有至少70％，优选80％，更优选90％，最优选95％同源性的蛋白质，其中多肽具有Ice1的转录激活因子的活性。因此，酶具有与SEQ ID NO：2从70％最多到小于100％的同源性。

在另一个实施例中，本发明还提供一种提高植物适冷性的方法，包括在植物中过表达Snow1转录激活因子。在这个实施例中，Snow1还可以进一步和Ice1共表达。

在另一个实施例中，本发明提供一种提高植物适冷性的方法，包括提高一种或者更多附加转录因子的表达，该转录因子选自CBF转录因子和DREB1转录因子转录因子，和/或提高一种或者更多冷响应基因的表达。

在本发明上下文中，术语“冷响应基因”包括编码选自下列蛋白质的基因：糖类呼吸作用中的酶，糖类代谢中的酶，脂类呼吸作用中的酶，脂类代谢中的酶，类苯丙醇呼吸作用中的酶，类苯丙醇代谢中的酶，抗氧化剂呼吸作用中的酶，抗氧化剂代谢中的酶，分子伴侣，抗冻蛋白质，和对冷冻引起的脱水作用有耐性的蛋白质。

本发明的上述描述提供了一种任何本领域熟练的人都可以获得和利用的方法和步骤，并作为附加的权利要求书的主题，其构成了原始说明书的一部分。

在上面所使用的词组“选自”、“选自以下”和类似的表达包括限定物质的混合物。

在此提到数字界限或者范围时，其终点也是包括在内的。并且，在数字界限或者范围内所有数值和子集也都是特定包括在内的，如同其已经明确写出。

提供上述描述是使本领域技术人员能够获得和利用本发明，并且提供在特定应用和需要中。。本领域技术人员可以对所提到的实施例进行各种修饰，在此所提到的原理也可以应用到其他的实施例和应用中去，而没有离开本发明的精神和范围。因此，本发明不仅仅限制在实施例中所描述的，而是符合与在此所公开的原则和特征一致的最大范围。

本发明已经进行了总体上的介绍，通过参考特定的实施例获得更进一步的理解，在此提供的这些实施例只是为了描述而不是作为限制，除非有其他特殊说明。

具体实施方式

材料与方法：

基因表达分析：为了进行RNA分析，使用的是在相同MS培养基不同部分的10天的野生型秧苗和Ice1(显型)植物。通过Liu和hu(1997)所描述的RNA印迹实验对从对照和压力处理的植物中提取的总RNA进行分析。如上所述从过表达Sow1的植物中提取RNA。将RNA转到尼龙膜上，用全长的Snow1的cDNA或者CBF3探针标记尼龙膜。以β-微管蛋白基因通过PCR的方法(Chinnusamy等，2003)进行扩增来作为上样的对照。为了分析在不同组织中的表达，从根部，叶子，花和长角果中提取RNA并且用全长的Snow1的cDNA作为探针进行RNA印迹分析。ICE1的开放阅读框(SEQ ID NO：3)通过对由RT-PCR得到的cDNA进行测序来确定(见美国专利申请号No.10/425,913，其全部内容在此引入作为参考)。

酵母双杂交相互作用研究：用引物5′GATGGGAAGAGCTCCATGCTG 3′(SEQ ID NO：5)和5′CCGCTCGAGCTAGCCAATACATCGAACCAG 3′(SEQID NO：6)扩增Snow1的全长，并克隆到pACT2载体(猎物载体)的SmaI和XhoI位点。利用引物5′TGAGACTGGGATTGAGGTTTCTG 3′(SEQ ID NO：7)和5′CAAGCTTGCCTGCAGGTCGAC 3′(SEQ ID NO：8)从pMal-Icel DNA(Ice1克隆在MBP融合载体上)上作为模板扩增Ice1的C端区域(相对应的是266-494氨基酸)，并且克隆到pAS2载体(诱饵载体)的SmaI和SalI位点。为了描绘出相互作用的结构域，利用基因的特异引物进行PCR扩增Ice1的C端部分的一些缺失体，并克隆到pAS2的NcoI和BamHI的位点。将猎物和不同的诱饵质粒共转化化Y190酵母株，并从缺失色氨酸和亮氨酸的SC培养基上挑选阳性克隆。对所得到的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性测试。

在大肠杆菌中表达和纯化融合蛋白质：

用基因特定引物CG GGATCCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTG(SEQID NO：9)和SP6引物进行扩增全长的Snow1 cDNA(克隆在pGEMT-easy上)。所扩增的产物被克隆到pMAL载体(NEB)或者pGEX 4T-1载体(Pharmacia，美国)的BamHI和SalI位点。利用引物CG GGATCCGAATGGTGGAAGAAGTTTGGAGAAA(SEQ ID NO：10)和CCG CTCGAGTTAACAAAATGGAATCACCAAGTT(SEQ ID NO：11)扩增全长的AtMyb79cDNA并克隆到pGex 4T-1载体(Pharmacia)的BamHI和XhoI位点。根据手册的说明书的指导来纯化MBP-Snow1的融合蛋白质。用构建的表达GST融合的Snow1和GST融合的Atmyb79(远端MYB转录因子)的质粒转化大肠杆菌BL21(已增加密码子)细胞。将单克隆在37℃培养过夜后，转入新鲜的20倍体积的LB(Luria-Bertani)培养基中，进一步培养1小时。用1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37℃下处理4小时以诱导重组蛋白质的表达。离心收集细胞(5,000g，10分钟，4℃)，加入预冷的裂解缓冲液(10mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA and 100μg/ml溶菌酶)于冰上孵育15分钟。添加二硫苏糖醇(50mM)，氟化磺酰苯甲烷(1mM)and N-十二烷基肌氨酸(1％)后进行一分钟超声。超声产物在30,000g 4℃下离心15分钟后变得澄清。在上清中加入Triton X-100(1.5％)后振荡。准备谷胱甘肽-琼脂糖珠子(Sigma)。用预冷的PBS清洗六次珠子。再用100mM谷胱甘肽(Sigma)，50mM Tris，pH8.8清洗GST融合的蛋白质。用含有用1M咪唑的预冷的PBS清洗HIS标记的ICE1。

DNA结合：为了和CBF启动子结合，用KOD聚合酶(Novagen)通过PCR方法扩增CBF启动子的不同片断(在图3中有对片断的详细描述)。用Qiaquick胶纯化试剂盒(Qiagen)从琼脂糖胶上洗提出扩增的片断。清洗的片断用γ-P³²ATP和T₄多核苷酸激酶进行末端标记。500pg的标记过的探针与500ng提纯的MBP-SNOW1融合蛋白质在室温孵育30分钟。在与标记的探针孵育之前，纯化的蛋白质与100ng未标记的片断在室温下孵育30分钟以竞争。DNA-蛋白质的复合体在0.5XTBE中5％聚丙烯酰氨胶中分离，用并自显影的方法显像。

瞬时表达测试：将全长的Snow1和AtMyb79cDNA克隆在植物表达载体2X35S-MCS-Nos.的SmaI和SalI位点上。用基因枪将得到的效应质粒的质粒DNA效应物和CBF启动子-luc报告子转化到拟南芥的叶子中(Ohta等，2001)。

体外拖拉实验：体外拖拉实验是用来确认Snow1和Ice1的物理结合的。使用克隆在pGEM-Teasy载体上的全长Snow1与AtMyb79(克隆在pBCSKStrategene载体的EcoRI和XhoI位点之间)。全长的Ice1和ABI2克隆在pCITE4a的EcoRI/SalI和NcoI/EcoRI位点上。用Megascript T7RNA聚合酶试剂盒(Ambion)体外转录每种线性质粒各2μg。用Flexi Rabbit Reticulocyte系统(Promega)在35S-甲硫氨酸存在的情况下，体外翻译10μg纯化的Snow1和AtMyb79转录产物。S标记的Ice1和S标记的ABI2转录产物在没有35S-甲硫氨酸存在的情况下体外翻译，并用S标签纯化试剂盒(Novagen)根据手册的说明书来纯化所得到的蛋白质。利用结合在S标记的浆液上的S标记的Ice1和S标记的ABI2对35S标记蛋白质进行拖拉。在另一试验中，使用GST-Snow1或者GST-Myb79蛋白质来制备35S标记的S标签Ice蛋白质并用来拖拉。拖拉实验根据如上所述(Haftler et al 2000)进行。

Snow1的表达和定位：为了构建Snow1启动子-GUS的融合产物，首先用引物CCC AAGCTTATACCATATCAAATCTGAGAAAG(SEQ ID NO：18)和CGC GGATCCATTTGTGATTGCTGATAAAAGAAG(SEQ ID NO：19)从Col野生型的基因组中PCR扩增Snow1 cDNA起始位点上游的2.0kb片断，并克隆到pCAMBIA1391Z的HindIII和BamHI位点上。所得到质粒转移到农杆菌GV3101然后通过植物真空渗入的方法导入Col-O生态型的拟南芥中(Bechtold and Pelletier，1998)。在含有30mg/L潮霉素的MS培养基上筛选转基因植物。转基因的秧苗在长到21天的时候根据Jefferson等人(1987)所述，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸染色进行组织化学染色，并在奥林巴斯FZX12解剖显微镜下识别。为了构建全长的GFP融合的Snow1，首先用引物CCG GAATTCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGAG(SEQ ID NO：20)和CGC GGATCCCTAGCCAATACATCGAACCAGAAG(SEQ ID NO：21)进行PCR扩增并克隆到含有bialophos acetyltransferase选择标记基因的pEGAD载体的EcoRI和BamHI位点(Cutler等，2000)。所得到质粒利用农杆菌GV3101介导通过植物真空渗入的方法导入Col-O生态型的拟南芥(Bechtoldand Pelletier，1998)。为了进行共轭聚焦显微镜观察，在含有50mg/L潮霉素的MS琼脂糖培养基上筛选的Snow1：GFP转基因秧苗，在玻璃片上制作标本，进而利用Zeiss 510Meta共轭聚焦显微镜通过488-nm激发激光和522/DF35散发滤镜显象。

构建转基因植物：

利用引物GCTCTAGAATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGA(SEQ ID NO：22)和GGGGTACCCTAGCCAATACATCGAACCAGA(SEQ ID NO：23)通过PCR方法扩增全长的Snow1基因，并克隆到pRT105载体的XbaI/KpnI位点。从得到的质粒上分离出含有35S启动子-Snow1-nos终止子的基因盒，并克隆到pCAMBIA 3300载体的PstI位点。最终构建的质粒利用农杆菌GV3101介导，通过植物渗入的方法转化到拟南芥(CBF3-luc背景)。可以利用携带有Snow1过表达载体的农杆菌GV3101来得到在CBF3-LUC背景下Snow1过量表达的植物株。在萌芽两个星期后，每隔三天喷三次30mg/L basta来筛选T1代转基因植物。

结果：

Snow1在Ice1突变植物中表达量更高

RNA印迹实验用来分析Ice1突变体对于Snow1转录水平的影响。与微阵列分析结果一致的是在冷压力下Ice1突变体中Snow1的转录水平比野生型植物要高(CBF3：luc)。在冷处理1小时，3小时，6小时后可以看到增高的Snow1转录水平。然而，在冷压力处理12小时后，Ice1中Snow1的表达要比野生型植物要低。RNA印迹实验还说明在对冷处理的反应中Snow1的表达会上调。野生型植物在冷压力处理1小时后，可以表现出冷压力诱导的Snow1转录并在处理6小时候达到最高值。Snow1的转录在没有压力的条件下也可以被检测到。

Snow1在植物的所有部分都有组成型表达

为了分析Snow1的分布，对从根，茎，花和长角果中提取出的RNA进行RNA胶印迹分析。发现Snow1在拟南芥的所有组织中都有表达。获得了在Snow1启动子控制下表达Gus基因的转基因植物。转基因拟南芥植物的T1代进行了Gus表达的分析。发现在根，叶，干和花部有Gus的表达，这进一步证实了Snow1是组成型广泛表达的。

酵母双杂交相互作用

为了确定Snow1能否与Ice1相互作用，使用了酵母双杂交体系。Ice1蛋白质的不同部分用作诱饵蛋白质，全长的Snow1蛋白质作为猎物以研究它们之间的相互作用。Snow1优先能够与Ice1的C端部分相互作用。Snow1与Ice1的相互作用是特异的，因为单独的猎物质粒和AtMyb79猎物质粒都不能与Ice1相互作用。Ice1的C端部分还可以通过敲除来收缩，并用作诱饵以精确描绘与Snow1相互作用。相应于Ice1上358-494位的氨基酸的区域可以特异性的与Snow1相互作用。除了酵母双杂交以外，本发明人还利用蛋白质拖拉实验来确认Snow1与Ice1的相互作用。GST-Snow1能够拖拉35S-标记的Ice1。同样的，S-标签的Ice1也能够拖拉35S标记的Snow1。它们的相互作用是特异的，因为GST-Myb79和S标记的ABI2都不能分别拖拉Ice1或者Snow1。这些结果说明Snow1与Ice1相互作用。

Snow1与CBF3启动子的MYB识别位点结合

进行凝胶滞留实验(EMSA)确定Snow1与CBF启动子的结合。CBF启动子的不同区域进行PCR扩增并用于凝胶滞留实验。在CBF1启动子中，预测的Myb识别序列的分布如下：-1000/-750区域中为0，在-750/-500，-500/-300和-150/+1区域中分别有一个，在-300/-150区域中有两个。类似的，在CBF2启动子序列中，在-1000/-750区域也没有预测的Myb识别序列，在-500/-270和-270/-20区域各有一个。CBF3启动子的四个不同区域还被应用在与MBP-Snow1融合蛋白质的凝胶滞留实验中。除了第三个片断没有该序列外，其他所有的片断都有两个MYB识别序列。

在CBF1启动子的相应于-750/-500和-500/-300区域的片断中发现一个主要复合体，而CBF1启动子的其他区域则没有和Snow1结合。使用CBF2启动子片断时，观察到与相应于-1000/-750和-500/-270区域的片断的结合。而在CBF2的-270/-20区域则没有结合发生。Snow1与CBF3启动子的四个片断都可以结合。这些复合体可以通过添加更高量的与相同序列结合的冷竞争者来消除。这些结果说明Snow1可以和CBF启动子结合，并有可能是通过Myb序列介导的。

Snow1调节CBF3的表达

可以通过瞬时转化来确定Snow1是否能够激活CBF3的表达。在CaMV35S启动子控制下，克隆全长Snow1cDNA，构建效应子质粒。当CaMV35-Snow1和CBF3-响应报告基因CBF3-LUC被用基因枪转入拟南芥叶子中的时候，相对于带有或不带有只含有CBF3-luc的报告质粒的对照，荧光素酶的活性增高了将近6倍(图4A)。活性的提高要比使用CaMV35-Ice1作为效应子要大。当CaMV35-Snow1与CaMV35-Ice1被共同攻击的时候，相对于单独使用CaMV35-Snow1作为效应子，被荧光素酶的活性驱动的CBF3只有很小的变化。这些结果说明Snow1能够增强CBF3的表达。

Snow1的亚细胞定位

为了检测Snow1蛋白质的亚细胞定位，全长的Snow1 cDNA与绿色荧光蛋白质(GFP)编码序列的C端的序列进行框架融合。使用CaMV 35S启动子驱动的GFP-Snow1融合用来获得转基因植物。T1代转基因植物中GFP荧光的共轭聚焦图像表明在细胞核中中存在GFP-Snow1(图4B)，从而确认Snow1在没有压力的情况下是细胞核定位的。

转基因分析

将Snow1过表达构建导入GV3101的农杆菌中。含有Snow1过表达载体的农杆菌可以用作野生型(CBF3-LUC)植物的花浸渍(flower-dipping)转化。Snow1过表达株(T1)可以通过它对basta的抗性来筛选。用T2代的种子，分析了T2代秧苗中Snow1过表达株的CBF3-LUC荧光强度。野生型没有冷处理的情况下，Snow1过表达株中检测不到荧光。然而，冷处理后Snow1过表达株比野生型表现出较高的CBF3-LUC表达。应该注意的是本发明人利用了T2代Snow1过表达株(分离群体)，在T2代秧苗株中与野生型的密度相比具有较强荧光的荧光强度。在冷处理过程中，Snow1过表达株比野生型表现出较高的荧光强度。有趣的是，一种Snow1过表达株在所测试的时间里一直表现出较低的荧光发光密度，这说明可能Snow1也会有共抑制的作用。

根据上述指导，可以对本发明进行许多种修改和变化。因此，可以理解在随附的权利要求的范围中，除了在此特别限定的之外，也可以实现本发明。

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序列表

<110>ZHU，JIAN-KANG

AGARWAL，MANU

KAPOOR，AVNISH

<120>SNOW1：与ICE1结合并调节CBF表达和拟南芥的耐冻性

<130>258821US20

<150>US 60/508,316

<151>2003-10-06

<160>23

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>822

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>1

atgggaagag ctccatgctg tgagaagatg gggttgaaga gaggaccatg gacacctgaa 60

gaagatcaaa tcttggtctc ttttatcctc aaccatggac atagtaactg gcgagccctc 120

cctaagcaag ctggtctttt gagatgtgga aaaagctgta gacttaggtg gatgaactat 180

ttaaagcctg atattaaacg tggcaatttc accaaagaag aggaagatgc tatcatcagc 240

ttacaccaaa tacttggcaa tagatggtca gcgattgcag caaaactgcc tggaagaacc 300

gataacgaga tcaagaacgt atggcacact cacttgaaga agagactcga agattatcaa 360

ccagctaaac ctaagaccag caacaaaaag aagggtacta aaccaaaatc tgaatccgta 420

ataacgagct cgaacagtac tagaagcgaa tcggagctag cagattcatc aaacccttct 480

ggagaaagct tattttcgac atcgccttcg acaagtgagg tttcttcgat gacactcata 540

agccacgacg gctatagcaa cgagattaat atggataaca aaccgggaga tatcagtact 600

atcgatcaag aatgtgtttc tttcgaaact tttggtgcgg atatcgatga aagcttctgg 660

aaagagacac tgtatagcca agatgaacac aactacgtat cgaatgacct agaagtcgct 720

ggtttagttg agatacaaca agagtttcaa aacttgggct ccgctaataa tgagatgatt 780

tttgacagtg agatggaact tctggttcga tgtattggct ag 822

<210>2

<211>276

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的多肽

<400>2

Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Arg Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Ile Leu Val Ser Phe Ile Leu Asn His

20 25 30

Gly His Ser Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Lys Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Lys Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Ser

65 70 75 80

Leu His Gln Ile Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Lys Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Leu Glu Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Pro Lys Thr Ser Asn

115 120 125

Lys Lys Lys Gly Thr Lys Pro Lys Ser Glu Ser Val Ile Thr Ser Ser

130 135 140

Asn Ser Thr Arg Ser Glu Ser Glu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Pro Ser

145 150 155 160

Gly Glu Ser Leu Phe Ser Thr Ser Pro Ser Thr Ser Glu Val Ser Ser

165 170 175

Met Thr Leu Ile Ser His Asp Gly Tyr Ser Asn Glu Ile Asn Met Asp

180 185 190

Asn Lys Pro Gly Asp Ile Ser Thr Ile Asp Gln Glu Cys Val Ser Phe

195 200 205

Glu Thr Phe Gly Ala Asp Ile Asp Glu Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu

210 215 220

Tyr Ser Gln Asp Glu His Asn Tyr Val Ser Asn Asp Leu Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Leu Val Glu Ile Gln Gln Glu Phe Gln Asn Leu Gly Ser Ala Asn

245 250 255

Asn Glu Met Ile Phe Asp Ser Glu Met Glu Leu Leu Val Arg Cys Ile

260 265 270

Gly Ile Cys Glu

275

<210>3

<211>2021

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>3

atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct 60

ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaatt catgaaatcct cgtgattcta 120

ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt 180

tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac 240

tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg 300

ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa 360

gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct 420

atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta 480

cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt 540

cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt 600

gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat 660

gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt 720

cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac 780

agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc 840

aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt 900

ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag 960

gtgttagcat cgtctggtgc acagcctact ctgttccaga aacgtgcagc tatgcgtcag 1020

agctctggaa gcaaaatggg aaattcggag agttcgggaa tgaggaggtt tagtgatgat 1080

ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata 1140

aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag 1200

aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat 1260

aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata 1320

cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat 1380

gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg 1440

acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta 1500

ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg 1560

aacattcata tgttctgtgg tcgtagaccg ggtctgttgc tcgctaccat gaaagctttg 1620

gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg 1680

gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa 1740

gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag 1800

tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt 1860

tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa 1920

tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa 1980

cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtc t 2021

<210>4

<211>494

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的多肽

<400>4

Met Gly Leu Asp Gly Asn Asn Gly Gly Gly Val Trp Leu Asn Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Glu Arg Glu Glu Asn Glu Glu Gly Ser Trp Gly Arg Asn Gln

20 25 30

Glu Asp Gly Ser Ser Gln Phe Lys Pro Met Leu Glu Gly Asp Trp Phe

35 40 45

Ser Ser Asn Gln Pro His Pro Gln Asp Leu Gln Met Leu Gln Asn Gln

50 55 60

Pro Asp Phe Arg Tyr Phe Gly Gly Phe Pro Phe Asn Pro Asn Asp Asn

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln His Ser Ile Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Pro Ser

85 90 95

Gln Ala Phe Ser Leu Asp Pro Ser Gln Gln Asn Gln Phe Leu Ser Thr

100 105 110

Asn Asn Asn Lys Gly Cys Leu Leu Asn Val Pro Ser Ser Ala Asn Pro

115 120 125

Phe Asp Asn Ala Phe Glu Phe Gly Ser Glu Ser Gly Phe Leu Asn Gln

130 135 140

Ile His Ala Pro Ile Ser Met Gly Phe Gly Ser Leu Thr Gln Leu Gly

145 150 155 160

Asn Arg Asp Leu Ser Ser Val Pro Asp Phe Leu Ser Ala Arg Ser Leu

165 170 175

Leu Ala Pro Glu Ser Asn Asn Asn Asn Thr Met Leu Cys Gly Gly Phe

180 185 190

Thr Ala Pro Leu Glu Leu Glu Gly Phe Gly Ser Pro Ala Asn Gly Gly

195 200 205

Phe Val Gly Asn Arg Ala Lys Val Leu Lys Pro Leu Glu Val Leu Ala

210 215 220

Ser Ser Gly Ala Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Met Arg

225 230 235 240

Gln Ser Ser Gly Ser Lys Met Gly Asn Ser Glu Ser Ser Gly Met Arg

245 250 255

Arg Phe Ser Asp Asp Gly Asp Met Asp Glu Thr Gly Ile Glu Val Ser

260 265 270

Gly Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Glu Ile Asn Glu Ser Gly Lys Ala Ala

275 280 285

Glu Ser Val Gln Ile Gly Gly Gly Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Met

290 295 300

Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn

305 310 315 320

Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met

325 330 335

Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp Tyr Leu Lys Glu Leu

340 345 350

Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ser Thr Pro Pro

355 360 365

Gly Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr

370 375 380

Pro Gln Thr Leu Ser Cys Arg Val Lys Glu Glu Leu Cys Pro Ser Ser

385 390 395 400

Leu Pro Ser Pro Lys Gly Gln Gln Ala Arg Val Glu Val Arg Leu Arg

405 410 415

Glu Gly Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Gly Arg Arg Pro Gly

420 425 430

Leu Leu Leu Ala Thr Met Lys Ala Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp Val

435 440 445

Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Leu Asp Val Phe

450 455 460

Arg Ala Glu Gln Cys Gln Glu Gly Gln Glu Ile Leu Pro Asp Gln Ile

465 470 475 480

Lys Ala Val Leu Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gly Met Ile

485 490

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>5

gatgggaaga gctccatgct g 21

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>6

ccgctcgagc tagccaatac atcgaaccag 30

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>7

tgagactggg attgaggttt ctg 23

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>8

caagcttgcc tgcaggtcga c 21

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>9

cgggatccat gggaagagct ccatgctgtg 30

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>10

cgggatccga atggtggaag aagtttggag aaa 33

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>11

ccgctcgagt taacaaaatg gaatcaccaa gtt 33

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>12

ggatccttaa cagccac 17

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>13

ggtaacggtt accctac 17

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>14

ggtaattcaa ccgtaaa 17

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>15

ggccttctag ttaaatt 17

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>16

ggaattacaa ctgcatg 17

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>17

ggataattaa ctacttt 17

<210>18

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>18

cccaagctta taccatatca aatctgagaa ag 32

<210>19

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>19

cgcggatcca tttgtgattg ctgataaaag aag 33

<210>20

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>20

ccggaattca tgggaagagc tccatgctgt gag 33

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>21

cgcggatccc tagccaatac atcgaaccag aag 33

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>22

gctctagaat gggaagagct ccatgctgtg a 31

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>23

ggggtaccct agccaataca tcgaaccaga 30

Claims

1.一种分离的多聚核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的分离的多聚核苷酸，其中所述的蛋白质具有Snow1转录激活因子活性。

3.一种分离的多聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的多聚核苷酸。

4.一种分离的多聚核苷酸，其与权利要求3所述的多聚核苷酸互补。

5.一种分离的多聚核苷酸，其与权利要求3所述的多聚核苷酸至少70％相同。

6.一种分离的多聚核苷酸，其与权利要求3所述的多聚核苷酸至少80％相同。

7.一种分离的多聚核苷酸，其与权利要求3所述的多聚核苷酸至少90％相同。

8.一种分离的多聚核苷酸，其与权利要求3所述的多聚核苷酸在严格条件下杂交；其中所述严格条件包括在5X SSC中50～68℃温度下清洗。

9.权利要求3所述的分离的多聚核苷酸，其编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质。

10.一种包含权利要求1所述的分离的多聚核苷酸的载体。

11.一种包含权利要求3所述的分离的多聚核苷酸的载体。

12.一种包含权利要求1所述的分离的多聚核苷酸的寄主细胞。

13.一种包含权利要求3所述的分离的多聚核苷酸的寄主细胞。

14.一种包含权利要求1所述的分离的多聚核苷酸的植物细胞。

15.一种包含权利要求3所述的分离的多聚核苷酸的植物细胞。

16.一种包含权利要求1所述的分离的多聚核苷酸的转基因植物。

17.一种包含权利要求3所述的分离的多聚核苷酸的转基因植物。

18.权利要求16所述的转基因植物，其中所述的植物为拟南芥。

19.权利要求17所述的转基因植物，其中所述的植物为拟南芥。

20.权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物选自小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆植物。

21.权利要求16所述的转基因植物，其中分离的多聚核苷酸连接于可诱导启动子。

22.权利要求17所述的转基因植物，其中分离的多聚核苷酸连接于可诱导启动子。

23.一种筛选编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求1所述的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸杂交；表达多聚核苷酸得到蛋白质；检测所述的蛋白质中是否具有Snow1转录激活因子活性。

24.一种筛选编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求3所述的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸杂交；表达多聚核苷酸得到蛋白质；检测所述的蛋白质中是否具有Snow1转录激活因子活性。

25.一种筛选编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求8所述的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸杂交；表达多聚核苷酸得到蛋白质；检测所述的蛋白质中是否具有Snow1转录激活因子活性。

26.一种检测与权利要求1所述核苷酸至少70％同源的核酸的方法，包括将核酸样品与包含权利要求1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸的探针或者引物进行接触。

27.一种制备与权利要求1所述核苷酸至少70％同源的核酸的方法，包括将核酸样品与包含权利要求1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸的引物进行接触。

28.一种检测权利要求3所述核苷酸的方法，包括将核酸样品与包含权利要求3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸的探针或者引物进行接触。

29.一种制备权利要求3中所述核苷酸方法，包括将核酸样品与包含权利要求3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或者其互补序列的至少15个连续核苷酸的引物进行接触。

30.一种获得Snow1蛋白质的方法，包括在适合Snow1表达的条件下培养权利要求12的寄主细胞一段时间，并收集Snow1蛋白质。

31.一种获得Snow1蛋白质的方法，包括在适合Snow1表达的条件下培养权利要求13的寄主细胞一段时间，并收集Snow1蛋白质。

32.一种获得转基因植物的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸导入植物中。

33.一种获得转基因植物的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸导入植物中。

34.一种提高植物所需要的适冷性的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸导入所述的植物中。

35.一种提高植物所需要的适冷性的方法，包括将权利要求3的多聚核苷酸导入所述的植物中。

36.一种提高植物所需要的适冷性的方法，包括在所述植物中增强Snow1基因的表达。

37.一种分离的多肽，其含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

38.权利要求37所述的分离的多肽，其具有Snow1转录激活因子活性。

39.一种分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少70％相同并具有Snow1转录激活因子的活性。

40.一种分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少80％相同并具有Snow1转录激活因子的活性。

41.一种分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少90％相同并具有Snow1转录激活因子的活性。

42.一种分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少95％相同并具有Snow1转录激活因子的活性。

43.一种提高植物适冷性的方法，包括在植物中过表达Snow1转录激活因子。

44.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列。

45.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有SEQ IDNO：1序列的核酸编码。

46.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与Snow1至少70％相同的序列的核酸编码。

47.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与Snow1至少90％相同的序列的核酸编码。

48.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子由与Snow1核酸互补序列在严格条件下进行杂交的核酸编码，其中所述严格条件包括在5XSSC中50～68℃温度下清洗。

49.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与Snow1具有至少80％的同源性。

50.权利要求43所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与Snow1具有至少90％的同源性。

51.权利要求43所述的方法，其中植物为拟南芥。

52.权利要求43所述的方法，其中植物选自小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆。

53.权利要求43所述的方法，其中植物具有一种或者更多附加的转录因子的增强表达，转录因子选自CBF转录因子和DREB1转录因子。

54.权利要求43所述的方法，其中植物具有一种或者更多冷应答基因的增强表达。

55.权利要求54所述的方法，其中冷应答基因编码一种蛋白质，该蛋白质选自一种糖类的呼吸作用中的酶，一种糖类代谢中的酶，一种脂类呼吸作用中的酶，一种脂类代谢中的酶，一种类苯丙醇呼吸作用中的酶，一种类苯丙醇代谢中的酶，一种抗氧化剂呼吸作用中的酶，一种抗氧化剂代谢中的酶，一种分子伴侣，一种抗冻蛋白质，和一种对冷冻引起的脱水作用有抗性的蛋白质。

56.权利要求43所述的方法，其中植物被编码Snow1转录激活因子的载体所转化。

57.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列。

58.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有SEQ IDNO：1序列的核酸编码。

59.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与SEQ IDNO：1至少70％相同的序列的核酸编码。

60.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与SEQ IDNO：1至少90％相同的序列的核酸编码。

61.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子由一种与SEQ IDNO：1互补序列在严格条件下进行杂交的核酸编码，其中所述严格条件包括在5X SSC中50～68℃温度下清洗。

62.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性。

63.权利要求56所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同源性。

64.权利要求56所述的方法，其中植物为拟南芥。

65.权利要求56所述的方法，其中植物选自小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆。

66.权利要求56所述的方法，其中植物具有一种或更多附加转录因子的增强表达，该附加转录因子选自CBF转录因子和DREB1转录因子。

67.权利要求56所述的方法，其中植物具有一种或更多冷应答基因的增强表达。

68.权利要求67所述的方法，其中所述冷应答基因编码一种蛋白质，该蛋白质选自一种糖类的呼吸作用中的酶，一种糖类代谢中的酶，一种脂类呼吸作用中的酶，一种脂类代谢中的酶，一种类苯丙醇呼吸作用中的酶，一种类苯丙醇代谢中的酶，一种抗氧化剂呼吸作用中的酶，一种抗氧化剂代谢中的酶，一种分子伴侣，一种抗冻蛋白质，和一种对冷冻引起的脱水作用有抗性的蛋白质。

69.一种在植物细胞中提高一种或更多冷应答基因表达的方法，包括用编码Snow1转录激活因子的载体转化植物。

70.权利要求69所述的方法，其中植物具有增强的适冷性。

71.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列。

72.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有SEQ IDNO：2序列的核酸编码。

73.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与SEQ IDNO：1至少70％相同的序列的核酸编码。

74.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子由具有与SEQ IDNO：1至少90％相同的序列的核酸编码。

75.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子由一种与SEQ IDNO：1互补序列在严格条件下进行杂交的核酸编码，其中所述严格条件包括在5X SSC中50～68℃温度下清洗。

76.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少80％的同源性。

77.权利要求69所述的方法，其中Snow1转录激活因子的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同源性

78.权利要求69所述的方法，其中植物细胞为拟南芥。

79.权利要求69所述的方法，其中植物细胞选自小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆。

80.一种表达盒，其包括一种启动子，其作用于在植物细胞中连接到编码SEQ ID NO：1的Snow1蛋白质的分离的核酸上，其中植物细胞中蛋白质的增强表达表明所述植物细胞的适冷性增强。

81.权利要求80所述的表达盒，其中启动子选自一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子蛋白球蛋白启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子，和一种膨胀诱导启动子。

82.一种携带共表达(a)和(b)的载体的寄主细胞，其中(a)是与SEQID NO：1具有至少70％同源性并编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸，(b)是与SEQ ID NO：3具有至少70％同源性并编码具有Ice1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸。

83.权利要求82所述的寄主细胞，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

84.权利要求82所述的寄主细胞，其中(a)是SEQ ID NO：1的多聚核苷酸。

85.权利要求82所述的寄主细胞，其中(b)是与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

86.权利要求82所述的寄主细胞，其中(b)是SEQ ID NO：3的多聚核苷酸。

87.权利要求82所述的寄主细胞，其中所述的载体包括所述的连接于可诱导启动子的多聚核苷酸。

88.权利要求87所述的寄主细胞，其中启动子选自一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子球蛋白蛋白质启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子，和一种膨胀诱导启动子。

89.权利要求87所述的寄主细胞，其中(a)和(b)是可选择诱导的。

90.一种携带共表达(a)和(b)的载体的植物细胞，其中(a)是与SEQID NO：1具有至少70％同源性并编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸，(b)是与SEQ ID NO：3具有70％同源性并编码具有Ice1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸。

91.权利要求90所述的植物细胞，其中植物是拟南芥。

92.权利要求90所述的植物细胞，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

93.权利要求90所述的植物细胞，其中(a)是SEQ ID NO：1的多聚核苷酸。

94.权利要求90所述的植物细胞，其中(b)是与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

95.权利要求90所述的植物细胞，其中(b)是SEQ ID NO：3的多聚核苷酸。

96.权利要求90所述的植物细胞，其中所述的载体包括所述的连接于可诱导启动子的多聚核苷酸。

97.权利要求96所述的植物细胞，其中启动子选自一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子球蛋白蛋白质启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子，和一种膨胀诱导启动子。

98.权利要求96所述的植物细胞，其中(a)和(b)是可选择诱导的。

99.一种携带共表达(a)和(b)的载体的转基因植物，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性并编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸，(b)是与SEQ ID NO：3具有70％同源性并编码具有Ice1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸。

100.权利要求99所述的转基因植物，其中所述植物选自小麦，玉米，花生，棉花，燕麦和大豆植物。

101.权利要求99所述的转基因植物，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

102.权利要求99所述的转基因植物，其中(a)是SEQ ID NO：1的多聚核苷酸。

103.权利要求99所述的转基因植物，其中(b)是与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

104.权利要求99所述的转基因植物，其中(b)是SEQ ID NO：3的多聚核苷酸。

105.权利要求99所述的转基因植物，其中所述的载体包括所述的连接于可诱导启动子的多聚核苷酸。

106.权利要求105所述的转基因植物，其中启动子选自一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子球蛋白蛋白质启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子和一种膨胀诱导启动子。

107.权利要求105所述的转基因植物，其中(a)和(b)是可选择诱导的。

108.一种提高植物所需要的适冷性的方法，包括将至少一种可以共表达(a)和(b)的载体导入所述植物，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性并编码具有Snow1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸，(b)是与SEQ ID NO：3具有至少70％同源性并编码具有Ice1转录激活因子活性的蛋白质的多聚核苷酸，其中所述植物中存在这两种多聚核苷酸。

109.权利要求108所述的方法，其中所述植物为拟南芥。

110.权利要求108所述的转基因植物，其中(a)是与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

111.权利要求108所述的转基因植物，其中(a)是SEQ ID NO：1的多聚核苷酸。

112.权利要求108所述的转基因植物，其中(b)是与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。

113.权利要求108所述的转基因植物，其中(b)是SEQ ID NO：3的多聚核苷酸。

114.权利要求108所述的方法，其中所述的载体包含所述的连接于可诱导启动子的多聚核苷酸。

115.权利要求114所述的方法，其中启动子选自一种病毒包被蛋白质启动子，一种组织特异性启动子，一种单子叶植物启动子，一种泛素启动子，一种压力诱导启动子，一种CaMV 35S启动子，一种CaMV 19S启动子，一种肌动蛋白启动子，一种cab启动子，一种蔗糖合成酶启动子，一种微管蛋白启动子，一种napin R基因复合体启动子，一种番茄E8启动子，一种patatin启动子，一种甘露碱合成酶启动子，一种大豆种子球蛋白蛋白质启动子，一种大豆植物储存蛋白质启动子，一种细菌噬菌体SP6启动子，一种细菌噬菌体T3启动子，一种细菌噬菌体T7启动子，一种Ptac启动子，一种根部细胞启动子，一种ABA诱导启动子，和一种膨胀诱导启动子。

116.权利要求114所述的方法，其中(a)和(b)是可选择诱导的。