CN101372692B - 冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因序列及其克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了冰凌花中分离低温胁迫转录因子AaCBF基因序列及其克隆和应用，属于分子生物学领域。根据其它植物中发表的CBF氨基酸序列，设计引物，分离得到中间片段后，利用反向PCR方法，从冰凌花中分离出低温胁迫转录因子AaCBF基因全序列。将该基因构建高效表达载体，转化烟草，转基因植株具有较高的抗寒力。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的抗寒能力。

Description

冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因序列及其克隆和应用

(一)技术领域

本发明涉及冰凌花(Adonis amurensis)低温胁迫转录因子AaCBF基因的克隆、重组及抗寒性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

低温是典型的环境胁迫因素之一。一般认为低温胁迫使植物光合作用降低，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，植物处于饥饿状态，严重影响了植物正常生长发育甚至导致死亡。因此，研究并提高植物抗寒力具有重要理论和现实意义。目前，有关CBF(C-repeat Binding Factor)低温反应途径及其相关基因的分离和应用在植物抗寒分子生物学研究中倍受关注。CBF是低温信号传导中的一个转录因子，参与调控COR15a，COR6.6，COR47和COR78等低温/干旱应答基因的表达(Fowler & Thomashow，2002)，在这些基因的启动子上均有一个低温/干旱反应DNA调控元件CRT/DRE，序列为CCGAC，该转录因子就是通过与CRT/DRE元件相互作用，参与调控上述基因的表达。在正常生长条件下(20℃及充足的水分)，转录因子CBF基因和它调控的低温应答基因COR均不表达。然而，当把植物转移到低温情况下(4℃)，10分钟之后CBF基因首先表达，大约2小时后COR基因表达。另外，转基因拟南芥组成型超表达CBF1或CBF3，不仅使COR78 RD17，KIN1，COR6.6和COR15a基因在正常条件下能表达，在低温胁迫条件下，也使这些基因的表达都比野生型显著增强，植物对低温的耐性也随之大大增强；同时，转基因拟南芥的可溶性糖含量、脯氨酸含量显著高于未转基因对照植株，相反，叶片组织EL₅₀值显著低于对照植株(Fowler & Thomashow，2002)。上述研究结果表明CBF蛋白对于调控低温胁迫下抗寒基因的表达、提高植物抗寒性具有重要作用。

(三)发明内容

本发明的目的是提供冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因序列，并提供将该基因导入受体植物，获得具有抗寒能力的转基因植物。

技术方案

1.从冰凌花中分离出低温胁迫转录因子AaCBF基因的全长cDNA片段：

采用基因组DNA小量提取试剂盒提取冰凌花基因组DNA，电泳检测良好。根据已发表在Genebank中的植物CBF基因序列，应用primer5.0引物设计软件，设计一对兼并引物：

正向引物：5′-CC(GATC)CC(GATC)AT(TAC)AT(TAC)TT(TC)AA(TC)GC-3′

反向引物：5′-GT(GATC)AC(GATC)TT(AG)TGCCA(GATC)GT(AG)TA-3′

通过PCR扩增得到长度为434bp中间片段。然后设计两对特异引物。通过反向PCR扩增出752bp的全长AaCBF片段。包括起始密码子前的上游序列和终止密码子的下游序列。开放阅读框部分为621bp，由此推得具307个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表其它CBF基因同源性达到49.6％，表明经过上述克隆步骤得到了冰凌花低温胁迫转录因子CBF基因的类似基因。该基因序列及其编码的氨基酸序列如下：

序列表

2.构建含有上述完整基因片段的表达载体：

根据上述序列，设计构建表达载体的引物

正向引物：5′-gCCggATCCATGGATTATTCGCAGTACGG-3′

反向引物：5′-gCCgagCTCTGTCCTTGTGGAACGATTAA-3′

以基因组DNA为模板，利用构建高效表达载体。

3.将构建好的表达载体通过冻融法转入农杆菌EHA105。

4.转化烟草NC89，在含卡那霉素(100mg/L)和头孢(250mg/L)的MS固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗进行分化生根培养后，对其进行低温处理比较其抗寒性变化。实验结果表明，与野生型相比，含有本发明所得的冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因的转基因植株具较高的抗寒能力。

根据上述技术，从冰凌花中分离出的低温胁迫转录因子AaCBF基因，该基因过量表达能导致转基因烟草具较高的抗寒性。让该基因在其它作物中表达，将会提高作物的抗寒性；如果与特异启动子连接，对其表达进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益.

(四)附图说明

图1是野生型和转AaCBF基因植株的光合速率的测定结果柱状图；横坐标表示低温处理的时间，纵坐标表示光合速率值；W代表野生型，T代表转基因植株。

图2是野生型和转基因植株的叶绿素含量的测定结果柱状图；横坐标表示低温处理的时间，纵坐标表示叶绿素含量；W代表野生型，T代表转基因植株。

(五)具体实施方式

实施例1：冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因的克隆方法

1.基因组DNA的提取：采用基因组DNA小量提取试剂盒(百奥公司产品)提取冰凌花基因组DNA。

2.基因组DNA酶切、环化：取1微克基因组DNA，加入10×K反应缓冲液4μl，0.1％BSA4μl，用ddH₂O补足体系40μl，37℃保温过夜。65℃保温20分钟终止反应。用T_4 DNAligase连接环化。

3.反向PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：

第一轮PCR反应：

10×反应缓冲液(内含MgCl2)      2.5μl

10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)     1μl

F1引物(10μM)                  1μl

R1引物(10μM)                  1μl

模板DNA                        1μl

Taq DNA聚合酶                  0.1μl

总体积                         25μl

PCR反应条件为：94℃8分钟，然后进入下列循环：94℃40秒，56℃50秒，72℃70秒，共35个循环，最后72℃延伸8分钟。

第二轮PCR反应：(模板为第一轮PCR产物稀释20倍)

10×反应缓冲液(内含MgCl2)      2.5μl

10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)     1μl

F2引物(10μM)                  1μl

R2引物(10μM)                  1μl

模板DNA                      1μl

Taq DNA聚合酶                0.1μl

总体积                       25μl

PCR反应条件为：94℃8分钟，然后进入下列循环：94℃40秒，54℃50秒，72℃70秒，共35个循环，最后72℃延伸8分钟。

4.基因克隆：用凝胶回收试剂盒回收后的PCR3μl与PMD18-T载体进行连接，操作步骤说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

5.质粒DNA的提取：碱法提取DNA。

6.序列测定：本工作在大连宝生物工程技术服务有限公司进行。

7.同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。

实施例2：冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因序列测定，本工作在大连宝生物工程技术服务有限公司进行。

冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因及其编码的氨基酸序列如下：

实施例3：表达载体的构建

1.根据分离出的冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因的核苷酸序列，设计构建表达载体的引物：

正向引物：5′-gCCggATCCATGGATTATTCGCAGTACGG-3′

反向引物：5′-gCCgagCTCTGTCCTTGTGGAACGATTAA-3′

以基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应。

2.BamHI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。构建高效表达载体。

3.将构建好的表达载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。

实施例4：转化烟草，进行抗寒性分析

1.种植烟草NC89

2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。

3.3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10X MS培养基悬浮。

4.将烟草叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。

5.侵染后的叶片切块置于分化培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，)上共培养2天，然后转入选择培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，2.4g/L琼脂粉，卡那霉素100毫克/升，头孢青霉素250毫克/升)筛选，得到抗性植株。

6.将抗性植株移入花盆，置于低温胁迫下进行抗寒性分析，实验结果表明，转AaCBF基因的烟草抗寒能力明显高于对照。

Claims (4)

1.一种冰凌花低温胁迫转录因子AaCBF基因，其特征在于它的核苷酸序列如下所示

CGCACTTTTGTCTTCTCTTCTCACTTCACACTCTCACTTCAATTCAACGAATCACAGTTT    60

CTGAAAATGGATTATTCGCAGTACGGTTATCCTTCTTCACCAATCTATTCTTCTTCATCA   120

TCATCACAAGGAGACGACACAGCAAGTCAAGCATCTCACAAGAGAAAATCCGGACGAAAG   180

AAGTTCACAGAGACGCGACACCCCATTTATAGAGGTGTTCGGCAGAGAAATGGCGCCAAA   240

TGGGTGTCTGAAATTCGTGATCGTAGCAAGAAAAACTCCAGTATATGGCTAGGCACATTC   300

CCAACGCCTGGAATGGCTGCTAGAGCCTACGATGTTGCAGCTTTGGCACTCAGAGGGAAG   360

TCTGCGCCGCTGAATTTTGTTGATTCTGCTTGGCTGCTGCCACGCCCCAAGTCATCCTCA   420

GCTCAGGATATCAAACTCGCTGCTTCTGAAGCTGCTCAAGCATTTGCACCTACTGCTACA   480

TCATCTTCGTCGTCGTCTTCCCCAATGAACCTCAGAGTTCCTGTGGAACCTTCTTCTATG   540

TTCTGGGATGAGGAGGCAATGTTCAATATGCCAAGTTTACTTGACAATATGGCAGAAGGG   600

ATGCTCCTTACGCCGCCAAGCATGCAGGAAAGGTTTAGCTGCGAAGATGTGGATTTCAAC   660

ATGGAGTTGTCCTTGTGGAACGATTAATGTCGTCGCATGGTGCTTTTGCCTTGTACAGAT   720

TTTTGTATTCAAGATGGAATAATTGAAATATA                               752。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码如下所述氨基酸序列的蛋白质

MDYSQYGYPSSPIYSSSSSSQGDDTASQASHKRKSGRKKFTETRHPIYRGVRQRNGAKWV    60

SEIRDRSKKNSSIWLGTFPTPGMAARAYDVAALALRGKSAPLNFVDSAWLLPRPKSSSAQ   120

DIKLAASEAAQAFAPTATSSSSSSSPMNLRVPVEPSSMFWDEEAMFNMPSLLDNMAEGML   180

LTPPSMQERFSCEDVDFNMELSLWND                                     206。

3.根据权利要求1所述的基因的应用，其特征是在于该基因在植物中表达，能有效地提高植物的耐寒性。

4.根据权利要求3所述的基因的应用，其特征是在于该基因在烟草中表达，能有效地提高烟草的耐寒性。

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