CN110438151B

CN110438151B - 一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体及其应用

Info

Publication number: CN110438151B
Application number: CN201910803596.1A
Authority: CN
Inventors: 杨广; 傅淑; 刘昭霞; 陈金芝; 孙庚晓; 尤民生
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110438151A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种可以在转基因植物中表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的双链RNA（dsRNA）结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株。本发明通过接虫试验，表明转基因植株可以导致小菜蛾PxAK基因的转录水平下调66.5%‑79.7%，从而降低了化蛹率，导致死亡率升高了17.5%，为小菜蛾的防治提供了一种新方法，也为害虫防治提供了新策略。

Description

一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种可以在转基因植物中表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK双链RNA（dsRNA）结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株，为小菜蛾的防治提供一种新的策略。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是十字花科蔬菜上的全球性重要害虫之一，据估计小菜蛾对我国的经济损失和防治费用每年高达7.7亿美元(Li et al., 2016)。目前，防治小菜蛾的手段依然是以化学农药为主，但大量使用农药不仅对其它生物甚至人类造成危害，而且对环境也会造成污染，更严重的是会对小菜蛾形成抗药性定向选择。已有报道表明小菜蛾对绝大部分农药已经产生了抗药性，并且是第一个被报道在田间对Bt蛋白毒素产生抗性的昆虫(Furlong et al., 2013)。因此，防治小菜蛾的新技术研发已是迫在眉睫。

RNA干扰（RNAi）指外源或内源的双链RNA（double strand RNA，dsRNA）引起生物体内与之互补配对的信使RNA（mRNA）的裂解或抑制其蛋白的表达，这一现象于1998年在线虫中首次报道(Fire et al., 1998)。RNAi技术作为一种基因调控的有效手段，目前已被广泛的应用于昆虫功能基因组学和害虫防治等的研究(胡少茹等, 2019)。在早期的RNAi研究中，一般是通过注射、混合食料饲喂等方式实现基因沉默的效果，但是这些方式在田间害虫防治中的应用比较困难，2007年首次出现了利用转基因植物表达害虫基因dsRNA来防治棉铃虫的报道，即植物介导昆虫RNAi防治害虫(Mao et al., 2007)。通过转基因植物表达害虫靶标基因dsRNA的方式为田间害虫治理提供了一种有效的解决思路。

精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是一种磷酸激酶，可以催化昆虫体内的ATP转化为ADP，从而释放生长发育所需的能量，是昆虫体内唯一提供能量的方式(Zhou et al.,2000)。有报道表明喂食黄曲条跳甲精氨酸激酶基因的dsRNA后，黄曲条跳甲出现了发育延迟、死亡率升高和繁殖力下降等症状(Zhao et al., 2008)，这说明了精氨酸激酶基因具有作为植物介导昆虫RNAi防治害虫的靶标基因的潜力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种可以在转基因植物中表达小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因dsRNA结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株，为小菜蛾的防治提供一种新的策略。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明选择了小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK（Genbank登入号：HQ327310.1，1068bp）中的一段384 bp长的保守序列为靶标，通过Gateway同源重组技术将该靶标片段以正反两个方向插入植物表达载体pHellsgate-4中构建可以表达其dsRNA结构的RNAi载体，命名为pHells-dsAK载体；通过农杆菌介导转化的方法，将该RNAi载体插入植株的基因组内，获得可以表达小菜蛾靶标基因PxAK的dsRNA结构的转基因植株。通过接虫喂养试验，分析取食该转基因植株的小菜蛾靶标基因PxAK的转录水平，虫体的化蛹率和死亡率等，评价转基因植株对小菜蛾的抗虫效果。

申请人提供了一种快速构建PxAK基因的植物表达RNAi载体，并提供了该载体在植物遗传转化中的应用，具体应用步骤如下所示：

（1）提取小菜蛾RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，分别以PxAKF / PxAKR为引物对，用高保真聚合酶扩增精氨酸激酶基因PxAK全长，并插入克隆载体pEASY-blunt中获得重组克隆载体pEASY-PxAK。在小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK内选择了一个长为384 bp的保守区域，并用PCR（Ploymerase Chain Reaction）方法对该片段序列进行了基因克隆，利用引物对attB₁-AKF/ attB₂-AKR在克隆序列的两端分别添加了序列attB₁和attB₂用于Gateway同源重组；利用Gateway同源重组技术将该靶标序列片段与植物表达载体pHellsgate-4反应，使靶标序列片段以正反两个方向分别插入载体中，其中两个序列片段之间包含一个PDK内含子序列，从而获得可以表达PxAK靶标序列片段dsRNA的植物表达RNAi载体，命名为pHells-dsAK载体。

PxAKF：5’- ATG GTG GAC GCT GCA ACT CTT G -3’；

PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’；

attB₁-AKF：5’- ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ctc a - GCC AAC GCTTGC CGC TTC TGG -3’；

attB₂-AKR：5’- ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gtc – GAT GTC GTACAC GCC GCC CTC -3’。

（2）采用冻融法将植物表达RNAi载体pHells-dsAK导入农杆菌GV3101感受态细胞内，再通过农杆菌浸染拟南芥花蕾的遗传转化方法导入拟南芥种子基因组内，获得转基因拟南芥种子；收集这些种子播种于含有50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中，种子发芽生长一周后，依然保持绿色状态的拟南芥被认为是转基因拟南芥。

（3）提取转基因拟南芥的基因组，以该基因组为模板，用特异性的引物进行PCR扩增小菜蛾的基因PxAK的靶标序列片段，对转基因植株进行PCR阳性分子鉴定，并且通过RT-PCR和RT-qPCR技术分析转基因植株转录表达基因PxAK靶标序列dsRNA的能力。

（4）转基因植株的接虫喂养试验：表达了小菜蛾基因PxAK靶标序列dsRNA转基因植株和正常野生型的植株长至第四周后进行试验，分别将小菜蛾初孵幼虫挑至这两种植株叶片上，罩上透明的塑料杯，并盖上具有滤网的盖子防止其逃逸，保持植株的生长。分析小菜蛾靶标基因PxAK被沉默水平，同时比较其化蛹率和死亡率，评估转基因植株抗小菜蛾的能力。

本发明的积极效果如下：本发明创造的表达小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因dsRNA的转基因植株抑制了小菜蛾靶标基因PxAK的66.5% - 79.7%转录表达水平，且减少了化蛹率，并提高了小菜蛾17.5%的死亡率，为小菜蛾的防治提供了新的策略。

附图说明

图1：含有小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列的植物表达RNAi载体pHells-dsAK的T-DNA区段图谱；图中LB和RB为T-DNA的左右边界；CaMV 35S为启动子，PDK intron为内含子，OCS terminator为终止子，NPTII为卡那霉素抗性基因。

图2：农杆菌介导的RNAi载体pHells-dsAK转化拟南芥；图2中A图为待转化的拟南芥；图2中B图为农杆菌转化的拟南芥的种子收集；图2中C图为正常拟南芥种子播种于不含卡那霉素抗生素的培养基中生长；图2中D图为正常拟南芥种子播种于含50 mg/L卡那霉素抗生素的培养基中生长；图2中E图为农杆菌转化后拟南芥的种子播种于含50 mg/L卡那霉素抗生素的培养基中生长，其中箭头指示的是具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥。

图3：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥PCR阳性检测示意图。图中1-15为转基因拟南芥，C为正常对照拟南芥，P为含有靶标基因序列的阳性质粒，18s rDNA为拟南芥内参基因。

图4：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥RT-PCR检测示意图。图中数字101、107、11、116、118、12、124、125、126、127、13、14、15、152和199均为不同转基因拟南芥株系，C为正常对照拟南芥，P为含有靶标基因序列的阳性质粒，18s rRNA为拟南芥内参基因。

图5：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥RT-qPCR检测示意图。图中数字101、107、11、118、12、124、125和127均为不同转基因拟南芥株系，PxAK基因相对表达量采用拟南芥Sand基因为内参。

图6：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥124株系喂饲小菜蛾的方法。

图7：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥124株系对小菜蛾的抗性评价。图7中的A图为转基因拟南芥124株系对小菜蛾化蛹率的影响；图7中的B图为转基因拟南芥124株系对小菜蛾死亡率的影响。图中WT为正常对照拟南芥。

图8：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA的转基因拟南芥124株系对小菜蛾PxAK基因mRNA表达水平的抑制。图8中的A图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾四龄幼虫PxAK基因的相对表达水平；图8中的B图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾一日蛹PxAK基因的相对表达水平。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在构建小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因的植物表达RNAi载体，创造能够表达PxAK基因dsRNA的转基因拟南芥，并对其抗小菜蛾能力进行评价的方法。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因CDS全长的扩增

提取单头4龄幼虫小菜蛾总RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1 μg RNA成第一链cDNA。分别以PxAKF / PxAKR为引物对（PxAKF：5’- ATG GTG GACGCT GCA ACT CTT G -3’； PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’），用高保真聚合酶扩增靶标基因PxAK（Genbank登入号：HQ327310.1，1068 bp）。反应体系为50μl：1 μl DNA聚合酶，1 μl cDNA，上下游引物各2 μl，1 μl dNTP，25 μl buffer缓冲液，ddH₂O补充至50 μl。PCR反应程序：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸90秒，35个循环；72℃延伸5分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒对正确大小的条带进行胶回收，并与平末端克隆载体pEASY-Blunt连接构建重组质粒pEASY-PxAK，将重组质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，再经氨苄抗生素筛选后，利用质粒提取试剂盒提取其质粒，送测序公司进行靶标基因的测序验证。

实施例2：小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列的植物表达RNAi载体构建

利用引物对attB₁-AKF / attB₂-AKR从质粒pEASY-PxAK中扩增基因PxAK相应的384bp的RNAi靶标区域（SEQ ID NO:1），并利用attB₁-AKF/ attB₂-AKR扩增靶标区域，在靶标区域两端添加attB₁和attB₂序列，即attB₁-AK-attB₂ （attB₁-AKF：5’- ggg gac aag ttt gtacaa aaa agc agg ctc a - GCC AAC GCT TGC CGC TTC TGG -3’； attB₂-AKR：5’- ggggac cac ttt gta caa gaa agc tgg gtc – GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’）。PCR反应体系为50 μl：1 μl DNA聚合酶，1 μl质粒模板，上下游引物各2 μl，1 μl dNTP，25 μlbuffer缓冲液，ddH₂O补充至50 μl。PCR反应程序：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。将PCR产物凝胶电泳检测，胶回收后即可用于Gateway BP同源重组反应。Gateway反应体系及程序为：胶回收产物50 ng，1 μl载体pHellsgate-4，TE缓冲液补至8 μl；2 μl BP Clonase聚合酶混合液；25℃反应1小时后，加入1 μl蛋白酶K后37℃孵育10分钟。获得可以表达dsRNA的植物表达载体pHells-dsAK后，将重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经壮观霉素筛选后，获得含有重组质粒的大肠杆菌，经大肠杆菌扩繁后，提取其质粒即为小菜蛾基因PxAK的植物表达RNAi载体pHells-dsAK（图1）。

实施例3：农杆菌介导的载体pHells-dsAK转化拟南芥

利用冻融法将构建好的重组质粒pHells-dsAK转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞，均匀涂布至含有终浓度25 mg/L利福平、50 mg/L庆大霉素和100 mg/L壮观霉素的LB固体培养基后，于28℃暗培养60小时，得到单克隆菌落，用无菌牙签接种单克隆菌落于4 mL的LB液体培养基内，在28℃ 180 rpm 振荡培养15小时进行扩繁培养，获得农杆菌菌液。同时将拟南芥种子播种于23℃、16小时光照2000 lux和8小时黑暗的光周期和湿度为60%-70%的环境下，待拟南芥长出花蕾后进行农杆菌的转染。即分别在100 mL LB液体培养基中加入0.1 mL的农杆菌菌液，28℃ 180 rpm 振荡培养15小时。将培养后的农杆菌于室温下5000rpm 离心10分钟，弃上清，用1/2 MS 液体培养基稀释至OD₆₀₀= 0.8，再加入0.02vol%表面活性剂Silwet-L77用于拟南芥花蕾的浸染。用准备好的农杆菌菌液浸染拟南芥的花蕾3 -5秒后，再用薄膜覆盖拟南芥保湿避光48小时，然后正常培育，收集浸染后的拟南芥种子。将收集到的种子于0.2 wt% NaClO浓度中灭菌10分钟，播种于含有终浓度50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中（4.43 g/L MS + 30 g/L蔗糖 + 8 g/L琼脂粉）生长，成功转化的拟南芥可以对卡那霉素形成抗性，保持绿色，而未转化苗则会出现白化死亡（图2）。因此，拟南芥生长一周后，依然保持绿色状态的正常拟南芥被认为是转基因T₁代拟南芥。

实施例4：转基因拟南芥表达小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因dsRNA的检测

（1）转基因拟南芥的PCR阳性检测

利用植物基因组提取试剂盒提取转基因T₁代拟南芥叶片基因组，以该基因组为模板分别扩增小菜蛾PxAK基因靶标序列片段，同时扩增拟南芥的基因18s rDNA作为对照基因。引物对分别为AKF / AKR和18sF / 18sR（AKF：5’- GCC AAC GCT TGC CGC TTC TGG -3’； AKR：5’- GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’；18sF：5’- CTA GTG GTA CAC AGA AGTCAT GG -3’； 18sR：5’- GTG GGG AAT CTT GGA CAA T -3’）。PCR反应体系为25 μl，含有转基因植株基因组50 ng，上下游引物各1 μM，Taq聚合酶混合物12.5 μl，添加相应的蒸馏水至25 μl。PCR反应程序为95℃ 3分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，进行35个循环；72℃ 10分钟。之后将PCR产物进行电泳检测扩增出的条带是否与靶标序列片段长度一致，一致则认为扩增到了相应的基因，获得了转基因植株（图3）。将获得的T₁代转基因拟南芥进行自交获得T₂代转基因拟南芥，T₂代再自交获得纯合体T₃代转基因拟南芥。

（2）转基因拟南芥的RT-PCR检测dsRNA的表达

利用植物RNA提取试剂盒提取转基因T₃代纯合体拟南芥叶片RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1 μg RNA成第一链cDNA。以该cDNA为模板分别扩增小菜蛾PxAK基因靶标序列相应片段和拟南芥的基因18s rRNA作为对照基因。RT-PCR反应引物、体系和程序与PCR阳性检测的一致，之后将PCR产物进行电泳检测扩增出的条带是否与靶标序列相应片段长度一致，一致则认为表达了其dsRNA（图4）。

（3）转基因拟南芥的RT-qPCR检测dsRNA的相对表达量

以cDNA为模板，AKqF / AKqR为引物，拟南芥自带基因Sand为参照基因（ATqF /ATqR为参照基因的引物），利用RT-qPCR的方法检测不同转基因植株的dsRNA相对表达量（AKqF：5’- TCC ACA ACG AGA ACA AGA C -3’；AKqR：5’- TTC AGG TCA CCA CCC ATC -3’；ATqF：5’- AAC TCT ATG CAG CAT TTG ATC CAC T -3’；ATqR：5’- TGA TTG CAT ATC TTTATC GCC ATC -3’）。RT-qPCR反应体系为20 μl：含cDNA模板2 μl，上下游引物各0.4 μl，qPCR Master Mix酶10 μl，添加无RNA酶蒸馏水至20 μl；RT-qPCR反应程序为95°C 3分钟；95°C 15秒, 56°C 15 秒，72°C 15秒，进行45个循环。分析比较不同转基因植株的dsRNA相对表达量，挑选相对表达量高的转基因植株进行下一步的接虫喂食试验（图5）。

实施例5：表达PxAK基因dsRNA的转基因拟南芥抗小菜蛾能力的检测

（1）转基因拟南芥对小菜蛾生长发育的影响

表达PxAK基因dsRNA的转基因拟南芥和正常拟南芥生长至第四周后进行接虫喂食试验，将小菜蛾初孵幼虫挑至拟南芥叶片上，用透明的塑料杯罩住，再用带滤网的盖子盖住塑料杯，防止小菜蛾逃逸，并保持拟南芥的正常生长外，这样还能方便观察小菜蛾的取食情况（图6）。试验分为5个重复，每个重复8头幼虫。小菜蛾羽化后，比较其化蛹率和最终死亡率。结果表明取食了转基因植株株系124的小菜蛾的化蛹率显著下降，并且死亡率达到了25.0%，显著的高于对照7.5%的死亡率（图7）。

（2）转基因拟南芥对小菜蛾PxAK基因mRNA的抑制水平

分别取喂食了转基因拟南芥株系124和正常对照拟南芥叶片的小菜蛾四龄幼虫和蛹，利用RT-qPCR技术分别检测其靶标基因PxAK的相对表达水平，评估转基因拟南芥对小菜蛾靶标基因mRNA表达水平的影响。提取单头小菜蛾总RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1 μg RNA成第一链cDNA。以AKqF / AKqR为引物对，小菜蛾基因RPS13和EF1a为双内参基因（RPS13F：5’- TCA GGC TTA TTC TCG TCG -3’；RPS13R：5’- GCT GTGCTG GAT TCG TAC -3’；EF1aF：5’- GCC TCC CTA CAG CGA ATC- 3’；EF1aR：5’- CCT TGAACC AGG GCA TCT -3’）。RT-qPCR反应体系为20 μl：含cDNA模板2 μl，上下游引物各0.4 μl，qPCR Master Mix酶10 μl，添加无RNA酶蒸馏水至20 μl；RT-qPCR反应程序为95°C 3分钟；95°C 15秒, 56°C 15秒，72°C 15秒，进行45个循环。结果表明小菜蛾幼虫和蛹的基因PxAK的表达水平被沉默了66.5%-79.7%（图8）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体及其应用

<130> 17

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccaacgctt gccgcttctg gccctctgga cgtggtatct tccacaacga gaacaagacc 60

ttcctggtgt ggtgcaacga ggaggaccac ctccgcctga tctccatgca gatgggtggt 120

gacctgaagg ccgtatacgc caggctggtg gccgccgtca acgacattga gaagcgcgtg 180

ccgttctcgc accacgaccg tctcggtttc ctgaccttct gccccaccaa cctgggcacc 240

accgtgcgcg cctccgtgca catcaagctg cccaagctgg ccgccgacaa gaccaagctg 300

gaggaggtgg cgtccaagta ccacctgcag gtgcgcggca cccgcggcga gcacacggag 360

gccgagggcg gcgtgtacga catc 384

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtggacg ctgcaactct tg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttacagggac ttctcgatct tgatgagc 28

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc agccaacgct tgccgcttct gg 52

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gatgtcgtac acgccgccct c 51

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccaacgctt gccgcttctg g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatgtcgtac acgccgccct c 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctagtggtac acagaagtca tgg 23

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtggggaatc ttggacaat 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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tccacaacga gaacaagac 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttcaggtcac cacccatc 18

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aactctatgc agcatttgat ccact 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgattgcata tctttatcgc catc 24

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcaggcttat tctcgtcg 18

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gctgtgctgg attcgtac 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcctccctac agcgaatc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccttgaacca gggcatct 18

Claims

1.一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体，其特征在于：选用小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的384 bp序列作为靶标序列，构建植物表达RNAi载体，所述的靶标序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

制备方法，具体包括以下步骤：

（1）提取小菜蛾RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，扩增精氨酸激酶基因PxAK全长，并插入克隆载体pEASY-blunt中获得重组克隆载体pEASY-PxAK；所述重组克隆载体pEASY-PxAK其插入序列PxAK的Genbank登入号为HQ327310.1；

（2）在小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK内选择了一个长为384 bp的保守区域，PCR扩增该序列，且在克隆序列两端添加用于Gateway同源重组的序列attB₁和attB₂；

（3）利用Gateway同源重组技术将该靶标序列片段与植物表达载体pHellsgate-4反应，使靶标序列片段以正反两个方向分别插入载体中，其中两个序列片段之间包含一个PDK内含子序列，由CaMV 35S启动子启动，T-OCS终止子终止表达，具有真核卡那霉素抗性和原核壮观霉素抗性；从而获得可以表达PxAK靶标序列片段dsRNA的植物表达RNAi载体，命名为pHells-dsAK载体；所述pHells-dsAK载体其结构如图1所示；

步骤（1）中采用的扩增引物对为PxAKF：5’- ATG GTG GAC GCT GCA ACT CTT G -3’；PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’；

步骤（2）中采用的扩增引物对为attB₁-AKF：5’- ggg gac aag ttt gta caa aaa agcagg ctc a - GCC AAC GCT TGC CGC TTC TGG -3’； attB₂-AKR：5’- ggg gac cac tttgta caa gaa agc tgg gtc – GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’。

2.一种如权利要求1所述的RNAi载体的应用，其特征在于，利用农杆菌转化法将pHells-dsAK载体转化拟南芥，获得可以表达PxAK靶标序列dsRNA，且对小菜蛾具有抗性的转基因拟南芥。