CN110452911B - 玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2及应用 - Google Patents

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Abstract

玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2及应用属分子生物学和生物技术领域，ZmABCE2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种耐冷玉米自交系ATP结合盒转运体蛋白E2，由ZmABCE2基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；一种植物表达载体，含有耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2；构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过干旱胁迫后观测转基因拟南芥的表型、根长、萌发率等生命状态，结果显示耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2可提高拟南芥的耐旱性。

Description

玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2及应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2及其在抗旱基因工程方面的应用。
背景技术
作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降。玉米已被证明是对环境最具适应性的作物之一。但玉米生长发育及产量依旧会受到多种非生物胁迫的影响。其中，干旱是影响玉米产量的主要非生物胁迫之一，当玉米遭受长时间干旱胁迫时，会导致玉米植株生长发育减缓、叶片失水萎蔫，甚至死亡，最终导致玉米产量下降。
ATP结合盒转运体蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC)存在于所有生物体中，是已知的最大蛋白家族之一。实际上，在原核生物中，ABC家族基因占基因组的1-3％。酵母和人类基因组分别编码30和48个ABC蛋白。相比之下，在拟南芥等植物中，已有100多个基因可以编码ABC蛋白。ABC蛋白数量的增加和功能多样化与植物的固着性以及适应不断变化的陆地环境是相一致的，也与植物进化过程中全基因组复制的历史相一致。
ABC蛋白结构通常分为跨膜结构域(TMDs)和核苷酸结合域(NBDs)。真核生物中，大部分ABC蛋白同时具有跨膜结构域TMD和核苷酸结合域NBD，构成完全蛋白，而在原核生物中其可被分为单肽。此外，ABC蛋白存在同源二聚体或异源二聚体，其中包含一个跨膜结构域TMD和一个核苷酸结合域NBD，或者仅由融合的核苷酸结合域NBD组成。ABC蛋白中的TMD属于一种特殊的转运体亚型，在远古物种中表现为相似的膜拓扑，每个TMD通常包含6-10个跨越细胞膜的α-螺旋，能生成一个可从细胞质或细胞外空间进入的孔隙。
目前已有文献表明ABC转运体对盐胁迫有一定的抗性。拟南芥核糖核酸酶L抑制因子家族(RLI/ABCE)是ABC转运蛋白家族中的一类可溶性蛋白，AtRLI2在RNA沉默过程中可作为一种内源抑制因子，抑制特定基因的表达，而这种调控作用发生于局部和系统水平，但还未见利用这些基因提高植物抗旱性的报道。
发明内容
本发明的目的在于：(1)提供了一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的编码ATP结合盒转运体蛋白E2基因，命名为ZmABCE2；(2)提供玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2在拟南芥抗旱基因工程方面的应用。
在下文中将详细描述本发明。
(一)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
提取课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816三叶期叶片的RNA，反转录成cDNA为模板，以ZmABCE2-FP/RP为特异引物，采用RT-PCR技术对ZmABCE2基因进行克隆。将扩增产物进行电泳检测，在1815bp左右处有扩增条带，与预期目的基因大小相一致。将扩增产物的凝胶回收片段连接到pMD18-T载体上，转化Top10大肠杆菌感受态，将阳性的单克隆菌液进行Sanger测序，获得耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2预期完整的开放阅读框(ORF)全序列。
耐冷玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2 ORF全长为1815bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，如SEQ ID NO:1所示。
(二)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2，由耐冷玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2所编码，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
耐冷玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2由604个氨基酸组成，此蛋白属于ABC(ATP-binding cassette transporters)中的可溶性转运蛋白家族，通过对玉米、水稻、拟南芥、黄灯笼辣椒、向日葵、褐家鼠、人等不同物种中的ABCE蛋白进行系统进化分析，发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmABCE2与OsABCE1(水稻)以及AtABCE2(拟南芥)的亲缘关系最近。
(三)本发明提供了一种植物表达载体，其含有耐冷玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2。
根据ZmABCE2基因的ORF序列及中间载体pCHF3300多克隆位点的相关信息，设计引物时加入相应酶切位点以扩增ZmABCE2基因。将经测序验证的、准确的ZmABCE2基因用相应的限制性内切酶酶切，回收小片段(基因)。同时将表达载体pCAMBIA3301以相同限制性内切酶酶切，回收大片段(载体)。用DNA连接酶将回收的大、小片段连接，重组为ZmABCE2基因的植物表达载体。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。
(四)本发明提供了耐冷玉米自交系W9816ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2在拟南芥抗旱基因工程方面的应用。
利用蘸花法将含有ZmABCE2基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经Basta筛选及分子鉴定，获得T3代拟南芥转基因植株。对纯合的T3代转基因拟南芥植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐旱性显著高于野生型。
本发明的有益效果在于：
提供了一种耐冷玉米自交系W9816的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过干旱胁迫处理后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果显示玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2可提高拟南芥的耐旱性。
附图说明
图1为玉米ZmABCE2与其他植物ABCE氨基酸的多重序列比较图。
其中：OsABCE1为水稻；AtABCE1为拟南芥。
图2为玉米ZmABCE2基因的系统进化树分析示意图。
其中：OsABCE1为水稻；AtABCE1为拟南芥；AtABCE2为拟南芥；Helianthus annuus
为向日葵；Artemisia annua为青蒿；Ostreococcus tauri为绿藻；Mus musculus为老鼠；Homo sapiens为人；Capsicum chinense为黄辣椒；Rattus norvegicus为褐家鼠。
图3至图4为300mM甘露醇处理条件下拟南芥萌发实验示意图。
其中：图3为300mM甘露醇处理条件下拟南芥萌发情况示意图。
图4为300mM甘露醇处理条件下拟南芥萌发率示意图。
图5至图6为300mM甘露醇处理条件下根长实验示意图。
其中：图5为300mM甘露醇处理条件下拟南芥主根生长情况示意图。
图6为300mM甘露醇处理条件下拟南芥主根根长统计意图。
图7至图9为20％PEG6000处理条采用件下拟南芥生理生化测定示意图
其中：图7为20％PEG6000处理条件下拟南芥中PRO含量示意图。
图8为20％PEG6000处理条件下拟南芥中POD含量示意图。
图9为20％PEG6000处理条件下拟南芥中CAT含量示意图。
具体实施方式
实施例一：玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2的克隆
1.RNA的提取
培养耐冷玉米自交系W9816至三叶期，使用康为世纪的超纯RNA提取试剂盒(CW0581)对叶片的Total RNA进行提取。
(1)取新鲜玉米叶片在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1ml TRIzonReagent，混匀。
(2)样品中加入TRIzon Reagent后温和上下颠倒几次，使样本充分裂解。室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。
(3)加入200μl氯仿，盖好离心管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。
(4)4℃12,000rpm离心10min，吸取上层水相550μl，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。
(5)在水相溶液中加入550μl的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。
(6)将上一步得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(9)重复步骤(8)。
(10)12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
(11)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μlRNase-Free Water，室温放置1min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，-80℃保存RNA，防止降解。
2.反转录
使用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)对提取的RNA进行反转录。
去gDNA反应体系如下表1：
表1.
试剂 体积
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free Water up to 10μl
将预混液混匀后放入42℃孵育2min，随后4℃，5min。
反转录反应SYBR Green qPCR法，具体反转录反应体系如下表2，
表2.
试剂 体积
步骤1反应液 10μl
rime Soript RT Enzyme MixⅠ 1μl
RT Primer Mix 1μl
5×Prime Soript Buffer 2 4μl
RNase Free Water 4μl
整个体系放入PCR仪中，程序设置37℃，15min；85℃，5s。
3.ZmABCE2基因ORF全长的扩增
根据NCBI公布的玉米ZmABCE2的ORF基因序列，运用生物信息学软件Primer 5.0遵循引物设计原则，设计该基因的特异性克隆引物，如下所示：
ZmABCE2-FP：5’-TCCCCCGGGATGGCAGAGCGTTTGACCC-3’
ZmABCE2-RP：5’-GCTCTAGATTAGTCATCGAGGTAGTAGTAGGA-3’
以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真耐热DNA聚合酶PrimeSTAR GXLDNApolymerase克隆ZmABCE2，反应体系和程序如表3。注：若cDNA浓度太低，可适当增加cDNA的用量。若第一次PCR的目的条带过浅，可用其回收产物继续进行同样步骤的PCR，PCR反应体系如表3：
表3.
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl
dNTP Mixture 4μl
ZmABCE2-FP 1μl
ZmABCE2-RP 1μl
cDNA 2μl
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μl
灭菌蒸馏水 31μl
PCR反应程序如表4：
表4.
Figure BDA0002087972100000061
4.ZmABCE2的DNA片段回收
使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmABCE2目的片段进行回收。
(1)电泳后切取含有ZmABCE2目的片段的胶块，称重，置于1.5ml离心管中。根据胶块的重量，每100mg左右的凝胶对应加入300μl Buffer B2。
(2)将离心管放入50℃金属浴10min，在此期间可数次颠倒离心管使融化的液体和未融化的胶块混匀，加速溶化。
(3)将所得溶液置于吸附柱中并以8000rpm离心30s。如果溶液的总体积大于750μl，每次加入750μl，多次重复操作。
(4)向吸附柱中加入300μl Buffer B2，转速设定为9000rpm，离心30s，然后倒出废液。
(5)向吸附柱中加入500μl Buffer B2，设置转速为9000rpm，离心时间30s。倒掉废液。再重复一次。
(6)把空的吸附柱和收集管一起放入离心机中，在9000rpm条件下离心60s。取一个新的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，晾置10min。
(7)在吸附膜中央加入30ul TE buffer或ddH2O，室温静置2min，在9000rpm条件下离心60s。将该步骤中所得到的DNA溶液放在-20℃的冰箱中保存或用于后续试验。
5.ZmABCE2连接pMD18-T Vector
使用TaKaRa的DNA A-Tailing Kit以及pMDTM18-T Vector Cloning Kit将目的片段与pMD18-T载体进行连接，获得重组载体用于基因测序。
(1)对ZmABCE2胶回收DNA片段的3’末端进行加“A”反应。
①在200μl离心管中配制如下连接反应体系如下表5：
表5.
组分 体积
10×A-Tailing Buffer 5μl
dNTP Mixture 4μl
A-Tailing Enzyme 0.5μl
ZmABCE2回收段 25μl
ddH<sub>2</sub>O 15.5μl
②72℃反应20min。
③冰中静置2min。
(2)对上述A-Tailing化的DNA片段与pMD18-T载体进行连接。pMD18-T连接反应体系如下表6：
表6.
组分 体积
pMD18-T Vector 1μl
A-Tailing ZmABCE2DNA 4μl
Solution I 5μl
反应程序：16℃反应1h。
6.Top10大肠杆菌感受态转化及PCR检测
(1)将50μl TOP10大肠杆菌感受态置于冰上融化。
(2)用移液枪吸取连接产物或重组质粒5μl，加到50μl的TOP10大肠杆菌感受态中。
(3)冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴5min。随后加入800μl LB液体培养基。
(4)37℃震荡培养1h，8000rpm离心5min。弃掉上清液，在离心管中留有大约50μl培养基。用移液枪吹打混匀后，将其涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温，倒置培养12-16h。
(5)挑取单菌落于800μl含有相应抗生素的LB液体培养基中，将离心管放入摇床，37℃180rpm，振荡培养10h左右。
(6)使用Ex Taq酶对菌液进行PCR分子检测。对PCR结果为阳性的菌液进行扩摇，并在菌液中加15％甘油，送华大基因公司进行测序，原菌液于-80冰箱保存。
实施例二：玉米基因的生物信息学分析
ZmABCE2基因编码一种玉米ATP结合盒转运体蛋白E2，其开放阅读框有1815bp的核苷酸，编码604个氨基酸，相对分子量为68262.83Da，等电点为7.79。
利用TMHMM Server v.2.0在线网站，对该蛋白的跨膜区域进行初步预测，结果发现在该蛋白中未出现跨膜结构域，初步推测ZmABCE2为非跨膜蛋白。
如图1和图2所示，根据基因结构域组成发现ABCE属于ABC(ATP-binding cassettetransporters)中的可溶性转运蛋白这一大类，通过对玉米、水稻、拟南芥、黄灯笼辣椒、向日葵、褐家鼠、人等不同物种中的ABCE蛋白进行系统进化分析，发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmABCE2与OsABCE1(水稻)以及AtABCE2(拟南芥)的亲缘关系最近。有研究表明AtABCE2基因参与了拟南芥的耐盐响应，但ABCE基因参与植物耐旱响应的研究还未见报到。
实施例三：ZmABCE2植物表达载体的构建
1.根据中间载体pCHF3300多克隆位点处相应序列，引物设计时加入相应酶切位点。
2.把经过高保真酶扩增出的基因，通过回收、加A、连接T载体、转化、PCR酶切鉴定、测序等一系列步骤，确定表达基因的正确性，有完整的开放阅读框、无错配、无移码。
3.把测序正确的基因利用其设计的酶切位点酶切，回收小片段(基因)。
选限制性核酸内切酶SmaⅠ和XbaⅠ，将测序正确的ZmABCE2从pMD18-T重组载体上切下，酶切体系如表7、表8所示。由于两个酶的酶切温度不同，因此先使用其中一种酶进行酶切，随后将酶切产物进行回收后，使用另一种酶进行酶切。SmaⅠ酶切体系如下表7：
表7.
Figure BDA0002087972100000081
30℃水浴1h。
XbaⅠ酶切体系如下表8：
表8.
Figure BDA0002087972100000091
37℃水浴1h。
4.把表达载体pCAMBIA3301以上述两种相同限制性内切酶切，回收大片段(载体)。
5.把回收的大片段与小片段连接，
6.转化大肠杆菌感受态、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。将从pMD18-T载体上酶切的ZmABCE2片段和pCAMBIA-3301载体片段于16℃连接3h。连接体系如表9所示。
表9.
组分 体积
目的片段 5.5μl
载体大片段 2.5μl
10×T4ligase buffer 1μl
T4DNA ligase 1μl
实施例四：转ZmABCE2基因拟南芥的获得及分子检测
利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：
1.将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中2min。
2.将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。
3.转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。
4.收获的部分T0代种子经Basta筛选，PCR鉴定，获得T1代转基因植株，经过两次加代，获得T3代拟南芥植株，可用于后续的表型筛选。
实施例五：T3代转ZmABCE2基因拟南芥的干旱胁迫处理与长势测定
分别随机播种拟南芥中ABCE基因的同源突变体、野生型与本发明的转基因拟南芥种子于同一含有300mM甘露醇的MS培养基上，4℃暗培养三天，再移入22℃光照条件下培养。观察萌发情况并统计萌发率，实验重复三次。
萌发情况如图3和4所示，转基因植株(R4、R5和R6)在干旱胁迫下，其萌发情况好于野生型(WT)和突变体(MUT)对照，并且萌发率显著高于野生型。
将突变体、野生型和转基因植株的拟南芥种子撒播于MS固体培养基上萌发，待长至4叶期时，分别移栽到含有300mM甘露醇的MS固体培养基上竖直培养，7d后观察根的生长状况并统计主根根长情况如图5和6所示，表明，转基因拟南芥植株(R4、R5和R6)的主根根长显著高于野生型(WT)和突变体(MUT)。说明过表达ZmABCE2能提高拟南芥的耐旱性。
实施例六：T3代转ZmABCE2基因拟南芥的生理生化分析
将培养至4周龄的拟南芥各株系用20％PEG6000处理24h，之后分别进行PRO含量、POD活力和CAT活力的测定。结果显示如图7所示。
实验结果表明，20％PEG 6000处理后，野生型、转基因植株和突变体的PRO的含量、POD和CAT的活力均有所上升，说明各株系均发生了胁迫响应。旱处理之后，转基因拟南芥R4的脯氨酸含量较对照而言显著提高，说明其耐旱性更强。转基因拟南芥植株R6的POD活力由102U/mg port提高至177U/m gport，显著高于正常生长状态的POD活力。
总之，与野生型相比，转基因拟南芥植株在旱处理之后PRO含量、POD活力和CAT活力显著提高，表明本发明的转基因拟南芥植株的耐旱性相对较高，过表达ZmABCE2基因可以提高拟南芥的耐旱性。
根据上述技术，本发明从玉米自交系W9816中得到一个ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2。通过农杆菌介导的转化方法，将ZmABCE2植物表达载体成功转化拟南芥，获得了纯合的T3代转基因拟南芥植株。结果显示，在干旱胁迫下，转基因拟南芥在种子萌发及苗期生长阶段对甘露醇不敏感转，显示出更高的萌发率及较强的根部生长能力。经干旱胁迫处理后，转基因拟南芥的PRO含量、POD活力和CAT活力较野生型对照均显著提高。上述结果均说明玉米自交系W9816 ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2能提高拟南芥的耐旱性。
SEQUENCE LISTING
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<120> 玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因
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<160> 2
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<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 1
atggcagagc gtttgacccg tatcgccatc gtcagcgagg acaagtgcaa gcccaagaag 60
tgccgccagg agtgcaagaa gagctgcccc gtcgtcaaga ctgggaagct ttgcattgaa 120
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tgtgtaaaga aatgtccatt tgatgccatt gaaatcatca accttccaaa agacttggaa 240
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aggcctggtc aggttttggg ccttgttgga acaaacggga ttggaaagtc gacagctctt 360
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caggaaattc ttacatactt tcgtgggtct gaacttcaga actacttcac acgcatattg 480
gaagataacc tgaaggcaat catcaaacct cagtatgttg accacattcc aaaagctgtt 540
caagggaatg taggacaagt acttgaacag aaggacgaga gggatatgaa atctgaactg 600
tgtgttgatc ttgaattaaa ccaagttatt gaccgaaatg taggagatct ttctggtggt 660
gagcttcaga gatttgcaat agcagttgtt gctgtgcaaa atgcggaaat ctatatgttc 720
gatgagccat caagctacct tgatgtgaag cagaggctaa aagctgcaca agtcgttagg 780
tccttgctta ggcctaacag ctatgtcatc gttgtggaac atgatttgag tgtcttggat 840
tacttgtccg acttcatttg ctgtttatat ggcaagccag gtgcttatgg tgtggttacc 900
ttgccattct cggtccgaga gggtatcaat attttcttgg ctggatttgt tccaacagaa 960
aatcttcggt tccgagatga atctcttaca tttaagattg cagagactca agaaaatgct 1020
gaggagattg agacgtatca gcggtataag taccctacta tgagcaaaac acagggaaat 1080
ttcaagctta ctgttgttga gggtgaattt actgattccc agattgttgt tatgcttggt 1140
gaaaacggga cagggaaaac tacattcatc agaatgctgg ctgggttgtt gaagccagac 1200
acggtggaag gaactgatat tgaaattcct gaattcaatg tgtcgtacaa gccccaaaag 1260
attagcccga aattccagaa taccgtgagg catttgctgc atcagaaaat tcgggattcc 1320
tatatgcatc cgcagtttgt gtctgatgtg atgaaaccac tgcaaattga acaactcatg 1380
gaccaagagg ttgttaattt atcaggtgga gagctccaaa gagttgctat atgcctctgc 1440
cttggaaagc ctgcagatat ctatctgatt gatgaaccaa gtgcttatct tgattcggag 1500
cagcgtattg ttgcctcaaa agttatcaag agattcattc ttcacgcgaa gaaaactgca 1560
tttattgttg agcatgattt catcatggca acatacttgg ctgacaaggt cattgtttat 1620
gaggggcgac cttctattga ctgtactgcc aacgcaccac agtctttagt atctgggatg 1680
aataaattct tatcgcatct cgacatcact tttagaagag acccaaccaa ctataggcca 1740
cgtataaaca agttggaatc gacaaaggac agggaacaga agtcagccgg gtcctactac 1800
tacctcgatg actaa 1815
<210> 2
<211> 604
<212> PRT
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 2
Met Ala Glu Arg Leu Thr Arg Ile Ala Ile Val Ser Glu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Lys Pro Lys Lys Cys Arg Gln Glu Cys Lys Lys Ser Cys Pro Val Val
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Leu Cys Ile Glu Val Thr Ser Ala Ser Lys Leu Ala
35 40 45
Phe Ile Ser Glu Glu Leu Cys Ile Gly Cys Gly Ile Cys Val Lys Lys
50 55 60
Cys Pro Phe Asp Ala Ile Glu Ile Ile Asn Leu Pro Lys Asp Leu Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Thr His Arg Tyr Gly Pro Asn Thr Phe Lys Leu His Arg
85 90 95
Leu Pro Val Pro Arg Pro Gly Gln Val Leu Gly Leu Val Gly Thr Asn
100 105 110
Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ala Leu Lys Val Leu Ala Gly Lys Leu Lys
115 120 125
Pro Asn Leu Gly Arg Phe Lys Asn Pro Pro Asp Trp Gln Glu Ile Leu
130 135 140
Thr Tyr Phe Arg Gly Ser Glu Leu Gln Asn Tyr Phe Thr Arg Ile Leu
145 150 155 160
Glu Asp Asn Leu Lys Ala Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Val Asp His Ile
165 170 175
Pro Lys Ala Val Gln Gly Asn Val Gly Gln Val Leu Glu Gln Lys Asp
180 185 190
Glu Arg Asp Met Lys Ser Glu Leu Cys Val Asp Leu Glu Leu Asn Gln
195 200 205
Val Ile Asp Arg Asn Val Gly Asp Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg
210 215 220
Phe Ala Ile Ala Val Val Ala Val Gln Asn Ala Glu Ile Tyr Met Phe
225 230 235 240
Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gln Arg Leu Lys Ala Ala
245 250 255
Gln Val Val Arg Ser Leu Leu Arg Pro Asn Ser Tyr Val Ile Val Val
260 265 270
Glu His Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Phe Ile Cys Cys
275 280 285
Leu Tyr Gly Lys Pro Gly Ala Tyr Gly Val Val Thr Leu Pro Phe Ser
290 295 300
Val Arg Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Ala Gly Phe Val Pro Thr Glu
305 310 315 320
Asn Leu Arg Phe Arg Asp Glu Ser Leu Thr Phe Lys Ile Ala Glu Thr
325 330 335
Gln Glu Asn Ala Glu Glu Ile Glu Thr Tyr Gln Arg Tyr Lys Tyr Pro
340 345 350
Thr Met Ser Lys Thr Gln Gly Asn Phe Lys Leu Thr Val Val Glu Gly
355 360 365
Glu Phe Thr Asp Ser Gln Ile Val Val Met Leu Gly Glu Asn Gly Thr
370 375 380
Gly Lys Thr Thr Phe Ile Arg Met Leu Ala Gly Leu Leu Lys Pro Asp
385 390 395 400
Thr Val Glu Gly Thr Asp Ile Glu Ile Pro Glu Phe Asn Val Ser Tyr
405 410 415
Lys Pro Gln Lys Ile Ser Pro Lys Phe Gln Asn Thr Val Arg His Leu
420 425 430
Leu His Gln Lys Ile Arg Asp Ser Tyr Met His Pro Gln Phe Val Ser
435 440 445
Asp Val Met Lys Pro Leu Gln Ile Glu Gln Leu Met Asp Gln Glu Val
450 455 460
Val Asn Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg Val Ala Ile Cys Leu Cys
465 470 475 480
Leu Gly Lys Pro Ala Asp Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Pro Ser Ala Tyr
485 490 495
Leu Asp Ser Glu Gln Arg Ile Val Ala Ser Lys Val Ile Lys Arg Phe
500 505 510
Ile Leu His Ala Lys Lys Thr Ala Phe Ile Val Glu His Asp Phe Ile
515 520 525
Met Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Lys Val Ile Val Tyr Glu Gly Arg Pro
530 535 540
Ser Ile Asp Cys Thr Ala Asn Ala Pro Gln Ser Leu Val Ser Gly Met
545 550 555 560
Asn Lys Phe Leu Ser His Leu Asp Ile Thr Phe Arg Arg Asp Pro Thr
565 570 575
Asn Tyr Arg Pro Arg Ile Asn Lys Leu Glu Ser Thr Lys Asp Arg Glu
580 585 590
Gln Lys Ser Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Leu Asp Asp
595 600

Claims (1)

1.玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2在拟南芥抗旱基因工程方面的应用，其中所述的玉米ATP结合盒转运体蛋白E2基因ZmABCE2核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
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