CN1757740A - 一种植物二价抗逆基因双元表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于植物基因工程育种的农杆菌双元表达载体，具体讲是包含紧密连锁的玉米泛素启动子Pubi调控的拟南芥冷响应基因转录激活因子基因cbf1和拟南芥特异的衰老基因启动子SAG12调控的异戊烯基转移酶ipt基因的二价抗逆基因双元表达载体。本发明通过三个步骤：首先把sag12－ipt融合基因中的T－Nos插入到双元载体上，然后插入ubi－cbf1融合基因，最后插入sag12－ipt融合基因，从而得到完整的二价双元载体。此载体利于两个功能基因同时转化目标植物，显著的提高了转化株对逆境的抗性，同时延缓了逆境所诱发的植物的衰老。

Description

一种植物二价抗逆基因双元表达载体

技术领域

本发明涉及一种用于植物基因工程育种的农杆菌双元表达载体，具体讲是包含紧密连锁的玉米泛素启动子Pubi调控的拟南芥冷响应基因的转录激活因子基因cbf1和拟南芥中特异的衰老基因的启动子SAG12调控的异戊烯基转移酶ipt基因的二价抗逆基因双元表达载体。本发明还涉及此双元载体的构建方法，属于植物基因工程领域。

技术背景

许多抗冻植物，如拟南芥、油菜、大麦和黑麦等，其共同的特征是具有冷驯化响应的特性，即在经过0℃以上至10℃以下的低温锻炼后就具有抗冻的能力。在这一过程中，植物发生了一系列的生理和生化变化。在低温胁迫下植物基因表达发生改变，包括原有蛋白质表达水平的增强、低温特异性诱导蛋白的表达等。因此，植物对低温的适应实际上是感受低温信号、调节基因的表达和代谢的环境适应过程。拟南芥上冷响应(Cold responsive，COR)基因的一个转录激活因子CBF1，能识别冷响应(Cold responsive，COR)基因中的CRT/DRE元件并与之结合，诱导COR基因的表达。人工构建含有cbf1的农杆菌双元表达载体，并以农杆菌为介导将cbf1插入拟南芥基因组内并使其超量表达，在非低温条件下可以激活含有CRT/DRE的靶基因的表达，从而提高植物的抗冻性和耐脱水性(Jaglo-Ottosen等1998，Science，，280：104-106；Liu等1998，PlantCell，10：1391-1046)。

但即使在低温等逆境条件下能够存活的植物，其叶片中细胞分裂素(CTK)含量下降(Yamada等1985，J Japan Soc Hort Sci，53：419-426)植物易于衰老。CTK可直接或间接地清除自由基，减少脂质过氧化作用(Leshem等1981，PhysiolPlant，53：9-12)，提高SOD等膜保护酶的活性(王三根和梁颖1995，中国水稻科学，9：223-229)。异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase，ipt)是细胞分裂素生物合成中的第一关键限速酶，它促使5`-AMP和异戊烯基腺嘌呤焦磷酸合成异戊烯基腺苷-5`-磷酸。此物质很快被转化成异戊烯基腺苷和异戊烯基腺嘌呤。这两种物质经过细胞分裂素氧化酶作用分别形成玉米素核苷和玉米素。有关ipt转化初期的研究发现，以原始ipt即未更换启动子的ipt为外源基因获得的转基因植株中，细胞分裂素超量表达，叶片衰老明显延缓，同时导致植株矮化丛生，完全失去顶端优势，叶片小而圆，根系不能形成，植株不能正常生长发育(Smigocki等1988，PNAS，85：5131-5135；Beinsberger等1991，Plant CellPhysiology，32：489-496)。为了消除植物组织中细胞分裂素过量表达产生的影响，研究者应用了许多组织特异性启动子和可诱导启动子，如热激启动子(Schmulling等1989，FEBS Lett，249：401-406；Medford等1987，PlantCell，1：403-413；Smart等1991，Plant Cell，3：647-656；Van Loven 1993，J Exp Bot，44：1671-1678)、铜诱导启动子(Mckenzie等1998，Plant Physiology，116：969-977)、四环素诱导启动子(Kunkel等1999，Nat Biotechnol，116：969-977)、光诱导启动子(Smigocki等1988，PNAS，85：5131-5135)、果实特异性启动子(Martineau等1994，Plant J，5：11-19)、伤害诱导启动子(Gatz等1998，Trends in Plant Sci.，3：352-358)，都获得了相应的抗衰老植株，但由于它们或者诱导因子自身对植物生长不利，大大限制了抗衰老遗传转化工程在农业生产上的应用。1995年，Gan and Amasino将拟南芥中高度特异的衰老基因SAG12的启动子与农杆菌Agrobacteriumtumefaciens中Ti质粒的ipt融合，构建了一个可延缓衰老的自我调控系统。P_SAG12-ipt的工作原理是：当叶片刚开始衰老时，SAG12启动子被激活，ipt开始表达，细胞分裂素浓度升高，衰老受到抑制；当细胞分裂素浓度达到一定水平，衰老的症状消失，SAG12启动子不再有活性，ipt不再表达，细胞分裂素的浓度也得到控制，从而防止过量的激素对植物的负面影响。用P_SAG12-ipt基因转化烟草(Can等1995，Science，270：1986-1988)、水稻(付永彩等1999，农业生物技术学报，01：17-22)、番茄(张赛群等1999，园艺学报，26：376-379)、牧草白三叶(Schroeder等2001，Journal of the American Society for Horticultural，126，523-530))、花椰菜(Chang等2003，Plant physiology，132：2174-2183)、莴苣(McCabe等，2001)、青菜(袁政等2002，植物生理与分子生物学学报，28：379-384)和小麦(奚亚军等2004，中国农业科学，37：1236-1238)，都已获得了叶片衰老延缓的转基因植株，且基本不影响植株的正常生长与发育。

抗逆性育种一直是植物育种工作的重要目标，由于植物对低温等逆境的抗性是由微效多基因调控的，因此如果cbf1和ipt基因同时转入植物，将可能使植物获得更好的抗寒性并保持旺盛的生命力。在过去的研究中仅构建了含有cbf1或ipt其中一个功能基因的双元载体。若要将两个功能基因同时转入植株时必须进行共转化，其结果将使转基因植株后代中两个功能基因的独立遗传概率极大升高，难以获得两个功能基因连锁遗传的稳定转基因株系。

发明内容

本发明的目的是将cbf1和ipt两个功能基因构建到同一个农杆菌双元表达载体上，以使cbf1和ipt基因通过农杆菌为介导，同时转入植物而获得两个功能基因紧密连锁、稳定遗传的转基因株系，使植物的抗逆性和抗衰老能力增强。

本发明的双元表达载体，是包含紧密连锁的拟南芥冷响应基因COR的转录激活因子基因cbf1和异戊烯基转移酶基因ipt的二价抗逆基因双元表达载体。

本发明成功构建了包含紧密连锁的拟南芥冷响应基因COR的转录激活因子基因cbf1和异戊烯基转移酶基因ipt的二价抗逆基因双元表达载体。利用此载体转化目标植物，所获得的转基因植株明显增强了对逆境的抗性，并延缓了逆境诱发的衰老。

本发明所构建的双元表达载体，其功能基因cbfl是由玉米泛素启动子Pubi调控，功能基因ipt是由拟南芥中特异的衰老基因的启动子Psag₁₂所调控，其结构参见图1。

本发明所构建的双元表达载体，碱基对约17.3kb，其中T-DNA区约11kb，含有诱导型启动子Psag₁₂调控的ipt基因，组成型启动子Pubi调控的cbf1基因，以及组成型启动子CaMV35s调控的抗除草剂基因bar和报告基因gus。用Sac I和KpnI分别对其进行酶切，产物在琼脂糖浓度为1.5％的胶上，以3v/cm的电压电永1h，经EB染色后，在紫外光成像仪上应得到其裂解图谱为图2。

本发明构建的二价抗逆基因双元表达载体的构建方法是以具有融合基因Pubi-cbf1的中间克隆载体、具有融合基因Psag₁₂-ipt的中间克隆载体和双元表达载体p3301为原始载体构建的。

其中具有融合基因Pubi-cbf1的中间克隆载体，是含有融合基因Pubi-cbf1的质粒转化农杆菌所得到的。分类命名为：大肠杆菌埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号.中国科学院微生物研究所，保藏日期为2005年8月18日，保藏编号为CGMCCNo.1440，保藏名称为：pUBC/DH5a.

pUBC/DH5a中质粒的结构图为图3，碱基对约5.2kb，用HindIII单酶切可得到2.3+2.0+0.9kb三个片段。

具有融合基因Psag₁₂-ipt的中间克隆载体，是含有融合基因Psag₁₂-ipt的质粒转化农杆菌所得到的。分类命名为：大肠杆菌埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号.中国科学院微生物研究所，保藏日期为2005年8月18日，保藏编号为CGMCCNo.1441，保藏名称为：pSAGI/DH5a.

pSAGI/DH5a的结构图为图4，碱基对约5.62kb，用SacI单酶切可以得到2.9+2.72kb两个片段。

双元表达载体p3301从PCAMBIA公司购买。

本发明的二价抗逆基因双元表达载体的构建方法是先将Psag₁₂-ipt融合基因中的T-nos插入到双元载体上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入不含T-nos的Psag₁₂-ipt融合基因，从而得到完整的二价双元载体。

具体讲是用EcoRI和SacI酶切中间载体pSAGI，回收0.3kb的T-nos片段，同时用EcoRI和SacI酶切双元载体p3301，回收11.3kb片段作为载体，用T4-DNA连接酶连接两片段的相应位点上，得到载体p3301-nos，新插入的T-nos片段5’端先后为SacI位点和HindIII位点，均为单酶切位点，参见图5。

用内切酶HindIII酶切克隆载体pUBC，回收约3kb的融合基因Pubi-cbf1片段，同时用内切酶HindIII酶切载体p3301-nos，回收11.6kb片段作为载体，将融合基因ubi-cbf1接到p3301-nos的Hind III位点上，得到载体p3301C-nos，其中融合基因ubi-cbf1为顺时针方向，在p3301C-nos上新插入的T-nos的5’端有SacI单酶切位点。参见图7。

用内切酶SacI酶切中间克隆载体pSAGI，回收约2.7kb的不带有T-nos的融合基因Psag₁₂-ipt片段，同时用内切酶Sac I酶切载体p3301C-nos，回收酶切产物中大片段作为载体，将不带有T-nos的融合基因Psag₁₂-ipt片段，正向插入到p3301C-nos的Sacl位点，得到二价双元载体p3301IC。参见图9。

本发明的优点在于：

1.本发明将玉米泛素启动子调控的抗逆基因cbf1和衰老特异性启动子调控的抗衰老基因ipt整合到同一个双元载体上，利于两个功能基因同时转化目标植物，与仅有两功能基因其中之一的双元载体所转化的植物相比显著的提高植物对逆境的抗性，并延缓了逆境所诱发的植物的衰老，使植物在逆境中，生长期和绿期均明显延长。

2.该双元载体转化植物后，转基因植株明显矮壮，以仅有两功能基因其中之一的双元载体所转化的植物为对照，茎杆明显加粗；叶厚度增加10.8-18.5％；叶色浓绿，叶片中叶绿素a+b较对照增加22.3-30.6％，生长期较对照延长30-45天。在低温或干旱胁迫下，转基因植株叶片中脯氨酸和可溶性糖水平均明显高于对照，植株也表现出较强的抗寒性和抗干旱性。

3.本发明载体构建步骤简单。如果按照传统的方法，先后把两个完整的融合基因Pubi-cbf1、Psag₁₂-ipt插入到p3301比较困难，因为启动子Pubi、Psag₁₂以及功能基因ipt DNA序列上有大量常用的限制内切酶的切割位点，要把它们构建在同一个双元载体上就必须避开这些酶切位点。在载体构建中常用的方法是在目标片段的两端接上新的酶切位点，而找到合适的中间载体同样很困难。经过分析，我们采用了三个步骤成功地把两个融合基因整合到一个双元载体上。即首先把Psag₁₂-ipt融合基因中的T-nos插入到双元载体上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入Psag₁₂-ipt融合基因，从而得到完整的二价双元载体。

附图说明

图1二价双元载体p3301IC的构建图

图2p3301IC酶切鉴定图。图中1为KpnI酶切：10.0kb+3.1kb+2.7kb+0.86kb+0.74kb；2为SacI酶切：14.4kb+2.9kb；M为Marker从上至下依次为：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。

图3pUBC/DH5a的构建图

图4pSAGI/DH5a的构建图

图5载体p3301-nos的构建图

图6p3301-nos酶切鉴定图。图中1为KpnI酶切：0.8+1.8kb；M为Marker从上至下依次为：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。

图7载体p3301C-nos的构建图

图8p3301C-nos酶切鉴定图。图中1为KpnI酶切：11.0+2.8+1.8kb；3为HindIII酶切：11.6+2.0+1.0kb；M为Marker从上至下依次为：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。

图9二价双元载体p3301IC的构建图

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1构建载体p3301-Nos

一、实验材料及试剂盒

所用的限制性内切酶及连接酶试剂盒均为NEB公司所产，DNA片段回收采用清华天为时代公司生产的柱离心试剂盒。大肠杆菌感受态细胞购自清华天为时代公司。质粒提取用清华天为时代公司生产的试剂盒，所有操作程序均按试剂盒说明书进行。

二、实验内容

用EcoRI和SacI酶切中间载体pSAGI，回收0.3kb的T-Nos片段，同时用EcoRI和SacI酶切双元载体p3301，回收11.3kb片段作为载体，用T4-DNA连接酶连接两片段的相应位点上，得到载体p3301-nos，新插入的T-nos片段5’端先后为SacI位点和HindIII位点，均为单酶切位点。参见图3，4。

三、实验步骤

1、质粒提取

(1)所需设备：0.5μl-1000μl不同规格移液器，离心机。

(2)提取质粒：程序参见试剂盒说明书。

2、质粒酶切反应：

(1)所需设备：0.5-100μl不同规格移液器，离心机，37℃温箱：

(2)反应体系为EcoR I和SacI双酶切体系：

质粒           5μl(约1μg)

10×buffer1    0.5μl

EcoRI          0.5μl(约5个单位)

SacI           0.5μl(约5个单位)

10×BSA        0.5μl

ddH₂O         43μl

Total          50μl

以上样品混均后，完全酶切样品置37℃温育过夜。不完全酶切样品置7℃温育4min后取出，立即加入Loadimg buffer终止反应。

3、片段回收

(1)所需设备：0.5μl-1000μl不同规格移液器，DNA电泳仪，紫外光成像系统，离心机。

(2)目标片断回收：在浓度为0.8-1.5％琼脂凝胶上电泳酶切产物，回收需要的片段。

4、DNA连接反应

(1)所需设备：0.5-100μl不同规格移液器，离心机，PCR仪(用于提供16℃恒温环境)。

(2)反应体系：

目标片段           10μl

载体片段           2μl

10×buffer         1.5μl

T4连接酶           1.0μl(约10个单位)

ddH₂O             0.5μl

Total              15μl

反应体系中目标片段与载体片段的摩尔比例为4∶1。样品混匀后置于16℃下连接反应2小时.连接反应产物直接用于转化大肠杆菌或保存于4℃冰箱内备用。

5、连接产物转化大肠杆菌

(1)所需设备：水浴锅，0.5μl-1000μl不同规格移液器，离心机。

(2)转化大肠杆菌：程序参见试剂盒说明书。

实施例2构建载体p3301C-nos

试剂设备及实验步骤与实施例1相同，实验内容如下：

用内切酶HindIII酶切克隆载体pUBC，回收约3kb的融合基因Pubi-cbf1片段，同时用内切酶HindIII酶切载体p3301-nos，回收11.6kb片段作为载体，将融合基因Pubi-cbf1接到p3301-nos的HindIII位点上，得到载体p3301C-nos，其中融合基因Pubi-cbf1为顺时针方向，在p3301C-nos上新插入的T-nos的5’端有SacI单酶切位点。参见图5，6。

反应体系为HindIII单酶体系：

质粒          5μl(约1μg)

10×buffer2         0.5μl

HindIII             0.5μl(约5个单位)

ddH₂O              44μl

Total               50μl

实施例3构建二价双元载体p3301IC

试剂设备及实验步骤与实施例1相同，实验内容如下：

用内切酶Sac I酶切中间克隆载体pSAGI，回收约2.7kb的不带有T-nos的融合基因Psag₁₂-ipt片段，同时用内切酶SacI酶切载体p3301C-nos，回收酶切产物中大片段作为载体，将不带有T-nos的融合基因Psag₁₂-ipt片段，正向插入到p3301C-nos的SacI位点，得到二价双元载体p3301IC。参见图7，2。

反应体系为Sac I单酶切体系：

质粒             5μl(约1μg)

10×buffer1      0.5μl

SacI             0.5μl(约5个单位)

10×BSA          0.5μl

ddH₂O           43.5μl

Total            50μl

实施例4二价双元载体p3301IC转化烟草

按照无菌操作，挑取一个含p3301IC的农杆菌LBA4404单菌落转移到3mL液体LB培养基(表一)中，此培养基还含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平，200rmp，28℃条件下培养24小时，再从中取1mL菌液转移到含有50mL的LB培养液的250mL三角瓶内扩大繁殖6小时。当OD/600nm为0.35时，用50ml离心管收集菌液，以4000rmp离心10min，沉淀用等体积的农杆菌重悬培养液，重新悬殊菌体，作转化备用液。培养基成分除与上述含有卡那霉素和利福平的液体LB培养基成分相同外，另外还含有100μg/L的乙酰丁香酮。

取新发出的无菌烟草叶片，用解剖刀在垂直主脉方向划3-5次，以划断叶脉、但不使叶片分成碎片为度，然后放到备用液内浸泡4分钟，取出叶片，后用无菌滤纸吸干菌液，接种到烟草分化培养基(Ms培养基(表二)另加激素为0.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)、0.05mg/L萘乙酸(NAA))上。在25℃下黑暗中共培养4天后，用无菌水清洗叶片至清洗液澄清，无菌滤纸吸干多余的液体，转到新的烟草分化培养基(另含250mg/L头孢霉素)上培养8天，然后转入选择培养基上培养。选择培养基是在烟草分化培养基中分别加入2.5mg/L草丁膦(Sigma公司生产)和250mg/L头孢霉素。在选择培养基上诱导再生转化植株，然后将再生的小植株转到烟草生根培养基(Ms培养基(表二)附加激素为0.02mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.02mg/L萘乙酸(NAA))上，培养出完整植株。

转化烟草植株矮状，叶色深绿。在干旱、低温等逆境胁迫下，转基因植株叶表面很快形成一层腊质层，叶面有光泽，植株失水缓慢，表现出明显的抗旱、抗寒性状，延缓植株衰老。

实施例5二价双元载体p330llC转化香石竹

受体材料为香石竹新生叶。农杆菌浸染、转化植株再生及筛选过程同实施例4。

转化香石竹植株节间距比对照植株短，分枝增多，叶片相对较厚。在低温胁迫下，转基因植株叶片中脯按酸、可溶性糖含量明显高于未转化对照植株，丙二醛含量显著低于对照植株，说明植株抗寒能力增强，并保持了旺盛的生命力。

表一：

LB培养基：Nacl 10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、pH7.0。

表二：

MS基本培养基(Murashige & Skoog，1962)成分

组分	成分	含量(mg/L)
			大量元素	硝酸铵	1650
硝酸钾	1900
		磷酸二氢钾		170
七水合硫酸镁	370
		二水合氯化钙		440
微量元素	四水合硫酸锰				22.3
		七水合硫酸锌	8.6
	硼酸			6.2
		碘化钾	0.83
	二水合钼酸钠			0.25
		六水合氯化钴	0.025
	五水合硫酸铜			0.025
		有机元素	肌醇		100
烟酸	0.5
			盐酸硫胺素	0.1
盐酸吡哆醇	0.5
			甘氨酸	2.0
铁盐	七水合硫酸亚铁				27.8
		乙二胺四乙酸二钠	37.3

Claims (10)

1.一种双元表达载体，其特征在于所述双元表达载体载有紧密连锁的二价抗逆基因拟南芥冷响应基因转录激活因子基因cbf1和异戊烯基转移酶基因ipt。

2.按照权利要求1所述的双元表达载体，其特征在于基因cbf1是由玉米泛素启动子Pubi调控，基因ipt是由拟南芥特异衰老基因启动子SAG12调控，所述的双元表达载体结构为：

3.按照权利要求2所述的双元表达载体，其特征在于所述双元表达载体为17.3kb，其中T-DNA区为11kb，载有诱导型启动子P_SAg12调控的ipt基因，组成型启动子P_ubi调控的cbf1基因，以及组成型启动子CaMV35s调控的抗除草剂基因bar和报告基因gus。

4.按照权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于以具有融合基因pUbi-cbf1的中间克隆载体、具有融合基因pSag-ipt的中间克隆载体和双元表达载体p3301为原始载体构建的。

5.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述的具有融合基因pUbi-cbf1的中间克隆载体，是含有融合基因Pubi-cbf1的质粒转化农杆菌所得到的，保藏编号为CGMCCNo.1440。

6.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述的具有融合基因pSag-ipt的中间克隆载体，是含有融合基因Psag₁₂-ipt的质粒转化农杆菌所得到的，保藏编号为CGMCCNo.1441。

7.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于此二价抗逆基因双元表达载体的构建方法是先将Psag₁₂-ipt融合基因中的T-Nos插入到双元载体上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入不含T-Nos的Psag₁₂-ipt融合基因，从而得到完整的二价双元载体。

8.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于用EcoR I和SacI酶切中间载体Psag₁₂-ipt，回收0.3kb的T-Nos片段，同时用EcoR I和SacI酶切双元载体p3301，回收11.3kb片段作为载体，用T4-DNA连接酶连接两片段的相应位点上，得到载体p3301-Nos，新插入的T-Nos片段5’端先后为Sac I位点和Hind III位点，均为单酶切位点。

9.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于用内切酶Hind III酶切克隆载体pUbi-cbf1，回收约3kb的融合基因ubi-cbf1片段，同时用内切酶Hind III酶切载体p3301-Nos，回收11.6kb片段作为载体，将融合基因ubi-cbf1接到p3301-NOS的Hind III位点上，得到载体p3301C-NOS，其中融合基因ubi-cbf1为顺时针方向，在p3301C-Nos上新插入的T-Nos的5’端有SacI单酶切位点。

10.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于用内切酶Sac I酶切中间克隆载体pSag₁₂-ipt，回收约2.7kb的不带有T-Nos的融合基因Psag-ipt片段，同时用内切酶Sac I酶切载体p3301C-Nos，回收酶切产物中大片段作为载体，将不带有T-Nos的融合基因Psag12-ipt片段，正向插入到p3301C-NOS的SacI位点，得到二价双元载体p3301IC。

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