CN102329812A - 利用同源重组构建多基因双元表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体通过多克隆酶切位点，将单个基因或多个基因连成多基因聚合体形成同源重组中间载体，然后通过同源重组将单个基因或多基因聚合体加进基本双元载体中，所述同源重组可以多次进行，使基本双元载体的T-DNA的长度逐步加大，构成含有多基因的双元表达载体；本发明还公开了多基因双元表达载体的构建方法以及在植物转基因中的应用，本发明公开的多基因双元表达载体用于植物遗传改造中，能够同时转入多个靶基因，具有共转化效率高的优点。

Description

利用同源重组构建多基因双元表达载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，还涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法及其应用。

背景技术

众多基因的功能明确后，需要将大量基因聚合导入到栽培作物，以对其综合农艺性状或多种性状实施改良。因此基因大规模的遗传转化或大片段DNA的遗传转化，是植物转基因研究与利用的重要发展方向之一。目前，实现多基因转化植物主要通过多基因聚合法，包括多个表达载体多次转化法、多个表达载体共转化法、多基因单载体的一次性转化法。

多个表达载体多次转化法是将一次转化的植株作为受体接受二次转化，顺序多重转化将外源基因反复多次地导入同一生物中以达到目标基因的聚合；这种方法虽然不用考虑载体的容量，但是由于转化是进行多次独立转化，其工作量大、转基因植株的稳定性差、获得含有多个靶基因的转基因纯合系比较困难。多个表达载体共转化法是将位于不同载体上的多个基因同时转化到同一植物中，是一步法多基因转化，这种方法降低了工作量，但是实现多基因同时转化的共转化效率低。多基因单载体的一次性转化法分为多个基因融合克隆到表达载体的一个表达盒上或将多个靶基因串联在一个载体上；这种方法避免了费时费力和共转化频率低，但是，由于在构建多基因单载体大都采用酶切连接的方法，加上的目的基因受酶切位点的限制，使研究者不能按需要连入多个基因，制约了多基因载体的构建。

因此，急需一种多基因双元表达载体，能够同时转入多个基因而连入的多个基因不受酶切位点的限制，具有共转化效率高的优点。同源重组是低等生物中普遍存在的DNA重组方式。它不依赖于限制性酶酶切位点，可使两个DNA分子之间的遗传信息精确和特异性交换。利用同源重组途径，是植物基因工程研究早期建立的构建共整合Ti载体的一种方法。但是利用多重同源重组途径、逐步将基因添加进双元表达载体的T-DNA中，构建多基因双元表达载体的方法，目前尚未见报道。

 

发明内容

有鉴于此，为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体；本发明的目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的构建方法，本发明的目的之三在于提供多基因双元表达载体在植物转基因中的应用，从而为实现多基因遗传转化提供有力工具，实现对植物多种性状实施改良。

本发明目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、大肠杆菌复制子ColE1、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、大肠杆菌复制子ColE1、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括T-DNA区、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1，所述T-DNA区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因Kan和所述大肠杆菌复制子ColE1顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子ColE1的所述靶基因与所述基本双元载体所述T-DNA区靠近左边界一侧的所述靶基因有1.3-2.2 kb的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。

进一步，所述多基因双元表达载体所述T-DNA区由左边界，真核抗性标记基因nptII，原核抗性标记基因TetA，PsSym35、PsSynm10、PsENOD12a和PsLectin四个靶基因和右边界顺序串联；所述基本双元载体所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII部分序列、PsSynm10、PsLectin和PsENOD12a三个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括基于Amp筛选同源重组中间载体或基于Tc筛选同源重组中间载体，所述基于Amp筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区由所述左边界、原核抗性标记基因Amp基因，PsSym35和PsSynm10’ 靶基因顺序串联；所述基于Tc筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区的由所述左边界、真核抗性标记基因nptII、原核抗性标记基因TetA基因、PsSym35Lp靶基因顺序串联。

本发明目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，包括以下步骤：

a. 基于Amp筛选同源重组中间载体

采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVS1-REP和右边界序列，在所述T-DNA区插入至少一个靶基因和Amp基因，得基于Amp筛选同源重组中间载体；

b. 基于Tc筛选同源重组中间载体

采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVS1-REP和右边界序列，在所述基本双元载体所述T-DNA区插入TetA基因和至少一个靶基因，得基于Tc筛选同源重组中间载体；

c．构建多基因双元表达载体

将基本双元载体转化所述根癌农杆菌，得含有基本双元载体的根癌农杆菌，将步骤a所得的基于Amp筛选同源重组中间载体转化进所得含有基本双元载体的根癌农杆菌中，所述同源重组片段发生同源重组，得含重组DNA分子的根癌农杆菌；将步骤b所得的基于Tc筛选同源重组中间载体转化所得含重组DNA分子的根癌农杆菌，所得重组DNA分子即为多基因双元表达载体。

进一步，所述基本双元载体按如下步骤制得：

（1）克隆豌豆品种食荚大菜豌PsLectin基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1215载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsENOD12a基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1226载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym10基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1227载体；

（2）克隆pBIN19载体Pnos::nptII基因，进行酶切，同时酶切pCAMBIA1302载体，将Pnos::nptII基因与pCAMBIA1302载体酶切片段连接，得pVCT2020载体；

（3）酶切所得pVCT1215载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收；同时酶切所得pVCT2020载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；将pVCT1215载体与pVCT2020载体的回收片段连接，得pVCT2105载体；

（4）酶切所得pVCT2105载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得pVCT1226载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，将pVCT2105载体与pVCT1226载体的回收片段连接，得pVCT2120载体；

（5）酶切所得pVCT1227载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1227酶切片段；同时酶切pVCT2120载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2120酶切片段；将回收的pVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片进行连接，得基本双元载体pVCT2121。

进一步，步骤a所述基于Amp筛选同源重组中间载体按如下步骤制得：

a1酶切所得基本双元载体pVCT2121载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，补平后连接，得pVCT1210载体；

a2酶切步骤a1所得pVCT1210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1210酶切片段，所述pVCT1210酶切片段与所述Amp基因连接，得pVCT1220载体；

a3克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym35up基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1229载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym35Lp基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1230载体；

a4分别酶切所得pVCT1229载体与pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，连接pVCT1229载体与pVCT1230载体回收片段，得pVCT1231载体；酶切步骤a2所得pVCT1220载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1220酶切片段，同时酶切所得pVCT1231载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1231酶切片段，连接所得pVCT1220酶切片段和pVCT1231酶切片段，得基于Amp筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2125。

进一步，步骤b所述基于Tc筛选同源重组中间载体，包括以下步骤：

b1将 pCR2.1-TOPO载体酶切，自环化连接，得pCR2.1m载体；以pCR2.1m载体为模板，用如SEQ ID NO：14所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：15所示序列为下游引物，进行PCR扩增，扩增产物自环化连接，得pVCT1191载体；以pVCT1191载体为模板，如SEQ ID NO：16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：17所示序列为下游引物，进行PCR扩增；以扩增产物为模板，如SEQ ID NO：16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：18所示序列为下游引物，进行PCR扩增，得nptII基因，所得nptII基因与pMD18-T载体连接，得pVCT1202载体；

b2酶切pCAMBIA1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pCAMBIA1302载体酶切片段；同时酶切所得pVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得nptII基因；将pCAMBIA1302载体酶切片段与nptII基因连接，得pVCT2072载体；酶切所得pVCT2072载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得pVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，连接pVCT2072载体与pVCT1202载体回收片段，得pVCT2102载体； 

b3酶切所得pVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2102酶切片段，将所得pVCT2102酶切片段与所述TetA基因连接，得pVCT2129载体；

b4酶切pUC18载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pUC18载体酶切片段；同时酶切pBI121载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI121载体酶切片段连接，得pVCT2006载体；然后酶切所得pVCT2006载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2006载体酶切片段；同时酶切如SEQ ID NO：13所示双链DNA片段，将pVCT2006载体酶切片段与所得酶切双链DNA片段连接，得pVCT2079载体；

b5酶切所得pVCT2079载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2079酶切片段，同时酶切所述pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1230酶切片段，连接所述pVCT2079酶切片段和所述pVCT1230酶切片段，得pVCT1302载体；

b6 酶切步骤b5所得pVCT1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1302酶切片段，同时酶切步骤b3所得pVCT2129载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2129酶切片段，连接pVCT1302酶切片段和pVCT2129酶切片段，得基于Tc筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2127。

进一步，步骤c所述构建多基因双元表达载体，包括以下步骤：

将所得基本双元载体pVCT2121转化所述根癌农杆菌，所述根癌农杆菌为EHA105，在含Rif、Str和Kan的YEB平板上筛选，得含基本双元载体的根癌农杆菌EHA105/pVCT2121，将所得同源重组中间载体pVCT2125转化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Str的YEB平板上筛选，得含有重组DNA分子的根癌农杆菌EHA105/pVCT2126；将所得同源重组中间载体pVCT2127转化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Str的YEB平板上进行筛选，得多基因双元表达载体pVCT2128。 

进一步，所述Amp基因，制备步骤如下：以大肠杆菌克隆载体pBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：20所示，进行PCR扩增， PCR产物经限制性内切酶消化后Klenow Fragment酶补平，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1337 bp片段，得Amp基因。

进一步，所述TetA基因，制备步骤如下：以大肠杆菌克隆载体pBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：19所示，下游引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：20所示，进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1470 bp片段，得TetA基因片段。

本发明目的之三在于提供多基因双元表达载体用于植物转基因，所述多基因双元表达载体转化大豆。

本发明的优点在于：本发明利用同源重组，通过交替使用氨苄青霉素和四环素交替筛选，在农杆菌中实现同源重组，顺序将多个基因串联组合，从而使T-DNA持续延长。由于大肠杆菌ColE1质粒复制子不能对大分子量载体DNA进行复制，因此，同源重组过程被安排在农杆菌中进行，并利用根癌农杆菌Ti质粒的复制子来确保大分子量质粒或大分子量T-DNA的合成与构建。本发明公开的多基因双元表达载体用于植物遗传改造中，能够同时转入多个基因，具有共转化效率高的优点。

本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其它优点可以通过下面的说明书，权利要求书，以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

农杆菌介导的植物遗传转化是一个借助农杆菌将外源基因导入植物基因组的自然过程，由Ti质粒上的T-DNA区进行精确切割、包装和转运至植物细胞内，最后T-DNA区随机整合进植物基因组内。双元表达载体一般由T-DNA区、农杆菌复制子、大肠杆菌复制子、原核抗性标记基因，其中T-DNA区有两个边界，位于T-DNA左侧边界为左边界、位于T-DNA右侧边界为右边界，在左边界和右边界之间含有真核抗性标记基因和多个靶基因。

原核抗性筛选Amp基因、TetA基因、Kan基因，其中Amp基因编码的蛋白具有抗氨苄青霉素（Amp）的活性，TetA基因编码的蛋白质具有抗四环素（Tc）的活性，Kan基因编码的蛋白质具有抗卡那霉素活性（Kan）。真核抗性筛选中抗卡那霉素（Kan）活性的基因称为nptII。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明pVCT1215载体结构图；

图2为本发明pVCT1216载体结构图；

图3为本发明pVCT1227载体结构图；

图4为本发明pVCT1231载体构建流程图；

图5为本发明pVCT2020载体构建流程图；

图6为本发明pVCT2079载体构建流程图；

图7为本发明pVCT2102构建流程图；

图8为本发明pVCT2105载体结构图；

图9为本发明pVCT2120载体结构图；

图10为本发明pVCT2121载体结构图；

图11为本发明pVCT1210载体结构图；

图12为本发明pVCT1220载体结构图；

图13为本发明pVCT2125载体结构图；

图14为本发明pVCT2129载体结构图；

图15为本发明pVCT1302载体结构图；

图16为本发明pVCT2127载体结构图；

图17为本发明同源重组的T-DNA拼接及其多基因双元表达载体的构建流程图；

图18为本发明pVCT2126载体结构图；

图19为本发明pVCT2128载体结构图。

图20为本发明pVCT2128载体电泳图（M为DL2000 DNA Marker，A为第1代质粒，B为第10代质粒）。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1 基础载体的获得

优选实例中使用的材料：豌豆（Pisum sativum L.）品种食荚大菜豌为材料；大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α，大肠杆菌XL1-Blue，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105由本实验室保存；pBI121质粒和pCAMBIA1302质粒由本实验室保存；pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen，US），pEasy-T3载体（TransGen，德国）；DNA marker、载体pBR322购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pUC18载体、pMD18-T载体、限制性内切酶、Klenow Fragment酶、T4-DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PrimStar HS DNA 聚合酶购自TaKaRa公司（Japan）；E. Z. N. A. Plasmid Miniprep Kit和E. Z. N. A. Gel Exteaction Kit购自Omega公司（USA）；氨苄青霉素（Ampicilin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、四环素（Tetracycline，Tc）、利福平（Rifampicin，Rif）、链霉素（Streptomycin，Str）、细菌培养基购自北京鼎国生物技术发展中心；其他化学试剂为国产分析纯；引物的合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

以下以豌豆凝集素基因PsLectin、豌豆结瘤素基因PsENOD12a、PsSym35和PsSym10为靶基因，利用同源重组构建多基因双元表达载体。

（1）pVCT1215载体构建

以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据已报道的豌豆凝集素基因，简称PsLectin基因(GenBank accession No. X66368）设计引物，上游引物序列为：5’-gttaagttctgatgatgtggtgtg-3’（SEQ ID NO：1），下游引物序列为5’-ttgccaagaatgggttctattagg-3’（SEQ ID NO：2），使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10秒，55℃退火20秒，72℃延伸2 分 20 秒，30个循环；72℃延伸10分钟；得1946 bp的PsLectin基因片段，所得PsLectin片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pMD18-T载体连接，得含豌豆凝集素基因的pMD18-T载体，命名为pVCT1215载体，如附图1所示。其中所得PsLectin基因片段包括启动子、编码区和终止子。

（2）pVCT1226载体构建

以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据已报道的豌豆早期结瘤素基因，简称PsENOD12a基因（GenBank accession No. X81366），设计特异引物，上游引物序列为5’-caatattgggttatgggtggctgag-3’（SEQ ID NO：3），下游引物序列为5’-ggtactagaatgctttagaaatggatg-3’（SEQ ID NO：4），使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10 秒，56℃退火20 秒，72℃延伸1分 30 秒，30个循环；72℃延伸10 分钟；得1282 bp大小的、缺失终止子的PsENOD12a基因片段，所得PsENOD12a片段，用Taq DNA聚合酶加A，然后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含PsENOD12a基因的载体，命名为pVCT1226载体，如附图2所示。其中所得PsENOD12a基因片段包括启动子（Pro）和编码区（PsENOD12a），不含有终止子。

（3）pVCT1227载体构建过程

以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因，简称PsSym10基因（GenBank accession No. AJ575250），设计特异引物，上游引物序列为5’-ggtcaagtgctagaaatcatcttgg-3’（SEQ ID NO：5），下游引物序列为5’-gctgacttgcatcaacattttatggg-3’（ SEQ ID NO：6），使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性2分钟，1个循环；95℃变性10秒，58℃退火20 秒，72℃延伸3 分30 秒，30个循环；72℃延伸10分钟；得3320 bp大小的豌豆结瘤素基因PsSym10片段，所得PsSym10片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pEasy-T3载体连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含PsSym10基因的载体，命名为pVCT1227，如附图3所示。其中所得PsSym10基因片段包括启动子（Pro）、编码区（Sym10）和终止子（Ter）。

（4）pVCT1229

以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因PsSym35上游片段，命名为PsSym35up基因（GenBank accession No. AJ493063），设计特异引物，上游引物序列为5’-catttcctcaagaccaactgtctcgc-3’（ SEQ ID NO：7），下游引物序列为5’-ccatctcttcccaacaacaaaaccac -3’ （SEQ ID NO：8），使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10 秒，60℃退火20 秒，72℃延伸2分钟20 秒，30个循环；72℃延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出2159 bp的PsSym35 up基因片段，所得PsSym35up基因片段用Taq DNA聚合酶加A，然后与pEasy-T3载体连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含PsSym35up片段的pEasy-T3，命名为pVCT1229载体，如附图4所示。其中PsSym35up片段包括启动子（Pro）和上游部分编码区序列（PsSym35p）。

（5）pVCT1230

以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因PsSym35下游片段，简称PsSym35Lp基因（GenBank accession No. AJ493063），设计特异引物，上游引物序列为5’-ctctcaccttctaatattctctctc-3’（ SEQ ID NO：9），下游引物序列为5’-tatctaggaagatggactgctactg-3’ （SEQ ID NO：10），使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10 秒，56℃退火20 秒，72℃延伸3 分 20秒，30个循环；72℃延伸10 分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出3203 bp的PsSym35Lp基因片段，所得PsSym35Lp基因片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含PsSym35Lp基因片段的pMD18-T，命名为pVCT1230载体，如附图4所示。其中PsSym35Lp基因片段包括下游部分编码区序列，但没有终止子（Ter）。PsSym35up基因片段和PsSym35Lp基因片段构成PsSym35基因的启动子和编码区。

（6）pVCT1231载体构建过程

所得pVCT1229载体含有PsSym35up基因片段，所得pVCT1230载体含有PsSym35Lp基因片段，用限制性内切酶BstX I和Sal I分别酶切pVCT1229载体和pVCT1230，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，分别回收pVCT1229载体2132bp的片段和pVCT1230载体5583bp的片段，按其摩尔比为3：1，在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接，然后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有Amp（50 mg/L）的LB平板上筛选，提取质粒，经酶切验证，得pVCT1231载体，如附图4所示。在载体构建过程中PsSym35Lp基因插入PsSym35up基因片段的下游，因此pVCT1231载体中PsSym35up片段和PsSym35Lp片段构成PsSym35基因，含有启动子和编码区，但无终止子。

（7）pVCT2020载体构建

根据报道的pBIN19载体序列（GenBank accession U09365），设计含启动子Pnos和卡那霉素基因nptII编码区（简称Pnos::nptII基因）的特异引物，上游引物序列为5’-cggaattcagggagtcacgttatgac-3’（ SEQ ID NO：11），下划线为EcoR I酶切位点，下游引物序列为5’-cgctcgagtcccgctcagaagaac-3’（SEQ ID NO：12），划线处为Xho I酶切位点，使用PrimStar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10 秒，54℃退火20秒，72℃延伸1分10秒，30个循环；72℃延伸10 分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，回收片段经EcoR I和Xho I酶切后，回收1107 bp片段，得Pnos::nptII酶切片段；用EcoR I和Xho I酶消化载体pCAMBIA1302，回收8425 bp片段，得pCAMBIA1302酶切片段；连接Pnos::nptII酶切片段和pCAMBIA1302酶切片段，得pVCT2020载体，如附图5所示。

（8）pVCT2079载体构建

用EcoRI/HindIII同时双酶切pUC18载体和pBI121载体，回收pUC18载体2635 bp片段，得pUC18载体酶切片段，回收pBI121载体的含β-葡萄糖苷酸酶基因gus的表达盒，得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI121载体酶切片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2006载体。用Ecl136 II/Xba I酶切pVCT2006载体（Ecl136 II与Sac I为同位异裂酶，即识别序列相同），弃1894 bp片段，电泳回收3773bp片段，得pVCT2006载体酶切片段；人工合成如SEQ ID NO：13所示双链DNA片段，该DNA片段为138 bp，在3’端含有Xba I酶切位点，Xba I酶切人工合成的双链DNA片段，回收131 bp酶切片段，得含Xba I粘性末端的双链DNA片段；将pVCT2006载体酶切片段与含Xba I粘性末端的双链DNA片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2079载体，构建过程如附图6所示。

（9）pVCT2102载体构建

将 pCR2.1-TOPO载体用EcoR I，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收3913 bp片段，将回收片段T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，Amp和Kan抗性筛选，提取质粒酶切鉴定，得pCR2.1m载体。

根据pCR2.1m载体序列设计引物，上游引物为序列为pCR2.1m F 5’-tcatgaccaaaatccct-3’（SEQ ID NO：14），下游引物序列为pCR2.1m R 5’-ttcagaagaactcgtcaagaagg -3’（SEQ ID NO：15）；以pCR2.1m载体为模板，用PrimStar HS DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃变性2 分钟，1个循环；95℃变性10 秒，50℃退火20秒，72℃延伸3分钟，30个循环；72℃延伸10 分钟。经琼脂糖电泳鉴定，回收2942 bp目的片段，将回收片用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，在含Kan的LB固体培养基上抗性筛选，提取质粒酶切验证，得pVCT1191载体，pVCT1191载体上pCR2.1m载体的Amp抗性基因得到删除，并使nptII基因末端带上原核基因终止子，简称nptII基因，该基因能编码新霉素磷酸转移酶，使大肠杆菌具有Kan抗性。

根据pVCT1191载体，设计引物，上游引物序列为：pVCT1191 F1 5’-atactcgagctactgggctatctgg-3’（SEQ ID NO：16），划线处为Xho I位点，下游引物序列为：pVCT1191 R1 5’-cattatacgaagttatcctgcaggcggccgcccagggccctggtagctcttgatccggc-3’（SEQ ID NO：17），用PrimStar HS DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性2 分钟，95℃变性10秒，52℃退火20秒，72℃延伸1分钟20秒，3个循环，再经95℃变性10秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟20秒，27个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增出1265 bp大小的nptII基因，将所得PCR扩增产物为模板，以SEQ ID NO：15所示序列为上游引物，下游引物序列为：pVCT1191 R2  5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc-3’（SEQ ID NO：18），进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性2 分钟，95℃变性10秒，46℃退火20 秒，72℃延伸1 分钟20 秒，3个循环，再经95℃变性10 秒，60℃退火20 秒，72℃延伸1 分钟 20 秒，27个循环，最后72℃延伸10 分钟；经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收1283 bp片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18-T中，得pVCT1202载体。

用Xho I酶切pCAMBIA1302载体，弃1094 bp片段，回收9455 bp片段，得pCAMBIA1302载体骨架；同时用Xho I和Sal I酶切pVCT1202载体，弃2693 bp片段，回收1284 bp片段，得nptII基因编码区；将pCAMBIA1302载体骨架与nptII基因编码区用T4 DNA连接酶连接，得pVCT2072载体。所得pVCT2072载体相当于nptII基因编码区替换pCAMBIA1302载体上潮霉素抗性标记基因，即构建含2x35S::nptII::T35s表达盒pVCT2072载体；所得pVCT2072载体经农杆菌介导转化烟草，得到具有卡那霉素抗性的植株，结果表明2x35S::nptII::T35s基因表达正常。

用PmaC I和Xba I酶切载体pVCT2072，弃413 bp和1124 bp片段，电泳回收8475bp片段；同时用Not I酶切所得pVCT1202载体，用Klenow Fragment酶补平后再用Xba I酶切，弃1250 bp片段，回收2732 bp片段；将回收片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2102载体，构建过程如附图7所示。

本实施例以豌豆早期结瘤素基因PsSym35、PsSynm10、PsENOD12a和豌豆凝集素基因PsLectin为例，构建含有靶基因的基本载体，还可以为其他靶基因，载体也可以为其他双元植物表达载体。

实施例 2

基本双元载体构建

（1）pVCT2105载体的构建

用EcoR I和Hind III 酶切载体pVCT1215，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃2635 bp片段，回收2007 bp片段；用相同的酶酶切pVCT2020载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃51 bp片段，回收9481 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2105载体。如附图8所示，所得pVCT2105载体含有PsLectin靶基因。

（2）pVCT2120载体的构建

用PmaC I和Hind III酶切载体所得pVCT2105，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃413 bp和1118 bp片段，回收9957 bp片段；用Xba I酶切pVCT1226，Klenow Fragment酶补平后，再用Hind III酶切割，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃2684 bp片段，回收1297 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2120载体，如附图9所示。所得pVCT2120载体含有PsLectin和PsENOD12a两个靶基因，PsENOD12a基因位于pVCT2105载体的胭脂碱合成酶基因终止子Tnos之前，使不含终止子的PsENOD12a基因表达能够终止。

（3）pVCT2121载体的构建

用限制性内切酶SalI酶切所得pVCT1227载体，经Klenow Fragment酶补平，再用NcoI酶切，弃2966bp片段，回收3395bp大片段，得pVCT1227酶切片段；同时用Ecl136 Ⅱ（Ecl136 II与Sac I为同位异裂酶，即识别序列相同）和NcoI酶切pVCT2120载体，弃874bp片段，回收10383bp片段，得pVCT2120酶切片段。将回收的pVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片段在T4 DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，得基本双元载体pVCT2121，如附图10所示。

pVCT2121为本实施例中的基本双元载体，pVCT2121载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、STA区、大肠杆菌复制子ColE1、原核抗性标记基因Kan，其中T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因npt II部分序列、PsSym10、PsLectin和PsENOD12a三个靶基因和右边界所组成；其中左边界、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1构成同源重组片段，位于T-DNA区的靠左边界一侧的PsSym10基因的部分序列，构成另一同源重组片段。

基于Amp筛选同源重组中间载体构建

（1）pVCT1210载体的构建

用限制性内切酶AvrII /EheI双酶切所得基本双元载体pVCT2121，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃9008bp条带，回收大小为4684bp的片段，得pVCT2121酶切片段，pVCT2121酶切片段用Klenow Fragment酶补平，补平后在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接，得自环化载体pVCT1210，如附图11所示；其中，由原基本双元载体pVCT2121保留下来的左边界、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1顺序串联位于T-DNA区的左边界外侧序列构成同源重组片段，PsSym10基因的部分序列构成另一同源重组片段。

（2）Amp基因或TetA基因片段获得

以大肠杆菌克隆载体pBR322为模板，采用PrimStar HS DNA 聚合酶，Amp基因或TetA基因（以下简称：Amp/TetA基因）特异引物，上游引物为p9：5’-tttctcgagttggtagctcttgatcc-3’ (SEQ ID No：19），下游引物为p10：5’-gactcgagcacgatcatgcgcac-3’  (SEQ ID No：20），进行PCR扩增， 扩增条件：95℃ 预变性2 分钟； 95℃ 变性10 秒，50℃ 退火15秒，72℃ 延伸3分钟，循环3次；95℃变性 10秒，59℃ 退火15秒，72℃延伸3分，循环27次；最后72℃延伸10 分钟，PCR反应结束后，进行电泳检测，回收2818bp大小的条带，得Amp/TetA基因片段。

所得Amp/TetA基因片段用限制性内切酶XhoI/EcoR I进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，分别回收大片段和小片段，其中小片段约1337bp，得 Amp基因片段；大片段约为1470bp，得TetA基因片段。

(3) pVCT1220载体的构建

用限制性内切酶AseI酶切所得pVCT1210载体，再用Klenow Fragment酶补平，补平后进行胶回收，得pVCT1210酶切补平片段。将所得Amp基因片段，用Klenow Fragment酶补平，得Amp基因补平片段，将pVCT1210酶切补平片段与Amp基因补平片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16℃过夜连接，得载体pVCT1220，如附图12所示。

（4）pVCT2125的构建

用限制性内切酶XhoI酶切所得pVCT1220质粒DNA，经Klenow Fragment酶补平，再用NotI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收大片段，得pVCT1220片段；同时，用限制性内切酶Sma I/NotI双酶切所得含有PsSym35靶基因的载体pVCT1231，经琼脂糖凝胶电泳回收大片段，得pVCT1231酶切片段。连接pVCT1220片段和pVCT1231酶切片段，在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接，得载体pVCT2125，如附图13所示。

pVCT2125载体为本发明实施例的基于Amp筛选同源重组中间载体，含有T-DNA区、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1，其中T-DNA区由左边界、原核抗性标记基因Amp、PsSym35靶基因和1757bp的PsSym10基因部分片段（即PsSym10’）从左至右顺序串联，但不含有基本双元载体所含有的农杆菌复制子pVS1-REP和右边界。PsSym10’位于T-DNA区的右侧，因此同源重组中间载体T-DNA区的靠右侧与基本双元载体T-DNA区靠近左边界一侧有PsSym10’ 的1757bp的相同基因序列，构成同源重组片段。pVCT2125载体与pVCT2121载体的左边界、所述原核抗性标记基因Kan和所述大肠杆菌复制子ColE1顺序串联构成含有2338bp相同序列的片段，构成另一个同源重组片段。pVCT2125载体与pVCT2121载体同时存在于根癌农杆菌中时，将通过两个同源重组片段介导而发生同源重组，形成含重组DNA分子的根癌农杆菌。

本实施例以pVCT2121载体为基本双元载体，以Amp基因为原核抗性标记基因为例，基本双元载体还可以为其他双元载体，抗性基因也可以为其他基本双元载体上不含有的抗性基因，如：氯霉素抗性基因。

基于Tc筛选同源重组中间载体构建

（1）pVCT2129载体的构建

用限制性内切酶SalI/EcoR I双酶切所得pVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳回收8503bp大小的片段，得pVCT2102酶切片段，将pVCT2102酶切片段与所得的TetA基因片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16℃过夜，得pVCT2129载体，如附图14所示。

（2）pVCT1302载体的构建

用限制性内切酶Hind III酶切所得pVCT2079载体，经Klenow Fragment酶补平，再用NheI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收2959bp的片段，得pVCT2079酶切片段；同时用限制性内切酶EcoR I酶切所得pVCT1230质粒DNA，经Klenow Fragment酶补平，再用限制性内切酶XbaI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收1333bp的片段，得pVCT1230酶切片段。将回收的pVCT2079酶切片段与pVCT1230酶切片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16℃过夜连接，得pVCT1302载体，如附图15所示。

（3）pVCT2127载体的构建

用限制性内切酶EcoR I酶切所得pVCT1302载体，经Klenow Fragment酶补平，再用NdeI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收1874bp的片段，得pVCT1302酶切片段；同时用限制性内切酶BstE II酶切所得pVCT2129载体，经Klenow Fragment酶补平，再用NdeI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收5537bp的片段，得pVCT2129酶切片段。将pVCT1302酶切片段和pVCT2129酶切片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16℃过夜连接，得载体pVCT2127，如附图16所示。

载体pVCT2127为本发明本实施例的基于Tc筛选同源重组中间载体，含有T-DNA区、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1，其中T-DNA区由左边界、真核标记基因npt II、原核抗性标记基因TetA、PsSym35Lp’从左至右顺序串联，但是不含有基本双元载体所含有的农杆菌复制子pVS1-REP和右边界，靶基因PsSym35Lp部分序列（简称PsSym35Lp’）位于同源重组中间载体T-DNA区的右侧。T-DNA区的左边界、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1的2227bp序列构成同源重组片段，1324bp的靶基因PsSym35Lp’构成另一同源重组片段。

本实施例以TetA基因为原核抗性标记基因，作为同源重组筛选重组载体的标记基因，原核抗性标记基因还可以为重组子上没有的其他抗性筛选基因，如：氯霉素抗性基因。

实施例 3 同源重组多基因双元表达载体的构建

如附图17所示，将所得基本双元载体pVCT2121采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，在含Rif（100mg/L）、Str（100mg/L）和Kan（50mg/L）的 YEB固体培养基上抗性筛选，获得含有基本双元载体pVCT2121的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2121。将基于Amp筛选同源重组中间载体pVCT2125冻融法转化EHA105/ pVCT2121感受态细胞，在含Kan（50mg/L）、Amp（100mg/L）、Rif（100mg/L）和Str（100mg/L）的YEB固体培养基上筛选，获得发生同源重组的含重组DNA分子pVCT2126的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2126，pVCT2126如附图18所示。pVCT2125载体和pVCT2121载体上的两个同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。由于pVCT2125载体上不含有农杆菌复制子pVS1-REP，只有发生同源重组的重组子才能在含Kan（50mg/L）、Amp（100mg/L）、Rif（100mg/L）和Str（100mg/L）的YEB抗性培养基上生长。

将EHA105/ pVCT2126制备感受态细胞，采用冻融法将基于Tc筛选同源重组中间载体pVCT2127转入农杆菌感受态细胞中，转化后将菌液移到含Kan（50mg/L）、Tc（100mg/L）、Rif（100mg/L）和Str（100mg/L）的YEB抗性平板上筛选，获得发生二次同源重组的多基因双元表达载体pVCT2128的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2128，pVCT2128如附图19所示。同源重组中间载体pVCT2127与pVCT2126载体具有两段相同的基因片段构成同源重组片段，一段相同片段为由左边界、原核标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1构成2227bp的同源重组片段，另一段相同片段为PsSym35Lp’靶基因1324bp构成的同源重组片段。同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组，由于pVCT2127载体上不含有农杆菌复制子pVS1-REP，不能在根癌农杆菌中复制，因此不能在根癌农杆菌中遗传，只有同源重组形成多基因双元表达载体pVCT2128后才能在含Kan（50mg/L）、Tc（100mg/L）、Rif（100mg/L）和Str（100mg/L）的YEB抗性培养基上生长。所得多基因双元表达载体pVCT2128含有T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、大肠杆菌复制子、原核抗性标记基因Kan，T-DNA区包括左边界、真核抗性标记基因nptⅡ、原核抗性标记基因TetA以及豌豆凝集素基因PsLectin、早期结瘤素基因PsSym10、PsSym35和PsENOD12a四个靶基因。

重复以上实验步骤，利用Amp和Tc交替筛选，能插入更多的靶基因，使T-DNA得到持续延伸，完成多基因聚合，构建含有更多基因的双元表达载体，插入基因的数量以根癌农杆菌复制子pVS1-REP的复制极限为度（pVS1-REP的复制极限为200 kb左右）。在最后一次同源重组时，不使用Amp基因作为原核抗性标记基因，而使用四环素抗性基因TetA，且要加入nptⅡ、hptII或pat等抗性基因作为真核标记基因，整合进植物后用于对转基因植株的筛选。

将本发明构建的带有豌豆凝集素基因PsLectin和早期结瘤素基因PsSym10、PsSym35和PsENOD12a以及Pnos-nptII卡那霉素抗性基因和TetA四环素抗性基因等多基因双元表达载体pVCT2128，经农杆菌介导转化大豆，培育能同时被大豆根瘤菌和豌豆根瘤菌侵染形成根瘤的、固氮性能得到改善的转基因大豆新材料。

本实施例同源重组以农杆菌EHA105转化大豆为例，也可以为农杆菌的其他株系，如：LBA4404等，转化受体也可以根据研究选择不同植物作为受体，如：烟草、拟南芥等。

实施例 4 多基因双元表达载体的遗传稳定性

将EHA105/ pVCT2128接种于5mL 含Rif（100mg/L）、Str（100mg/L）和kan（50mg/L）、Tc（100mg/L）的YEB液体培养基中，28℃、225 rpm振荡培养过夜，培养后的菌液为第一代。取第一代的菌液1μL接种于5mL新鲜的与上述相同抗生素的YEB液体培养基中，进行第二代菌液的培养，培养条件同上。依次培养10代，分别用1.5 mL Eppendorf管收集第1代和第10代的菌体。对收集的菌提取质粒DNA，电泳检测所提取pVCT2128质粒DNA，检测结果如附图20所示。结果表明第1代和第10代菌体提取的pVCT2128质粒DNA，条带大小一致，说明pVCT2128载体能在根癌农杆菌EHA105中稳定遗传。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

<110>  西南大学

<120>  利用同源重组构建多基因双元表达载体及其制备方法和应用

 

<160>  12

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆凝集素基因PsLectin上游引物

 

<400> 1

gttaagttct gatgatgtgg tgtg  24

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆凝集素基因PsLectin下游引物

 

<400>  2

ttgccaagaa tgggttctat tagg  24

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆早期结瘤素基因PsENOD12a上游引物

 

<400>  3

caatattggg ttatgggtgg ctgag  25

 

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆早期结瘤素基因PsENOD12a下游引物

 

<400>  4

ggtactagaa tgctttagaa atggatg  27

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆结瘤素基因PsSym10上游引物

 

<400>  5

ggtcaagtgc tagaaatcat cttgg  25

 

<210>  6

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆结瘤素基因PsSym10下游引物

 

<400>  6

gctgacttgc atcaacattt tatggg  26

 

<210>  7

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆结瘤素基因PsSym35up上游引物

 

<400>  7

catttcctca agaccaactg tctcgc 26

 

<210>  8

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  豌豆结瘤素基因PsSym35up下游引物

 

<400>  8

ccatctcttc ccaacaacaa aaccac 26

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  豌豆结瘤素基因PsSym35 Lp上游引物

 

<400>  9

Ctctcacctt ctaatattct ctctc 25

 

<210>  10

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  豌豆结瘤素PsSym35 Lp基因下游引物

 

<400>  10

tatctaggaa gatggactgc tactg 25

 

<210>  11

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  Pnos::nptII基因上游引物

 

<400>  11

cggaattcag ggagtcacgt tatgac  26

 

<210>  12

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  Pnos::nptII基因下游引物

 

<400>  12

cgctcgagtc ccgctcagaa gaac  24

 

 

<210>  13

<211>  138

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  含Xba I酶切位点的双链DNA片段

 

<400>  13

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctagcttgg   60

taccgagctc ggccgaggcg gcctgatcaa ttggccgtaa tggccagggc cctgggcggc  120

cgcctgcagg tctagagg                                                138

 

<210>  14

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  pCR2.1m载体上游引物pCR2.1m F

 

<400>  14

 

tcatgaccaa aatccct  17

 

<210>  15

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  pCR2.1m载体下游引物pCR2.1m R

 

<400>  15

ttcagaagaa ctcgtcaaga agg  23

 

<210>  16

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  pVCT1191载体上游引物 pVCT1191 F1

 

<400>  16

atactcgagc tactgggcta tctgg    25

 

<210>  17

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  pVCT1191载体下游引物 pVCT1191 R1

 

<400>  17

cattatacga agttatcctg caggcggccg cccagggccc tggtagctct tgatccggc  59

 

<210>  18

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  pVCT1191载体下游引物 pVCT1191 R2

 

 <400>  18

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcc  36

 

<210>  19

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  Amp/TetA基因上游引物

 

<400>  19

tttctcgagt tggtagctct tgatcc    26

 

<210>  20

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  Amp/TetA基因下游引物

 

<400>  20

gactcgagca cgatcatgcg cac      23

 

Claims (10)

1.利用同源重组构建多基因双元表达载体，其特征在于：所述多基因双元表达载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、大肠杆菌复制子ColE1、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVS1-REP、大肠杆菌复制子ColE1、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括T-DNA区、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子ColE1，所述T-DNA区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因Kan和所述大肠杆菌复制子ColE1顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子ColE1的所述靶基因与所述基本双元载体所述T-DNA区靠近左边界一侧的所述靶基因有1.3-2.2 kb的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。

2.根据权利要求1所述利用同源重组构建多基因双元表达载体，其特征在于：所述多基因双元表达载体所述T-DNA区由左边界，真核抗性标记基因nptII，原核抗性标记基因TetA，PsSym35、PsSynm10、PsLectin和PsENOD12a四个靶基因和右边界顺序串联；所述基本双元载体所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因nptII部分序列、PsSynm10、PsLectin和PsENOD12a三个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括基于Amp筛选同源重组中间载体或基于Tc筛选同源重组中间载体，所述基于Amp筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区由所述左边界、原核抗性标记基因Amp基因，PsSym35和PsSynm10’ 靶基因顺序串联；所述基于Tc筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区的由所述左边界、真核抗性标记基因nptII、原核抗性标记基因TetA基因、PsSym35Lp靶基因顺序串联。

3.权利要求1所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 基于Amp筛选同源重组中间载体

采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVS1-REP和右边界序列，在所述T-DNA区插入Amp基因和至少一个靶基因，得基于Amp筛选同源重组中间载体；

b. 基于Tc筛选同源重组中间载体

采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVS1-REP和右边界序列，在所述基本双元载体所述T-DNA区插入TetA基因和至少一个靶基因，得基于Tc筛选同源重组中间载体；

c．构建多基因双元表达载体

将基本双元载体转化所述根癌农杆菌，得含有基本双元载体的根癌农杆菌，将步骤a所得的基于Amp筛选同源重组中间载体转化进所得含有基本双元载体的根癌农杆菌中，所述同源重组片段发生同源重组，得含重组DNA分子的根癌农杆菌；将步骤b所得的基于Tc筛选同源重组中间载体转化所得含重组DNA分子的根癌农杆菌，所得重组DNA分子即为多基因双元表达载体。

4.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，所述基本双元载体按如下步骤制得：

（1）克隆豌豆品种食荚大菜豌PsLectin基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1215载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsENOD12a基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1226载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym10基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1227载体；

（2）克隆pBIN19载体Pnos::nptII基因，进行酶切，同时酶切pCAMBIA1302载体，将Pnos::nptII基因与pCAMBIA1302载体酶切片段连接，得pVCT2020载体；

（3）酶切步骤（1）所得pVCT1215载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收；同时酶切步骤（2）所得pVCT2020载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；将pVCT1215载体与pVCT2020载体的回收片段连接，得pVCT2105载体；

（4）酶切步骤（3）所得pVCT2105载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切步骤（1）所得pVCT1226载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，将pVCT2105载体与pVCT1226载体的回收片段连接，得pVCT2120载体；

（5）酶切步骤（1）所得pVCT1227载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1227酶切片段；同时酶切步骤（4）所得pVCT2120载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2120酶切片段；将回收的pVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片进行连接，得基本双元载体pVCT2121。

5.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，步骤a所述基于Amp筛选同源重组中间载体按如下步骤制得：

a1酶切所得基本双元载体pVCT2121载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，补平后连接，得pVCT1210载体；

a2 酶切步骤a1所得pVCT1210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1210酶切片段，所述pVCT1210酶切片段与所述Amp基因连接，得pVCT1220载体；

a3克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym35up基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1229载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌PsSym35Lp基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1230载体；

a4分别酶切步骤a3所得pVCT1229载体与pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，连接pVCT1229载体与pVCT1230载体回收片段，得pVCT1231载体；酶切步骤a2所得pVCT1220载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1220酶切片段，同时酶切所得pVCT1231载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1231酶切片段，连接所得pVCT1220酶切片段和pVCT1231酶切片段，得基于Amp筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2125。

6.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于：步骤b所述基于Tc筛选同源重组中间载体，包括以下步骤：

b1将pCR2.1-TOPO载体酶切，自环化连接，得pCR2.1m载体；以pCR2.1m载体为模板，用如SEQ ID NO：14所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：15所示序列为下游引物，进行PCR扩增，扩增产物自环化连接，得pVCT1191载体；以pVCT1191载体为模板，如SEQ ID NO：16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：17所示序列为下游引物，进行PCR扩增；以扩增产物为模板，如SEQ ID NO：16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO：18所示序列为下游引物，进行PCR扩增，得nptII基因，所得nptII基因与pMD18-T载体连接，得pVCT1202载体；

b2 酶切pCAMBIA1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pCAMBIA1302载体酶切片段；同时酶切步骤b1所得pVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得nptII基因；将pCAMBIA1302载体酶切片段与nptII基因连接，得pVCT2072载体；酶切所得pVCT2072载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得pVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，连接pVCT2072载体与pVCT1202载体回收片段，得pVCT2102载体； 

b3 酶切所得pVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2102酶切片段，将所得pVCT2102酶切片段与所述TetA基因连接，得pVCT2129载体；

b4 酶切pUC18载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pUC18载体酶切片段；同时酶切pBI121载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI121载体酶切片段连接，得pVCT2006载体；然后酶切所得pVCT2006载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2006载体酶切片段；同时酶切如SEQ ID NO：13所示双链DNA片段，将pVCT2006载体酶切片段与所得酶切双链DNA片段连接，得pVCT2079载体；

b5 酶切步骤b4所得pVCT2079载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2079酶切片段，同时酶切步骤a3所得pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1230酶切片段，连接所述pVCT2079酶切片段和所述pVCT1230酶切片段，得pVCT1302载体；

b6 酶切步骤b5所得pVCT1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1302酶切片段，同时酶切步骤b3所得pVCT2129载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2129酶切片段，连接pVCT1302酶切片段和pVCT2129酶切片段，得基于Tc筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2127。

7.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，步骤c所述构建多基因双元表达载体，包括以下步骤：

将所得基本双元载体pVCT2121转化所述根癌农杆菌，所述根癌农杆菌为EHA105，在含Rif、Str和Kan的YEB平板上筛选，得含基本双元载体的根癌农杆菌EHA105/pVCT2121，将所得同源重组中间载体pVCT2125转化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Str的YEB平板上筛选，得含有重组DNA分子的根癌农杆菌EHA105/pVCT2126；将所得同源重组中间载体pVCT2127转化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Str的YEB平板上进行筛选，得多基因双元表达载体pVCT2128。

8.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，所述Amp基因，制备步骤如下：以大肠杆菌克隆载体pBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：20所示，进行PCR扩增， PCR产物经限制性内切酶消化后Klenow Fragment酶补平，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1337 bp片段，得Amp基因。

9.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，所述TetA基因，制备步骤如下：以大肠杆菌克隆载体pBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：19所示，下游引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：20所示，进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1470 bp片段，得TetA基因片段。

10.权利要求1所述多基因双元表达载体用于植物转基因，其特征在于：所述多基因双元表达载体转化大豆。

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