CN104388454B - 一种高拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高拷贝pTerm系列质粒及其构建方法和应用，所述的pTerm系列质粒包括colE1复制子基因、原核生物转录终止子以及抗生素抗性基因。本发明的一种高拷贝pTerm系列质粒具有拷贝数高、容量大、稳定性高等特点，可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。

Description

一种高拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和基因工程领域，具体地涉及一种高拷贝pTerm系列质粒及其构建方法和应用。

背景技术

质粒是染色质外的遗传因子，能够进行自主复制，是一种能独立复制的复制子。质粒是一种双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb～300kb之间。

质粒虽然不是宿主生存所必需的遗传元件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性等。质粒可以作为载体用于克隆外源基因，广泛应用于基因克隆、测序及基因合成等领域。人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。

所谓复制子，即是一个遗传单位，包括DNA复制起点(ori)及其相关的调控原件。每个质粒DNA上都含有ori，在质粒中ori是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，只有ori能被宿主细胞复制及蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与ori的序列结构相关。

根据质粒复制的特点，质粒被分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒也称低拷贝数质粒，每个细胞中拷贝数有限，大约一个至十几个；松弛型质粒也称高拷贝数质粒，其拷贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。尤其是高拷贝数质粒更是因其分子量小、拷贝数高、操作方便、易于大量制备等优点而成为实验中的首选。

松弛型质粒(高拷贝数质粒)通常带有蓝白斑筛选功能(例如pUC系列载体)，这个特点给基因克隆带来了极大的方便。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz＇的基因，lacz＇中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子序列；编码α肽链的序列；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的序列中，是外源DNA的插入位点。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链)，从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，能够使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生有活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型呈现白色菌落。

虽然带有蓝白斑筛选功能的高拷贝数质粒给基因克隆提供了极大的方便，但是其β-半乳糖苷酶的启动子属于强启动子，能够大量启动外源基因的转绿、翻译，这就导致结构复杂的基因、转录或翻译产物对宿主有毒性的基因无法克隆。因此，如何克服现有质粒载体存在的上述缺陷，提高克隆“难度”基因的成功率是很多科研人员需要解决的首要问题。

发明内容

本发明解决的问题在于现有技术中高拷贝数质粒存在的诸多缺陷，进而提供一种没有蓝白斑筛选功能及相应的强启动子，并且MCS两端添加多个原核生物转录终止子的高拷贝数质粒，所述质粒能够有效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能够成功克隆“难度”基因。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种高拷贝pTerm质粒，包括colE1复制子基因、原核生物转录终止子以及抗生素抗性基因；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端；所述抗生素抗性基因为bla基因或Kan基因中的任一种。

优选的，所述bla基因具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述Kan基因具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。

优选的，所述质粒的拷贝数为380-560个。

优选的，所述质粒记为pTerm-HA，具有如SEQ ID No.7所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第22bp～615bp为Terminator基因；961bp～1821bp为bla基因；1916bp～2598bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在329bp～370bp处；或者，

所述质粒记为pTerm-HK，具有如SEQ ID No.8所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第132bp～725bp为Terminator基因；1071bp～1886bp为Kan基因；1981bp～2663bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在439bp～480bp处。

一种构建高拷贝pTerm质粒的方法，包括以下步骤：

步骤一：人工设计并合成所述的colE1复制子基因、原核生物转录终止子基因、抗生素抗性基因片段；

步骤二：运用多段重组法将所述colE1复制子基因片段、抗生素抗性基因片段和原核生物转录终止子基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。

优选的，所述的多段重组法为Gibson重组方法，反应体系及条件：按1:1:1的摩尔比取所述colE1基因片段、抗生素抗性基因片段和原核生物转录终止子基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

一种构建高拷贝pTerm系列质粒的方法，包括以下步骤：

步骤一：人工合成所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段；

步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性bla基因或Kan基因的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性bla基因或Kan基因的质粒为模板，设计F-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK为引物，通过PCR扩增得到colE1-原核生物转录终止子基因片段；

步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述colE1-原核生物转录终止子基因片段与分别与所述抗生素抗性Kan基因或bla基因片段进行组装。

优选的，所述步骤二中，所述引物包括：

F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt-3’；

R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA-3’

优选的，所述的Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述colE1-原核生物转录终止子基因片段与所述第二抗生素抗性基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

上述高拷贝pTerm质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。

优选的，所述pTerm系列质粒在结构复杂、含有重复序列以及不稳定序列基因的克隆、筛选和测序中的应用。

优选的，所述pTerm质粒在长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组合成中的应用。

本发明利用人工合成的方法，合成一种高拷贝pTerm系列质粒，主要技术手段是删除众多克隆质粒所具有的蓝白斑筛选基因及相应的强启动子，并且在多克隆位点两端添加了多个防止外源DNA序列从上游质粒启动子过多转录的原核生物转录终止子，即不依赖ρ因子的原核生物转录终止子，因此能够有效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能够克隆高拷贝、低拷贝载体所不能克隆的基因及对宿主细胞有毒害的基因。

本发明的一种高拷贝pTerm系列质粒具有拷贝数高、容量大、稳定性高等特点，可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为pTerm-HA质粒的物理图谱；

图2为pTerm-HK质粒的物理图谱；

图3为pTerm-HA质粒构建流程模式图；

图4为重组质粒SF3B1-pTerm-HA的酶切验证图，其中1为重组质粒对照；2为重组质粒用限制性内切酶Mlu Ⅰ和Nde Ⅰ的酶切结果；3为DS5000DNA Marker；

图5为重组质粒MMR-pTerm-HK的酶切验证图，其中1为重组质粒对照，2为重组质粒用限制性内切酶Afe Ⅰ和Sac Ⅰ的酶切结果，3为DS5000DNA Marker。

具体实施方式

实施例1：质粒pTerm-HA的构建

质粒pTerm-HA的构建流程模式图如图3所示，具体方法如下：

1.设计并合成bla基因，序列全长950bp，其中61～921为bla基因，编码β-内酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列1；

2.设计并合成colE1复制子基因，序列全长928bp，其中序列95～777bp为colE1复制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2；

3.设计并合成Terminator基因，序列全长959bp，其中51～644bp为原核生物原核生物转录终止子，基因序列如序列表中的序列3；

4.分别合成以上三个基因片段，由于三个片段之间具有30bp重叠区，因此使用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为pTerm-HA，其测序序列如SEQ ID No.7所示。

GibsonMaster Mix反应体系及条件：三个基因片段各1μl，灭菌去离子水7μl，Gibson AssemblyMaster Mix：10μl，50℃反应1小时，取5μl连接产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的长度为2749bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：22bp～615bp；bla基因：961bp～1821bp；colE1复制子基因：1916bp～2598bp；其中多克隆位点在329bp～370bp处。

实施例2：质粒pTerm-HK的构建

质粒pTerm-HK的构建流程与质粒pTerm-HA的构建流程相似，具体方法如下：

1.设计并合成Kan基因，序列全长906bp，其中碱基61～876为Kan基因编码区。基因序列如序列表中的序列4；

2.设计并合成colE1复制子基因，序列全长928bp，其中序列95～777bp为colE1复制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2；

3.设计并合成Terminator基因，序列全长959bp，其中51～644bp为原核生物原核生物转录终止子，基因序列如序列表中的序列3；

4.分别合成以上三个基因片段，由于三个片段之间具有30bp重叠区，因此使用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为pTerm-HA，其测序序列如SEQ ID No.8所示。

GibsonMaster Mix反应体系及条件：三个基因片段各1μl，灭菌去离子水7μl，Gibson AssemblyMaster Mix：10μl，50℃反应1小时，取5μl连接产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的长度为2704bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：132bp～725bp；Kan基因：1071bp～1886bp；colE1复制子基因：1981bp～2663bp；其中多克隆位点在439bp～480bp处。

实施例3：以质粒pTerm-HA为模板构建pTerm-HK质粒

在实施例1制备得到的质粒pTerm-HA的基础上通过改变抗生素抗性基因，构建得到具有卡那霉素抗性的质粒pTerm-HK，具体方法如下：

1.人工设计并合成Kan基因序列，序列全长906bp，其中碱基61～876为Kan基因编码区。Kan基因序列如序列表中的序列4；

2.以pTerm-HA质粒为模板，F-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK为引物，通过PCR得到片段colE1-Terminator。

F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt-3’；

R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA-3’。

由于该片段与Kan基因序列两端具有30bp重叠互补区域，因此采用GibsonAssembly Master Mix(NEB)试剂盒将两个片段进行组装。

GibsonMaster Mix反应体系及条件：两个DNA片段各1μl，灭菌去离子水8μl，Gibson Assembly Master Mix：10μl，50℃反应1小时，即得环形质粒pTerm-HK，其测序序列如SEQ ID No.8所示。

取5μl连接产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的长度为2704bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：132bp～725bp；Kan基因：1071bp～1886bp；colE1复制子基因：1981bp～2663bp；其中多克隆位点在439bp～480bp处。

实施例4：以质粒pTerm-HK为模板构建pTerm-HA质粒

在实施例2制备得到的质粒pTerm-HK的基础上通过改变抗生素抗性基因，构建得到具有氨苄青霉素抗性的质粒pTerm-HA，具体方法如下：

1.人工设计并合成bla基因，序列全长950bp，其中61～921为bla基因，编码β-内酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列1；

2.以pTerm-HK质粒为模板，F-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK为引物，通过PCR得到片段colE1-Terminator。

F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt-3’；

R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA-3’。

由于该片段与bla基因序列两端具有30bp重叠互补区域，因此采用GibsonAssembly Master Mix(NEB)试剂盒将两个片段进行组装。

Master Mix反应体系及条件：两个DNA片段各1μl，灭菌去离子水8μl，Gibson Assembly Master Mix：10μl，50℃反应1小时，即得环形质粒pTerm-HA，其测序序列如SEQ ID No.7所示。

取5μl连接产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的长度为2749bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：22bp～615bp；bla基因：961bp～1821bp；colE1复制子基因：1916bp～2598bp；其中多克隆位点在329bp～370bp处。

实施例5：质粒pTerm-HA、pTerm-HK稳定性检测

分别将质粒pTerm-HA、pTerm-HK转化到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，挑取单克隆菌落在含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的LB培养基中过夜培养，之后对培养的菌液在含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的平板上划线培养，对划线得到的单克隆重新在含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的平板上再进行一次划线培养，由此得到纯的阳性转化克隆。

将得到的纯的阳性转化克隆接种到不含有抗生素的LB培养基中，37℃培养20代(约7h)后，从中取100μl接种至新的不含有抗生素的LB培养基中，37℃继续培养20代，如此重复6次，最后分别得到40代、60代、80代、100代和120代的细菌，取上述各代菌液100μl，稀释100倍后分别接种至不含有抗生素的LB平板上和含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的LB平板上，37℃培养过夜。

无抗生素条件下质粒的保持率＝含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的LB平板上的存活菌落数/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落数。

在没有选择压力的情况下，连续培养120代，质粒pTerm-HA的保持率为99.9％；质粒pTerm-HK的保持率为100％。以上结果表明合成的pTerm-HA、pTerm-HK质粒具有较强的稳定性，适用于作为基因工程的克隆载体。

实施例6：质粒pTerm-HA、pTerm-HK拷贝数检测

分别转化pTerm-HA、pTerm-HK以及pUC57质粒到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，分别挑取四个单克隆菌落到含有相应抗生素(Amp：100μg/μl或Kan：50μg/μl)的4ml LB培养基中，37℃200rpm过夜培养12小时，第二天提取质粒，最终将质粒溶解到50μl灭菌TE中，测质粒的浓度得到pUC57的浓度分别是：352ng/μl、336ng/μl、343ng/μl、337ng/μl，pTerm-HA质粒的浓度分别是：308ng/μl、296ng/μl、311ng/μl、303ng/μl，pTerm-HK质粒的浓度分别是：301ng/μl、289ng/μl、304ng/μl、331ng/μl，根据所测质粒浓度计算pUC57、pTerm-HA以及pTerm-HK的摩尔浓度。

腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)分子量分别为313.2、304.2、329.2、289.2(g/mol)，则：

pUC57的分子量＝313.2g/mol×672+304.2g/mol×691+329.2g/mol×683+289.2g/mol×664＝837545g/mol；

pTerm-HA的分子量＝313.2g/mol×676+304.2g/mol×721+329.2g/mol×688+289.2g/mol×664＝849570g/mol；

pTerm-HK的分子量＝313.2g/mol×663+304.2g/mol×695+329.2g/mol×647+289.2g/mol×699＝834214g/mol；

检测得到质粒pUC57的平均浓度＝342ng/μl，pTerm-HA的平均浓度＝304.5ng/μl，pTerm-HK的平均浓度＝306.25ng/μl；

质粒pUC57的摩尔浓度＝388.75ng/μl÷837545g/mol＝4.6415416485E-7mol/L；

质粒pTerm-HA的摩尔浓度＝304.5ng/μl÷849570g/mol＝3.5841661075E-7mol/L；

质粒pTerm-HK的摩尔浓度＝306.25ng/μl÷834214g/mol＝3.6711203548E-7mol/L；

pUC57为高拷贝质粒，每个细胞中质粒的拷贝数为500个～700个，由此可以计算出质粒pTerm-HA的拷贝数＝pTerm-HA的摩尔浓度×(500～700)÷pUC57的摩尔浓度＝3.5841661075E-7×(500～700)÷4.6415416485E-7＝386～540(个)，pTerm-HK的拷贝数＝pTerm-HK的摩尔浓度×(500～700)÷pUC57的摩尔浓度＝3.6711203548E-7×(500～700)÷4.6415416485E-7＝395～554(个)。

故每个细胞中质粒pTerm-HA的拷贝数为386～540个，质粒pTerm-HK的拷贝数为395～554个，均为高拷贝质粒。

实施例7：利用质粒pTerm-HA构建人SF3B1基因的克隆重组体

真核生物mRNA需要经过剪接才能形成成熟的mRNA，剪接过程需要众多剪接因子参与。人SF3B1(splicing factor 3b，subunit 1，transcript variant 1，GenBank登录号：NM_012433)编码剪接因子3b蛋白复合物的亚基1。剪接因子3b与剪接因子3a、12S RNA共同形成U2核内小核糖核蛋白复合物(U2 snRNP)。剪接因子3b/3a复合物以序列依赖性的形式与前体mRNA分子中的内含子上游位点结合，并可以将U2 snRNP固定在前体mRNA分子上。剪接因子3b也是较小的U12类型剪接体的组成部分。剪接因子3b羧基端的三分之二区域具有不完全一样的HEAT氨基酸串联重复，这些串联重复构成“拉杆”样(rod-like)螺旋结构。近年来的研究表明，RNA剪接不但与胚胎发育、性别确定、激素分泌和细胞衰老等密切相关，还与人类某些重大疾病的病理过程相关。

人SF3B1基因CDS全长3915碱基对(序列如序列表中序列5)，为了方便克隆将序列的5’、3’端分别添加Mlu Ⅰ和HindⅢ酶切位点及保护碱基。经过分析将目标DNA序列分成首尾重叠互补的四段分别合成，标记为SF3B1-1、SF3B1-2、SF3B1-3和SF3B1-4。根据这四段基因设计寡核苷酸链，使用PCR方法分别将寡核苷酸链拼接成SF3B1-1、SF3B1-2、SF3B1-3和SF3B1-4，最后设计引物将四个片段重组拼接成完整的SF3B1基因。引物序列如下：

SF3B1-F1：5’-CATACTCTTCACGCGTATGGCGAAGA-3’

SF3B1-R1：5’-GATCTGTTCGAGGAGTCTCAGCCCAT-3’

SF3B1-F2：5’-GTGGATGGGCTGAGACTCCTCGAACA-3’

SF3B1-R2：5’-CACAGCCCATAAGAATAGCTATCTGTTGT-3’

SF3B1-F3：5’-TACAACAGATAGCTATTCTTATGGGCTGTG-3’

SF3B1-R3：5’-CTGCCCAATACTTCAGGGTACTCTTCAC-3’

SF3B1-F4：5’-GGGTGAAGAGTACCCTGAAGTATTGGG-3’

SF3B1-R4：5’-AGACGTCAGGAAGCTTTTATAAGATATAGTC-3’

将PCR拼接得到的SF3B1基因片段和质粒pTerm-HA以及质粒pUC57用Mlu Ⅰ和HindⅢ双酶切，再将酶切后的片段和载体使用T4 DNA连接酶进行连接。酶切和连接反应体系如下：

PCR产物酶切反应体系及反应条件：SF3B1基因片段：4μl(200ng)，10×Buffer：2μl，Mlu Ⅰ：1μl；HindⅢ：1μl，H2O：12μl。37℃，30min。

载体酶切反应体系及反应条件：pTerm-HA(pUC57)：1.5μl(800ng)，10×Buffer：2μl，Mlu Ⅰ：1μl；HindⅢ：1μl，H2O：14.5μl。37℃，30min。

连接反应体系及反应条件：2×Buffer：10μl，SF3B1基因片段：2μl(80ng)，pTerm-HA(pUC57)：1μl(20ng)，H2O：6μl，T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,1000U 1000CEU/μl)：1μl；22℃，30min。

将连接产物分别转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天分别挑选24个单克隆进行菌检PCR，结果显示使用pTerm-HA载体的菌检阳性率为100％，而使用pUC57载体的菌检阳性率为0。将使用pTerm-HA载体菌检到的阳性克隆摇菌并抽质粒然后进行酶切验证，酶切验证图如图4所示，其中1为重组质粒SF3B1-pTerm-HA对照；2为重组质粒用限制性内切酶Mlu Ⅰ和Nde Ⅰ酶切结果，条带大小和理论值(1712bp、4946bp)相符；3为DS5000 DNAMarker，此图说明目的基因SF3B1已经成功克隆进pTerm-HA载体，将酶切正确质粒进行测序验证，测序结果显示序列完全正确。

将重组质粒SF3B1-pTerm-HA用Mlu Ⅰ和HindⅢ酶切并胶回收SF3B1基因片段，再将胶回收的SF3B1基因片段与低拷贝pCA(Mlu Ⅰ和HindⅢ酶切并胶回收，苏州金唯智生物科技有限公司专利载体)载体用T4 DNA连接酶进行反应，并将反应产物转化公司所有感受态细胞，第二天各挑取24个单克隆进行菌检PCR，结果显示菌检阳性率为0，该实验结果从另一个角度证明pTerm-HA载体能够用于克隆pUC57高拷贝类型载体、pC系列低拷贝载体(苏州金唯智生物科技有限公司专利载体)所不能克隆的基因序列。

实施例8：利用质粒pTerm-HK构建巨噬细胞甘露糖受体基因(macrophage mannosereceptor，MMR)重组体

巨噬细胞甘露糖受体是一种跨膜糖蛋白，属于C型血凝素受体，对甘露糖寡聚糖有很高的亲和力，普遍表达于巨噬细胞、树突状细胞、特异的淋巴细胞以及肝脏的内皮细胞(Taylor PR,et al.(2005)23:901–944.)。MMR细胞外区域包括氨基端与糖蛋白结合的半胱氨酸富集区，纤维连接蛋白Ⅱ结构域(fibronectin Ⅱ)，8个与糖具有高亲和力的碳水化合物识别结构域。MMR不但在内吞和噬菌过程中起作用，而且在清除不必要的甘露糖蛋白保持免疫平衡的过程中担当重要角色。

本实施例的具体实验过程如下：

1.对目标基因序列进行分析并设计合成寡核苷酸链

优化后的目标基因CDS如序列表中序列6，序列全长4407bp。为验证质粒pTerm-HK是否能够用于构建不稳定序列，使用质粒pTerm-HK与质粒pUC57同时构建MMR基因重组体。将MMR基因序列5’、3’端分别添加BamH Ⅰ、Mlu Ⅰ酶切位点及相应的保护碱基，然后将序列分成首尾重叠互补的四段分别合成，标记为MMR-1、MMR-2、MMR-3和MMR-4。根据这四个基因设计寡核苷酸链，使用PCR方法分别将寡核苷酸链拼接成MMR-1、MMR-2、MMR-3和MMR-4，最后设计引物将四个片段重组拼接成完整的MMR基因。引物序列如下：

MMR-F1：

’-CAGTCACGACGGATCCATGAGGCTACCCCTGCTCCTGGTTT-3’；

MMR-R1：5’-GGCCACCACTGACTTGGACAGTTAG-3’；

MMR-F2：5’-GCCTACTAACTGTCCAAGTCAGTGGT-3’；

MMR-R2：5’-CCAGGACATACCAGAGTCACCTTTCAAC-3’；

MMR-F3：5’-GAGTTGAAAGGTGACTCTGGTATGTCCTG-3’；

MMR-R3：5’-GCTTGCAATACTTCTCTGCTTCATGCC-3’；

MMR-F4：5’-AGTGGCATGAAGCAGAGAAGTATTGC-3’；

MMR-R4：5’-CGTGAGCGCTACGCGTTTAGATGCCTGCATGTTCATTCTGTTC-3’。

2.基因克隆至载体构建重组体

将拼接得到的MMR基因片段和质粒pTerm-HK以及质粒pUC57使用BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切，再将酶切后的片段和载体使用T4 DNA连接酶进行连接。酶切和连接反应体系如下：

PCR产物酶切反应体系及反应条件：MMR基因片段：4μl(200ng)，10×Buffer：2μl，BamH Ⅰ：1μl；Mlu Ⅰ：1μl，H2O：12μl。37℃，30min。

载体酶切反应体系及反应条件：pTerm-HK(pUC57)：1.5μl(800ng)，10×Buffer：2μl，BamH Ⅰ：1μl；Mlu Ⅰ：1μl，H2O：14.5μl。37℃，30min。

连接反应体系及反应条件：2×Buffer：10μl，DNA片段：2μl(80ng)，pTerm-HK(pUC57)：1μl(20ng)，H2O：6μl，T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,1000U 1000CEU/μl)：1μl；22℃，30min。

3.检测

将连接产物分别转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天各挑选24个单克隆进行菌检PCR，结果显示使用pTerm-HK载体的克隆菌检阳性率为100％，而使用pUC57载体的克隆菌检阳性率为0。将使用pTerm-HK载体菌检到的阳性克隆摇菌并抽质粒然后进行酶切验证，酶切验证图如图5所示，其中1为重组质粒MMR-pTerm-HK对照；2为重组质粒用限制性内切酶Afe Ⅰ和Sac Ⅰ的酶切结果，条带大小和理论值(1946bp、5147bp)相符；3为DS5000 DNAMarker，此图说明目的基因MMR已经成功克隆进pTerm-HK载体，将酶切正确质粒进行测序验证，测序结果显示序列完全正确。

将质粒MMR-pTerm-HK用限制性内切酶BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切并胶回收MMR片段然后与用相同限制性内切酶酶切的pCK(苏州金唯智生物科技有限公司专利载体)载体再次进行连接转化实验，尝试公司所有的感受态细胞，结果仍未检到阳性克隆，实验结果再次证明pTerm-HK可以用于克隆pUC57这类高拷贝载体、以及pC系列低拷贝载体所无法克隆的不稳定序列。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种高拷贝pTerm质粒，其特征在于，由colE1复制子基因、原核生物转录终止子、多克隆位点以及抗生素抗性基因组成；在多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子为不依赖ρ因子的原核生物转录终止子；所述抗生素抗性基因为bla基因或Kan基因中的任一种。

2.根据权利要求1所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述bla基因如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述Kan基因如SEQ ID No.4所示的序列结构。

3.根据权利要求1或2所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒的拷贝数为380-560个。

4.根据权利要求3所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于：

所述质粒记为pTerm-HA，如SEQ ID No.7所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第22bp～615bp为Terminator基因； 961bp～1821bp为bla基因；1916bp～2598bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在329bp～370bp处；或者，

所述质粒记为pTerm-HK，如SEQ ID No. 8所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第132bp～725bp为Terminator基因；1071bp～1886bp为Kan基因；1981bp～2663bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在439bp～480bp处。

5.一种构建权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工设计并合成所述的colE1复制子基因、含有原核生物转录终止子基因和多克隆位点的基因片段、抗生素抗性基因片段；所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；

步骤二：运用多段重组法将所述colE1复制子基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。

6.根据权利要求5所述的高拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的多段重组法为Gibson重组方法，反应体系及条件：按1:1:1的摩尔比取所述colE1基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂， 50℃下反应至得到环形质粒。

7.一种构建权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm系列质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工合成所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段；

步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性bla基因或Kan基因的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性bla基因或Kan基因的质粒为模板，F-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK为引物,通过PCR扩增得到colE1-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段，所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；所述引物包括： F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt -3’；R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA -3’；步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述colE1-原核生物转录终止子基因片段分别与所述抗生素抗性Kan基因或bla基因片段进行组装。

8.根据权利要求7所述的高拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述colE1-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段分别与所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

9.权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。