KR100878017B1 - 이종 유전자 발현을 위한 숙주균 및 그의 이용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이종 유전자 발현을 위한 시스템을 갖춘 숙주균으로서 (A) 이종 세균의 시그마 인자 유전자를 함유하고; (B) 숙주균의 시그마 인자의 활성이 조건에 따라 조절되는 숙주균, 이 숙주균을 이용한 이종 유전자의 발현방법 및 이종 세균으로부터의 유용물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하여, 숙주균의 프로모터 및 외부의 프로모터의 도움없이 이종 유전자의 발현을 유도시켜, 활성을 토대로한 신규 물질 탐색효율을 개선할 수 있는 발현시스템을 제공할 수 있게 된다.
방선균, 이종발현, 메타게놈, 숙주, 시그마 유전자
Description
도 1은 발현분석 벡터와 시그마 유전자 발현을 위한 벡터의 구조를 보여주는 개념도.
도 2는 대장균에서 방선균 유전자의 발현 양상을 보여주는 웨스턴 블럿 결과사진.
도 3은 대장균에서 방선균 sigE에 의한 dagA 유전자의 발현 유도를 보여주는 웨스턴 블럿 결과사진.
도 4은 DH10b(rpoD285) 균주와 방선균 hrdD에 의한 방선균 조절유전자의 발현유도를 보여주는 웨스턴 블럿 결과사진.
도 5는 DH10b(rpoD285) 균주와 방선균 시그만 인자 공급에 의한 방선균 분해유전자의 발현유도를 보여주는 웨스턴 블럿 결과사진.
본 발명은 이종 유전자 발현을 위한 시스템을 갖춘 숙주균, 이 숙주균을 이용한 이종 유전자의 발현방법 및 이종 세균으로부터의 유용물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
대장균 (E. coli) 또는 다른 세균 숙주 (bacterial host)에서 방선균 (streptomyces) 및 이와 유사한 high GC Gram positive 세균 (high GC Gram positive bacteria) 유래의 게놈 라이브러리 (genomic library) 또는 이들 세균이 포함되어 있는 메타게놈 라이브러리 (metagenome library) 상의 유전자들을 대장균의 프로모터(promoter) 또는 대장균에서 작동될 수 있는 외부 프로모터(예를 들어 T7 promoter, λ promoter 등)의 도움 없이 발현을 유도시켜, 활성을 토대로 한 신규 물질 탐색효율을 개선할 수 있는 발현시스템이다. (대장균의 프로모터는 대장균의 RNA 중합효소(RNA polymerase)에 의해 인식되는 프로모터를 가리킨다.)
세균 (bacteria)은 다양한 생리활성물질 뿐 아니라 효소의 공급원이다. 특히 방선균은 항생제 뿐 아니라, 면역억제제, 항암제, 제초제, 구충제, 신경세포 보호물질, 당뇨병 치료제에 이르기까지 매우 다양한 생리활성을 갖는 이차대사물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 하지만 방선균이 생산하는 항생물질의 3%만이 현재 밝혀졌을 정도로 (Arch. Microbiol. 176, 386, 2001) 방선균은 아직 밝혀지지 않은 생리활성을 갖는 이차대사물질 및 인간에게 유용한 효소의 보고이다. 따라서 본 발명은 대장균에서 방선균 유래의 게놈 라이브러리(genomic library) 또는 이들 세균 이 포함되어 있는 메타게놈 라이브러리 (metagenome library) 상의 유전자들을 대장균의 프로모터 또는 대장균에서 작동될 수 있는 외부 프로모터(예를 들어 T7 promoter, λ promoter 등)의 도움 없이 발현을 유도시켜, 활성을 토대로 한 신규 물질 탐색효율을 개선할 수 있는 발현시스템이다. 하지만 이 시스템은 방선균과 유사한 high GC Gram positive 세균 (high GC Gram positive bacteria) 및 다른 세균에도 적용 될 수 있다.
세균은 다양한 생리활성물질 뿐 아니라 인간에게 유용한 효소의 공급원이지만, 세균으로부터 유용 물질을 탐색하는 데는 2 가지 문제점이 존재한다. 첫째, 현재 배양 기술로는 전체 세균의 약 1~2 %만 배양이 가능하여, 미생물의 대부분을 차지하는 배양이 불가능하거나 또는 배양이 어려운미생물은 탐색 대상에서 제외된다. 둘째, 다른 세균의 유전자가 클로닝 숙주(host)인 대장균에서 대장균의 프로모터 또는 외부 프로모터(예를 들어 T7 프로모터, λ 프로모터) 도움 없이는 잘 발현되지 않는다.
배양과정을 거치지 않고, 환경으로부터 직접 DNA를 추출하여 대장균에 클로닝하는 메타게놈 (metagenome) 기술이 개발되면서 (US 6,280,926 B1), 배양이 불가능하거나, 또는 배양이 어려운 미생물의 유전자 자원을 확보하는 것이 가능하게 되었다. 이러한 메타게놈적인 방법(metagenomic approach)과 기존의 보통 클로닝 방법으로 미생물로부터 유전자원이 확보되면, 이로부터 유용물질을 탐색하는 방법은 염기서열을 토대로 한 탐색방법과 활성을 토대로 한 탐색방법, 2가지로 분류된다. 염기서열을 토대로 한 탐색방법은, 탐색 대상 단백질의 상동성을 바탕으로 PCR 을 이용하거나, 핵산 프로브, 유전자칩 등을 이용하여 라이브러리(library) 내에 대상 유전자가 존재하는지를 확인한다(U.S. Patent Number 6,455,245). 하지만 이 방법은 기존의 밝혀진 단백질들과의 상동성에 기초를 두고 있기 때문에, 결과적으로 이미 밝혀진 단백질과 유사한 기작(mechanism)을 갖는 단백질만을 탐색될 수밖에 없다. 즉 새로운 기작을 갖는 단백질 탐색이 매우 어렵다. 이에 반해 활성을 토대로 한 탐색방법은, 대상 단백질의 상동성과는 독립적로로, 대상 단백질의 활성 자체를 이용하여 때문에, 새로운 기작을 갖는 단백질의 탐색에 매우 유리하다. 하지만 이 탐색방법은 대장균에서 대상의 단백질을 암호화(coding)하는 유전자의 발현이 필수적이다. 하지만 위에서 언급한 대장균에서의 대장균 프로모터 또는 외부 프로모터의 도움 없이는 외래 유전자가 잘 발현되지 않는 현상은, 활성을 토대로 유용 신규 물질을 탐색을 어렵게 하는 가장 큰 문제점 중에 하나이다. 특히 탐색대상이 2차대사 물질같이 여러 유전자의 발현이 요구되는 경우 유전자 발현 문제는 더욱 심각해진다.
이 문제점을 해결하고자, 강력한 대장균 프로모터를 갖는 전위인자(transposable element)를 이용하는 방법(WO/2004/013327)과 클로닝 벡터로써 발현 벡터(J Biotechnol. 127: 575 (2006))를 사용하는 방법이 개발되었다. 하지만 두 가지방법 모두 제공된 대장균 프로모터에 인접한 유전자의 발현은 유도되지만 대장균 프로모터로부터 멀리 떨어져 있을수록 유전자의 발현이 저하되며, 만약 전사 종결신호(transcription terminator)가 존재하면 그 이 후의 유전자는 발현되지 않을 가능성이 높다는 문제점이 지적되고 있다.
전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 숙주 프로모터 또는 외부 프로모터가 도입되지 않아도 숙주균에서 이종 유전자의 발현이 가능하도록 하는 이종 유전자 발현 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 이종 유전자 발현 시스템을 이용하여 간편하게 이종 유전자를 숙주균에서 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 이종 유전자 발현 시스템을 이용하여 경제적으로 이종 유전자 중 유용 유전자를 탐색/분리할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 이종 유전자 발현을 위한 시스템을 갖춘 숙주균, 상기 숙주균을 이용한 이종 세균의 유전자 발현방법 및 이종 세균의 유전자로부터의 유용물질 스크리닝방법에 관한 것이다.
(1) 본 발명에 의한 이종 유전자 발현(heterologous expression)을 위한 시스템을 갖춘 숙주균은 (A) 이종 세균의 시그마 인자 유전자를 함유하고; (B) 숙주균의 시그마 인자의 활성이 배양조건에 따라 조절되는; 특징을 갖는다. 따라서 본 발명은 당연히 특정 숙주균의 시그마 인자가 배양조건에 따라 그 활성이 조절되도록 조작하는 단계; 및 이종 세균의 시그마 인자 유전자를 상기 숙주균에 도입(형질전환 및 유전체에 삽입)하는 단계로 이루어지는 이종 유전자 발현을 위한 숙주균의 제조방법에 관한 것이기도 하다(제1항).
본 발명에서 시그마 인자의 "활성"이 조절된다는 것은 시그마 인자의 발현(따라서 농도)이 조절되거나 활성이 변하는 것을 의미한다.
본 발명은 다음과 같은 원리에 기초한다.
시그마 인자는 RNA polymerase의 구성 요소 중 프로모터의 인식에 가장 중요한 역할을 하는 인자이다. 숙주균의 시그마 인자가 정상적인 조건에서는 이종 세균의 시그마 인자와 숙주균의 시그마 인자가 동시에 존재하더라도, 숙주균의 시그마 인자가 숙주균의 core RNA polymerase에 대해 결합력(affinity)이 더 높다. 따라서 숙주균의 시그마 인자와 숙주균의 polymerase core와 조립(assembly)되어 숙주균의 유전자들이 발현되므로 숙주균이 정상적으로 생장한다. 배양조건에 따라 그 활성이 조절되게 제조된 숙주균에서, 숙주균이 정상적(소정의 농도 이상)으로 생장한 다음 숙주균의 시그마 인자의 활성이 저해되는 조건으로 배양환경을 전환하면, 이종 세균의 시그마 인자가 숙주균 시그마 인자에 의해 차지되지 않은 polymerase core와 조립(assembly)되거나, 이종 세균의 시그마 인자의 결합력이 상대적으로 더 높게 되어 숙주균의 polymerase core와 이종 세균의 시그마 인자가 조립된다. 이렇게 조립된 polymerase는 이종 세균의 프로모터를 인식할 수 있어, 숙주균의 프로모 터가 아닌 이종 세균 자체의 프로모터를 가진 이종 세균의 유전자를 자연스럽게 발현시키게 된다. 결과적으로, 이종 세균의 genomic library 또는 이들 세균이 포함되어 있는 메타게놈 라이브러리(metagenome library) 상의 유전자들을 숙주균의 프로모터 또는 외부 프로모터를 도입하는 과정이 필요 없이 발현을 유도시킬 수 있게 된다.
본 발명에서 "배양조건에 따라 그 활성이 조절되는" 시그마 인자는 "온도 감수성이거나, 특정 물질 의존성이거나 특정 물질에 저해받는 특성 등을 가진" 돌연변이 시그마 인자를 의미한다.
본 발명은 숙주균 프로모터 또는 외부 프로모터의 도움없이 유전자 발현이 가능하기 때문에, 프로모터로부터 멀리 떨어져 있을수록 유전자의 발현이 저하되는 현상이나 transcription terminator의 존재와 무관하게 여러 이종 유전자를 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라, 기존에 재조된 library를 활용함으로써 연구효율을 높일 수 있다.
이러한 숙주균의 예로서 유전적/생리화학적 특성이 많이 알려진 대장균을, 이종 세균의 예로서 다양한 2차대사물질을 생산할 수 있는 것으로 알려진 방선균을 선택할 수 있다. 즉, 본 발명은, ① 상기 숙주균은 대장균이며, ② 상기 이종 세균의 시그마 인자 유전자는 방선균의 시그마 인자 유전자인 hrdB, hrdD 또는 sigE 중의 어느 하나이거나 이들 모두이며, ③ 상기 대장균의 시그마 인자의 유전자는 온도감수성인 rpoD285 유전자인 이종 유전자 발현을 위한 숙주균을 제공한다(제2항). 따라서 본 발명은 당연히 대장균의 주 시그마인자(major sigma factor)의 농도를 조건에 따라 조절 가능한 대장군을 제조하는 단계와, 상기 대장균 또는 보통 대장균에 방선균 시그마 인자를 공급하여, 대장균 core RNA polymerase와 방선균 시그마 인자가 대장균 내에서 재구성시키는 단계로 이루어지는 이종 유전자 발현을 위한 대장균의 제조방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명에 의한 상기 이종 유전자 발현을 위한 숙주균은, 예를 들면 다음과 같이 제조될 수 있다.
본 발명은 대장균에서 외래 유전자(foreign gene) 발현이 잘 되지 않는 문제를 해결함으로써, 미생물 유전자 자원으로부터 인간에게 유용한 신규 물질을 효율적으로 탐색하기 위한 것이다. 본 발명에 있어서, 이종 유전자 발현의 모델 세균은, 다음과 같은 이유로 방선균 및 이와 유사한 high GC gram positive bacteria이니 것이 바람직하다: 1) 이 세균은 항생제를 포함하는 인간에게 유용한 물질을 가장 많이 생산하는 미생물이다. 2) 방선균은 거의 모든 환경에 존재하여, 어떤 환경으로부터 metagenome library를 제조 할 경우, 그 library에 포함될 가능성이 가장 높다. 3) 그럼에도 불구하고 대장군에서 유전자의 발현될 가능성이 가장 낮다.
그러나 본 발명의 heterologous expression system은 다른 세균의 유전자 발현에도 적용될 수 있음은 명백하다.
대장군에서 방선균의 유전자가 발현되지 않는 가장 중요한 원인 중에 하나는, 대장균의 RNA polymerase가 방선균 프로모터를 인식하지 못할 가능성이다. 세균에 있어서, 시그마 인자(sigma factor)는 프로모터 인식에 가장 중요한 요소이다. 따라서 본 발명에서는, 방선균의 시그마 인자(sigma factor) 유전자를 대장균에서 발현함으로써, 대장균 세포 내에 방선균 시그마 인자를 제공한다. 제공되는 시그마 인자는 방선균의 주 시그마 인자 hrdB 뿐 아니라 방선균에 존재하는 minor sigma factor가 될 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 hrdB와 hrdD, sigE를 사용하였다. 발현 벡터는 pMex3를 이용하였으나, 대장균에서 이용되는 타 발현벡터를 이용하거나 chromosome 상에서 발현시킬 수 있음은 당업자에게 있어 당연하다.
대장균 내의 대장균 주 시그마인자의 농도는 core RNA polymerase의 농도보다 높을 뿐 아니라, 대장균의 주 시그마인자의 core RNA polymerase에 대한 affinity는 제공해준 방선균의 시그마인자의 affinity보다 높다. 따라서 효과적인 RNA polymerase의 재구성을 위해 조건에 따라 대장균의 시그마인자의 농도를 조절 가능한 대장군을 제조하였다. 이를 위해 ts (temperature sensitive) rpoD gene인 (rpoD285)유전자(Mol. gen. Genet. 175:251 (1979))를 사용하였다. RpoD285는 30 ℃에서는 정상적인 활성을 보이고, 42 ℃에서 불활성화되며, 37 ℃에서는 중간의 성질을 보인다. 따라서 대장균을 30 ℃에서 배양하다가, 온도를 높이면, 대장균 세포내에 주 시그마 인자의 농도가 낮아져, 공급한 방선균의 시그마 인자는 대장균의 core RNA polymerase와 재구성되는 비율이 높아지고, 이렇게 재구성된 RNA polymerase는 방선균 유전자를 인식하게 된다. 이러한 재구성 효율을 높이기 위해, rpoD285 이외의 다른 ts RpoD를 사용할 수 있다.
(2) 또한 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어지는 이종 세균의 유전자 발현방법에 관한 것이다 : (A) 본 발명에 의한 상기 숙주균에 상기 이종 세균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계; (B) 상기 숙주균의 시그마 인자가 활성화되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계; (C) 이어서 상기 숙주균의 시그마 인자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계.
이에 대한 구체적인 예는 하기 실시예로 설명한다.
(3) 또한 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어지는 이종 세균의 유전자로부터의 유용물질 스크리닝방법에 관한 것이다 : (A) 제1항 또는 제2항에 의한 숙주균에 상기 이종 세균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계; (B) 상기 숙주균의 시그마 인자가 활성화되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계; (C) 이어서 상기 숙주균의 시그마 인자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계; (D) 이어서 상기 배양 결과물로부터 유용물질을 탐색하는 단계.
이에 대한 구체적인 예는 하기 실시예로 설명한다.
(4) 한편 본 발명에 의한 시스템은 발현벡터의 형태로 제작될 수도 있다. 이 경우 본 발명에 의한 발현벡터는, (A) 숙주균의 시그마 인자 및 이종 세균의 시그마 인자 유전자를 함유하고; (B) 상기 숙주균의 시그마 인자의 활성이 숙주균의 배양조건에 따라 조절되는; 것을 특징으로 하는 이종 유전자 발현을 위한 발현벡터이다. 발현벡터는 본 발명의 기술적 사상에 기초하여 다양한 구조(개열지도, 도입된 유전자 등의 다양성)를 가질 수 있으므로 특정 발현벡터를 제안하지는 않는다.
상기 발현벡터는, 숙주균이 대장균이이고, 상기 대장균의 시그마 인자의 유전자는 온도감수성인 rpoD285 유전자이고, 상기 이종 세균의 시그마 인자 유전자는 방선균의 시그마 인자 유전자인 hrdB, hrdD 또는 sigE 중의 어느 하나이거나 이들 모두인 것도 가능하다.
나아가 상기 발현벡터를 이용한 이종 세균의 유전자 발현방법 유용물질 스크리닝방법이 제공된다.
즉, (A)본 발명에 의한 상기 발현벡터를 상기 숙주균에 도입하는 단계; (B) 상기 숙주균에 상기 이종 세균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계; (C) 상기 숙주균의 시그마 인자가 활성화되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계; (D) 이어서 상기 숙주균의 시그마 인자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 이종 유전자가 도입된 숙주를 배양하는 단계;를 포함하는 이종 세균의 유전자 발현방법을 제공한다. 이때 상기 (A)와 (B) 단계는 순서가 바뀔 수 있다.
나아가 (E) 이어서 상기 배양 결과물로부터 유용물질을 탐색하는 단계;를 추 가한다면 이종 세균의 유전자로부터의 유용물질 스크리닝방법으로도 활용될 수 있다.
이하 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
하기 실시예에서 사용된 대장균은 당업계에서 널리 알려진 균주일 뿐만 아니라, 본 발명의 실시에 숙주가 한정될 필요는 없으며, 사용된 벡터나 플라스미드도 당업계에서 널리 알려져 있거나 시판되고 있는 것일 뿐만 아니라 역시 특정한 벡터나 플라스미드에 한정될 필요가 없다. 또한 이들을 활용하여 특정 유전자의 PCR 증폭, 벡터에의 도입, 형질전환 등의 과정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 기법이다. 따라서 본 발명의 실시예에 의해 제작된 형질전환 숙주의 기탁을 생략하였다.
하기 실시예에서 사용된 프라이머 등의 서열을 다음 표 1로 나타내었다.
실시예 1 : 대장균에서 방선균 유전자들의 발현 분석
방선균의 유전자들이 대장균에서 발현되는지 여부를 확인하였다.
먼저 발현분석벡터를 제조하였다(도 1). 벡터 상에 존재하는 대장균의 프로모터의 영향 없이, 방선균 프로모터에 의한 방선균유전자의 발현을 분석하기위해, strong transcription terminator rrrBT1T2와 λtR2-T7Te를 벡터의 multiple 클로닝 site 양 끝에 각각 삽입하였고, 방선균 유전자의 발현 분석을 Western blotting으로 확인하기위해, FLAG tag을 삽입하였다. 방선균 모델 유전자로써, 표 2과 같은 고분자 분해효소를 coding하는 유전자(분해유전자)와 표 3과 같은 2차 대사물질합성 조절 유전자(조절유전자)를 선택하였다. 각 모델 유전자는 coding sequence와 프로모터를 포함하는 regulatory sequence를 포함하였다. 표 2와 같은 PCR primer와 chromosome을 사용하여 모델 유전자들을 PCR 증폭하였고, 분해유전자는 pUC21K에, 2차 조절유전자는 pZC320dZ에 클로닝 하였다. annealing 온도는 표 2 및 3과 같고, 그 외의 조건은 다음과 같다.
<반응 용액>
주형 DNA (50 ng/μl) 1μl
10X reaction buffer 5μl
dNTP (10mM) 1μl
primer F (10 pmol/μl) 1μl
primer R (10 pmol/μl) 1μl
Taq polymerase 1μl
H2O 40μl
<반응 조건>
initial denaturation: 95℃ 5분 1 cycle
denaturation: 95℃ 30초
annealing: 표2,3 30초
elongation: 72℃ 30초 30 cycle
final extension: 72℃ 5분 1 cycle
분해 유전자의 경우 PCR product를 표 2에 제시된 제한효소로 절단 후, 동일한 효소로 절단된 pUC21K와 ligation하여 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 클로닝된 유전자는 염기서열을 결정하여 확인하였다. 조절유전자의 경우, PCR product를 표 3에 제시된 제한효소로 절단 후, 동일한 효소로 절단된 pUC21K에 클로닝한 후 다시 표 3의 제한효소를 이용하여 pZC320dZ에 클로닝하였다.
이렇게 제조된 방선균 유전자를 대장균 DH10b와 w3110에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균은 LB에서 약 12시간 동안 배양한 후 anti-FLAG antibody를 이용하여 Western blotting으로 발현을 분석하였다.
그 결과 도 2에서와 같이 방선균 모델 유전자의 발현이 검출되지 않았다. 이 결과로부터 모델 방선균 유전자는 대장균 프로모터의 도움 없이는 대장균에서 발현되지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 방선균 시그마 인자의 공급
방선균 프로모터를 대장균에서 인식시키기 위해, 방선균의 시그마 인자를 대장균에서 발현시켜, 대장균 내에서 대장균 core RNA polymerase와 방선균 시그마 인자의 재구성(reconstitution)을 시도하였다.
먼저, 방선균의 주 시그마 인자 유전자 hrdB, minor 인자인 유전자 hrdD, sigE를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭 조건은 위와 동일하며, PCR의 annealing 온도와 클로닝시 사용한 제한효소는 표 4와 같다. 증폭된 시그마 인자 유전자는대장균 발현 벡터인 pMex3(도 1)에 클로닝하여 발현시켰다. 시그마 인자를 포함하는 pMex3 플라스미드와 모델 유전자를 함유하는 플라스미드를 DH10b에 동시에 형질전환하여 위와 동일한 조건으로 배양한 후 발현을 분석한 결과 dagA의 발현이 유도되는 것을 발견하였다(도 3).
실시예 3 : 대장균 주 시그마 인자의 조절
보다 효과적인 RNA polymerase의 재구성을 위해 조건에 따라 대장균의 시그마인자의 농도를 조절 가능한 대장군을 제조하였다. 즉 배양조건에 따라 대장균의 주 시그마 인자의 농도를 낮추어 제공된 시그마 인자와 대장균의 core RNA polymerase와의 재구성을 촉진시킬 수 있는 대장군을 제조하였다.
이를 위해 ts (temperature sensitive) rpoD gene인 rpoD285유전자를 대장균 DH10b와 대장균 W3110의 chromosome상의 wild type rpoD 유전자와 치환하였다.
rpoD285 유전자는 대장균 chromosome으로부터 PCR을 이용하여 제조하였다. primer D285-F와 D285-R을 이용하여 증폭된 DNA를 NotI, PstI로 절단하여 1kb의 DNA fragment를 얻었다. 또한 Esig-F와 Esig-R을 이용하여 증폭된 DNA를 PstI과 SalI로 절단하여 830bp의 DNA 절편을 얻었다. 이 두 DNA 절편을 NotI, SalI으로 절단된 replacement 벡터 pKO3 (J. Bacteriology 171: 4617 (1989))에 ligation 하였다. 이렇게 제조된 pKO3-rpoD285를 W3110과 DH10b에 형질전환한 후, double cross-over를 이용하여, chromosome상에서 rpoD285로 치환된 대장균 W3110(rpoD285)과 대장균 DH10b(rpoD285)를 제조하였다.
이와 같은 방법으로 제조된 DH10b(rpoD285) 균주에 방선균 시그마 인자와 조절유전자를 동시에 형질전환한 후 발현을 조사한 결과 도 4, 5 와 같다. 조절유전자 actII-orf4와 redD의 경우, 30℃에서 배양하다가, 37℃로 온도를 올린 경우, 유전자의 발현이 증가되었다(도 4). 분해유전자의 hrdB에 의해 chiA와 chiC가 발현되었으며, hrdD에 의해 dagA가 발현되었다.
이상에서 본 발명에의한 이종 유전자 발현을 위한 시스템을 갖춘 숙주균을 제작하는 것이 가능하며, 이를 활용하여 간편하게 이종 유전자를 숙주에서 발현시킬 수 있고, 나아가 이종 유전자 중 유효 유전자를 용이하게 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 대장균 (E. coli) 또는 다른 세균 숙주 (bacterial host)에서 방선균 (streptomyces) 및 이와 유사한 high GC Gram positive 세균 (high GC Gram positive bacteria) 유래의 genomic library 또는 이들 세균이 포함되어 있는 메타 게놈 라이브러리 (metagenome library) 상의 유전자들을 대장균의 프로모터 (프로모터) 도움 없이 발현을 유도시켜, 활성을 토대로 한 신규 물질 탐색효율을 개선할 수 있는 발현시스템을 제공한다.
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the Strains
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<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for agarase
<400> 1
gcgcggatcc tgaatcgtga ccggcgcgac g 31
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for agarase
<400> 2
tctcggatcc ggtctcgaat ccacggcctg atacgtcctg acccagc 47
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for chitinase
<400> 3
gcgggatccg cactgatcga ccag 24
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for chitinase
<400> 4
gccggtctcg aatccggcag ggcgtgtacg tgc 33
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for chitinase
<400> 5
gcgggatccc gcggtgctcg ac 22
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for chitinase
<400> 6
gccggtctcg aatctccgag gccgctgttg atcg 34
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for protease
<400> 7
gcgggatccg cctcgcggac cagggtgttc 30
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for protease
<400> 8
gccgaagacg caatcgcgct gggaggcctt ctccag 36
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for actinorhodin
<400> 9
gccgaagctt gccgtatcag gaatgccaga ttctattg 38
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for actinorhodin
<400> 10
cggcaagctt gaagacgcaa tccacgagca ccttctcacc gttgag 46
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for undecylprodigiosin
<400> 11
gagcggatcc tctgccctct gaccgcggtg aacatcc 37
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for undecylprodigiosin
<400> 12
tgacggatcc gaagacgcaa tcggcgctga gcaggctggt gtcg 44
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for cephamycin
<400> 13
cgcgaagctt acgggttcat caaccggatg tcc 33
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for cephamycin
<400> 14
taataagctt gaagacgcaa tcggccgggg taccgacccg caggacc 47
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for doxorubicin
<400> 15
tattaagctt ccactaggag aaccagcgcg gc 32
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for doxorubicin
<400> 16
taataagctt gaagacgcaa tccccggctg ctggcccgct gac 43
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for hrdB
<400> 17
gcgcggtctc gtatgtcggc cagcacatcc cgtacgctc 39
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for hrdB
<400> 18
gctcggtctc gcgattagtc gaggtagtcg cgcagcacct gc 42
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for hrdD
<400> 19
gcgcgaattc aagaaggaga tatacatatg gcaacccgtg ccgtcgc 47
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for hrdD
<400> 20
ggcttcgagg cggcggcctg aagcttcgcg 30
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for sigE
<400> 21
gcgcgaattc aagaaggaga tatacatatg ggcgaggtgc tcgagttc 48
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for sigE
<400> 22
cgggagcgtt gcgcggcctg aagcttgcgc 30
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
gtcgcggccg catggagcaa aacccgcag 29
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
gaacaagccg tggtcggaaa aactgcagca g 31
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
gatcgaattc ccaaagagag gacacaatgg agcaaaaccc gc 42
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
cgtagcttcc tggacgatta aggtaccgat c 31
Claims (8)
- 삭제
- (A) 방선균의 시그마 인자 유전자인 hrdB, hrdD 및 sigE 중 하나 이상의 유전자; 및(B) 온도감수성 rpoD285 유전자;를 함유하는 것을 특징으로 하는 방선균 유전자 발현을 위한 대장균.
- (A) 제 2 항에 의한 대장균에 방선균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계;(B) 상기 rpoD285 유전자가 활성화되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(C) 이어서 상기 rpoD285 유전자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 방선균 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방선균의 유전자 발현방법.
- (A) 제 2 항에 의한 대장균에 방선균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계;(B) 상기 rpoD285 유전자가 활성화되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(C) 이어서 상기 rpoD285 유전자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(D) 이어서 상기 배양 결과물로부터 유용물질을 탐색하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방선균의 유전자로부터의 유용물질 스크리닝방법.
- 삭제
- 방선균 유전자 발현을 위한 시스템을 갖춘 발현벡터로서,(A) 대장균의 rpoD285 유전자; 및(B) 방선균의 시그마 인자 유전자인 hrdB, hrdD 및 sigE 중 하나 이상의 유전자;를 함유하는 것을 특징으로 하는 방선균 유전자 발현을 위한 발현벡터.
- (A) 제 6 항에 의한 발현벡터를 대장균에 도입하는 단계;(B) 상기 대장균에 방선균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계;(C) 상기 대장균의 rpoD285 유전자가 활성화되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(D) 이어서 상기 대장균의 rpoD285 유전자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방선균의 유전자 발현방법.
- (A) 제 6 항에 의한 발현벡터를 대장균에 도입하는 단계;(B) 상기 대장균에 상기 방선균의 유전자(유전자군, 게놈 라이브러리, 메타게놈 라이브러리 포함)를 도입하는 단계;(C) 상기 대장균의 rpoD285 유전자가 활성화되는 조건에서 상기 방선균 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(D) 이어서 상기 대장균의 rpoD285 유전자의 활성이 저해되는 조건에서 상기 방선균의 유전자가 도입된 대장균을 배양하는 단계;(E) 이어서 상기 배양 결과물로부터 유용물질을 탐색하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방선균의 유전자로부터의 유용물질 스크리닝방법.
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