KR20190027843A - Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란 - Google Patents

Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란 Download PDF

Info

Publication number
KR20190027843A
KR20190027843A KR1020197003175A KR20197003175A KR20190027843A KR 20190027843 A KR20190027843 A KR 20190027843A KR 1020197003175 A KR1020197003175 A KR 1020197003175A KR 20197003175 A KR20197003175 A KR 20197003175A KR 20190027843 A KR20190027843 A KR 20190027843A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
host cell
genetically engineered
gene
polynucleotide
Prior art date
Application number
KR1020197003175A
Other languages
English (en)
Inventor
쇼운 맨체스터
Original Assignee
지머젠 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 지머젠 인코포레이티드 filed Critical 지머젠 인코포레이티드
Publication of KR20190027843A publication Critical patent/KR20190027843A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/225—Tyrosine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 하나 이상의 RNA 분해/가공 유전자의 변형 발현 또는 개시 코돈 변형을 갖는 신규한 박테리아 균주를 제공한다. 본 발명의 RNA 분해 유전자는 이종성 프로모터에 의해 제어된다. 본 발명은 RNA 분해/가공 유전자에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 서열을 포함하는 미생물 균주를 생성시키는 방법을 추가로 기술한다.

Description

RNA 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란
본 발명은 미생물 게놈 공학에 관한 것이다. 본 방법, 조성물 및 RNA 분해체 섭동에 대한 키트는 선택된 mRNA의 정상 상태 조절을 용이하게하고, 박테리아 균주 생산 효율을 개선시키는 연구자를 보조한다.
박테리아 유전자 발현의 조절은 소정의 유전자로부터의 mRNA의 전사 조절 또는 합성 조절; 번역 제어, 또는 리보솜에 의해 mRNA가 폴리펩타이드 서열로 번역되는 효율의 조절; 및 mRNA 안정성, 또는 세포 내 소정의 mRNA 모집단이 처리되어 비활성 상태로 되는 효율을 포함하는 많은 수준에서 발생한다.
mRNA의 전사 수준을 변경시키는 방법이 널리 연구되어 왔지만, mRNA의 번역 후 정상 상태를 최적화하기 위한 다른 기술은 아직 파악하기가 어렵다.
일부 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어 유전자 서열 및 반응 조건을 변경하여 RNA 안정성을 조절함으로써 산업적 균주 효율을 개선시키는 방법을 교시한다.
본 발명은 산업적 균주 효율을 개선시키는 신규한 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 mRNA 정상 상태를 조절하고, 숙주 균주의 바이오매스 또는 생성물 성능을 향상시킨다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 향상된 산업 성능을 가진 유전자 조작 숙주 세포를 교시하며, 상기 숙주 세포는 a) 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드, 및 b) RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며; 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 유전자는 내인성 유전자이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 외인성 RNA 분해 효소에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 외인성 암호화 폴리뉴클레오타이드는 상이한 종으로부터 유래된 유전자이다. 다른 실시태양에서, 외인성 암호화 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 내인성 유전자이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포의 RNA 분해 효소의 개시 코돈을 돌연변이시키는 것을 교시하며, 여기서 RNA 분해 유전자의 비-돌연변이 된 개시 코돈은 'ATG'또는 'GTG'에서 'TTG'로 변경된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 ATG 개시 코돈을 TTG로 대체시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 ATG 개시 코돈을 GTG로 대체시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 GTG 개시 코돈을 ATG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 GTG 개시 코돈을 TTG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 TTG 개시 코돈을 ATG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양서, 본 발며은 TTG 개시 코돈을 GTG로 대체하는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 조작 숙주 세포를 교시하며, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 조작 숙주 세포를 교시하며, 여기서 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 조작 숙주 세포를 교시하며, 여기서 RNA 분해 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 및 SEQ ID NO: 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 45로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 유전자 숙주 세포를 교시하며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 10), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), c- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 18), d- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 20), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 11), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), g- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), h- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), i- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), j- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 19), k- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), l- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), m- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 12), n- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 15), o- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 17), p- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 19), q- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 14), r- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 13), s- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 19), t- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 21), u- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 14), v- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 20), w- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), x- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9), 및 y- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 18)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 11이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 12이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 13이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 14이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 17이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 20이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 임의의 종의 숙주 세포 유기체와 양립할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 원핵생물 숙주 세포에 적용된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 박테리아 숙주 세포에 적용된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 진핵생물 숙주 세포에 적용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 유전자 조작 숙주 세포가 코리네박테리움 속에 속하는 것을 교시한다. 본 발명의 방법은 유전자 조작 숙주 세포가 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법을 추가로 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 생체 분자는 아미노산, 유기산 또는 알코올이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 및 라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 생산하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙시네이트, 락테이트 및 피루베이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유기산을 생산하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 에탄올 또는 아이소부탄올과 같은 알코올을 생산하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 역가를 나타낼 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 3% 더 높은 생체 분자의 역가를 나타낼 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 6% 더 높은 생체 분자의 역가를 나타낼 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 유전자 조작 숙주 세포의 수율을 결정하기 위해 탄소 소진시 역가를 측정한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2%-10% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 5% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 10% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 20% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생체 분자 생산을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법을 교시하며, 이 방법은 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며; 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율에 비해 높은 생체 분자 수율을 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 포화 바이오매스를 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법을 교시하며, 이 방법은 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며; 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스에 비해 증가된 포화 바이오매스를 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 유전자는 내인성 유전자이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 효소를 암호화하는 내인성 암호화 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 향상된 산업 성능을 갖는 유전자 조작 숙주 세포를 교시하며, 상기 숙주 세포는 a) RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; b) (a)의 폴리뉴클레오타이드의 개시 코돈의 돌연변이를 포함하며; 여기서 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드의 내인성 개시 코돈을 상이한 개시 코돈으로 대체한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 생체 분자의 생산을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법을 교시하며, 상기 방법은 숙주 세포를 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 변형시키는 단계는 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈을 돌연변이시키는 것을 포함하고, 여기서 변형은 RNA 분해 유전자를 발현하는 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며; 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포로부터 생산된 생체 분자의 양과 비교하여 생체 분자의 양을 증가시키며, 여기서 대조군 숙주 세포는 돌연변이 개시 코돈을 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생체 분자 또는 포화 바이오매스의 수율을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법을 교시하며, 상기 방법은 숙주 세포를 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 변형시키는 단계는 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈을 돌연변이시키는 것을 포함하고, 여기서 변형은 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며; 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율과 비교하여 생체 분자 수율을 증가시키거나 또는 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스과 비교하여 보다 높은 포화 바이오매스를 달성하고, 대조군 숙주 세포는 유전자 조작 숙주 세포의 개시 코돈 돌연변이를 포함하지 않으며, 유전자 조작 숙주 세포 및 대조군 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RNA 분해 유전자를 돌연변이시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19를 돌연변이시킨다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 배양액의 바이오매스를 개선하도록 디자인된 특정 이종성 프로모터::RNA 분해 유전자 조합을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID No: 1:: SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 1:: SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 2:: SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 2:: SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 2:: SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 2:: SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 3:: SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 3:: SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 3:: SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 5:: SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 5:: SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 6:: SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 6:: SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 8:: SEQ ID No: 21, 및 SEQ ID No: 8:: SEQ ID No: 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이종성 프로모터::RNA 분해 유전자 조합을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 배양액의 생성물 생산을 개선하도록 디자인된 특정 이종성 프로모터::RNA 분해 유전자 조합을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID No: 2:: SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 3:: SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 6:: SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 6:: SEQ ID No: 11, 및 SEQ ID No: 8:: SEQ ID No: 9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이종성 프로모터::RNA 분해 유전자 조합을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 배양액의 바이오매스를 개선하도록 디자인된 RNA 분해 유전자의 특정 개시 코돈 대체를 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID No: 21의 GTG로부터 TTG, SEQ ID No: 14의 ATG로부터 TTG, SEQ ID No: 19의 GTG로부터 TTG 및 SEQ ID No: 17의 ATG로부터 TTG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RNA 분해 유전자의 개시 코돈 대체를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 배양액의 생성물 생산을 개선하도록 디자인된 RNA 분해 유전자의 특정 개시 코돈 대체를 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID No: 21의 GTG로부터 TTG, SEQ ID No: 10의 ATG로부터 TTG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RNA 분해 유전자의 개시 코돈 대체를 교시한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 형질전환 플라스미드의 조립 및 숙주 유기체로의 이들의 통합을 나타낸다. 삽입체 DNA는 하나 이상의 합성된 올리고를 조립 반응에서 결합함으로써 생성된다. 원하는 서열을 함유하는 DNA 삽입체는 게놈의 표적화된 영역과 상동성을 갖는 DNA의 영역의 측면에 위치한다. 이러한 상동성 영역은 게놈 통합을 촉진하고 일단 통합되면 후속 단계에서 벡터 백본 DNA를 루핑 아웃(looping-out)하도록 디자인된 직접 반복 영역을 형성한다. 조립된 플라스미드는 삽입체 DNA 및 임의로 하나 이상의 선택 마커를 함유한다.
도 2는 숙주 균주로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하기 위한 절차를 도시한다. 삽입된 DNA 및 숙주 게놈의 직접 반복 영역은 재조합 사건에서 "루프 아웃"될 수 있다. 선택 마커에 대해 선택된 세포 계수기는 직접 반복 영역이 측면에 위치하는 루프 DNA의 결실을 포함한다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 방법에 따른 여러 RNA 분해 유전자 교란 실험의 결과를 나타낸다. 선택된 RNA 분해 효소 유전자에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 조작 처리 숙주 세포의 성능이 측정되었다. 그래프 상의 막대는 대조군 배양액에 대한 유전자 조작 숙주 세포의 포화 바이오매스 또는 생산 수율의 백분율 변화를 나타낸다. 대조군 배양액은 본 발명의 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터가 결여된 것을 제외하고는 유전자 변형 배양액과 유전적으로 동일 하였다. 오차 막대는 두 표준 편차를 나타낸다. 결과는 데이터의 크기를 수용하기 위해 도 3a 및 3b에 걸쳐 펼쳐진다.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 여러 RNA 분해 유전자 교란 실험의 결과를 나타낸다. 선택된 RNA 분해 효소 상에 돌연변이된 개시 코돈을 포함하는 유전자 조작 처리 숙주 세포의 성능이 측정되었다. 그래프 상의 막대는 대조군 배양액에 대한 유전자 조작 숙주 세포의 포화 바이오매스 또는 생산 수율의 백분율 변화를 나타낸다. 대조군 배양액은 본 발명의 돌연변이된 개시 코돈이 결여된 것을 제외하고는 유전자 변형 배양액과 유전적으로 동일하였다. 오차 막대는 두 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법에 따른 여러 RNA 분해 유전자 교란 실험의 생성물 수율 결과를 나타낸다. 선택된 RNA 분해 효소에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 유전자 조작 처리 숙주 세포의 성능이 측정되었다. 그래프 상의 막대는 대조군 배양액에 대한 유전자 조작 숙주 세포의 생산 수율의 백분율 변화를 나타낸다. 대조군 배양액은 본 발명의 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터가 결여된 것을 제외하고는 유전자 변형 배양액과 유전적으로 동일하였다. 오차 막대는 두 표준 편차를 나타낸다.
정의
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "세포 생물", "미세유기체" 또는 "미생물"은 광범위하게 이해되어야 한다. 이 용어들은 상호 교환적으로 사용되나 두 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "미세유기체" 또는 "세포유기체" 또는 "미생물"을 의미한다. 이런 특성화는 표와 도면의 확인된 분류학적 속과 확인된 분류학적 종뿐만 아니라 상기 표 또는 도면의 임의의 유기체의 다양한 신규하고 새로운 확인된 또는 디자인된 균주를 의미할 수 있다. 동일한 특성화는 실시예에서와 같이, 명세서의 다른 부분에서 이런 용어의 인용에 대해서도 마찬가지이다.
용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵 또는 다른 세포 기관을 함유하지 않는 세포를 의미한다. 원핵 생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
"진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 세포 기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군(Eukarya 또는 Eukaryota)에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(상기 박테리아와 고세균)와 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
용어 "고세균"은 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음)이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
"박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"는 원핵 생물의 영역을 의미한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개위 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이크로콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라미디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
용어 "유전자 변형된 숙주 세포", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되고 본 발명의 복제 및 변형 방법에 의해 유전자 변형된 미생물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 미생물과 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 세포(예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 곰팡이 세포, CHO, 인간 세포 등)를 포함한다. 이 용어는 문제의 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 핵산의 삽입 또는 결실에 의한) 숙주 세포 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
용어 "균주 개선 프로그램"은 숙주 세포 배양을 개선시키기 위한 임의의 방법을 의미한다. 예를 들어, 본 발명은 개선된 성능을 나타내기 위해 숙주 세포를 유전자 조작하는 방법을 교시한다.
용어 "야생형 미생물"은 자연에서 발생하는 세포, 즉 유전자 변형되지 않은 세포를 기술할 수 있다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 숙주 세포"는 유전자 변형 또는 실험적 처리의 효과를 측정하기 위한 적절한 비교기 숙주 세포를 의미한다. 일부 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 다른 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 처리 숙주 세포를 분화시키는 유전자 변형을 제외하고, 유전자 변형된 숙주 세포와 유전적으로 동일하다. 따라서, RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 본 발명의 유전자 변형 유기체에 대한 대조군은 이종 프로모터가 없이 유전적으로 동일한 유기체일 수 있다.
용어 "RNA 분해 유전자" 또는 "RNA 데그라도솜"은 광범위하게 해석되어야 한다. 이 용어는 상호 교환적으로 사용되며 생체 내 RNA 분해, mRNA 전사체 가공 또는 mRNA 안정성의 변형을 가져 오는 기타 기능과 관련된 원핵 또는 진핵 생물 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 유전자는 표 1에 개시된 단백질 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "RNA 데그라도솜 유전자" 또는 "RNA 분해 유전자"를 언급한다. 이 특성화는 표와 도면의 특정 유전자뿐만 아니라 상동체, 오솔로그(orthologs), 패럴로그(paralogs), 또는 이의 변이체를 의미한다. 동일한 특성화는 실시예와 같이 명세서의 다른 부분에서 이 용어를 인용할 때도 마찬가지이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 표 12에 개시된 RNA 분해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "표현형"은 개체의 유전적 구성(즉, 유전자형)과 환경 사이의 상호작용으로부터 기인하는 개별 세포, 세포 배양, 유기체 또는 유기체의 그룹의 관찰 가능한 특성을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 단백질 서열을 기술할 때 용어 "키메라" 또는 "재조합체"는 적어도 2개의 이종 폴리 뉴클레오타이드 또는 2개의 이종 폴리펩타이드를 단일 거대분자 속에 연결하거나 적어도 하나의 천연 핵산 또는 단백질 서열의 하나 이상의 요소를 배열하는 핵산 또는 단백질 서열을 의미한다. 예를 들어, 용어 "재조합체"는 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전 공학 기술에 의한 핵산의 분리된 단편의 조작에 의해 서열의 두 개의 분리된 단편의 인공적 조합을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "합성 뉴클레오타이드 서열"또는 "합성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 알려지지 않았거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 서열이다. 일반적으로, 이런 합성 뉴클레오타이드 서열은 임의의 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 뉴클레오타이드 차이를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미할한다. 이 용어는 분자의 1 차 구조를 의미하고, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 단편을 의미한다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동의" 또는 "상동체" 또는 "오솔로그"는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 의미할 수 있다. 용어 "상동성", "상동의", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교될 수 있다. "상동 서열" 또는 "상동체" 또는 "오솔로그"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되고, 믿거나 알려져 있다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 7.71에서 논의된 바와 같은 당해분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수있다. 일부 정렬 프로그램은 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하는 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미한다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 함유한다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 변형"은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및 또는 삽입을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 것이다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩타이드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 바람직하게는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 중합화제의 존재 하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
용어 "엄격성" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 하이브리드의 안정성에 영향을 주는 혼성화 조건, 예를 들어 온도, 염 농도, pH, 포름아마이드 농도 등을 의미할 수 있다. 이러한 조건은 특이적 결합을 최대화하고 표적 핵산 서열에 대한 프라이머 또는 프로브의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 경험적으로 최적화된다. 사용된 용어는 프로브 또는 프라이머가 다른 서열보다 검출 가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 배경보다 적어도 2배) 이의 표적 서열에 혼성화될 조건에 대한 언급을 포함한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서 상이할 것이다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브 또는 프라이머에 하이브리드화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M Na+ 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 50개 초과 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 불안정화제의 첨가로 성취될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건 또는 "감소된 엄격한 조건"은 37℃에서 30% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에 의한 하이브리드화 및 40℃에서 2 x SSC의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격 조건은 37℃에서 50% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS에서 하이브리드화 및 60℃에서 0.1 x SSC 세척을 포함한다. 하이브리드화 절차는 당업계에 주지되어 있으며 예를 들어, Ausubel et al., 1998 and Sambrook et al., 2001에 의해 기술된다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건은 1 mM Na2EDTA, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%와 같은 45℃의 0.5-20% 황산 도데실 나트륨을 함유하는 0.25 M Na2HPO4 완충액(pH 7.2)에서의 하이브리드화, 및 뒤이은 55℃ 내지 65℃에서 0.1%(w/v) 황산 도데실 나트륨을 함유하는 5 x SSC 세척이다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성될 수 있고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 불린다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 완전히 유도되거나 자연계에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성되거나 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 프로모터를 의미한다. 이러한 특성화는 특정 프로모터뿐만 아니라 이의 변이체를 의미할 수 있다. 동일한 특성화는 실시예에서와 같이, 명세서의 다른 부분에서 이런 용어의 인용에 대해서도 마찬가지이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 특정 프로모터::유전자 조합의 사용을 교시한다.
본 발명에 사용된 용어 "이종성" 또는 "이종성 프로모터"는 특정 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 의미한다. 서열은 또한 정상적인 서열 컨텍스트 외부에 배치되는 경우 이종일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 "이종성 프로모터"는 상이한 종 또는 균주로부터 유래된 프로모터일 수 있거나, 또는 동일한 종으로부터 유래되었지만 유전자 조작된 숙주 세포 내의 다른 위치에 삽입된 프로모터 서열일 수 있다 .
본 발명에 사용된 용어 "내인성", "내인성 유전자" 또는 "내인성 RNA 분해 유전자"는 숙주 세포 게놈 내에서 발견되는 위치에서 유전자의 자연 발생 복제물을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 이종 프로모터를 내인성 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 것은 그 유전자가 자연적으로 존재하는 위치에서, RNA 분해 유전자 앞에 이종 프로모터 서열을 유전적으로 삽입하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어, "외인성"은 "이종성"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용되고, 천연 출처 이외의 일부 출처로부터 유래하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 용어 "외인성 단백질" 또는 "외인성 유전자"는 비천연 출처 또는 위치로부터이며 인위적으로 생물학적 시스템에 공급된 단백질 또는 유전자를 의미한다. 내인성 유전자의 인위적 돌연변이 변이체는 본 발명을 위해서 "외인성"으로 간주된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-라이신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 이 내용에서 추가 폴리뉴클레오타이드의 전사를 초래하는 추가의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의한 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 순차적 배열을 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터 서열은 유전자의 5'UTR 또는 오픈 리딩 프레임 직전에 삽입된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열 및 유전자 서열은 하나 이상의 링커 뉴클레오타이드에 의해 분리된다.
용어 "탄소원"은 일반적으로 세포 성장을 위한 탄소원으로 사용되기에 적합한 물질을 의미한다. 탄소원은 바이오매스 가수분해물, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 자일로오스 및 리그닌뿐만 아니라 이들 기질의 단량체 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 탄소원은 폴리머, 탄수화물, 산, 알코올, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 펩타이드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 다양한 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트로스(D-글루코오스), 말토오스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 포화 또는 불포화 지방산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물과 같은 다양한 모노사카라이드를 포함한다. 광합성 유기체는 광합성의 산물로서 탄소원을 추가로 생산할 수 있다. 일부 실시태양에서, 탄소원은 바이오매스 가수분해물 및 글루코오스로부터 선택될 수 있다.
용어 "공급원료"는 미생물 또는 발효 공정에 공급되는 원료 또는 원료의 혼합물로서 다른 생성물이 제조될 수 있는 것으로 정의된다. 예를 들어, 바이오매스 또는 바이오매스에서 유도된 탄소 화합물과 같은 탄소 공급원은 발효 공정에서 관심 생성물(예를 들어, 작은 분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)을 생산하는 미생물의 공급원료이다. 그러나, 공급원료는 탄소원 이외의 영양분을 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "관심 생성물" 또는 "생체 분자"는 원료로부터 미생물에 의해 생성된 임의의 생성물을 의미한다. 일부 경우에, 관심 생성물은 작은 분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체 분자는 임의의 1차 또는 2차 세포외 대사산물일 수 있다. 1차 대사산물은 특히 에탄올, 시트르산, 락트산, 글루탐산, 글루탐산염, 라이신, 트레오닌, 트립토판 및 다른 아미노산, 비타민, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 2차 대사산물은 특히 페니실린과 같은 항생물질 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리세오풀빈과 같은 살균제 등일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체 분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 글루코오스 아이소머라제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토 키나아제 및 여러 다른 것을 포함하는 미생물 효소와 같은 미생물에 의해 생성된 임의의 세포내 성분일 수 있다. 세포내 성분은 또한 인슐린, B형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니-자극 인자, 스트렙토키나아제 및 기타와 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "체적 생산성" 또는 "생산 속도"는 단위 시간당 매질의 체적당 형성된 생성물의 양으로 정의된다. 체적 생산성은 시간당 리터 당 그램(g/L/h)으로 보고될 수 있다.
용어 "비 생산성"은 생성물의 형성 속도로 정의된다. 비 생산성은 본 발명에서 시간당 세포 건조 중량(CDW)의 그래당 그램 생성물(g/g CDW/h)의 비 생산성으로서 더 정의된다. 소정의 미생물에 대한 OD600에 대한 CDW의 관계를 사용하여, 비 생산성은 시간당 600nm(OD)(g/L/h/OD)에서 배양액의 광학 밀도당 배양 배지당 그램 생성물로 표현될 수 있다.
용어 "수율"은 원료의 단위 중량당 수득된 생성물의 양으로 정의되며 g 기질 당 g 생성물(g/g)("생성물 수율")로 표현될 수 있다. 수율은 이론적 수율에 대한 실제 수율의 백분율("백분율 수율")로 표현될 수 있다. "이론적 수율"은 생성물을 제조하는데 사용된 신진대사 경로의 화학양론에 따라 결정된 소정량의 기질당 생성될 수 있는 최대 생성물로 정의된다.
용어 "역가(titre 또는 titer)"는 용액의 강도 또는 용액 속의 물질의 농도로 정의된다. 예를 들어, 발효액에서 관심 생성물(예를 들어, 작은 분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 역가는 발효액 리터당 용액 속 관심 생성물의 g(g/L)로 기술된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 배양액의 바이오매스가 임의의 시간(예를 들어, 미리 결정된 배양 시간 후 또는 탄소 소모시의 역가 측정)에서 측정될 수 있음을 교시한다. 탄소 소진시 측정된 역가는 또한 이런 조건에서 배양약의 수율을 반영하는 것으로 간주된다.
용어 "총 역가"는 용액 속의 관심 생성물, 적용 가능한 경우 기체상의 관심 생성물, 및 공정으로부터 제거되고 공정에서 최초 부피 또는 공정에서 작동 부피에 따라 회수된 임의의 관심 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 공정에서 생산된 모든 관심 생성물의 합으로 정의된다.
용어 "바이오매스"는 배양액의 세포 밀도를 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양액의 바이오매스는 600nm 스펙트럼에서 배양액의 광학 밀도 - 유기체가 없는 상응하는 대조 배지의 광학 밀도에 의해 결정된다. 다른 실시태양에서, "바이오매스"는 세포 밀도(예를 들어, 혈구계를 통한) 또는 배양 배지로부터 세포를 분리한 후 배양액 중량과 같은 다른 측정 기준에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 배양액의 바이오매스가 언제든지 측정될 수 있음을 교시한다.
용어 "포화 바이오매스"는 소정의 조건 설정하에서 숙주 세포에 의해 달성 된 최대 바이오매스를 의미한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 포화 매스는 특정 온도 및 광 조건에서 특정 성장 배지에서 배양액에 의해 달성된 최대 바이오매스를 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 동일한 성장 조건하에서 다양한 변형된 미생물의 포화 바이오매스를 비교하여, 포화 바이오매스의 임의의 차이가 테스트된 미생물 사이의 근원적인 유전적 차이에 기인한다.
유전자 발현 최적화
일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 유전자 발현의 조절을 통해 숙주 세포 생산성을 개선시키는 방법을 교시한다. 유전자 발현은 RNA 합성의 전사 제어, mRNA 안정성, 단백질로의 mRNA 번역 및 단백질 안정성을 포함하는 다단계 조절 과정의 측정 가능한 결과이다. 유전자의 전사 조절(예를 들어, 프로모터를 변경하거나 조절 전사 인자를 유도함으로써)을 통한 유전자 발현의 제어에 많은 관심이 있었지만, 바람직한 유전자의 전사 후 조절을 이해하는데 거의 노력이 이루어지지 않았다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 유기체의 RNA 분해 유전자(예를 들어, RNA 데그라도솜)를 교란시킴으로써 바람직한 유전자의 세포 발현을 개선시키는 방법을 교시한다. RNA의 데그라도솜은 mRNA를 포함하는 세포 내 RNA의 분해를 담당하며, 세포 내 RNA의 정상 상태 농도에 중요한 역할을 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 바람직한 유전자의 전사 속도를 증가시키는 것이 항상 원하는 단백질의 증가된 발현을 유도하지 않는다는 발명자의 인식에 부분적으로 기초한다. 원핵 생물에서, 전사와 번역 사이의 밀접한 결합은 mRNA의 안정성에 중요하다. 예를 들어, 원핵 생물 mRNA가 빠른 T7 RNAP에 의해 증가된 전사를 통해 과도하게 발현되는 경우, 길게 늘어난 리보솜-제거 메시지(ribosome-free message)가 발생하여 번역되지 않은 mRNA가 불안정하게 한다. (Makarova, O. V. et al. (1995) "Transcribing of　Escherichia coli　genes with mutant T7 RNA polymerases: stability of lacZ mRNA inversely correlates with polymerase speed"　Proc Natl Acad Sci USA　92: 12250-12254).
임의의 한 이론에 구속되기를 바라지 않고, 본 발명자들은 세포의 RNA 분해 유전자의 조절이 선택된 관심 유전자의 mRNA 안정성을 최적화함으로써 세포 효율을 향상시킬 수 있다고 믿는다. 정상 상태의 RNA 농도는 mRNA의 경우 단백질 생산을 위한 주형으로서의 역할 또는 비 암호화(nc) RNA를 통한 mRNA 생산의 조절을 포함하는 다양한 메커니즘을 통해 여러 세포 표현형에 영향을 미친다. 데그라도솜은 RNA 분해의 허브 역할을 하고 상이한 유형의 RNA에 대해 다양한 범위로 작동하는 다양한 상이한 단백질로 구성되기 때문에, 데그라도솜에서 유전자의 체계적 교란은 복잡한 전사체 폭 넓은 효과를 가질 수 있으며 따라서 표현형에 복잡한 효과를 가질 수 있다. 높은 처리량으로 관심 표현형에 대한 각 교란의 효과를 결정하는 방법과 결합하여, 본 발명은 다양한 표현형에 걸쳐 미생물 성능을 개선시키는 교란의 발견 및 적층을 허용한다.
RNA 데그라도솜 및 RNA 분해 유전자
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 및 유전자 가공을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 유전자는 RNA 데그라도솜의 일부이다. 대장균의 RNA 데그라도솜은 RNase E를 정제하고 특성화하려는 노력 동안 발견된 다중 효소 복합체이다(Carpousis, A. J. et al. (1994) "Copurification of　E. coli　RNAase E and PNPase: evidence for a specific association between two enzymes important in RNA processing and degradation"　Cell　76: 889-900; Carpousis, A. J. et al. (1999) "mRNA degradation A tale of poly(A) and multiprotein machines"　Trends Genet　15: 24-28; Miczak, A. et al. (1996) "Proteins associated with RNase E in a multicomponent ribonucleolytic complex"　Proc Natl Acad Sci USA　93: 3865-3869).
RNase E는 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제이며, 대장균 메신저 RNA 붕괴에서 주요 엔도뉴클레아제로 생각된다(Regnier, P. and Arraiano, C. M. (2000) "Degradation of mRNA in bacteria: emergence of ubiquitous features"　Bioessays　22: 235-244). RNase E는 1061 잔기의 큰 단백질이며, 핵산 분해 활성이 단백질의 N 말단 절반에 존재한다. 단백질의 C 말단 절반은 프롤린이 풍부한 링커, 아르기닌이 풍부한 RNA 결합 도메인(RBD), 및 데그레도솜의 다른 구성 요소와의 단백질-단백질 상호 작용을 위한 스캐폴드(scaffold)인 영역을 포함한다(Carpousis, A.J. 2007 "The RNA Degradosome of Escherichia coli: An mRNA-Degrading Machine Assembled on RNase E" Annu. Rev. Microbiol. 61:71-87).
RNase E와 관련된 단백질은 진정세균계 전체와 일부 식물에서 발견된다(Condon, C. et al. (2001) "Identification of the gene encoding the 5S ribosomal RNA maturase in　Bacillus subtilis: mature 5S rRNA is dispensable for ribosome function"　RNA　7: 242-253). 식물 상동체는 아마도 진정세균 기원의 세포 기관인 엽록체에 있다. RNase E 기반 데그라도솜이 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)에서 최근에 동정되었다(Jager, S. et al. (2001) "An mRNA degrading complex in Rhodobacter capsulatus" Nucleic Acids Res　29: 4581-4588).
RNAse E 복합체는 2개의 DEAD 단백질 및 전사 종결 인자 Rho 및 PNPase 및 에놀라제를 함유하는 것으로 생각된다(Carpousis, A.J. 2007 "The RNA Degradosome of Escherichia coli: An mRNA-Degrading Machine Assembled on RNase E" Annu. Rev. Microbiol. 61:71-87). 대장균은 RNase G로도 알려진 RNase E의 패럴로그를 암호화한다(Li, Z. et al. (1999) "RNase G (CafA protein) and RNase E are both required for the 5' maturation of 16S ribosomal RNA"　Embo J　18: 2878-2885.). 대장균은 RNase E의 N-말단 촉매 도메인과 현저한 상동성을 가지만, c-말단 절반이 없기 때문에 더 작다. 따라서 'RNase E/G' 단백질 계열은 데그라도솜을 형성할 수 있는 대형 RNase E 유사 효소 및 단독으로 명백하게 작용하는 소형 RNase G 유사 효소와 같은 두 그룹으로 나뉠 수 있다.
데그라도솜의 다른 필수 구성 요소는 에놀라제, RNA 헬리카제(RhlB) 및 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제(PNPase)이다. RhlB는 RNA 헬리카제의 DEAD-box 계열의 구성원이다(Schmid, S. R., and Linder, P. (1992) "D-E-A-D protein family of putative RNA helicases Mol Microbiol　6: 283-291). 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제인 PNPase는 3'→ 5' RNA 분해 효소의 RNase PH 계열의 구성원이다(Deutscher, M. P., and Li, Z. (2001) "Exoribonucleases and their multiple roles in RNA metabolism"　Prog Nucleic Acid Res Mol Biol　66: 67-105; Symmons, M., Williams et al. (2002) "Running rings around RNA: a superfamily of phosphate-dependent RNases"　Trends Biochem. Sci.,　27: 11-18). 두 계열의 구성원은 광범위한 원핵 생물 및 진핵 생물에서 발견된다.
시험관내 실험은 데드라도솜 내의 RhlB가 PNPase에 의한 구조화된 RNA의 분해를 촉진한다는 것을 입증하였다(Coburn, G. A. et al. (1999) "Reconstitution of a minimal RNA degradosome demonstrates functional coordination between a 3' exonuclease and a DEAD-box RNA helicase"　Genes Dev　13: 2594-2603; Py, B. et al. (1996) "A DEAD-box RNA helicase in the　Escherichia coli　RNA degradosome" Nature　381: 169-172).
Rho I 효소(Rho 인자)는 mRNA 발현 및 Rho 의존성 전사 종결의 다른 중요한 조절 인자이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 Rho을 교란시키는 방법을 교시한다. Rho-의존성 전사 종결은 대장균 전사된 유전자의 약 절반을 조절하는 역할을 한다. 대장균에서 발견된 다른 종결 인자는 Tau와 nusA를 포함한다(Sandy B. Primrose and Richard Twyman (2006) "Principles of Gene Manipulation and Genomics" John Wiley & Sons ISBN 1-4051-3544-1 참조). Rho는 전체 헥사머 주위로 연장되는 단일 파편 주위에 핵산을 감싸서 기능하는 ATP 의존적 헥사메릭 헬리 카제 계열의 구성원이다. Rho는 RNA에 결합하고 하이브리드 이중 구조를 풀어 전사 종결을 유도하는 RNA-DNA 나선형 영역에 도달할 때까지 RNA를 따라 전위하도록ATPase 활성을 사용하여 에너지를 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 스트레스 조건에서 유전자 발현과 관련되어있는 CshA와 같은 다른 DEAD-박스 헬리카제의 사용을 교시한다(Oun, S. et al. "The CshA DEAD-box RNA helicase is important in quorum sensing control in Staphylococcus aureus. RNA Biol. 2013 10(1): 157-165; Hunger, K. et al. "Cold-Induced Putative DEAD Box RNA Helicases CshA and CshB Are Essential for Cold Adaptation and Interact with Cold Shock Protein B in　Bacillus subtilis" J Bacteriol. 2006 188(1): 240-248).
RNA 정상 상태에 대한 조절 효과를 갖는 다른 헬리카제도 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 발명은 rhlE 유전자의 교란을 교시한다. 대장균에서 RhlE RNA 헬리카제는 리보솜 조립 과정에서 관련 RNA 헬리카제의 기능을 조절한다(Jain, C. "The　E. coli　RhlE RNA helicase regulates the function of related RNA helicases during ribosome assembly" RNA. 2008 14(2) 381-389).
일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 효소는 선택된 단백질 샤폐론 유전자를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 groEL 및 groEL2 유전자를 교시한다. GroEL은 열 충격 단백질인 hsp60 계열의 구성원이다. GroEL은 각각의 모노머 서브 유닛이 약 57 kD의 분자량을 갖는 테트라데카머이다. GroEL은 두 가지 메커니즘을 통해 여러 단백질의 접힘을 촉진한다; (1) 부분적으로 접힌 단백질에 결합함으로써 응집을 방지하고(Goloubinoff P et al (1989) Nature 342 : 884-889, Zahn R 및 Pluickthun A (1992) Biochemistry 21 : 3249-3255), 그런 후에 GroEL에 다시 접혀서 천연 유사 상태가 된다(Zahn R and Pluckthun A (1992) Biochemistry 21 : 3249-3255, Gray TE 및 Fersht AR (1993) J Mol Biol L : 1197-1207); 및 (2) 잘못 접힌 단백질을 재접힘이 다시 시작될 수 있는 상태로 펼쳐서 잘못 접힌 단백질을 연속적으로 어닐링한다(Zahn R et al (1996) Science 271 : 642-645). 정점 도메인의 일부 돌연변이는 폴리펩타이드 결합의 감소를 가져왔으며(Fenton W A et al (1994) Nature 371 : 614-619), 이는 이 도메인이 폴리펩타이드의 결합에 관여 함을 시사한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 DnaK의 교란을 교시한다. DnaK는 샤페론 단백질 DnaK 및 DnaJ 및 GrpE와 같은 다양한 코-샤프론 단백질을 포함하는 다중 단백질 박테리아 샤페론 시스템에서 중심 단백질임이 입증되었다. 코-샤프론 단백질은 천연 및 비 천연 기질의 효율적인 생리학적 처리에 필수적이다. 이 샤프론 시스템에 대한 하나의 역할은 열 충격 반응에서 이 시스템의 역할로부터 명백한 바와 같이 펼쳐지거나 잘못 접힌 박테리아 단백질의 재접힘에 촉매 작용을 미치는 것이다. DnaK 샤페론 시스템의 추가적인 역할은 특정 RNA 중합효소 서브 유닛의 처리를 통한 유전자 발현의 조절이다.
일부 실시태양에서, 유전자 발현과 관련된 다른 유전자는 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 gpsI을 교시한다. GpsI는 구아노신 펜타인산염 합성 및 폴리리보뉴클레오타이드 뉴클레오티딜트랜스페라제에 관여된 추정 다기능 효소이다. 대장균 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제인 정제된 GPSI는 ADP의 중합 및 폴리 (A)의 인산 분해에 촉매 작용을 미치는 것으로 나타났다(Jones, G. and Bibb, M. "Guanosine Pentaphosphate Synthetase from Streptomyces antibioticus Is Also a Polynucleotide Phosphorylase" J. of Bact. 1996 July 4281-4288.).
다른 실시태양에서, 본 발명은 에놀라제(eno)를 교시한다. 포스포피루베이트 수화효소라고도 알려진 에놀라제는 당화의 9번째 및 최종 직전 단계인 2-포스포글리세레이트(2-PG)의 포스포에놀피루베이트(PEP)로의 전환의 촉매 작용을 담당하는 금속 효소이다. (예를 들어, 미국 특허 제7,118,904호 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 RNA 분해 유전자를 교란시킴으로써 숙주 세포의 유전자 발현을 조절하는 것을 교시한다. 당업자는 본 개시의 RNA 분해 유전자 교란은, 일부 실시태양에서, 특정 세포 표현형을 최적화할 목적으로 RNA 데그라도솜의 구성원인 단백질의 변형을 위한 임의의 방법을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, RNA 분해 유전자의 교란은 유전자 서열 자체의 지시된 또는 무작위 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, RNA 분해 유전자의 교란은 돌연변이된 내인성 또는 외인성 프로모터로 발현을 조절하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 RNA 분해 유전자의 비 한정적인 목록은 하기 표 1에 제공된다.
본 발명의 선택된 RNA 분해 유전자
종 유전자 명칭 SEQ ID
(cDNA) 		SEQ ID
(단백질) 		Gene "단축 명칭"
Corynebacterium glutamicum cg1144 9 34 G1
Corynebacterium glutamicum cg2453 10 35 G2
Corynebacterium glutamicum cshA 11 36 G3
Corynebacterium glutamicum dnaK 12 37 G4
Corynebacterium glutamicum eno 13 38 G5
Corynebacterium glutamicum gpsI 14 39 G6
Corynebacterium glutamicum groEL 15 40 G7
Corynebacterium glutamicum groELhomolog 16 41 G8
Corynebacterium glutamicum groEL2 17 42 G9
Corynebacterium glutamicum mutM2 18 43 G10
Corynebacterium glutamicum rhlE 19 44 G11
Corynebacterium glutamicum rho 20 45 G12
Corynebacterium glutamicum rne(RNAse E) 21 46 G13
Corynebacterium glutamicum cg2160/ RNAse J 22 47 G14
일부 실시태양에서, 본 발명의 RNA 분해 유전자는 표 1의 유전자(cDNA 또는 단백질)와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
프로모터
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 기능을 조절하고 전체 숙주 균주 생산성에 유익한 효과를 나타내기 위해 최적 발현 특성을 갖는 프로모터를 선별하는 방법을 교시한다.
프로모터는 유전자가 전사되는 속도를 조절하고 다양한 방식으로 전사에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 프로모터를 확인 및/또는 다양한 발현 강도(예를 들어, 아래에서 논의되는 프로모터 래더) 또는 뛰어난 조절 특성(즉, 선택된 유전자에 대한 보다 엄격한 조절 제어)을 나타내는 숙주 세포 내 하나 이상의 프로모터의 변이체를 생성시키는 방법을 교시한다.
예를 들어, 구조성 프로모터는 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 비율로 관련 유전자의 전사를 지시하지만, 조절 가능한 프로모터는 내부 및/또는 외부 세포, 예를 들어, 성장 속도, 온도, 특정 환경 화학물질에 대한 반응 등에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가 또는 감소시킨다. 프로모터는 정상적인 세포 컨텍스트로부터 격리될 수 있으며 사실상 모든 유전자의 발현을 조절하도록 조작되어 세포 성장, 생산 수율 및/또는 기타 관심 표현형의 효과적인 변형을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다양한 발현 강도(예를 들어, 아래에서 논의된 프로모터 래더) 또는 뛰어난 조절 특성(즉, 선택된 유전자에 대한 엄격한 조절 제어 또는 특정 조건에 대한 반응)을 나타내는 하나 이상의 프로모터를 확인 및/또는 숙주 세포 내에서 하나 이상의 프로모터의 변이체를 생성시키는 방법을 교시한다. 이들 확인된 및/또는 생성된 프로모터의 특정 조합은 보다 상세히 이하에서 설명된 RNA 분해 교란 실험에 사용하기 위한 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 다양한 발현 강도를 갖는 관심 표적 유전자와 관련된 천연, 고유 또는 야생형 프로모터를 동정함으로써 생성된다. 이런 동정된 프로모터는 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 관심 표적 유전자와 관련된 천연, 고유 또는 야생형 프로모터를 동정한 다음 상기 프로모터를 돌연변이시켜 다수의 돌연변이 프로모터 서열을 유도함으로써 생성된다. 이들 돌연변이된 프로모터의 각각은 표적 유전자 발현에 대한 효과에 대해 테스트된다. 일부 실시태양에서, 편집된 프로모터는 다양한 조건에 걸쳐 발현 활성에 대해 테스트되어 각 프로모터 변이체의 활성이 문서화/특징화/주석처리되고 데이터베이스에 저장된다. 생성된 편집된 프로모터 변이체는 뒤이어 그 발현의 강도에 기초하여 배열된 프로모터 래더로 조직화된다(예를 들어, 상부 근처의 고도로 발현된 변이체 및 하부 근처의 약화된 발현에 의해, 따라서 "래더"라는 용어를 유도한다).
일부 실시태양에서, 본 발명은 확인된 자연 발생 프로모터 및 돌연변이된 변이체 프로모터의 조합인 프로모터 래더를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 기준을 모두 만족하는: 1) 구조성 프로모터의 래더를 나타내며; 2) 이상적으로 100개 염기쌍 미만의 짧은 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있는 자연, 고유 또는 야생형 프로모터를 확인하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 구조성 프로모터는 두 개의 선택된 성장 조건 (전형적으로, 산업용 배양 동안 경험된 조건들 간에 비교됨)에 걸쳐 일정한 유전자 발현을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 ~60 염기쌍 코어 프로모터 및 26-40 염기쌍 길이의 5' UTR로 구성될 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 확인된 자연 발생 프로모터 서열 중 하나 이상이 유전자 편집을 위해 선택된다. 일부 실시태양에서, 자연 프로모터는 임의의 공지된 유전자 돌연변이 방법을 통해 편집된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 원하는 서열을 갖는 새로운 프로모터 변이체를 합성함으로써 편집된다.
2015년 12월7일 출원된 미국 특허 출원 제62/264,232호 및 PCT 공개 번호 WO2017/100376의 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해 각각 본 발명에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 프로모터의 비 제한적인 목록이 하기 표 2 에 제공된다.
본 발명의 선택된 프로모터 서열
SEQ ID No. 프로모터 단축 명칭
1 P1
2 P2
3 P3
4 P4
5 P5
6 P6
7 P7
8 P8
일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 표 2로부터의 프로모터 서열과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
RNA 분해 유전자 발현 교란
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 유전자를 본 발명의 프로모터와 작동 가능하게 연결시킴으로써 하나 이상의 RNA 데그라도솜 유전자의 발현을 최적화하는 것을 교시한다. 따라서, 하나가 프로모터 P1-P8(다양한 발현 강도를 나타내도록 확인 및/또는 생성된 8개의 프로모터를 나타냄)을 가지며 프로모터 래더를 미생물의 단일 RNA 분해 유전자와 결합하는 경우(즉, RNA 발현 유전자의 천연 또는 외인성 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 소정의 프로모터로 미생물을 유전 공학적으로 조작한다), 8개의 프로모터의 각각의 효과는 조작된 미생물이 표적 유전자와 결합된 특정 프로모터를 제외하고 동일한 유전자 배경을 가진다는 것을 고려하여, 8개의 조작된 균주의 각각을 특징화함으로써 확인될 수 있다.
유기체에서 정상 상태의 유전자 수준을 조절하는 것은 유기체 행동에 영향을 미치는 제어의 핵심 포인트이다. 세포는 수천 가지 다른 유형의 단백질을 발현하며, 이러한 단백질은 여러 복잡한 방식으로 상호 작용하여 기능을 만든다. 선택된 RNA 데그라도솜 유전자의 정상 상태 수준을 변화시킴으로써, 본 발명은 향상된 숙주 성능을 달성한다. RNA 데그라도솜에 대한 일부 변경은 성능을 증가시킬 수 있으며, 따라서 성능을 평가하기 위한 메커니즘과 결합하여, 이 기술은 향상된 기능을 가진 유기체의 생성을 허용한다.
따라서, 특정 실시태양에서, RNA 분해 유전자 교란은 i) 프로모터 래더로부터(예를 들어, 본 발명의 표 2에 나열된 프로모터 또는 이의 변이체) 프로모터를 선택하는 단계; ii) 표적화할 RNA 데그라도솜 유전자(예를 들어, 본 발명의 표 1에 열거된 유전자 또는 이의 변이체)를 선택하는 단계, 및 iii) 선택된 숙주 유기체의 게놈에서 선택된 프로모터 또는 선택된 유전자를 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는 다단계 공정이다. 일부 실시태양에서, 선택된 프로모터를 선택된 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 단계는 다음과 같이 수행된다: 천연 프로모터가 선택된 RNA 데그라도솜 유전자 앞에 존재하고 이의 서열이 알려지면, 천연 프로모터를 선택된 프로모터로 교체한다. 천연 프로모터가 존재하지 않거나 이의 서열이 알려지지 않은 경우, RNA 데그라도솜 유전자 앞에 선택된 프로모터를 삽입한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 프로모터 및 유전자 서열 또는 "::"로 분리 된 이름을 기재함으로써, 작동 가능하게 연결된 프로모터와 선택된 RNA 분해 유전자의 특정 조합을 언급할 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용된 "::" 기호는 "작동 가능하게 연결된" 대신에 사용된다. 따라서 SEQ ID NO: 1 :: SEQ ID NO: 22의 기재는 SEQ ID NO: 22의 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 SEQ ID NO: 1로부터의 프로모터를 의미한다. 유사하게, P1 :: G10은 표 1에 개시된 mutM2 RNA 분해 서열에 작동 가능하게 연결된, 표 2의 프로모터 1을 의미한다. 명세서의 일부에서,"-" 기호는 "::"과 같은 상호 교환가능하게 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 작동 가능하게 연결된 프로모터가 결여 된 유전적으로 동일한 숙주에 대해 조작된 숙주를 최적화되는 성능을 나타내는 하나 이상의 측정법과 비교함으로써 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 RNA 분해 유전자를 포함하는 유전자 조작 숙주 유기체를 평가하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 선택된 RNA 데그라도솜 유전자에 작동 가능하게 연결된 선택된 프로모터의 특정 조합을 교시한다. 본 발명에 의해 고려되는 프로모터 :: 유전자 조합의 비 독점적 목록은 하기 표 3에 요약되어 있다. 제한된 공간을 고려하여, 이들 조합은 본 명세서의 앞 부분에서 정의된 바와 같이 이들의 프로모터 및 유전자 단축 명칭으로 표현된다.
본 발명의 프로모터 : RNA 분해 효소 유전자 조합.
P1::G1 P2::G1 P3::G1 P4::G1 P5::G1 P6::G1 P7::G1 P8::G1
P1::G2 P2::G2 P3::G2 P4::G2 P5::G2 P6::G2 P7::G2 P8::G2
P1::G3 P2::G3 P3::G3 P4::G3 P5::G3 P6::G3 P7::G3 P8::G3
P1::G4 P2::G4 P3::G4 P4::G4 P5::G4 P6::G4 P7::G4 P8::G4
P1::G5 P2::G5 P3::G5 P4::G5 P5::G5 P6::G5 P7::G5 P8::G5
P1::G6 P2::G6 P3::G6 P4::G6 P5::G6 P6::G6 P7::G6 P8::G6
P1::G7 P2::G7 P3::G7 P4::G7 P5::G7 P6::G7 P7::G7 P8::G7
P1::G8 P2::G8 P3::G8 P4::G8 P5::G8 P6::G8 P7::G8 P8::G8
P1::G9 P2::G9 P3::G9 P4::G9 P5::G9 P6::G9 P7::G9 P8::G9
P1::G10 P2::G10 P3::G10 P4::G10 P5::G10 P6::G10 P7::G10 P8::G10
P1::G11 P2::G11 P3::G11 P4::G11 P5::G11 P6::G11 P7::G11 P8::G11
P1::G12 P2::G12 P3::G12 P4::G12 P5::G12 P6::G12 P7::G12 P8::G12
P1::G13 P2::G13 P3::G13 P4::G13 P5::G13 P6::G13 P7::G13 P8::G13
P1::G14 P2::G14 P3::G14 P4::G14 P5::G14 P6::G14 P7::G14 P8::G14
코돈 최적화 시작
일부 실시태양에서, 본 발명은 개시 및 정지 코돈 변이체를 교환하는 방법을 교시한다. 예를 들어, 에스, 세레비시애 및 포유 동물에 대한 전형적인 정지 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 단엽 식물에 대한 전형적인 정지 코돈은 UGA인 반면 곤충과 대장균은 보통 UAA를 정지 코돈으로 사용한다(Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24 : 216-218).
다른 실시태양에서, 본 발명은 ATG 개시 코돈을 TTG로 대체시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 ATG 개시 코돈을 GTG로 대체시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 GTG 개시 코돈을 ATG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 GTG 개시 코돈을 TTG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 TTG 개시 코돈을 ATG로 대체하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 TTG 개시 코돈을 GTG로 대체하는 것을 교시한다.
유전자 디자인에 민감한 유기체
개시된 게놈 공학적 방법은 산업적 미생물 세포 배양으로 예시되지만, 임의의 유기체에 적용 가능하다.
따라서, 본 발명에 사용된 용어 "미생물"은 광범위하게 해석되어야 한다. 미생물은 두 가지 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류와 원생 생물을 포함한다. 그러나, 특정 양태에서, 곤충, 식물 및 동물과 같은 "보다 높은" 진핵생물이 본 발명에 교시된 방법에서 이용될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 조류 세포, 식물 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 예시적인 실시태양에서, 적합한 숙주 세포는 대장균(예를 들어, 매사추세츠주, 입스위치의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)로부터 구입가능한 SHuffle™ competent E. coli)을 포함한다.
한 예시적인 실시태양에서, 적합한 숙주 세포는 대장균을 포함한다. 대장균 종의 적절한 숙주 균주는 장독소성 대장균(ETEC), 장병원성 대장균 (EPEC), 장침입성 대장균(EIEC), 장출혈성 대장균(EHEC), 요로병원성 대장균(UPEC), 베로톡신 생성 대장균, 대장균 O157:H7, 대장균 O104:H4, 대장균 O121, 대장균 O104:H21, 대장균 K1 및 대장균 NC101를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 대장균 K12, 대장균 B 및 대장균 C의 게놈 조작을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 대장균 균주 NCTC 12757, NCTC 12779, NCTC 12790, NCTC 12796, NCTC 12811, ATCC 11229, ATCC 25922, ATCC 8739, DSM 30083, BC 5849, BC 8265 , BC 8231, BC 8319, BC 8320, BC 8321, BC 8322, BC 8321, BC 8231, BC 8319, BC 8231, BC 8231, 8326, BC 8327, BC 8331, BC 8335, BC 8338, BC 8341, BC 8344, BC 8345, BC 8346, BC 8347, BC 8348, BC 8863 및 BC 8864의 게놈 조작을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 4734 (O26:H11), BC 4735 (O157:H-), BC 4736, BC 4737 (n.d.), BC 4738 (O157:H7), BC 4945 (O26:H-), BC 4946 (O157:H7), BC 4947 (O111:H-), BC 4948 (O157:H), BC 4949 (O5), BC 5579 (O157:H7), BC 5580 (O157:H7), BC 5582 (O3:H), BC 5643 (O2:H5), BC 5644 (O128), BC 5645 (O55:H-), BC 5646 (O69:H-), BC 5647 (O101:H9), BC 5648 (O103:H2), BC 5850 (O22:H8), BC 5851 (O55:H-), BC 5852 (O48:H21), BC 5853 (O26:H11), BC 5854 (O157:H7), BC 5855 (O157:H-), BC 5856 (O26:H-), BC 5857 (O103:H2), BC 5858 (O26:H11), BC 7832, BC 7833 (O 미가공 형태:H-), BC 7834 (ONT:H-), BC 7835 (O103:H2), BC 7836 (O57:H-), BC 7837 (ONT:H-), BC 7838, BC 7839 (O128:H2), BC 7840 (O157:H-), BC 7841 (O23:H-), BC 7842 (O157:H-), BC 7843, BC 7844 (O157:H-), BC 7845 (O103:H2), BC 7846 (O26:H11), BC 7847 (O145:H-), BC 7848 (O157:H-), BC 7849 (O156:H47), BC 7850, BC 7851 (O157:H-), BC 7852 (O157:H-), BC 7853 (O5:H-), BC 7854 (O157:H7), BC 7855 (O157:H7), BC 7856 (O26:H-), BC 7857, BC 7858, BC 7859 (ONT:H-), BC 7860 (O129:H-), BC 7861, BC 7862 (O103:H2), BC 7863, BC 7864 (O 미가공 형태:H-), BC 7865, BC 7866 (O26:H-), BC 7867 (O 미가공 형태:H-), BC 7868, BC 7869 (ONT:H-), BC 7870 (O113:H-), BC 7871 (ONT:H-), BC 7872 (ONT:H-), BC 7873, BC 7874 (O raw form:H-), BC 7875 (O157:H-), BC 7876 (O111:H-), BC 7877 (O146:H21), BC 7878 (O145:H-), BC 7879 (O22:H8), BC 7880 (O 미가공 형태:H-), BC 7881 (O145:H-), BC 8275 (O157:H7), BC 8318 (O55:K-:H-), BC 8325 (O157:H7), 및 BC 8332 (ONT), BC 8333와 같은 베로세포독성 대장균(VTEC)를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 8246 (O152 : K- : H-), BC 8247 (O124 : K (72) : H3), BC 8248 O124), BC 8225 (O112), BC 8250 (O136 : K (78) : H-), BC 8251 (O124 : H-), BC 8252 (O144 : K- : H-), BC 8253 BC 8256 (O112), BC 8256 (O28a.e), BC 8257 (O124 : H-), BC 8258 (O143), BC 8259 (O167 : K- : H5), BC 8262 (O128a.c.:H35), BC 8261 (O164), BC 8262 (O164 : K- : H-), BC 8263 (O164) 및 BC 8264 (O124)과 같은 장침입성 대장균(EIEC)을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 5581 (O78 : H11), BC 5583 (O2 : K1), BC 8221 (O118), BC 8222 (O148 : H), BC 8229 (O111), BC 8224 (O110 : H-), BC 8225 (O148), BC 8226 (O 118), BC 8227 (O25 : H42), BC 8229 (O6), BC 8231 (O153 : H45) BC 8238 (O148), BC 8234 (O128), BC 8235 (O118), BC 8237 (O111), BC 8238 (O 110 : H17), BC 8240 (O148), BC 8241 (O 6H 16) BC 8313 (O6 : H6), BC 8315 (O153 : H-), BC 8243 (O153), BC 8244 (O15 : H-), BC 8245 (O20) , BC 8329, BC 8334 (O118 : H12) 및 BC 8339와 같은 장독성 대장균(ETEC)을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 7567 (O86), BC 7568 (O128), BC 7571 (O114), BC 7572 (O119), BC 7573 (O125) BC 7575 (O126), BC 7576 (O126), BC 7578 (O142), BC 7579 (O26), BC 7580 (OK26), BC 7581 (O142), BC 7582 (O55) BC 8535 (O-), BC 7585 (O-), BC 7586 (O-), BC 8330, BC 8550 (O26), BC 8551 (O55), BC 8552 (O158), BC 8553 (O26), BC 8554 (O158), BC 8555 (O86), BC 8556 (O128), BC 8557 (OK26), BC 8558 (O55), BC 8560 (O158), BC 8561 (O158), BC 8562 BC 8565 (O158), BC 8565 (O158), BC 8565 (O158), BC 8568 (O111), BC 8569 (O128), BC 8570 (O114) BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158) (O158), BC 8583 (O128), BC 8584 (O158), BC 8585 (O128), BC 8586 (O158), BC 8588 (O26), BC 8589 (O 86), BC 8590 (O 127), BC 8591 ), BC 8592 (O114), BC 8593 (O114), BC 8594 (O114), BC 8595 (O125), BC 8596 (O158), BC 8597 (O26), BC 8598 (O26), BC 8599 (O158), BC 8605 (O158), BC 8606 (O158), BC 8607 O86), BC 8618 (O86), BC 8616 (BC 8616), BC 8616 , BC 8621, BC 8622, BC 8623, BC 8624 (O158) 및 BC 8625 (O158)과 같은 장병원성 대장균(EPEC)을 교시한다.
본 발명의 다른 적합한 숙주 유기체는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바람직한 코리네박테리움 균주/종은 기탁된 유형 균주가 DSM44549인 C. 에피센스(C. efficiens), 기탁된 유형 균주가 ATCC13032인 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 기탁된 유형 균주가 ATCC6871인 C. 암모니아게네스(C. ammoniagenes)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바람직한 숙주는 C. 글루타미쿰이다.
특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 코리네박테리움 속의 적합한 숙주 균주는 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게 네스 FERM BP- 1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및 브레비박테리움 다이바리카툼 ATCC14020; 및 예를 들어, L-리신 생산 균주로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주: 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM P-1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714 및 코리네박테리움 글루타미 쿰 DSM12866.
용어 "마이크로콕쿠스 글루타미쿠스"는 C. 글루타미쿰에도 사용되어 왔다. C. 에피시엔스 종의 일부 대표는 또한 예를 들어, 균주 FERM BP-1539와 같은 종래 기술에서 C. 써모아미노게네스로 불려왔다.
다른 실시태양에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 적합한 원핵생물 세포는 그람 양성, 그람 음성 및 그람 가변 박테리아 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)의 종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 균주는 산업용 균주이다. 수많은 박테리아 산업용 균주가 알려져 있고 본 발명에 기술된 방법 및 조성물에 적합하다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움 종(예를 들어, A. radiobacter, A. rhizogenes, A. rubi), 아테로박터 종(예를 들어, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparaffinus, A. sulfureus, A. ureafaciens), 바실루스 종(예를 들어, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulars, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans 및　B. amyloliquefaciens)이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 푸밀루스, B. 리체니포르미스, B. 메가테륨, B. 클라우실, B. 스테아로써모필루스, 및B. 아밀로리퀴에파시엔스를 포함하나 이에 제한되지 않는 산업용 바실루스일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 클로스트리디움 종(예를 들어, C. acetobutylicum, C. tetani　E88,　C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. beijerinckii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 코리네박테리움 종(예를 들어, C. glutamicum, C. acetoacidophilum)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에스체리아치아 종(예를 들어, E. coli)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에르위니아 종(예를 들어, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata, E. terreus)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 판토에아 종(예를 들어, P. citrea, P. agglomerans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 수도모나스 종(예를 들어, P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토콕쿠스 종(예를 들어,　S. equisimiles, S. pyogenes, S. uberis)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토마이세스 종(예를 들어, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, S. lividans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 자이모모나스 종(예를 들어, Z. mobilis, Z. lipolytica) 등일 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 적합한 진핵생물 숙주 세포는 곰팡이 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 균류 숙주 세포는 아스코코타(Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 데우티로마이코다(Deuteromycota), 자이고마이코타(Zygomycota), 펑기 임퍼펙티(Fungi imperfecti)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 숙주 세포는 효모 세포 및 사상 균류 세포를 포함한다. 적합한 사상 균류 숙주 세포는 예를 들어 유마이코티나(Eumycotina) 및 오마이코타(Oomycota) 세분의 임의의 섬유상 형태를 포함한다. (예를 들어, 참조로 본 발명에 포함된 Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th　edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 참조). 사상 균류는 키틴, 셀룰로오스 및 다른 복합 다당류로 구성된 세포벽을 갖는 식물성 균사체를 특징으로 한다. 사상 균류 숙주 세포는 효모와 형태학적으로 구별된다.
특정 예시적이고 비 제한적인 실시태양에서, 사상 균류 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella), 또는 텔레오모르프(teleomorphs), 또는 아나모르프(anamorphs), 이의 동의어 또는 분류학적 동등물의 종의 세포일 수 있다.
적합한 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세누라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces,), 피키아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 및 야로비아(Yarrowia)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 효모 세포는 한세누라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르젠시스(Saccaromyces carlsbergensis), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코다매(Pichia kodamae), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오프니티애(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 피제페리(Pichia pijperi), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 일비칸스(Candida albicans), 또는 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포는 클라미도모나스(Chlamydomonas)(예를 들어, C. 레인하르티(C. Reinhardtii)) 및 포름디움(Phormidium)과 같은 조류(P. sp. ATCC29409)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 다세포 유기체에도 적용 가능하다. 예를 들어, 플랫폼은 작물의 성능을 개량시키는데 사용될 수 있다. 유기체는 그라미니애(Gramineae), 페투코이데애(Fetucoideae), 포아코이데애(Poacoideae), 아그로스티스(Agrostis), 필레움(Phleum), 닥틸리스(Dactylis), 소르검(Sorgum), 세타리아(Setaria), 제아(Zea), 오리자(Oryza), 트라이티쿰(Triticum), 세칼레(Secale), 아베나(Avena), 호르데움(Hordeum), 삭카룸(Saccharum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 스테노타프룸(Stenotaphrum), 사이노돈(Cynodon), 코익스(Coix), 올리레애(Olyreae), 파레애(Phareae), 콤포시태(Compositae) 또는 레구미노새(Leguminosae)와 같은 복수의 식물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물은 옥수수, 쌀, 콩, 면화, 밀, 호밀, 귀리, 보리, 완두콩, 콩, 렌즈콩, 땅콩, 참마콩, 동부, 벨벳콩, 클로버, 알팔파, 자주개자리, 루핀, 살갈퀴, 등나무, 완두콩, 사탕수수, 수수, 해바라기, 카놀라 등일 수 있다. 마찬가지로, 유기체는 비-인간 포유류, 어류, 곤충 등과 같은 복수의 동물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물 세포, 예를 들어 인간(293, WI38, PER.C6 및 보우 즈(Bowes) 흑색종 세포 포함), 생쥐(3T3, NS0, NS1 , Sp2/0), 햄스터(CHO, BHK), 원숭이(COS, FRhL, Vero) 및 하이브리도마 세포주를 포함하는 다양한 동물 세포 형태와의 사용에 적합하다.
다양한 실시태양에서, 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS), 및 Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL)과 같은 여러 세포 기탁단체로부터 일반대중이 쉽게 접근할 수 있다.
맞춤 플라스미드의 조립/복제
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 게놈에 원하는 표적 DNA 절편(예를 들어, 특정 프로모터 또는 프로모터::유전자 조합을 함유)을 삽입할 수 있는 벡터를 제조하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA, 상동성 암 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 벡터를 복제하는 방법을 교시한다(도 1 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로의 형질 전환에 적합한 임의의 벡터와 양립 가능하다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포와 양립 가능한 셔틀 벡터의 사용을 교시한다. 한 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 셔틀 벡터는 적어도 두 개의 상이한 종(최초 복제 및/증폭을 위한 대장균 및 통합을 위한 코리네박테리움과 양립가능)에서 증식가능한 셔틀 벡터이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 벡터는 본 발명에 기술된 바와 같은 선택 및/또는 카운터-선택을 위한 마커를 포함할 수 있다. 표지는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에서 제공된 임의의 표지일 수 있다. 셔틀 벡터는 당업계에 공지된 바와 같은 상기 셔틀 벡터의 조립에 유용한 임의의 조절 서열 및/또는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 셔틀 벡터는 예를 들어 대장균 또는 C. 글루타미쿰과 같은 본 발명에 제공된 바와 같은 숙주 세포에서 증식에 필요할 수 있는 임의의 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 적어도 하나의 조절 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조절 서열은 숙주 세포의 유전 공학에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공되는 임의의 조절 서열일 수있다. 특정 예에서, 표적 DNA는 상용 벡터(예를 들어, DNA2.0 custom 또는 GATEWAY® 벡터)와 같은 임의의 저장소 또는 카탈로그 생성물로부터 수득 가능한 벡터, 구조체 또는 플라스미드에 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조립/복제 방법은 다음 조립 전략 중 적어도 하나를 사용할 수 있다: i) II형 통상적인 복제, ii) II형 S-매개 또는 "골든 게이트" 복제(예를 들어, Engler, C., R. Kandzia, and S. Marillonnet. 2008 "A one pot, one step, precision　cloning method with high-throughput capability". PLos One 3:e3647; Kotera, I., and T. Nagai. 2008 "A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS　restriction enzyme." J Biotechnol 137:1-7.; Weber, E., R. Gruetzner, S. Werner, C. Engler, and S. Marillonnet. 2011 Assembly of Designer TAL Effectors by　Golden Gate　Cloning. PloS One 6:e19722 참조), iii) GATEWAY® 재조합, iv) TOPO®　복제, 엑소누클레아제-매개 조립(Aslanidis and de Jong 1990. "Ligation-independent　cloning　of PCR products (LIC-PCR)." Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 20 6069), v) 상동성 재조합, vi) 비 상동성 말단 결합, 또는 이의 조합. 모듈형 IIS 기반 어셈블리 전략은 PCT 공개공보 WO 2011/154147에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 선택 마커를 갖는 벡터의 복제를 교시한다. 다양한 선별 마커 유전자는 선택적 압력하에서 원핵 세포(예컨대, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 제오신, 스펙티노마이신/스트렙토마이신) 또는 진핵 세포(예컨대, 제네티신, 네오마이신, 하이그로마이신, 푸로마이신, 블라 스티신, 제오신)에서 선택을 위한 항생제 내성 기능을 주로 암호화하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 다른 마커 시스템은 성공적으로 형질도입된 숙주 세포에서 발현된 X-gal 또는 녹색 또는 적색 형광 단백질과 같은 형광 리포터의 존재하에서 양성 클론을 선택하기 위해 박테리아에서 사용되는 주지된 청색/백색 스크리닝 시스템과 같은 원하거나 원하지 않는 세포의 선별 및 동정을 허용한다. 대다수가 원핵 생물 시스템에서만 기능하는 선별 마커의 또 다른 부류는 생산자 세포를 죽이는 독성 유전자 생성물을 발현하는 "사멸 유전자"라고도하는 선택 가능한 마커 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예는 sacB, rpsL (strA), tetAR, pheS, thyA, gata-1 또는 ccdB를 포함하며, 이의 기능은 (Reyrat et al. 1998 "Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis." Infect Immun. 66(9): 4011-4017)에 기술된다.
숙주 세포의 형질 전환
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 형질 전환, 형질 감염, 형질 도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법은 인산 칼슘 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 형질 주입 또는 전기 천공을 포함한다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I. 1986 "Basic Methods in Molecular Biology"). 형질 전환의 다른 방법은 예를 들어, 아세트산 리튬 형질 전환 및 전기 천공을 포함한다. 예를 들어, Gietz et al.,　Nucleic Acids Res.　27:69-74 (1992); Ito et al.,　J. Bacterol.　153:163-168 (1983); and Becker and Guarente,　Methods in Enzymology　194:182-187 (1991) 참조. 일부 실시태양에서, 형질 전환된 숙주 세포는 재조합 숙주 균주로 불린다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입 DNA는 단일-교차 또는 이중 교차 재조합에 의해 표적 게놈 DNA 영역 내로 혼입된다(예를 들어, Nakashima et al., 2014 "Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing" Int. J. Mol Sci. 15(2), 2773-2793).
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 하나 이상의 선택 마커로 형질전환된 세포를 선별하는 것을 교시한다. 이런 한 실시태양에서, 카나마이신 내성 마커(KanR)를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 유효량의 카나마이신 항생제를 함유하는 배지 상에 덮인다. 카나마이신-레이스(kanamycin-laced) 배지에서 볼 수 있는 콜로니 형성 단위는 벡터 카세트를 게놈에 통합시킨 것으로 추정된다. 원하는 서열의 삽입은 PCR, 제한 효소 분석 및/또는 관련 삽입 위치의 서열화를 통해 확인될 수 있다.
선택된 서열의 루핑 아웃
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하는 방법을 교시한다. 루핑 아웃 방법은 Nakashima et al. 2014 "Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing." Int. J. Mol. Sci. 15(2), 2773-2793에 기술될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 양성 형질전환 체로부터 선택 마커를 루핑 아웃하는 것을 교시한다. 루핑 아웃 결실 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며 (Tear et al. 2014 "Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli." Appl. Biochem. Biotech. 175:1858-1867)에 기술된다.
본 발명에서 제공된 방법에 사용된 루핑 아웃 방법은 단일-교차 상동성 재조합 또는 이중-교차 상동성 재조합을 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 기술된 바와 같이 선택된 영역을 루핑하는 것은 단일-교차 상동성 재조합을 사용하여 수행된다.
먼저, 루프 아웃 벡터가 (예를 들어 상동성 재조합, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 기술을 통해) 숙주 유기체의 게놈 내의 선택된 표적 영역 내로 삽입된다. 삽입된 벡터는 현존하는 또는 숙주 서열 근처에 도입된 직접 반복체인 서열을 갖도록 디자인되어, 직접 반복체가 루핑 및 결실이 예정된 DNA의 영역에 인접하게 된다. 일단 삽입되면, 루프 아웃 플라스미드 또는 벡터는 선택 영역의 결실을 위해 역 선택될 수 있다(예를 들어, 선택 유전자에 대한 내성의 결핍). 한 이런 실시태양에서, SNP는 선택 마커가 직접 반복 서열에 의해 인접한 루프아웃 벡터에 삽입된다. 벡터의 삽입은 이의 선택 마커를 통해 확인된다. 일단 확인되면, 선택 마커는 결실이 예정된 DNA의 루핑 아웃을 위해 선택함으로써 제거된다(도 2 참조).
세포 배양 및 발효
본 발명의 세포는 임의의 바람직한 생합성 반응 또는 선택을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 프로모터를 활성화시키기 위해 배지를 유도하는 배양을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 형질전환체(예를 들어, 항생제)의 선택 제제 또는 억제 조건(예를 들어, 높은 에탄올 조건)하에 성장하기에 적합한 유기체의 선택 제제를 포함하는 선택 제제를 갖는 배지를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 위해 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 생산 수율에 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 유도할 수 있는 배지에서 배양 물을 배양하는 것을 교시하며 최종 생성물 생산을 위한 필수 전구체(예를 들어, 에탄올 생산을 위한 높은 수준의 당)를 포함한다.
온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다. 언급한 바와 같이, 박테리아, 식물, 동물(포유류 포함) 및 고세균 기원 세포를 포함하는 많은 세포의 배양 및 생산에 대한 많은 참고 자료가 이용될 수 있다. 예를 들어, Sambrook, Ausubel (all supra), as well as Berger, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology　volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; and　 Freshney (1994)　Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Doyle and Griffiths (1997)　Mammalian Cell Culture: Essential Techniques　John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company; and Ricciardelle et al., (1989)　In Vitro Cell Dev. Biol.　25:1016-1024, all of which are incorporated herein by reference. For plant cell culture and regeneration, Payne et al. (1992)　Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems　John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995)　Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg N.Y.); Jones, ed. (1984)　Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, N.J. and　Plant Molecular Biology　(1993) R. R. D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6 참조하고, 이의 전문은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적으로 세포 배양 배지는 Atlas and Parks (eds.)　The Handbook of Microbiological Media　(1993) CRC Press, Boca Raton, Fla에서 설명되며, 이는 참조로 본 발명에 포함된다. 세포 배양에 대한 추가 정보는 Life Science Research Cell Culture Catalogue　from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC") 및, 예를 들어,　The Plant Culture Catalogue　and supplement also from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-PCCS")와 같은 구입가능한 상업용 논문에서 발견되며, 이의 전부는 참조로 본 발명에 포함된다.
사용될 배양 배지는 적절한 방식으로 각각의 균주의 요구를 충족시켜야한다. 다양한 유기체에 대한 배양 배지에 대한 설명은 American Bacteriology Society (Washington D.C., USA, 1981)의 "General Bacteriology Methods for Manual"에 제공된다.
또한, 본 발명은 a) 적절한 매질에서 본 발명에 따른 미생물을 배양하여 발효액을 생성하는 단계; b) a)의 발효액 및/또는 미생물의 세포에 관심 생성물을 농축시키는 단계를 포함하여 관심 생성물의 발효 제제를 위한 공정을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생산된 미생물이 원하는 유기-화학적 화합물을 생산하기 위한, 예를 들어 WO 05/021772에 기술된 바와 같이 연속적으로 또는 배치 공정(배치 배양) 또는 페드 배치(fed-batch) 또는 반복된 페드 배치에서 불연속적으로 배양될 수 있음을 교시한다. 알려진 배양 방법에 관한 일반적인 내용은 Chmiel(Bioprozesstechnik. 1: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))에 의한 교과서 또는 Storhas(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 의한 교과서에서 이용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 배치 또는 연속 발효 조건하에 성장된다.
고전적인 배치 발효는 폐쇄된 시스템이며, 배지의 조성물은 발효의 시작시에 설정되고 발효 동안 인공적인 변형을 겪지 않는다. 배치 시스템의 변형은 본 발명에서 사용되는 페드 배치 발효이다. 이 변형에서, 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분으로 첨가된다. 페드 배치 시스템은 이화생성물 억제가 세포의 신진대사를 억제 할 가능성이 있고 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 배치 및 페드 배치 발효는 일반적이고 당업계에 일반적으로 주지되어 있다.
연속 발효는 정의된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고 동일한 양의 조건 배지가 원하는 단백질의 가공 및 수확을 위해 동시에 제거되는 시스템이다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 세포가 주로 대수기 성장하는 일정한 고밀도로 배양물을 유지시킨다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 정지기 또는 늦은 대수기/정지기 성장시에 배양물을 유지시킨다. 연속 발효 시스템은 정지기 성장 조건을 유지하기 위해 노력한다.
연속 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라 생성물 형성의 속도를 최대화하기 위한 기술은 산업용 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 본 발명의 배양물에 대한 탄소원의 비 제한적인 목록은 당 및 수화물, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공에 의한 수크로오스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로오스; 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산; 알코올, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 젖산을 포함한다.
본 발명의 배양액을 위한 질소 공급원의 비 제한적인 목록은 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 콩가루 및 우레아와 같은 유기 질소 함유 화합물; 또는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 탄산 암모늄 및 질산 암모늄과 같은 무기 화합물을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 배양액을 위한 가능한 인 공급원의 비 제한적인 목록은 인산, 인산 이수소 칼륨 또는 인산 수소 이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 포함한다.
배양 배지는, 예를 들어, 추가로 성장에 필수적인, 황산 마그네슘 또는 황산 철과 같은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 염화물 또는 황산염 형태의 염을 포함한다.
마지막으로, 아미노산, 예를 들어 호모세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 바이오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 상기 언급된 물질에 추가로 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양물의 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아; 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 산 또는 염기, 또는 완충 염에 의해 적절한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 실시태양에서, pH는 일반적으로 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조절된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스터를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 예를 들어 항생제와 같은 적합한 선택 물질을 첨가함으로써 배양물의 플라스미드를 안정화시키도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 배양은 호기성 조건하에 수행된다. 이러한 조건을 유지하기 위해, 예를 들어 공기와 같은 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물이 배양물 내로 도입된다. 과산화수소가 풍부한 액체를 사용하는 것도 가능하다. 발효는, 적절한 경우에, 상승된 압력, 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 상승된 압력에서 수행된다. 배양의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배치 또는 페드 배치 공정에서, 배양은 바람직하게는 회수되는데 충분한 양의 원하는 관심 생성물(예를 들어, 유기-화학 화합물)이 형성될 때까지 계속된다. 이 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간 내에 달성될 수 있다. 연속 공정에서, 더 긴 배양 시간이 가능하다. 미생물의 활성은 발효 배지 및/또는 상기 미생물의 세포에서 관심 생성물의 농축(축적)을 초래한다.
일부 실시태양에서, 배양은 혐기성 조건하에 수행된다.
유전자 조작 균주 검증
일부 실시태양에서, 본 발명은 선택된 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 선택된 프로모터를 포함하는 유전자 변형 균주를 검증하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 검증은 유전자 조작 균주를 대조군 균주와 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대조군 균주는 유전자 조작 균주로서, 유전자 조작 균주의 프로모터::RNA 분해 유전자 변형이 결여되어 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 유전자 조작 균주의 숙주 성능을 대조군 균주의 숙주 성능과 비교하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 강화된 숙주 성능은 후술하는 바와 같이 특정 선택 목표에 대해 측정될 것이다.
선택 기준 및 목표
본 발명의 방법에 적용되는 테스트 기준은 균주 개선 프로그램의 특정 목표에 따라 달라질 것이다. 본 발명은 임의의 프로그램 목표를 충족시키도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 즉각적인 시간 제한없이 반응의 단일 배치 수율을 최대화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 폴리머의 탄소 사슬을 길게하는 것과 같이 생성물의 화학적 구조를 변형시키는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 폴리머의 탄소 사슬을 연장시키는 것과 같이 생성물의 화학적 구조를 변형시키는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 수율, 역가, 생산성, 부산물 제거, 공정 이상현상에 대한 내성, 최적 성장 온도 및 성장율과 같은 성능 특성을 개선하는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 숙주 세포에 의해 생성된 관심 생성물의 부피 생산성, 비 생산성, 수율 또는 역가에 의해 측정된 바와 같이 개량된 숙주 성능이다.
다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 투입량 당 최종 생성물 수율(예를 들어, 수크로오스의 파운드당 생산된 총 에탄올의 양)의 관점에서 상업적 균주의 합성 효율을 최적화하는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 백분율 수율을 최적화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 예를 들어 배치 완료율 또는 연속 배양 시스템에서의 수율로 측정된 합성 속도를 최적화하는 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 프로그램 목표는 관심 생체 분자 또는 생성물의 최종 생성물 수율 및/또는 생산 속도를 최적화하는 것이다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 특정 파지에 대한 균주 내성을 증가시키거나, 그렇지 않으면 배양 조건하에서 균주 생력/강건성을 증가시키는 것일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 균주 성장 속도(예를 들어, 포화 바이오매스)를 개선하는 것일 수있다.
일부 실시태양에서, 균주 개선 프로젝트는 하나 이상의 목표에 종속될 수 있다. 일부 실시태양에서, 변형 프로젝트의 목표는 품질, 신뢰성 또는 전반적인 수익성에 달려있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 관련된 선택된 돌연변이 또는 상기한 하나 이상의 균주 특성을 갖는 돌연변이의 그룹의 방법을 교시한다.
당업자는 특정 프로젝트 목표를 충족하기 위해 어떻게 균주 테스트 기준을 맞춤하는지를 인식할 것이다. 예를 들어, 반응 포화시 균주의 단일 배치 최대 수율의 선택은 높은 단일 배치 수율을 가진 균주를 확인하는데 적절할 수 있다. 다양한 온도 및 조건에서 수율의 일관성에 기반한 선택은 견고성 및 신뢰성이 증가된 균주를 확인하는데 적절할 수 있다.
일부 실시태양에서, 초기 소형-배치 단계 및 탱크-기반 검증을 위한 선택 기준은 동일할 것이다. 다른 실시태양에서, 탱크-기반 선택은 추가 및/또는 상이한 선택 기준하에서 동작할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 고-처리량 균주 선택은 단일 배치 반응 완료 수율에 기초할 수 있지만, 탱크-기반 선택은 반응 속도에 대한 수율에 기초한 선택을 포함하도록 확장될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 세포에 비해 적당한 성능 증가를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 선택된 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 선택된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결여된 유전자 동일 숙주 세포와 비교할 때 성능이 적어도 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%, 6%, 6.1%, 6.2%, 6.3%, 6.4%, 6.5%, 6.6%, 6.7%, 6.8%, 6.9%, 7%, 7.1%, 7.2%, 7.3%, 7.4%, 7.5%, 7.6%, 7.7%, 7.8%, 7.9%, 8%, 8.1%, 8.2%, 8.3%, 8.4%, 8.5%, 8.6%, 8.7%, 8.8%, 8.9%, 9%, 9.1%, 9.2%, 9.3%, 9.4%, 9.5%, 9.6%, 9.7%, 9.8%, 9.9%, 또는 10.0% 증가할 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 미생물 수율, 백분율 수율, 생산성 또는 포화 바이오매스를 포함하나 이에 제한되지 않는 성능을 측정하는 다양한 방법을 교시한다. 따라서 당업자는 미생물 성능의 현재 개시된 백분율 또는 배수 증가가 본 발명에 개시된 임의의 성능 증가를 의미할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시태양에서, 증가된 성능 백분율은 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결여된 유전자 동일 숙주 세포와 비교하여 수율의 증가를 직접적으로 의미한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 세포에 비해 우수한 성능 증가를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 선택된 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 선택된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결여된 유전자 동일 숙주 세포와 비교할 때 성능이 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 세포보다 훌륭한 성능 증가를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 선택된 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 선택된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 유전자 조작 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결여된 유전자 동일 숙주 세포와 비교할 때 성능이 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 이상 증가할 것이다. 일부 실시태양에서, 증가된 성능은 체적 생산성, 비 생산성, 수율, 역가 및 총 역가로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산성 측정법에 의해 평가된다. 일부 실시태양에서, 증가된 성능은 원하는 생성물의 숙주 세포 수율이다. 일부 실시태양에서, 성능은 포화 바이오매스에 의해 결정된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 RNA 분해 유전자의 다른 교란을 갖는 유전자 조작 숙주 세포가 상기한 바와 같이 중간, 우수한 및 훌륭한 성능 개선을 나타낼 수 있다는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 돌연변이된 RNA 분해 유전자 (예를 들어, 돌연변이된 개시 코돈)를 갖는 숙주 세포는 대조군 세포에 비해 중간(1-10%), 우수(1-200%) 또는 훌륭한(2-20배) 성능 증가를 나타낼 수 있다.
생성물 회수 및 정량화
관심 생성물의 생산을 위한 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 본 명세서 전반에 걸쳐 논의된다. 이러한 방법은 본 발명의 균주를 선별할 때 사용될 수있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비 분비된 세포내 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 세포내 효소, 오일, 약제 또는 다른 가치있는 작은 분자 또는 펩타이드를 생성하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다. 비 분비된 세포내 생성물의 회수 또는 분리는 용해 및 본 발명에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 주지된 회수 기술에 의해 달성될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 원심 분리, 여과, 침전 또는 다른 방법에 의해 수확될 수 있다. 이어서, 수확된 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제의 사용, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함하는 임의의 편리한 방법으로 파괴된다.
관심의 생성된 생성물, 예를 들면, 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 회수/분리될 수 있으며 임의로 정제될 수 있다. 예를 들어, 생성물 폴리펩타이드는 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성 상호작용, 크로마토포커싱 및 크기 배제) 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에서 사용될 수 있다. (예를 들어, Purification of intracellular protein as described in Parry et al., 2001, Biochem. J.353:117, and Hong et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol.　73:1331, 참조, 모두는 참조로 본 발명에 포함된다).
상기한 참조문헌 이외에, 다양한 정제 방법은, 예를 들어, Sandana (1997)　Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996)　Protein Methods,　2nd　Edition, Wiley-Liss, NY; Walker (1996)　The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990)　Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal　Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993)　Protein Purification: Principles and Practice　3rd　Edition, Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998)　Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition, Wiley-VCH, NY; and Walker (1998)　Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ에 개시된 것들을 포함하여 당업계에 주지되어 있으며, 이의 전부는 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 분비된 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 귀중한 작은 분자 또는 펩타이드를 생산하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 면역학적 방법을 사용하여 본 발명의 세포에 의해 생산된 분비된 또는 분비되지 않은 생성물을 검출 및/또는 정제하는데 사용될 수 있다. 한 예시적 접근법에서, 통상적인 방법을 사용하여 생성물 분자(예를 들어, 인슐린 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편에 대해)에 대해 생성된 항체는 비드 상에 고정화되고, 엔도글루카나아제가 결합되고 침전되는 조건하에 세포 배양 배지와 혼합된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)의 사용을 교시한다.
다른 관련 실시태양에서, 면역크로마토그래피가 미국 특허 제5,591,645호, 미국 특허 제4,855,240호, 미국 특허 제4,435,504호, 미국 특허 제4,980,298호 및 Se-Hwan Paek, et al., "Development of rapid One-Step Immunochromatographic assay, Methods", 22, 53-60, 2000에 개시된 바와 같이 사용되며, 이의 각각은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적인 면역크로마토그래피는 2개의 항체를 사용하여 표본을 검출한다. 제 1 항체는 시험 용액 중에 또는 시험 용액을 떨어뜨린 다공성 막으로 제조된 대략 직사각형 형태의 시험편의 말단 부분에 존재한다. 이 항체는 라텍스 입자 또는 금 콜로이드 입자(이 항체는 이하에서 표지 항체로 불릴 것이다)로 표지한다. 떨어뜨린 시험 용액이 검출될 표본을 포함하는 경우, 표지된 항체는 표본을 인식하여 표본과 결합한다. 표본과 표지된 항체의 복합체는 모세관 현상에 의해 여과지로 만들어지고 표지된 항체를 포함하는 말단의 반대편 말단에 부착된 흡수체를 향하여 흐른다. 이 흐름 동안, 표본과 표지 항체의 복합체가 다공질 막의 중간에 존재하는 제 2 항체(이하에서 태핑 항체로 불릴 것이다)에 의해 인식되어 포획되고, 그 결과, 복합체는 가시광 신호로서 다공성 막 상의 검출부 상에 나타내고 검출된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 선별 방법은 측광 검출 기술(흡수, 형광)에 기초한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 검출은 항체에 결합된 GFP와 같은 형광 단 검출기의 존재에 기초할 수 있다. 다른 실시태양에서, 측광 검출은 세포 배양 물로부터의 원하는 생성물 상의 축적에 기초할 수 있다. 일부 실시태양에서, 생성물은 배양물의 UV 또는 상기 배양물로부터의 추출물을 통해 검출될 수 있다.
실시예 1 - 후보 프로모터 활성의 평가.
후보 프로모터 활성을 평가하기 위해, 한 세트의 플라스미드 기반 형광 리포터 구조체를 디자인하였다. 간단히 말해, 각 프로모터는 셔틀 벡터 pK18rep에서 황색 형광 단백질을 암호화하는 유전자인 eyfp 앞에 복제되었다. 이들 플라스미드를 C. 글루타미쿰 NRRL B-11474로 형질전환시키고 프로모터 활성을 분광법에 의해 YFP 단백질의 축적을 측정함으로써 평가하였다.
셔틀 벡터 pK18rep를 pK18mobSacB(ATCC 87087)의 sacB 유전자를 pBL1 복제 기점(GenBank: AF092037.1)으로 대체함으로써 제작하여 대장균 및 C. 글루타미쿰 모두에서 증식할 수 있는 벡터를 수득하였다.
SEQ ID No 1-8로부터 선택된 각 프로모터를 포함하는 eyfp pK18rep 플라스미드로 형질전환된 C. 글루타미쿰 숙주 세포를 BHI 한천과 25㎍/mL 카나마이신에 대해 선택하였다. 각각의 형질전환을 위해, 여러 개의 단일 콜로니를 선택하여 300μL의 BHI 배지와 25μg/mL 카나마이신을 함유하는 96개의 중간-웰 블록의 개별 웰에 접종하였다. 세포를 1,000rpm에서 흔들면서 30℃에서 48시간 동안 배양하여 포화상태로 만들었다.
배양 후, 배양액을 3,500rpm으로 5 분 동안 원심분리하고, 배지를 흡인 제거 하였다. 세포를 300μL의 PBS에 재현탁시키고 3,500rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 흡인한 후 300μL의 PBS에 최종 재현탁시켰다. 이 혼합물의 20μL 분취 량을 180μL의 PBS를 함유하는 96-웰 완전 영역 흑색 투명 바닥 분석 플레이트로 옮겼다. 600nm에서의 세포의 광학 밀도를 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기로 측정하고 형광을 514nm에서 여기시키고 527nm에서 방출을 측정함으로써 TECAN M1000 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 각각의 웰에 대하여, 정규화된 형광 활성은 형광을 광학 밀도로 나누어 계산하였다.
부모 플라스미드 pK18rep로 형질전환된 숙주 세포는 음성 대조군으로서 작용 하였다. 정규화된 형광 활성을 리포터 구조체와 생물학적 복제물 사이에서 비교하였다. 프로모터 활성의 수치 요약을 하기 표 4에 나타내었다.
선택된 프로모터의 발현 강도.
SEQ ID No. 프로모터
발현 강도
(평균) 		표준 편차 평균의 표준 오차 복제물의 번호
1 114402 52987.9 15296 12
2 89243 16162.2 3708 19
3 44527 18110.3 4155 19
4 43592 3643 1152 10
5 11286 10459.4 3154 11
6 4723 1854.3 425 19
7 661 731.9 173 18
8 98 537.5 144 14
대조군 -45 214.9 48 20
2015년 12월7일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/264,232호 및 PCT 공개공보 WO2017/100376의 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 발명에 참조로 포함된다.
실시예 2 - 포화 바이오매스에 대한 프로모터 교란의 효과
본 발명의 프로모터::유전자 조합을 배양 포화 바이오매스에 대한 효과를 결정하기 위해 실험적으로 테스트하였다.
C. 글루타미쿰 RNA 데그라도솜의 교란에 대한 표적은 KEGG 데이터베이스(http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html)의 주석에 기초하여 선택되었으며, 이는 본 발명의 표 1에 개시되어 있다. 표적 유전자의 각각에 대한 천연 프로모터는 문헌 조사를 기초로 결정하였다. 확인된 천연 프로모터 목록은 하기 표 5에 제공된다.
확인된 천연 프로모터 서열
유전자 표적 단축 명칭 확인된 천연 프로모터 서열 (개시 코돈으로부터) 대체된 염기쌍의 수
cg1144 G1 SEQ ID No: 23 101
cg2453 G2 SEQ ID No: 24 61
cshA G3 SEQ ID No: 25 62
dnak G4 SEQ ID No: 26 179
eno G5 SEQ ID No: 27 129
gpsI G6 SEQ ID No: 28 154
groEL G7 SEQ ID No: 29 205
groEL2 G9 확인되지 않음 0
mutM2 G10 SEQ ID No: 30 59
rhlE G11 SEQ ID No: 31 59
rho G12 SEQ ID No: 32 101
rne G13 SEQ ID No: 33 140
cg2160/RNAse J G14 확인되지 않음 0
이용 가능한 경우, 전체 천연 프로모터 서열을 상기 표 5에 개략된 바와 같이 본 발명의 프로모터의 각각으로 대체하였다. 천연 프로모터가 확인되지 않으면, 프로모터 래더 내의 8개의 프로모터 각각을 표적의 개시 코돈의 5'에 직접 삽입하였다.
C. 글루타미쿰 게놈에서 이러한 변화를 일으키는 플라스미드는 효모 상동성 재조합을 이용하여 생성한 다음 대장균에서 증식하였다. 각 플라스미드는 게놈 편집의 위치에 인접하는 ~2kb 상동성 영역이 삽입된 공통 백본으로 제작되었다. 이 상동성 영역을 C. 글루타미쿰 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 이들 2kb의 상동성 영역 사이에서, 신규 프로모터 또는 개시 코돈은 상동성 영역을 PCR하는데 사용된 프라이머의 5' 말단에서 암호화되었다.
플라스미드를 서열 확인하고 C. 글루타미쿰에 전기 천공시켰다. 게놈 통합을위한 선택 후, 플라스미드 백본 DNA를 본 발명의 루프아웃 카운터 선택 방법을 사용하여 제거하였다. 정확하게 제작된 C. 글루타미쿰 균주는 PCR 및 서열화에 의해 확인되었다.
정확하게 제작된 유전자 조작 C. 글루타미쿰 균주를 강화시킨 후 포화 바이오매스 성능을 평가하기 위해 디자인된 소규모 배양액에서 증식시켰다. 소규모 배양은 산업 규모의 배양으로부터의 배지를 반영하는 배지를 사용하여 수행하였다. 포화 바이오매스는 96시간에서 배양액의 OD600을 측정하여 측정하였다. 이 소규모 테스트의 데이터는 아래 표 6에 포함된다. 바이오매스에 최고 개선을 나타내는 프로모터::바이오매스 조합이 강조된다. 이 실험의 결과의 시각적 표현이 도 3a 및 도 3b에 제공된다.
도 3a 및 3b에 개략된 바와 같은 결과는 프로모터 Pcg1860(P3, SEQ ID NO : 3)이 증가하는 포화 바이오매스에서 cshA(G3, SEQ ID NO: 11) 및 gpsI(G6, SEQ ID NO: 6)와 작동 가능하게 연결될 때 특히 효과적이라는 것을 입증하였다.
결과는 프로모터 Pcg3121(P8, SEQ ID NO: 8)이 증가하는 포화 바이오매스에서 gpsI(G6, SEQ ID NO : 6) 및 rne(G13, SEQ ID NO : 21)과 작동 가능하게 연결될 때 특히 효과적이라는 것을 입증하였다.
배양 바이오매스에 대한 다양한 프로모터::유전자 조합의 효과
복사물의 수 프로모터
단축 명칭 		유전자
단축 명칭 		평균 포화 바이오매스 값
OD600 		표준
오차 		하위 95% 상위 95%
91 WT 참조 대조군 0.23611 0.00064 0.2348 0.2374
48 대조군 프로모터 부모 균주 0.19739 0.00089 0.1957 0.1991 부모로부터
백분율
성능 변화		 시그마
8 P1 G12 0.21027 0.00217 0.206 0.2145 6.5% 1.1%
8 P1 G7 0.19747 0.00217 0.1932 0.2017 0.0% 1.1%
8 P1 G10 0.1969 0.00217 0.1926 0.2012 -0.2% 1.1%
8 P1 G2 0.19447 0.00217 0.1902 0.1987 -1.5% 1.1%
8 P1 G11 0.20231 0.00217 0.198 0.2066 2.5% 1.1%
8 P1 G6 0.23219 0.00217 0.2279 0.2364 17.6% 1.1%
4 P2 G5 0.22844 0.00307 0.2224 0.2345 15.7% 1.6%
8 P2 G4 0.19898 0.00217 0.1947 0.2032 0.8% 1.1%
8 P2 G10 0.20436 0.00217 0.2001 0.2086 3.5% 1.1%
8 P2 G9 0.20499 0.00217 0.2007 0.2093 3.9% 1.1%
8 P2 G2 0.19516 0.00217 0.1909 0.1994 -1.1% 1.1%
8 P2 G11 0.20623 0.00217 0.202 0.2105 4.5% 1.1%
7 P3 G3 0.23954 0.00232 0.235 0.2441 21.4% 1.2%
8 P3 G1 0.19539 0.00217 0.1911 0.1997 -1.0% 1.1%
8 P3 G9 0.19734 0.00217 0.1931 0.2016 0.0% 1.1%
8 P3 G11 0.22449 0.00217 0.2202 0.2288 13.7% 1.1%
4 P3 G6 0.24268 0.00307 0.2367 0.2487 22.9% 1.6%
8 P5 G12 0.19038 0.00217 0.1861 0.1946 -3.6% 1.1%
8 P5 G7 0.19095 0.00217 0.1867 0.1952 -3.3% 1.1%
8 P5 G5 0.20366 0.00217 0.1994 0.2079 3.2% 1.1%
8 P5 G4 0.19408 0.00217 0.1898 0.1983 -1.7% 1.1%
8 P5 G10 0.20437 0.00217 0.2001 0.2086 3.5% 1.1%
8 P5 G9 0.2022 0.00217 0.1979 0.2065 2.4% 1.1%
7 P5 G2 0.19791 0.00232 0.1934 0.2025 0.3% 1.2%
8 P5 G6 0.20965 0.00217 0.2054 0.2139 6.2% 1.1%
8 P6 G12 0.17041 0.00217 0.1661 0.1747 -13.7% 1.1%
8 P6 G3 0.18666 0.00217 0.1824 0.1909 -5.4% 1.1%
8 P6 G5 0.22218 0.00217 0.2179 0.2264 12.6% 1.1%
8 P6 G2 0.19527 0.00217 0.191 0.1995 -1.1% 1.1%
8 P6 G11 0.21746 0.00217 0.2132 0.2217 10.2% 1.1%
8 P8 G13 0.24008 0.00217 0.2358 0.2443 21.6% 1.1%
8 P8 G1 0.20357 0.00217 0.1993 0.2078 3.1% 1.1%
8 P8 G10 0.19629 0.00217 0.192 0.2006 -0.6% 1.1%
8 P8 G9 0.19315 0.00217 0.1889 0.1974 -2.1% 1.1%
5 P8 G11 0.19225 0.00274 0.1869 0.1976 -2.6% 1.4%
8 P8 G6 0.23994 0.00217 0.2357 0.2442 21.6% 1.1%
실시예 3 - 생성물 역가에 대한 프로모터 교란의 효과(수율)
실시예 2의 다양한 프로모터::유전자 조합을 갖는 유전자 조작 배양액을 생성물 역가 성능을 평가하도록 디자인된 소규모 배양액에서 증식시켰다. 소규모 배양은 산업 규모의 배양으로부터의 배지를 반영하는 배지를 사용하여 수행하였다. 생성물 역가는 표준 비색 분석법을 사용하여 탄소 소진(즉, 수율)시에 광학적으로 측정하였다. 배양액은 생성물 배양액의 추가 변화가 측정될 수 없을 때까지 성장시켰다. 이 소규모 테스트의 데이터는 아래 표 7에 요약되어 있다. 수율에 최고 개선을 나타내는 프로모터::유전자 조합이 강조된다. 이 실험의 결과의 시각적 표현이 도 3a 및 도 3b에 제공된다.
개시 코딩 스와핑 및 프로모터 스와핑은 다수의 표현형에 영향을 미칠 수있다: cshA (G3, SEQ ID NO: 11)에 연결된 Pcg3381(P6, SEQ ID NO: 6)이 생성물 수율을 개선시키는 반면 eno(G5, SEQ ID NO: 13)에 연결된 Pcg3381(P6, SEQ ID NO: 6)는 포화 바이오매스를 개선시킨다.
결과는 또한 동일한 RNA 분해 유전자 표적이 어떻게 표적화되는지에 따라 상이한 표현형에 긍정적 영향을 미칠 수 있는지를 나타내고, cshA(G3, SEQ ID NO: 11)에 연결된 Pcg1860(P3, SEQ ID NO: 3)이 포화 바이오매스를 개선시키는 반면 cshA(G3, SEQ ID NO: 11)에 연결된 Pcg1860(P3, SEQ ID NO: 3)은 생성물 수율을 개선시킨다.
생성물 수율에 대한 다양한 프로모터::유전자 조합의 효과
복사물의
수 		프로모터 단축 명칭 유전자
단축 명칭 		평균 역가
성능 값 		표준 오차 하위 95% 상위 95%
96 WT 참조
대조군		 1.02651 0.00198 1.0226 1.0304
40 WT 프로모터
부모 균주		 0.95429 0.00307 0.9483 0.9603 부모로부터
백분율
성능 변화		 시그마
8 P1 G12 0.94201 0.00687 0.9285 0.9555 -1.3% 0.7%
4 P1 G7 0.9615 0.00972 0.9424 0.9806 0.8% 1.0%
8 P1 G10 0.9302 0.00687 0.9167 0.9437 -2.5% 0.7%
4 P1 G2 0.95563 0.00972 0.9365 0.9747 0.1% 1.0%
4 P1 G11 0.97209 0.00972 0.953 0.9912 1.9% 1.0%
8 P1 G6 0.92957 0.00687 0.9161 0.9431 -2.6% 0.7%
8 P2 G5 0.94668 0.00687 0.9332 0.9602 -0.8% 0.7%
4 P2 G4 0.97126 0.00972 0.9522 0.9904 1.8% 1.0%
8 P2 G10 0.9347 0.00687 0.9212 0.9482 -2.1% 0.7%
8 P2 G9 0.97912 0.00687 0.9656 0.9926 2.6% 0.7%
4 P2 G2 0.95691 0.00972 0.9378 0.976 0.3% 1.0%
8 P2 G11 0.95053 0.00687 0.937 0.964 -0.4% 0.7%
8 P3 G3 0.87718 0.00687 0.8637 0.8907 -8.1% 0.7%
8 P3 G1 0.95909 0.00687 0.9456 0.9726 0.5% 0.7%
8 P3 G9 0.98443 0.00687 0.9709 0.9979 3.2% 0.7%
8 P3 G11 0.96568 0.00687 0.9522 0.9792 1.2% 0.7%
8 P3 G6 0.93892 0.00687 0.9254 0.9524 -1.6% 0.7%
8 P5 G12 0.96723 0.00687 0.9537 0.9807 1.4% 0.7%
6 P5 G7 0.93788 0.00793 0.9223 0.9535 -1.7% 0.8%
8 P5 G5 0.91367 0.00687 0.9002 0.9272 -4.3% 0.7%
4 P5 G4 0.92425 0.00972 0.9051 0.9434 -3.1% 1.0%
8 P5 G10 0.96478 0.00687 0.9513 0.9783 1.1% 0.7%
8 P5 G9 0.94909 0.00687 0.9356 0.9626 -0.5% 0.7%
3 P5 G2 0.95719 0.01122 0.9351 0.9793 0.3% 1.2%
8 P5 G6 0.96477 0.00687 0.9513 0.9783 1.1% 0.7%
4 P6 G12 0.97625 0.00972 0.9571 0.9954 2.3% 1.0%
4 P6 G3 1.01238 0.00972 0.9933 1.0315 6.1% 1.0%
4 P6 G5 0.89369 0.00972 0.8746 0.9128 -6.4% 1.0%
8 P6 G2 0.96711 0.00687 0.9536 0.9806 1.3% 0.7%
8 P6 G11 0.9461 0.00687 0.9326 0.9596 -0.9% 0.7%
8 P8 G13 0.93432 0.00687 0.9208 0.9478 -2.1% 0.7%
4 P8 G1 0.9909 0.00972 0.9718 1.01 3.8% 1.0%
8 P8 G10 0.9453 0.00687 0.9318 0.9588 -0.9% 0.7%
8 P8 G9 0.95958 0.00687 0.9461 0.9731 0.6% 0.7%
6 P8 G11 0.965 0.00793 0.9494 0.9806 1.1% 0.8%
8 P8 G6 0.90574 0.00687 0.8922 0.9193 -5.1% 0.7%
실시예 4 - 포화 바이오매스 및 생성물 역가(수율)에 대한 돌연변이의 효과
본 발명의 선택된 RNA 분해 유전자에 대한 개시 코돈 대체의 생성물 역가 및 포화 바이오매스 영향을 테스트하였다. C. 글루타미쿰 게놈을 유전자 조작하는데 사용된 플라스미드는 효모 상동성 재조합을 이용하여 생성한 다음 대장균에서 증식하였다. 각 플라스미드는 게놈 편집의 위치에 인접하는 ~2kb 상동성 영역이 삽입된 공통 백본으로 제작되었다. 이 상동성 영역을 C. 글루타미쿰 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 이들 2kb의 상동성 영역 사이에서, 개시 코돈은 상동성 영역을 PCR하는데 사용된 프라이머의 5' 말단에서 암호화되었다.
플라스미드를 서열 분석하여 성공적인 복제를 확인한 후, C. 글루타미쿰에 전기 천공시켰다. 게놈 통합을 위한 선택 후, 플라스미드 백본 DNA를 본 발명의 루프아웃 카운터 선택 방법을 사용하여 제거하였다. 정확하게 제작된 C. 글루타미쿰 균주는 PCR 및 서열화에 의해 확인되었다. 이 경우, ATG, GTG 및 TTG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 개시 코돈에 대한 다른 변화가 본 발명의 범위 내에 있지만, 모든 개시 코돈이 TTG로 변경되었다.
다양한 시작 코돈 교체를 갖는 유전자 조작 배양액을 배양액의 생성물 성능 및 바이오매스를 평가하기 위해 설계된 소규모 배양액에서 증식시켰다. 배양 조건과 바이오매스 및 역가 측정을 실시예 2 및 3에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 따라서 탄소 소진시 생성물 역가의 측정은 숙주 세포 배양액에 대한 생성물 수율 값을 나타내었다. 배양액은 생성물 배양액의 추가 변화가 측정될 수 없을 때까지 성장시켰다. 바이오매스 배양액을 96시간 동안 성장시켰다. 이 소규모 테스트의 데이터는 아래의 표 8과 9에 포함된다. 생성물 수율 및 포화 바이오매스에 최고 개선을 나타내는 개시 코돈 교체가 강조된다. 이 실험으로부터의 결과의 시각적 표현이 또한 표 4에 제공된다.
흥미롭게도, gpsI 유전자의 프로모터 교체는 유전자 조작 배양액의 포화바이오 매스를 증가시키는 반면, 개시 코돈의 덜 발현된 코돈으로의 전환은 이를 감소시킨다.
결과는 rhlE (G11, SEQ ID NO: 19) GTG>TTG 코돈 변화가 생성물 수율을 향상시키는 반면 rne(G13, SEQ ID NO: 21) GTG> TTG가 포화 바이오매스를 개선한다는 것을 암시한다.
일부 실시태양에서, 단일 표적 교란은 rne(G13, SEQ ID NO: 21) GTG> TTG의 경우에서와 같이 생성물 수율 및 포화 바이오매스 모두를 개선시킬 수 있다.
포화 바이오매스에 대한 개시 코돈 변화의 효과
복제물의 수 개시
코돈
변화 		유전자 평균 포화 바이오매스 값
OD600 		표준
오차 		하위
95% 		상위 95%
12 WT 참조
대조군		 0.23128 0.00122 0.2289 0.2337
47 WT 개시 코돈 스왑 균주에 대한 부모 0.23464 0.00062 0.2334 0.2359 부모로부터의
백분율 성능 변화 		시그마
4 GTG>TTG G13 0.24833 0.00211 0.2442 0.2525 5.8% 0.9%
8 ATG>TTG G2 0.24097 0.00149 0.238 0.2439 2.7% 0.6%
8 ATG>TTG G6 0.22117 0.00149 0.2182 0.2241 -5.7% 0.6%
4 GTG>TTG G11 0.23333 0.00211 0.2292 0.2375 -0.6% 0.9%
6 ATG>TTG G4 0.23264 0.00173 0.2292 0.236 -0.9% 0.7%
8 ATG>TTG G9 0.22951 0.00149 0.2266 0.2325 -2.2% 0.6%
생성물 수율에 대한 개시 코돈 변화의 효과
복제물의 수 개시
코돈
변화 		유전자 평균 역가
성능 값 		표준
오차 		하위
95% 		상위 95%
16 WT 참조
대조군		 1.01491 0.0047 1.0057 1.0242
62 WT 개시 코돈 스왑 균주에 대한 부모 1.01782 0.00239 1.0131 1.0225 부모로부터의
백분율 성능 변화 		시그마
12 GTG>TTG G13 1.03308 0.00543 1.0244 1.0438 1.5% 0.5%
12 ATG>TTG G2 1.027 0.00543 1.0163 1.0377 0.9% 0.5%
12 ATG>TTG G6 1.06301 0.00543 1.0523 1.0737 4.4% 0.5%
4 GTG>TTG G11 1.06204 0.0094 1.0435 1.0805 4.3% 0.9%
12 ATG>TTG G4 1.02328 0.00543 1.0126 1.034 0.5% 0.5%
12 ATG>TTG G9 1.0478 0.00543 1.0371 1.0585 2.9% 0.5%
실시예 5 - 생성물 역가를 개선하는 추가 프로모터::유전자 조합의 검증
본 발명의 프로모터::유전자 조합을 실험적으로 테스트하여 관심 생성물의 역가에 대한 효과를 측정하였다.
C. 글루타미쿰 RNA 데그라도솜의 교란에 대한 표적은 실시예 2에 따라 선택하였다. 이용 가능한 경우, 전체 천연 프로모터 서열을 상기 표 5에 개략된 바와 같이 본 발명의 프로모터의 각각으로 대체하였다. 천연 프로모터가 확인되지 않으면, 프로모터 래더 내의 8개의 프로모터 각각을 표적의 개시 코돈의 5'에 직접 삽입하였다.
C. 글루타미쿰 게놈에서 이러한 변화를 일으키는 플라스미드는 효모 상동성 재조합을 이용하여 생성한 다음 대장균에서 증식하였다. 각 플라스미드는 게놈 편집의 위치에 인접하는 ~2kb 상동성 영역이 삽입된 공통 백본으로 제작되었다. 이 상동성 영역을 C. 글루타미쿰 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 이들 2kb의 상동성 영역 사이에서, 신규 프로모터 또는 개시 코돈은 상동성 영역을 PCR하는데 사용된 프라이머의 5' 말단에서 암호화되었다.
플라스미드를 서열 확인하고 C. 글루타미쿰에 전기 천공시켰다. 게놈 통합을위한 선택 후, 플라스미드 백본 DNA를 본 발명의 루프아웃 카운터 선택 방법을 사용하여 제거하였다. 정확하게 제작된 C. 글루타미쿰 균주는 PCR 및 서열화에 의해 확인되었다.
정확하게 제작된 유전자 조작 C. 글루타미쿰 균주를 강화시킨 후 포화 바이오매스 성능을 평가하기 위해 디자인된 소규모 배양액에서 증식시켰다. 관심 생성물은 발효 배지에 포함된 기질의 메틸화에 의해 생성된다. 이 메틸화 반응은 복제 플라스미드로부터 발현된 이종성 S-아데노실 메티오닌 의존성 o-메틸전이효소에 의해 촉매작용이 미친다.
96-웰 마이크로웰 플레이트에서 별도의 바이오 매스 증식 단계 후에, 세포 덩어리를 96-웰 마이크로웰 플레이트에서 기질을 함유하는 발효 배지에 첨가하고 생물 전환을 24시간 동안 진행시켰다. 예상 수율을 측정하기 위해 24시간에 채취 한 샘플로부터 고성능 액체 크로마토 그래피를 사용하여 각 균주에 대해 측정하였다. 배양액은 생성물 배양액의 추가 변화가 측정될 수 없을 때까지 성장시켰다. 이 테스트의 데이터는 아래 표 10에 포함된다. 생성물 수율에 최고 개선을 나탄는 프로모터::유전자 조합이 강조된다. 이 실험의 결과의 시각적 표현이 도 5에 제공된다.
소규모 배양에서 생성물 수율에 대한 다양한 프로모터::유전자 조합의 효과
복제물의 수 프로모터
단축
명칭		 유전자
단축
명칭		 평균
성능 값		 표준 오차 하위 95% 상위 95%
4 대조군 부모
균주		 347.065 37.749 272.37 421.76 부모로부터의 백분율 성능 변화 시그마
4 P5 G9 367.928 37.749 293.23 442.63 6 10
4 P8 G9 393.817 37.749 319.12 468.51 13 10
4 P6 G9 375.547 37.749 300.85 450.24 8 10
4 P3 G11 144.664 37.749 69.97 219.36 -58 26
4 P5 G11 297.898 37.749 223.2 372.6 -14 13
4 P1 G11 377.716 37.749 303.02 452.41 9 10
4 P8 G11 407.026 37.749 332.33 481.72 17 9
4 P6 G11 387.75 37.749 313.05 462.45 12 10
4 P5 G3 417.166 37.749 342.47 491.86 20 9
4 P2 G3 413.269 37.749 338.57 487.97 19 9
4 P6 G3 394.046 37.749 319.35 468.74 14 10
4 P1 G12 435.684 37.749 360.99 510.38 26 9
4 P2 G12 401.982 37.749 327.28 476.68 16 9
4 P6 G12 365.794 37.749 291.1 440.49 5 10
4 P3 G6 417.801 37.749 343.1 492.5 20 9
4 P5 G6 375.335 37.749 300.64 450.03 8 10
4 P2 G6 283.543 37.749 208.84 358.24 -18 13
4 P8 G6 264.055 37.749 189.36 338.75 -24 14
3 P6 G6 400.818 43.588 314.56 487.07 15 11
4 P3 G2 181.222 37.749 106.52 255.92 -48 21
4 P5 G2 298.603 37.749 223.91 373.3 -14 13
4 P6 G2 290.191 37.749 215.49 364.89 -16 13
4 P3 G13 204.889 37.749 130.19 279.59 -41 18
4 P5 G13 403.111 37.749 328.41 477.81 16 9
4 P8 G13 363.237 37.749 288.54 437.94 5 10
4 P3 G7 422.051 37.749 347.35 496.75 22 9
4 P5 G7 267.106 37.749 192.41 341.8 -23 14
4 P1 G7 291.39 37.749 216.69 366.09 -16 13
4 P3 G4 425.878 37.749 351.18 500.58 23 9
4 P3 G10 350.593 37.749 275.89 425.29 1 11
4 P5 G10 320.718 37.749 246.02 395.42 -8 12
4 P1 G10 410.906 37.749 336.21 485.6 18 9
4 P2 G10 413.604 37.749 338.91 488.3 19 9
4 P8 G10 416.955 37.749 342.26 491.65 20 9
4 P6 G10 345.231 37.749 270.53 419.93 -1 11
실시예 6 - 대규모 배양에서 고 처리량 결과의 검증.
실시예 5의 고 처리량 분석에 의해 확인된 유익한 프로모터::유전자 조합을보다 큰 부피의 쉐이크 플라스크 시스템에서 평가하였다. 세포 덩어리를 250mL의 삼각 진탕 플라스크에서 배양하여 생성시키고, 발효 배지 및 기질을 함유하는 플라스크로 옮겼다. 생성물에 대한 기질의 생물 전환을 24시간 동안 진행하였고 생성물 역가는 상기한 바와 같이 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 평가하였다. (P1::G12)를 포함하는 숙주 세포 균주의 검증으로부터의 데이터는 표 11에 요약되어 있다.
삼각 플라스크 배양에서의 생성물 역가에 대한 P1::G12 프로모터 유전자 조합의 효과
복제물의 수 프로모터
단축 명칭		 유전자
단축 명칭		 평균
성능 값		 하위 95% 상위 95% 부모로부터의 백분율 성능 변화
4 대조군 부모
균주		 622.752 605.055 640.449 0
4 P1 G12 749.943 736.374 763.512 20
G12 RNA 분해 유전자에 작동 가능하게 연결된 P1 프로모터를 포함하는 숙주 세포 배양액은 탄소 소진시 20% 더 높은 역가를 나타내어, rhoI(G12) 프로모터 변형이 없는 대조군 부모 숙주 세포 배양액보다 유의하게 높은 수율을 나타내었다.
실시예 7 - 다른 종에서 RNA 분해 유전자 동족체의 확인
표 1에 개시된 코리네박테리움으로부터의 RNA 분해 유전자 서열을 사용하여 동일한 속에서 유기체로부터의 상동성 유전자 변이체뿐만 아니라 다른 진핵 생물 및 원핵 생물로부터의 오솔로그 유전자를 확인하였다.
간략하게, 표 1에 개시된 RNA 분해 유전자에 대한 아미노산 서열을 NCBI BLASTP® 데이터베이스의 검색 문자열로 사용하여 검색 유전자와 상동성이 높은 관련 서열을 확인하였다. 초기 검색을 검색된 각 유전자에 대한 관련성이 높은 박테리아 동족체를 확인하기 위해 초기 검색 매개 변수를 사용하여 수행하였다. 특정 사카로마이세스 세레비시애에 한정된 2차 검색은 또한 선택된 속/종에서 오솔로그 서열을 확인하기 위해 수행하였다.
하기 표 12는 이 검색 동안 확인된 유전자의 폴리펩타이드 서열의 NCBI 참조 서열 명칭을 제공한다. 추가적인 상동체 및 오솔로그는 본 발명의 RNA 분해 유전자 서열에 기초한 추가적인 서열 검색에 의해 확인 가능하다.
BLASTP® 상동성 검색 엔진을 통해 확인된 RNA 분해 유전자 상동체
유전자 코리네박테리움 사카로마이세스 세레비시애
cg1144 WP_004568112.1
BAB98402.1
WP_011897001.1
WP_044029870.1
WP_003856809.1
BAU95388.1
WP_053544501.1
ANE03625.1
WP_011075272.1
 확인되지 않음
cg2453 WP_011014974.1
WP_020948617.1
WP_011897604.1
CAF20576.1
WP_006283992.1
WP_040967649.1
ANE04470.1
BAU96563.1
BAB99627.1
 확인되지 않음
cshA WP_011014161.1
WP_040072671.1
WP_060564360.1
WP_011265695.1
WP_034983681.1
WP_063967450.1
WP_040967279.1
WP_038583556.1
WP_003854929.1
 AJU31713.1
NP_011932.2
GAA23780.1
AJU22152.1
AJU20676.1
CAY80069.1
AJU31455.1
AJU18404.1
AJU16618.1
AJU22408.1
dnaK WP_003862798.1
WP_003862798.1
WP_003862798.1
WP_011015390.1
WP_003853569.1
BAU97148.1
ANE04953.1
WP_053545750.1
WP_047253930.1		 P0CS91.1
NP_012579.1
NP_011029.3
AJU42857.1
NP_009478.1
NP_010884.1
EDN63079.1
AJU50999.1
CAY79287.1
AJV34706.1
eno WP_003856756.1
WP_053544480.1
WP_015650797.1
WP_011075256.1
WP_018019189.1
WP_018119032.1
WP_055122813.1
WP_055178258.1
WP_010187392.1		 AJU27263.1
AJR76839.1
AJU32945.1
AJU25070.1
AJR81784.1
AJU34506.1
AJU33817.1
AJP39022.1
AHY7959.1
AJU19515.1
gpsI WP_038584450.1
WP_040967544.1
WP_044030042.1
WP_003861678.1
WP_003857481.1
WP_011014796.1
WP_063967578.1
WP_006284228.1
WP_011897394.1
 None Identified
groEL WP_038585947.1
WP_003862917.1
WP_063967760.1
WP_040967902.1
WP_060565225.1
WP_003853751.1
BAU97072.1
ANE04893.1
WP_053545701.1
WP_006769076.1		 AJV50345.1
AJV51242.1
AJP40402.1
CAY81488.1
AJV60668.1
NP_013360.1
EGA73773.1
AJV59776.1
AJV70941.1
EGA57589.1
groEL2 WP_003854561.1
WP_011013754.1
WP_015439426.1
WP_006284375.1
WP_011896815.1
BAU94999.1
WP_053544202.1
ANE03290.1
WP_015650463.1
WP_006769721.1		 AJV51242.1
AJP40402.1
AJV50345.1
EGA57589.1
AJV60668.1
AJV74435.1
AJV59776.1
NP_013360.1
EGA73773.1
CAY81488.1
mutM2 WP_060565392.1
WP_038586460.1
WP_011015556.1
WP_011266054.1
WP_059290038.1
WP_003861221.1
WP_003855116.1
WP_040073075.1
WP_006286827.1
BAU97354.1		 확인되지 않음
rhlE WP_060564204.1
WP_003863544.1
WP_003858152.1
WP_006283683.1
WP_011013876.1
WP_038583081.1
BAU95157.1
ANE03421.1
WP_015650586.1
WP_053544338.1		 EGA60267.1
NP_014287.3
AJT17782.1
A6ZRX0.1
AJT33306.1
AJT08370.1
KZV08510.1
EGA84542.1
AJT14054.1
EWG85578.1
rho WP_060564388.1
WP_038583630.1
WP_011897097.1
WP_059289111.1
WP_003854867.1
WP_031511799.1
WP_003861319.1
WP_040967300.1
WP_063967458.1
ANE03769.1		 확인되지 않음
rne WP_060564901.1
WP_038585170.1
WP_003859300.1
WP_011897695.1
WP_034983859.1
WP_011015068.1
WP_040072884.1
WP_004567676.1
WP_040967734.1
WP_059289673.1		 확인되지 않음
cg2160/RNAse J WP_011014791.1
WP_003857476.1
WP_044030039.1
WP_040967540.1
WP_063967576.1
WP_059289432.1
WP_011897391.1
BAU96303.1
WP_015651527.1
ANE04245.1		 확인되지 않음
본 발명의 추가 실시태양
본 발명에 의해 고려된 다른 주제는 다음 번호를 매긴 실시태양에서 설명된다.
1. a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드, 및
b. RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 향상된 산업 성능을 갖는 유전자 조작 숙주 세포로서,
이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되는 유전자 조작 숙주 세포.
2. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자는 내인성 유전자이다.
3. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이다.
4. 제 3 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자이다.
4.1 제 3 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 및 SEQ ID NO: 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다.
5. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 6로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20이다.
5.1 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 6로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 45이다.
6. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 10), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), c- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 18), d- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 20), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 11), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), g- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), h- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), i- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), j- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 19), k- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), l- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), m- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 12), n- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 15), o- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 17), p- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 19), q- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 14), r- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 13), s- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 19), t- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 21), u- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 14), v- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 20), w- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), x- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9), 및 y- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 18)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
6.1 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 35를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), c- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 43를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), d- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 45를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 43을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), g- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 38을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), h- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 43을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), i- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 42를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), j- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), k- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), l- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), m- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 37을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), n- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 40을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), o- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 42를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), p- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), q- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), r- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드) (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 38을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), s- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), t- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 46을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), u- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), v- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 45를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), w- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), x- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 34를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 y- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 43를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
7. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), b- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), c- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), d- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), e- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
7.1 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 2 :: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), b- (SEQ ID NO: 2 :: SEQ ID NO: 38을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), c- (SEQ ID NO: 3 :: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), d- (SEQ ID NO: 3 :: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), e- (SEQ ID NO: 6 :: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 f- (SEQ ID NO: 8 :: SEQ ID NO: 34를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
8. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20이다.
9. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20이다.
9.1. 제 1 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 45를 암호화한다.
10. 제 1-9.1 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다.
11. 제 1-10 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
12. 제 1-11 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 5% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다.
13. 제 1-11 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 10% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다.
14. 제 1-11 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 20% 더 높은 포화 바이오매스를 나타낸다.
15. 제 1-11 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자를 생산한다.
16. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신이다.
17. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트이다.
18. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
19. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
20. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 3% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
21. 제 15 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 6% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
22. 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 제 1-21 실시태양의 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법.
23. 생체 분자 수율을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법, 상기 방법은
a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며,
여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율에 비해 높은 생체 분자 수율을 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
24. 포화 바이오매스를 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법, 상기 방법은
a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며,
여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스에 비해 증가된 포화 바이오매스를 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
25. 제 23-24 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자는 내인성 유전자이다.
26. 제 23-25 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
27. 제 23-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
27.1 제 23-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 및 SEQ ID NO: 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다.
28. 제 23-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 방법.
28.1 28. 제 23-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 45인 방법.
29. 제 23, 25 또는 26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), b- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 17), c- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 20), d- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
29.1 제 23, 25 또는 26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 42를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), b- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 42를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), c- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 45를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), d- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 34를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
30. 제 23 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a-(SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
30.1 제 23, 25 또는 26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a-(SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 f- (SEQ ID NO: 8::SEQ ID NO: 34를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
31. 제 23, 25 또는 26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 방법.
31.1 제 23, 25 또는 26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 45인 방법.
32. 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 10), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), c- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), d- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 19), g- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), h- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), i- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 19), j- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 14), k- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 13), l- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 19), m- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 21), 및 n- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 14)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
32.1 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 35를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), c- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 38를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), d- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 43을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 42를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), g- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), h- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), i- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), j- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), k- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 38을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), l- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 44를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), m- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 46을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 n- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
33. 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), b- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), c- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), 및 d- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
33.1 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), b- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 38을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), c- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 36을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 및 d- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 39를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
34. 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20이다.
34.1. 제 24-26 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1이고 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 45를 암호화한다.
35. 제 23-34.1 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다.
36. 제 23-35 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
37. 제 23 및 25-31 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 생체 분자는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
38. 제 37 실시태양의 방법, 여기서 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신이다.
39. 제 37 실시태양의 방법, 여기서 유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트이다.
40. 제 37 실시태양의 방법, 여기서 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
41. 향상된 산업 성능을 갖는 유전자 조작 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는
a. RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
b. (a)의 폴리뉴클레오타이드의 개시 코돈의 돌연변이;를 포함하며
여기서 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드의 내인성 개시 코돈을 상이한 개시 코돈으로 대체한다.
42. 제 41 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
42.1 제 41 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 및 SEQ ID NO: 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
43. 제 41 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 19인 유전자 조작 세포.
43.1. 제 41 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 44인 유전자 조작 세포.
44. 제 41-43.1 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈은 'ATG' 또는 'GTG,'로부터 'TTG'로 변화된다.
45. 제 41-44 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다.
46. 제 41-45 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
47. 제 41-46 실시태양의 어느 하나의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자를 생산한다.
48. 제 47 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신이다.
49. 제 47 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트이다.
50. 제 47 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
51. 제 47 실시태양의 유전자 조작 숙주 세포, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
52. 생체 분자 또는 포화 바이오매스의 수율을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 숙주 세포를 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 변형시키는 단계는 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈을 돌연변이시키는 것을 포함하고, 여기서 변형은 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며
여기서 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율과 비교하여 생체 분자 수율을 증가시키거나 또는 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스과 비교하여 보다 높은 포화 바이오매스를 달성하고, 대조군 숙주 세포는 유전자 조작 숙주 세포의 개시 코돈 돌연변이를 포함하지 않으며, 유전자 조작 숙주 세포 및 대조군 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된다.
53. 제 52 실시태양의 방법, 여기서 내인성 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자이다.
53.1 제 52 실시태양의 방법, 여기서 내인성 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 및 SEQ ID NO: 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다.
54. 제 52 실시태양의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자이다.
54.1 제 52 실시태양의 방법, 여기서 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 44를 암호화한다.
55. 제 52-54.1 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈은 'ATG' 또는 'GTG'로부터 'TTG'로 변화된다.
56. 제 52-55 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다.
57. 제 52-56 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
58. 제 52-55 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 생체 분자는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
59. 제 58 실시태양의 방법, 여기서 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신이다.
60. 제 58 실시태양의 방법, 여기서 유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트이다.
61. 제 58 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
62. 제 58 실시태양의 어느 하나의 방법, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타낸다.
본 발명에 인용된 모든 참고 문헌, 논문, 출판물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
그러나, 여기에 인용된 임의의 참고 문헌, 논문, 출판물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원은 유효한 선행 기술을 구성하거나 또는 세계 어느 나라에서의 공통의 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen Inc. Manchester, Shawn <120> GENETIC PERTURBATION OF THE RNA DEGRADOSOME PROTEIN COMPLEX <130> ZYMR-007/01WO 327574-2026 <150> US 62/358,201 <151> 2016-07-05 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg0007_lib_39 <400> 1 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtat tatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 2 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg0007 <400> 2 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtaa gatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 3 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg1860 <400> 3 cttagctttg acctgcacaa atagttgcaa attgtcccac atacacataa agtagcttgc 60 gtatttaaaa ttatgaacct aaggggttta gca 93 <210> 4 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg0755 <400> 4 aataaattta taccacacag tctattgcaa tagaccaagc tgttcagtag ggtgcatggg 60 agaagaattt cctaataaaa actcttaagg acctccaa 98 <210> 5 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg0007_265 <400> 5 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtac gctggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 6 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg3381 <400> 6 cgccggataa atgaattgat tattttaggc tcccagggat taagtctagg gtggaatgca 60 gaaatatttc ctacggaagg tccgtt 86 <210> 7 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg0007_119 <400> 7 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgttg catggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 8 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression promoter derived from Pcg3121 <400> 8 gtggctaaaa cttttggaaa cttaagttac ctttaatcgg aaacttattg aattcgggtg 60 aggcaactgc aactctggac ttaaagc 87 <210> 9 <211> 1245 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1245) <223> RNA degradation/processing gene cg1144 <400> 9 atggcatttg gattttttag tagacgtaag aaaaagaaca aagacaaaaa cccgaatgaa 60 aattcagcag tgcccgcaca ctctgaagat tcacctcagg aggtttttga gggtaatggt 120 cgtcaggtag gcgaccccat tgaacagcag gttgatcgag atgctaaagg tcgtctcaca 180 gcggcggatt tcttgccgga cgctgatctg ccacagctga atcgttcgcg tgcaaatatg 240 ctgcgccgtg aattggagta ccgtttttca ctccagaatg cccacattaa tatcgatgga 300 aacacggcca tgattcagcg ttcagatggc ggggcagcac atgtctcgtt gcgcaccctc 360 gcgatgaatg cagctggcct tgataacttt gatcaactcc ctgaactggt ggaaagcttc 420 gttcacggca cgctggccga tgcaacatta aacgatcttt ctactgctga cctgtataaa 480 gcactgcgcc ttcgcctgct gccaacacct ggtgaaggcg acgatctagt tgagcatgga 540 ctcgaccggg aaagccagat ccgcgacgat tcaatcctgc gcaccttcac ctctgacatg 600 tcgatcgcgc tggtgctcga taccgagcat gccatccgca tccagccact caaagagctc 660 gaggagttcg atgacctcag cgccctagag cgggctgcgg accgcaatac ctggcaagag 720 ctttacgacg caaacgttga cgcttccttc gtcgacgctg aatcagacag cgaagggtca 780 tcattttggg ctttcgaatc taactcgtac tacctgggta gtgcaccact gttcctcaac 840 gatttgttgg caaagtgggc acctgacctg gaccaaagtg atggcgtcat ctttgctgtc 900 cctgatcgtg atctgttgat tgcgcgtcct gtgaccaccg gcgaagatct gatgaacgga 960 atcaccgcga tggtgaggat cgcgatgcgc tttggcctcg ggaacccgac gtcgataagc 1020 ccgcgcctgc acctgctgcg cgacaaccag gtgaccacct tcaccgactt ccgcgtcgtc 1080 tctcctgaaa tggaagctga atgggaagac agcgcgtttg acgcgccacc ggccggcgcg 1140 atcggcattg aggtgcgccc agatccgtat ctgatggagc gcctccaaca gggcggcttt 1200 ggtgatttcg gagatttcgg caagccccgc gatctagata tgtag 1245 <210> 10 <211> 1410 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1410) <223> RNA degradation/processing gene cg2453 <400> 10 atgaagctct atgcagcagt cctcgacttt gaaccagtgg cacaagagtt cggtgtggag 60 cgaggttttg accctcatat ccacgacgaa gccgcgtcaa gtgtcgatag gtatgcgcaa 120 gagcgggaag atctcctgca catgcccttt gtcaccatcg atcccgtagg ttccagagac 180 ctcgatcaag ctgtgctgat tgaggagatc gacagcggat ttcgggtgca ttacgcgatt 240 gcagatgtcg cagccttcgt ggagccgggc agtgaattgg aaaagatttc ccttcaccgc 300 gggcagacta tttatctgcc ggattcccca gcgcgactgc accctgagga attatccgaa 360 gatgcggcaa gcctgctgga gggacaaacg agaccagcgg ttgtgtggtc gattgatcta 420 gatgaacgtg gcgaagtcac agccaccaag gtgcgtcgcg ggttggtgaa atcccgggcg 480 cgtttggatt atgatcaggc tcaaatagat gccgagaatg gtcggttgca tccgtcgata 540 agcttattgc ccaaggtcgg gcagctgagg caggaaagcg cgctacggcg cgaagccgtg 600 aatctttcta ttcccagcca gcgagtggtg aaagtgccca atgatgacgc cggtgagcac 660 tatgaaattg tcatcgagcc acgcccgcac atcatggatt acaattccga gatttccctg 720 ctcacaggca tggtagcagg ggagatgatg gtgaaagcgg ggcacggttt gctgcgtaca 780 ctcgccccgg cgaccaaaga atccgaagct actttcagat cagaggcgca agcccttggt 840 tttgagatcg cgcccgaaca acccatcggt gagtttcttc aaagtgtgga tcccaatacg 900 cccaaaggga tggccattca gagggaagcg cagaaactct tgcggggttc tggctacgcc 960 agcgtgaaaa atggggactc ggaagtgcat tccggtgttg gtggttacta tgctcacgtc 1020 accgcaccgc tgcgccgact tatcgaccgt ttcgccaccg aacattgtct tgcgattgcc 1080 tccggaacgg acgttcctga atgggtgacc agggtggaag agcaagttct cgacaccatg 1140 aaatactcct ccattttggc cagccaagtg gataatgcct gcctcgacct cacagaagcc 1200 accgtgttga aatactggga gggccaaaac ttcaacgcgg tggttgtagc gagcgaacct 1260 gaaaagaact ctgctcgact ttttgtgtac aaaccgccag tgttggcaaa gtgtattggc 1320 gccccagaac agggaactaa ccaagaagtc acactggtga ctgcgaactt gaagaagcgt 1380 gaagttttgt ttgcgtggcc ggctgactaa 1410 <210> 11 <211> 2199 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2199) <223> RNA degradation/processing gene cshA <400> 11 atgagtaata ccgagaacgt caacggcgac gtagaacagc cgaataacgt catttcgtcg 60 gaatctcagg aaaccccgca gggtgactca gcatcagctg acttcgctct cgaaacccca 120 accaacactg ttgaagatgc accagcatct gagggtagcg aagagatcac cagggttgcg 180 gatacttctg aggacgccga ctctgcagat gcagacaacg cgagcaatgt aatcaatgag 240 aatgaggact cctcggaagg tgctaaccag ccttcaaacg agtcatcctc tacggaagcc 300 aagtccggct tcgatgcact cggactgcca gagcgtgttc ttgacgctgt gcgcaaggtg 360 ggttacgaaa ctccttcccc aattcaggca caaaccatcc caatcctcat ggagggccag 420 gatgttgttg gtctagcaca gaccggtacc ggtaagaccg cagctttcgc gctgccaatc 480 ctttcccgta ttgacaagtc cgtgcgcagc ccacaggcac ttgtgcttgc ccctacccgt 540 gagctggcac ttcaggttgc tgactccttc caatccttcg ctgaccacgt cggtggcctg 600 aacgttctgc caatctatgg tggacaggct tacggcattc agctctctgg cctgcgtcgt 660 ggcgctcaca tcgtcgtggg taccccaggc cgtatcatcg accacctcga aaagggctcc 720 ctggatatct ccggactgcg cttcctcgtg ctcgatgaag cagacgagat gctgaacatg 780 ggcttccagg aagatgtcga gcgcatcctc gaggacaccc cagacgagaa gcaggttgca 840 ctattctccg caacgatgcc aaacggcatt cgtcgcctgt ccaagcagta cctgaacaac 900 cctgctgaaa tcaccgttaa gtccgagacc aggactaaca ccaacatcac ccagcgcttc 960 ctcaacgttg cacaccgcaa caagatggat gcactgaccc gtattctcga ggtcaccgag 1020 tttgaagcaa tgatcatgtt cgtgcgcacc aagcacgaaa ctgaagaagt tgctgaaaag 1080 ctccgtgcac gcggattctc cgcagcagcc atcaacggcg acattgctca ggcacagcgt 1140 gagcgcaccg tcgaccagct gaaggacggc cgcctagaca tcctcgttgc aaccgacgtt 1200 gcagcccgtg gtcttgacgt tgagcgcatc tcccacgtgc ttaacttcga cattccaaac 1260 gacaccgagt cctacgttca ccgcatcggc cgcaccggcc gtgcaggacg taccggcgag 1320 gcaatcctgt tcgtgacccc acgtgagcgt cgtatgcttc gctccatcga gcgcgcaacc 1380 aacgcaccac tgcacgaaat ggaactgcca accgtcgatc aggtcaacga cttccgcaag 1440 gtcaagttcg ctgactccat caccaagtcc ctcgaggaca agcagatgga cctgttccgc 1500 accctggtca aggaatactc ccaggccaac gacgttcctt tagaggacat cgcagcggca 1560 ctggcaaccc aggcacagtc cggcgacttc ctgctcaagg agctcccacc agagcgccgc 1620 gagcgcaacg accgccgtcg tgaccgtgac ttcgacgacc gtggtggacg tggacgcgac 1680 cgtgaccgtg gcgaccgcgg agatcgtggc tcacgcttcg accgcgacga cgagaacctg 1740 gcaacctacc gcctcgcagt gggcaagcgc cagcacatcc gcccaggcgc aatcgttggt 1800 gcacttgcca acgaaggtgg cctgaactcc aaggacttcg gccgcatcac catcgcagcc 1860 gaccacaccc tggttgaact gccaaaggac ctcccacaga gcgttcttga caacctgcgc 1920 gacacccgca tctccggcca gctcatcaac atcgaacgcg actccggtgg acgcccacca 1980 cgccgcttcg agcgcgatga ccgtggcgga cgcggcggat tccgcggcga ccgtgatgac 2040 cgcggtggac gtggacgcga ccgtgacgat cgtggaagcc gtggaggttt ccgcggtgga 2100 cgtgaccgtg acgatcgtgg cggacgcggt ggattccgtg gacgcgacga ccgcggagac 2160 cgtggtggcc gtggcggtta ccgtggcgga cgcgattaa 2199 <210> 12 <211> 1857 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1857) <223> RNA degradation/processing gene dnaK <400> 12 atgggacgtg cagtaggaat tgaccttgga accaccaact ctgtggtttc cgtacttgaa 60 ggcggcgagc cagtagttat cgcaaacgca gaaggctcac gcaccacccc ttccgtcgtt 120 gcattcgcaa agaacggtga agttctagtc ggccagtccg ctaagaacca ggcagtcacc 180 aacgttgacc gcaccattcg ctccgtcaag cgccacatcg gcaccgactg gtccgttgct 240 atcgatgaca agaactacac ctcacaggaa atctcggctc gtaccctgat gaagctgaag 300 cgcgacgctg aagcatacct gggcgaggac gtcactgatg ctgttattac cgttcctgca 360 tacttcgagg actcacagcg ccaggcaacc aaggaagctg gccagatcgc aggccttaac 420 gttctgcgta ttgttaacga gccaaccgcg gctgcacttg catacggcct tgagaagggc 480 gagcaggagc agaccattct ggtattcgac ctcggtggcg gcaccttcga cgtctccctc 540 ctagagatcg gcgacggtgt tgttgaggtt cgcgcaacct ccggcgataa cgagctcggt 600 ggcgacgact gggatcagcg tatcgttgac tggctggtag agaagttcca gtcctccaac 660 ggcatcgacc tgaccaagga caagatggcc ctgcagcgtc tgcgtgaggc agctgagaag 720 gcaaagatcg agctgtcctc ttcccagagt gcaaacatca accttcctta catcaccgtt 780 gatgcagaca agaacccact gttcttggat gagacccttt cccgtgccga gttccagcgc 840 atcacccagg acctcctggc ccgcaccaag actcctttca accaggttgt taaggacgct 900 ggcgtgtccg tctcggagat cgaccacgtt gttctcgtcg gtggttccac ccgtatgcct 960 gctgttaccg aactggtcaa ggaactgacc ggtggacgtg agccaaacaa gggtgttaac 1020 ccagatgagg ttgttgcagt tggtgcagca cttcaggccg gtgttctccg cggcgaggtc 1080 aaggatgtgc ttcttcttga cgtcacccca ctgtccctcg gcattgagac caagggtggc 1140 gtgatgacca agctcatcga gcgcaacacc accatcccta ccaagcgttc cgagaccttc 1200 accaccgcag aggataacca gccttctgtt cagatccagg tcttccaggg cgagcgtgaa 1260 atcgcaaccg ccaacaagct gctcggatcc ttcgagctcg gcggcatcgc acctgcacca 1320 cgtggcgtcc cacagatcga ggtcactttc gacatcgacg ccaacggcat cgtccacgtc 1380 accgcaaagg acaagggtac tggcaaggaa aacaccatca ccattcagga cggctccggt 1440 ctctcccagg atgaaattga tcgcatgatc aaggatgctg aagctcacgc tgatgaggac 1500 aagaagcgcc gcgaggagca ggaagtccgc aacaacgctg agtccctggt ttaccagacc 1560 cgcaagttcg ttgaagagaa ctccgagaag gtctccgaag accttaaggc aaaggtcgaa 1620 gaggcagcca agggcgttga agaagcactc aagggcgagg acctcgaggc aatcaaggct 1680 gcagttgaga agctgaacac cgagtcccag gaaatgggta aggctatcta cgaggctgac 1740 gctgctgctg gtgcaaccca ggctgacgca ggtgcagaag gcgctgcaga tgacgatgtt 1800 gttgacgctg aagttgtcga agacgacgca gctgacaatg gtgaggacaa gaagtaa 1857 <210> 13 <211> 1278 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1278) <223> RNA degradation/processing gene eno <400> 13 gtggctgaaa tcatgcacgt attcgctcgc gaaattctcg actcccgcgg taacccaacc 60 gtcgaggcag aggttttcct tgatgacggt tcccacggtg tcgcaggtgt tccatccggc 120 gcatccaccg gcgtccacga ggctcatgag ctgcgtgacg gtggcgatcg ctacctgggc 180 aagggcgttt tgaaggcagt tgaaaacgtc aacgaagaaa tcggcgacga gctcgctggc 240 ctagaggctg acgatcagcg cctcatcgac gaagcaatga tcaagcttga tggcaccgcc 300 aacaagtccc gcctgggtgc aaacgcaatc cttggtgttt ccatggctgt tgcaaaggct 360 gctgctgatt ccgcaggcct cccactgttc cgctacatcg gtggaccaaa cgcacacgtt 420 cttccagttc caatgatgaa catcatcaac ggtggcgctc acgctgactc cggtgttgac 480 gttcaggaat tcatgatcgc tccaatcggt gcagagacct tctctgaggc tctccgcaac 540 ggcgcagagg tctaccacgc actgaagtcc gtcatcaagg aaaagggcct gtccaccgga 600 cttggcgatg agggcggctt cgctccttcc gtcggctcca cccgtgaggc tcttgacctt 660 atcgttgagg caatcgagaa ggctggcttc accccaggca aggacatcgc tcttgctctg 720 gacgttgctt cctctgagtt cttcaaggac ggcacctacc acttcgaagg tggccagcac 780 tccgcagctg agatggcaaa cgtttacgct gagctcgttg acgcgtaccc aatcgtctcc 840 atcgaggacc cactgcagga agatgactgg gagggttaca ccaacctcac cgcaaccatc 900 ggcgacaagg ttcagatcgt tggcgacgac ttcttcgtca ccaaccctga gcgcctgaag 960 gagggcatcg ctaagaaggc tgccaactcc atcctggtta aggtgaacca gatcggtacc 1020 ctcaccgaga ccttcgacgc tgtcgacatg gctcaccgcg caggctacac ctccatgatg 1080 tcccaccgtt ccggtgagac cgaggacacc accattgctg acctcgcagt tgcactcaac 1140 tgtggccaga tcaagactgg tgctccagca cgttccgacc gtgtcgcaaa gtacaaccag 1200 cttctccgca tcgagcagtt gcttggcgac gccggcgtct acgcaggtcg cagcgcattc 1260 ccacgctttc agggctaa 1278 <210> 14 <211> 2262 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2262) <223> RNA degradation/processing gene gpsI <400> 14 atgagcgatg taaagtactt cgaagacacc gaatttggcc tgatcgaggc cgtcgcaacc 60 atcgacaacg gtgacttcgg aacccgcacc atccgttttg aaaccggcca acttgcccgc 120 caggcagatg gtgcagtgac cacctatctc gacgatgaca cgatgctgct ggcaaccacc 180 accgcatcca accagccacg cgagggcttt gacttcttcc cactgaccgt ggacgttgaa 240 gagcgtatgt acgcagctgg tcgcatccct ggctctttct tccgtcgtga gggccgccca 300 tccaccgaag ctatcctggc ttgccgtctc atcgaccgcc cactgcgccc aacctttgtt 360 aagggcctgc gcaatgaggt tcagatcgtt gtcaccgtca tgtccatgaa ccctgaggat 420 tactacgatg tcgtagcaat caacggagct tccgcagcaa cccgcatctc cggacttcct 480 gtctccggcg ctgtcggtgg cgttcgcatg gcactggttg ttgatgaaaa gcacccagaa 540 ggccaatggg ttgcattccc aacccacgct caacatgagc agtccgtatt tgaaatcgtt 600 gtggctggtc gcctcgtcga gcgcaagcgc ggcaacaaga ccttctccga cgtcgcagtg 660 atgatggtgg aagctggcgc ttccgaaaac gttgtcaacc gcgtcaagga cggtgcacca 720 gcaccaaccg aaaagatcgt ctccgacggc cttgaagcag ctaagccatt catcgacatc 780 ctgtgccgcg cacaggaagg tctggcacag cgcgttggaa acgcagccaa ggaattccca 840 ctgttccctc catacaccga cgaggtgtac tccgcagtgg agcgcaaggt atccaagaag 900 ctagcttctt tgctgaccct gaaggcaaag caagagcgcg acgacgctac caacgcctac 960 atggaagaaa tcgaagccga actgcttcca aagttcgagg cttcctacag ctcagcagcg 1020 gaagcgtcca aggaaatccg tgcagcatac aacgctgtca tgaaggccat cgtgcgccgc 1080 atgatcctca ccgatcactt ccgcatcgac ggccgcggag tcaccgacat ccgtgacctg 1140 gcagtagaag ttgagctcat cccacgtgcg cacggttcct ccctcttcga gcgtggcgag 1200 acccagatcc tcggtgtcac caccctggac atgctcaaga tggaacagca aatcgactcc 1260 ctggcaccag gcgatgcgaa gcgctacatg caccactaca acttccctcc atactccacc 1320 ggtgaaaccg gtcgtgtggg ctcaccaaag cgccgcgaaa tcggccacgg tgcacttgca 1380 gaacgcgcag ttttgccagt aatcccatcc cgtgaggaat tcccatacgc aatccgtcag 1440 gtctctgaag ctctgggctc caacggctcc acctccatgg gctctgtctg tgcatccact 1500 ctgtccctgt acaacgctgg tgttccactg aaggcacctg ttgcaggtat cgccatggga 1560 cttgtttccg gtgaaatcga cggcaagacc gagtacgttg cactgaccga catcctcggc 1620 gcagaagacg cattcggcga catggacttc aaggttgccg gcaccgcaga cttcatcacc 1680 gcacttcagc tggacaccaa gctggacggc attccttcca aggtgctctc cgatgcgctt 1740 gagcaggcac gcgatgcccg actgaccatc ctgaacacca tggctgatgt catcaacgga 1800 gctgatgaga tgagcaagtt cgctcctcgc atcaccaccg tgaagatccc agtggcaaag 1860 atcggtgagc tgatcggacc aaagggtaag aacatcaacg ctcttaccga agagaccggc 1920 gcaaacatct ccatcgaaga tgacggcacc gtgttcatct ctgcagctga cggcgcatct 1980 gctgaagcgg cgatcgaaaa gatcaacgct ctggcgaacc cacagctgcc aaaggttggc 2040 gagcgcttcc tcggaaccgt cgtcaagacc accgcattcg gagcattcgt ttccttgctc 2100 ccaggccgcg acggccttgt tcacatctcc aagctgggta acggcaagcg agtagaaaag 2160 gtcgacgatg tggtgaaggt tggcgagaag attcaggtcg aaatcgctga catcgacaac 2220 cgcggcaaga tctccttggt cccagttgtt gaagaggact aa 2262 <210> 15 <211> 1647 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1647) <223> RNA degradation/processing gene groEL <400> 15 atggcaaaga tcatcgcctt tgatgaggaa gcacgtcgtg gcctagaaaa gggactgaac 60 accctggctg acgctgttaa ggttactttg ggaccaaagg gccgtaacgt cgttttggaa 120 aaggcttggg gcgccccaac cattaccaac gatggtgtca ccatcgcacg tgagatcgag 180 cttgaggatc cttacgagaa gatcggcgca gagctggtca aggaagttgc taagaagact 240 gatgacgtcg cgggcgatgg caccaccacc gctaccgtat tggcacaggc tctggttaag 300 gaaggcctgc gcaacgttgc tgctggttcc aacccaatgg gcatcaagcg tggcatcgag 360 aaggctgttg ctcaggtaac tgagaagctg ctcgaagctg cgaaggaagt tgagaccgag 420 gagcagatcg ctgctaccgc tggtatctcc gcagctgacc cagctatcgg cgcacagatt 480 gctaaggcaa tgtacgcagt tggcggtggc aagctgaaca aggattccgt catcactgtt 540 gaagagtcca acactttcgg tgttgagctc gaggttactg agggtatgcg ctttgataag 600 ggctacatct ccggttactt cgcaactgac atggagcgcc tcgaggctgt tctggaagat 660 ccttacatcc tgctggtttc cggcaagatc tccaacatca aggacctgct cccactgctg 720 gagaaggtca tgcagtccgg caagcctttg ctgatcatct ctgaggacgt cgagggcgag 780 gctctgtcca ccctggttgt caacaagatc cgtggcacct tcaagtctgt tgctgttaag 840 gctccaggct tcggcgaccg ccgtaaggct cagctgcagg acattgctgt tctgaccggt 900 ggccaggtca tttctgaaga ggttggcctc tccctcgaga ccgctgatct gccacttcta 960 ggccaggcac gcaaggttgt tgtcaccaag gatgacacca ctatcgttga tggcgcaggt 1020 tctgaggctc agatcgaggg tcgcgttaac cagatccgcg ttgagatcga gaactctgat 1080 tccgattacg accgtgagaa gctcaacgag cgcctggcta agcttgccgg cggcgttgca 1140 gttcttaagg ttggcgctgc aactgaggtt gagctcaagg agcgcaagca ccgcattgag 1200 gacgcagtcc gcaacgctaa ggcagctgtt gaagagggca tcgttgcagg cggtggcgtt 1260 gcgctgctgc aggctgctca cgtcctggac aacgatcttg agctttccgg cgacgaggca 1320 accggcgttc gcatcgtccg cgaggctctg actgctcctc tgaagcagat cgctgctaac 1380 gctggcctcg agccaggcgt tgttgctgac aaggtttccc agctcccaca gggcgagggc 1440 ctcaacgctg caaacggcga gtacgtcgac ctcatggctg cgggcatcaa cgacccagtt 1500 aaggtcaccc gctccgcact ccagaacgct gcatccattg cagctctgtt cctgaccact 1560 gaggctgtcg ttgctgacaa gccacagcct gcaggcgcag ctggcatgcc aggtgcagac 1620 gagatgggcg gcatgggcgg cttctaa 1647 <210> 16 <211> 1647 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1647) <223> RNA degradation/processing gene groEL genbank CP012194 homolog <400> 16 atggcaaaga tcatcgcctt tgatgaggaa gcacgtcgtg gcctagaaaa gggactgaac 60 accctgactg acgctgttaa ggttactttg ggaccaaagg gccgtaacgt cgttttggaa 120 aaggcttggg gcgccccaac cattaccaac gatggtgtca ccatcgcacg tgagatcgag 180 cttgaggatc cttacgagaa gatcggcgca gagctggtca aggaagttgc taagaagact 240 gatgacgtcg cgggcgatgg caccaccacc gctaccgtat tggcacaggc tctggttaag 300 gaaggcctgc gcaacgttgc tgctggttcc aacccaatgg gcatcaagcg tggcatcgag 360 aaggctgttg ctcaggtaac tgagaagctg ctcgaagctg cgaaggaagt tgagaccgag 420 gagcagatcg ctgctaccgc tggtatctcc gcagctgacc cagctatcgg cgcacagatt 480 gctaaggcaa tgtacgcagt tggcggtggc aagctgaaca aggattccgt catcactgtt 540 gaagagtcca acactttcgg tgttgagctc gaggttactg agggtatgcg ctttgataag 600 ggctacatct ccggttactt cgcaactgac atggagcgcc tcgaggctgt tctggaagat 660 ccttacatcc tgctggtttc cggcaagatc tccaacatca aggacctgct cccactgctg 720 gagaaggtca tgcagtccgg caagcctttg ctgatcatct ctgaggacgt cgagggcgag 780 gctctgtcca ccctggttgt caacaagatc cgtggcacct tcaagtctgt tgctgttaag 840 gctccaggct tcggcgaccg ccgtaaggct cagctgcaga acattgctgt tctgaccggt 900 ggccaggtca tttctgaaga ggttggcctc tccctcgaga ccgctgatct gccacttcta 960 ggccaggcac gcaaggttgt tgtcaccaag gatgacacca ctatcgttga tggcgcaggt 1020 tctgaggctc agatcgaggg tcgcgttaac cagatccgcg ttgagatcga gaactctgat 1080 tccgattacg accgtgagaa gctcaacgag cgcctggcta agcttgccgg cggcgttgca 1140 gttcttaagg ttggcgctgc aactgaggtt gagctcaagg agcgcaagca ccgcattgag 1200 gacgcagtcc gcaacgctaa ggcagctgtt gaagagggca tcgttgcagg cggtggcgtt 1260 gcgctgctgc aggctgctca cgtcctggac aacgatcttg agctttccgg cgacgaggca 1320 accggcgttc gcatcgtccg cgaggctctg actgctcctc tgaagcagat cgctgctaac 1380 gctggcctcg agccaggcgt tgttgctgac aaggtttccc agctcccaca gggcgagggc 1440 ctcaacgctg caaacggcga gtacgtcgac ctcatggctg cgggcatcaa cgacccagtt 1500 aaggtcaccc gctccgcact ccagaacgct gcatccattg cagctctgtt cctgaccact 1560 gaggctgtcg ttgctgacaa gccacagcct gcaggcgcag ctggcatgcc aggtgcagac 1620 gagatgggcg gcatgggcgg cttctaa 1647 <210> 17 <211> 1617 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1617) <223> RNA degradation/processing gene groEL2 <400> 17 atggcaaagc tcattgcttt tgaccaggac gcccgcgaag gcattctccg gggcgttgac 60 gctctggcaa acgctgtcaa ggtaaccctc ggcccacgcg gccgtaacgt ggttcttgat 120 aaggcattcg gcggacctct ggtcaccaac gacggtgtca ccattgcccg cgacatcgac 180 cttgaggatc cttttgagaa cctcggtgca cagctggtga agtccgttgc tgttaagacc 240 aacgatatcg ctggcgacgg caccaccacc gcaactctgc ttgctcaggc actcattgct 300 gaaggcctac gcaacgttgc tgctggcgca aacccaatgg agctcaacaa gggtattgct 360 gcagctgcag aaaagaccct ggaagagctg aaggcacgcg caaccgaggt gtctgacacc 420 aaggaaatcg caaacgtcgc aaccgtttca tcccgcgatg aagttgtcgg cgaaattgtt 480 gctgcagcaa tggagaaggt tggcaaagac ggtgtcgtca ccgtcgagga gtcccagtcc 540 atcgagactg ctctcgaggt caccgaaggt atttccttcg acaagggcta cctttcccct 600 tacttcatca acgacaacga cactcagcag gctgtcctgg acaaccctgc agtgctgctt 660 gttcgcaata agatttcttc cctcccagac ttcctcccac tgttggagaa ggttgtggag 720 tccaaccgtc ctttgctgat catcgcagaa gacgtcgagg gcgagccttt gcagaccctg 780 gttgtgaact ccatccgcaa gaccatcaag gtcgttgcag tgaagtctcc ttacttcggt 840 gaccgccgca aggcgttcat ggatgacctg gctattgtca ccaaggcaac tgtcgtggat 900 ccagaagtgg gcatcaacct caacgaagct ggcgaagaag ttttcggtac cgcacgccgc 960 atcaccgttt ccaaggacga aaccatcatc gttgatggtg caggttccgc agaagacgtt 1020 gaagcacgtc gcggccagat ccgtcgcgaa atcgccaaca ccgattccac ctgggatcgc 1080 gaaaaggcag aagagcgttt ggctaagctc tccggtggta ttgctgtcat ccgcgttggt 1140 gcagcaactg aaaccgaagt caacgaccgc aagctgcgtg tcgaagatgc catcaacgct 1200 gctcgcgcag cagcacaaga aggcgttatc gctggtggcg gttccgcttt ggttcagatc 1260 gctgagactc tgaaggctta cgccgaagaa ttcgaaggcg accagaaggt cggcgttcgc 1320 gcactggcta ctgctttggg caagccagcg tactggatcg cctccaacgc aggccttgac 1380 ggctctgttg ttgttgcacg cactgctgct ctgccaaacg gcgagggctt caacgctgca 1440 actttggaat acggaaacct gatcaacgac ggtgtcatcg acccagtcaa ggtcacccat 1500 tccgcagtag tgaatgcaac ctctgttgca cgcatggttc tgaccactga ggcttctgtt 1560 gttgagaagc ctgcagaaga agcagccgat gcacatgcag gacatcatca ccactaa 1617 <210> 18 <211> 810 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(810) <223> RNA degradation/processing gene mutM2 <400> 18 atgcctgaag gacacgtgat tcatcgacta gctggggaac tcaccaagaa ttttggcgat 60 accattttgg acgccacttc acctcaagga cgctttgctt ctgaagcggc gatcatcaac 120 ggtcaccgca tcgcggttgc ggaggcttac ggcaagcacc tgttcgtcga gttcgatgcg 180 gatcaccctg agcacatttt gtatatccat ttgggtctaa ttggcacgtt gcagtttgaa 240 cctgcggaag aaacccgcgg gcagattcgc ctgcaccttt ccgacgggga gatcgcagct 300 aatttgcgcg gaccccaatg gtgcaggttg atcaccgatg cagagcacac ccaggccatt 360 ggaaaattgg gcgctgatcc gattcgcgat gatgccgatc cggaaccaat tcggattaag 420 gtgcagcgct cagggcgaag cattggttcg ttgttgatgg atcagaagct tttcgcaggt 480 gtgggaaata tctaccgtgc ggagacactt ttccgactgg ggatttcacc gttcaccatt 540 ggaaaagaca tcaccacggc acagttccga tccatttggg cggatcttgt tgggttgatg 600 aaagacggtg ttgtggctgg tcggattgat actgtgcgcc cggaacacac accggaggcg 660 atgggtaggc caccgcggaa agatgatcac ggcggtgagg tttacaccta tcggcgaacc 720 ggtcaagagt gctttctgtg cgcaactccc atcaaggagc aggtcatgga gggtcgcaac 780 ttattttggt gtcccggctg ccaacgctag 810 <210> 19 <211> 1275 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1275) <223> RNA degradation/processing gene rhlE <400> 19 gtgtcttctg aaagccccag acctacgttc acagagctcg gcgttgcggt ggaaatcacc 60 gacgcactcg aagccctcgg catcaaccga actttcgcga tccaggagta cacacttccc 120 atcgcgctcg acggccacga cttcatcggc caagcccgca ccggcatggg caaaacctac 180 ggattcggtg tcccactcct cgatagagtc ttcgactcag ccgacgtcgc agcaaccgac 240 ggaacccccc gagccctcgt catcgtgccc acccgagaac tcgcagtcca agtcggcgac 300 gacctccaac gcgcagcaac caacctgccg ctaaagatct tcaccttcta cggcggcaca 360 ccctacgaag aacagatcga cgcactcaaa gtcggcgtcg acgttgtcgt aggcacaccc 420 ggacgactac tcgacctgca caaacgaggc gcgctatcgc tcgacaaagt agcgatccta 480 gtcctcgatg aagccgacga aatgctcgat ctgggctttc tgcccgacat cgaaaaaatc 540 ctccgtgccc tcacccacca gcatcaaacc atgctgttct ctgccacgat gcccggcgcg 600 atcctcacac tcgcacgcag cttcctgaac aaaccagtgc acatccgagc cgagacatcg 660 gacgcctcag caacacacaa aaccaccaga caagtggttt ttcaggcaca caaaatggac 720 aaggaagcca tcaccgcgaa aatcctgcaa gcgaaagatc gcggcaaaac gatcatcttc 780 gcccgcacga aacgcaccgc agcgcaagtt gccgaagacc tagcctccag aggattctcc 840 gtcggatcag tgcacggcga tatgggccaa ccagcccgcg agaaatcact caacgcattc 900 cgcacaggaa aaattgacat ccttgtagcc acagacgtag ccgcccgagg catcgatgtt 960 gatgacgtca cccacgtcat caactaccaa acccccgacg atcctatgac ctacgtccat 1020 cgtatcggac gcacgggacg cgcagggcac aacggaacag ccgtcactct tgtcggctac 1080 gacgaaaccc tcaaatggac cgtcatcgac aacgaactcg aactcggcca accaaaccca 1140 ccacaatggt tctccacctc accagagctg cttgaagcac tcgacatccc agaaggtgtc 1200 accgaacgag tcggaccacc aaccaaagtt ctaggcggaa cagccccacg accaccacgc 1260 cgcacccgga aataa 1275 <210> 20 <211> 2433 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2433) <223> RNA degradation/processing gene rho <400> 20 gtgacaacca cagacaacac cgcagcgaat cagggtgaac tgaccgccct ccgactgccg 60 gatctgcgca aaattgccgc cgaccttggg ctcaagggaa cctcggcatt gcgtaagggc 120 gatctgatca acgccatctc tgcagcccgc gagggtaagc caaccgcagc tgcgaagaag 180 acttccccac gcaaggcccc atcacgcacc cgtgcgacac agccttccgc accggttgag 240 caagcacaag aagctcccgc gcaaacttca actgcacctg cttcagcacc atctgaagag 300 actcccgcag ctcccgctcg tcgtggacgt cgccgtgtaa ccaccaccgc gaccacccca 360 gagccagcag cgcctgcaca atcccagcct gcagaagctc aaccagcaca gactcaggct 420 gcacagcaag aagaacttcc tgttgcagcg aaggagtccg caccagctac agaaaacact 480 cagggccaat cccagggcca agctcagggc gatgagcacg atgatcgctt tgagtcccgt 540 tctgctgcac gccgagcacg ccgcaaccgt cagcgccaga tccaccgcga tggcgatgac 600 aatgcgaatg caaacacaga gtctgagcag aacacccctg cccagaatgc aaccgcacag 660 gctgagtctg agcagactgc agctcctgca caggctgaag cagctgagca gaaccagaac 720 gataacagcg agtcctccga gaaccgcagc gataactacc gcaacaacaa tcgtcgttcc 780 cgcaacaacc ggaacaatcg caattaccgc gataacaacg agtcctctga taatgcagga 840 cagtccagca atgatgatgc cgacaacaat caggcacggt ctgaggacaa taacgacgat 900 cgccgttctc gtaataaccg taacaacgac cgcaatgatc gtaacaatcg caattaccgc 960 gataacaacg agtcctctga taatgcagga cagtccagca atgatgatgc cgacaacaat 1020 caggcacggt ctgaggacaa taacgacgat cgccgttctc gtaataaccg taacaacgac 1080 cgcaatgatc gtaacgatcg caattaccgc gacaaccaca acgacgacaa cgatgatcgc 1140 cgcaaccgtc gcggacgccg caaccgccgt ggacgcaacg accgtaacga tcgcgataac 1200 cgggataacc gggataaccg cgacaacagc aacgatggcg acaacaacca gcaagatgag 1260 ctgcagcagg tagcaggcat cctggacatc gtggaccata acgtcgcatt cgtgcgcacc 1320 accggttacc atgctgcacc ttctgacgtg tttgtcagca accagctgat ccgccgtatg 1380 ggtcttcgtt ccggtgacgc cattgaaggt caggttcgca tgaaccaggg tggtggcaac 1440 cacaacaacc atggtcgcaa ccgtcagaag tacaacaact tggtgcgcgt ggagatggtt 1500 aacggtcttc ctgctgaaga gactcgcaac cgtcctgagt tcggcaagct gactcctctg 1560 tacccgaacc agcgtctgca tttggaaact gagcagaaga ttcttaccac tcgtgtgatc 1620 gacttgatca tgcctattgg taagggacag cgtgctttga ttgtgtcgcc acctaaggct 1680 ggtaagacca cgatcctgca gaacattgcg aacgctattt ccaccaacaa cccagagtgc 1740 tacctcatgg ttgttttggt tgatgagcgt ccggaagaag ttactgatat gcagcgctcc 1800 gtcaacggcg aagtgattgc ttctactttt gatcgtccac catcagagca cactgcggtt 1860 gctgagctgg cgattgagcg tgcgaagcgc ctggtggagc agggccagga cgtcgttgtt 1920 ctgcttgact ccattactcg tttgggccgt gcgtacaaca acagctcacc tgcatcggga 1980 cgtattttgt ccggtggtgt ggattccaat gcactgtacc cgccgaagcg tttcttgggt 2040 gctgctcgaa acatcgaaaa tggtggatct ttgaccatca tcgcaactgc catggtggaa 2100 accggctctg ctggtgacac cgtgatcttc gaggagttca agggcactgg taacgctgag 2160 ctgaagctgg atcgtaagat ctctgagcgc cgcgttttcc cagctgtgga tgttaatcct 2220 tctggtactc gtaaggacga gctgttgctc aacccggacg aggctcgcat tatgcacaag 2280 ctgcgtcgta ttctgtctgc acttgataat cagcaagcca ttgatctgtt gatcaagcag 2340 ctgaagaaga ccaagtccaa tgcggaattc ctcatgcagg ttgcttccag cgctccaatg 2400 gcaggcacag aaaaagagga ggattactcc taa 2433 <210> 21 <211> 3066 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3066) <223> RNA degradation/processing gene rne <400> 21 gtgccaaata acaaggcagt agaagcagaa atctctccct cggctgtgct ggccgcggaa 60 tttgatcgag attcattgag cgaaaaaact cgcgtacatc aactggccaa acgacttgga 120 atggtttcca aggacgtcgt tgttgcgctc gatggcatcg gcctggtcaa ggttgcgcag 180 tcaaacctga gcaaagaaga agtagaaaag cttctcgacg ccctgtctca gcccgtactc 240 aacgctgccc cagctgccgt ccccgacgtt gaaccggtgg agaagattcg tcgacgcgtt 300 gagaagaatg tggaaaatga aatccaccaa atcgaagaaa aagtagagcg cgaactcgcg 360 gcagtcgcgc aacctaccga cttcgaggcg gcagcccgcg aagaagtcac tgcagaactg 420 ctggaagata tcgtcccaga gatcaccccg gcgccggtgg aagcacctgt gtacacaccg 480 atctttgtgg cacctgcagt tgtacctact gaaaacgtcc aacacaccga cgatgaacag 540 gcccgcgaac gcacggcgag gaagcgccgt gggcgtcgtg gcaccggccg cggacgtgga 600 gctgaagctg aaaccgtcac cgaagtgagt gaggaggcgt cgacaagcga agtagaagag 660 gtaaacgagc caatcggaat taagggctcc actcgcttgg aggcgcaacg ccgccgtcgc 720 acggaaatgc gcgaagaaaa caaaaagcgc cgccatgtgg tgagcaccca ggagttcatg 780 gaacgccgtg aatcgatgga acgtcgcatg attgtgcgcg agcgccaacg ccacgatcac 840 ccaggtctgg tcactcaggt tggtgtgctg gaagacgatc agctggttga gcagtttgtt 900 acctctgatg cgcagatgtc catggtgggc aatatttatc tggggcgcgt tcaaaatgtg 960 ctgccaagca tggaagctgc cttcattgac attggaaaag gtcgcaacgg tgtgttgtat 1020 gccggcgaag ttgactggaa agctgctgga cttggcggac gtggacgtcg cattgagcag 1080 gcgctgaaag ccggcgacca ggttctcgtc caggtctcca aggatccatt gggccataag 1140 ggtgcgcgtt tgaccaccca aatttccctg gcgggacgtt acctggtgta cgttccaggt 1200 ggtcgcagcg ctggcatttc ccgcaaactg cctggacctg agcgcaagcg tctgaaggaa 1260 atccttggcc gcgttgtccc agcgcagggt ggaaccatca tccgaactgc tgctgaaggt 1320 gtgtcggaag aaaacatcgc agctgacgtg aaccgtctgc acaccctgtg ggagcagatc 1380 aaggaacgca ctgcgaagga aaagaagtcc cgcggttcca agccgatcac catgtatgaa 1440 gagccagaca tgctggtgaa ggtgatccgt gacctcttca atgaagattt cacctcactg 1500 atcgttgacg gcgaccgtgc ctggaacacc gtgcgtgcct acatccaatc agtcgctcct 1560 gatttggtgt cccgcgtgga acacttcgat cgcgcagact ttgacggcaa ggatgctttc 1620 gaagcattcg acctgaacac ccagcttgag gaagcgctgt cccgaaaggt gaacctgcca 1680 tcgggtggat cgctgatcat cgaccgcacc gaagccatga cggtgatcga tgtgaacacc 1740 ggacgctaca ccggcaaggg tggtggcaac ttggaagaaa ccgtcacgct caacaacatt 1800 gaagctgccg aagaaatcgt gcgccaaatg cgcctgcgtg atctcggtgg catgatcgtt 1860 gtcgacttca tcgatatggt gctgccagaa aaccaagaat tggtcctgcg ccgactcaat 1920 gaagcgctag aaaacgatcg cacccgccac caagtctctg aggtaacctc actgggactt 1980 gttcagatga cccgcaaacg catcggcgcg ggcctgctgg aaaccttctc ttcaccgtgt 2040 gagcactgtg aaggccgagg catcatcgtt catgttgatc cagtagacac cgttgacgag 2100 cgcgttgagg cgaaagcgga agagcgtagc cgtcgtcacc agcgttccaa tagcactgag 2160 aaggcagctg cggagcaccc gatggttgtt gccatgcgtg atctcgtgga aagcgatgaa 2220 cacgatctgg atcaagaatt tgaggaactc gctgcatcag tgatcgtcct cgatgactcc 2280 gatctagatg atgtggtcaa cgacaagctc gacgagcctg agcgcattct tgctgaatcc 2340 accgtggaac cagaggaagg accacgcagg agggcccgcc gtcaacgtca ggaatctgct 2400 gcggatgata ttgccgcgat tgcagctgct gccgtggaca ttgcttctga agaagaccct 2460 gatgagcctt cgggatcgtc gtatgtgtct gaccttgagg cagagcctat tgcacctgta 2520 gttgagaagg ctgctgaacc tgtggctgag ccaaccgctg attatgaaaa ggcacgtgcc 2580 gaatttgagg caagcccacg caggcgccgc aagactcgtg gcaattcacg ttcggatcat 2640 gctccaaagc cagaggattt cgcacctgtg gttgaagagg ttgctgagac tccagtgaag 2700 acacctgcgc ggaaggctcc acgccgtaac cgtccaagtg agctcagttc cggtgcgccg 2760 tcctctgcac cattgaccag gaaccgtcgc cgcgcagtgc gccgtcaact ggtggaagct 2820 cctgagaccg tcgttgagat agcacctgaa gcagcaccag aacaggttgc agagcctcag 2880 gttgaattcg accagccaga caaccgccga aagcgtcgtc gtgctgtgcg cgtgacagcg 2940 gcgccggtgg agaagaaggt ggcgtcgaca agcaatgcgc gggcgccgaa gaaggaacct 3000 caggcggcga gcaccaccaa cccaggccgc cgtaggcggg ctacccgacg aggcccacga 3060 agctag 3066 <210> 22 <211> 2157 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2157) <223> RNA degradation/processing gene cg2160/ RNAse J <400> 22 atgaatgatt cccgaaatcg cggccggaag gttacccgca aggcgggccc accagaagct 60 ggtcaggaaa accatctgga tacccctgtc tttcaggcac cagatgcttc ctctaaccag 120 agcgctgtaa aagctgagac cgccggaaac gacaatcggg atgctgcgca aggtgctcaa 180 ggatcccaag attctcaggg ttcccagaac gctcaaggtt cccagaaccg cgagtccgga 240 aataacaacc gcaaccgttc caacaacaac cgtcgcggtg gtcgtggacg tcgtggatcc 300 ggaaacgcca atgagggcgc gaacaacaac agtggtaacc agaaccgtca gggcggaaac 360 cgtggcaacc gcggtggcgg acgccgaaac gttgttaagt cgatgcaggg tgcggatctg 420 acccagcgcc tgccagagcc accaaaggca ccggcaaacg gtctgcgtat ttacgcactt 480 ggtggcattt ccgaaatcgg tcgcaacatg accgtgtttg agtacaacaa ccgtctgctc 540 atcgtggact gtggtgtgct cttcccatct tcaggtgagc caggcgttga cctgattctt 600 cctgacttcg gcccaattga ggatcacctg caccgcgtcg atgcattggt ggttactcac 660 ggacacgaag accacattgg tgctattccc tggctgctga agctgcgcaa cgatatccca 720 attttggcat cccgtttcac cttggctctg attgcagcta agtgtaagga acaccgtcag 780 cgtccgaagc tgatcgaggt caacgagcag tccaatgagg accgcggacc gttcaacatt 840 cgcttctggg ctgttaacca ctccatccca gactgccttg gtcttgctat caagactcct 900 gctggtttgg tcatccacac cggtgacatc aagctggatc agactcctcc tgatggacgc 960 ccaactgacc tgcctgcatt gtcccgtttc ggtgacgagg gcgtggactt gatgctgtgt 1020 gactccacca acgccaccac ccctggtgtt tctggatctg aagctgatgt tgctccaacc 1080 ctgaagcgtt tggtcggcga tgctaagcag cgcgtcattt tggcgtcgtt tgcttccaac 1140 gtgtaccgcg ttcaggcagc tgtggatgct gctgttgcgt ccaaccgtaa ggttgcattc 1200 aacggtcgtt ccatgattcg caacatggag atcgcggaga agcttggtta cctgaaggca 1260 cctcgcggaa ccattatttc catggatgat gcttctcgta tggctcctca caaggtcatg 1320 ctgattacca ctggtactca gggtgagcct atggctgcgc tgtctcgcat ggcgcgtcgt 1380 gagcaccgac agatcactgt ccgtgatgga gacttgatta tcctttcttc ctccctggtt 1440 ccaggtaacg aagaagcagt gttcggtgtc atcaacatgc tggctcagat cggtgcaact 1500 gttgttaccg gtcgcgacgc caaggtgcac acctcgggcc acggctactc cggagagctg 1560 ttgttcttgt acaacgccgc tcgtccgaag aacgctatgc ctgtccacgg cgagtggcgc 1620 cacctgcgcg ccaacaagga actggctatc tccactggtg ttaaccgcga caacgttgtg 1680 cttgcacaaa acggtgttgt ggttgatatg gtcaacggtc gcgcacaggt tgttggtcag 1740 attccagttg gtaaccttta cgtcgacggt gtcaccatgg gtgatattga cgcggacatc 1800 cttgcagacc gtacctcgct tggtgagggt ggcttgatct cgatcactgc tgtcatcgac 1860 aaccgcactg gccgtctgtt ggagcgccca accgttcaga ccagcggttt ctctgaggat 1920 gcaaagtcca tgatgggtga ggtcactgag ctgtccgaaa ccaccatgaa tgatcttgca 1980 gctgaaggtg aaaacgatcc ttaccgcatg gttcagcagc tgcgccgcaa gctctctcgc 2040 ttcgtcgagc agaagtggaa gcgccagccg gtcatcatgc caaccgtcat tccgatgact 2100 gcggaaacca cgcacatcgg tgacgatgag gttcgcgctt cacgcgagtc cctgtaa 2157 <210> 23 <211> 101 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for cg1144 <222> (1)..(101) <400> 23 tagcatagat gacttgacac tgttgcagca ggcggttttc acctggcctc ttaggatttg 60 gtcaaatggt tgcaacgacg ccagggaagg aggcgcaccc c 101 <210> 24 <211> 61 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for cg2453 <222> (1)..(61) <400> 24 tgtgcccaag gaaactcaac acccctgcat atacttttcc gctgtggaac aatgggagcg 60 c 61 <210> 25 <211> 62 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for cshA <222> (1)..(62) <400> 25 ccgcggcgga agtggaattg catatggagt tttgatgata tttagcgtaa cttaaaggaa 60 ca 62 <210> 26 <211> 179 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for dnak <222> (1)..(179) <400> 26 aaattaagaa agttgagtct agtgggaaca actttgtggc atttaccgtt gccatatatg 60 taagcttgag tcaggcaggc tcaatgagga gtttttctta ccggcgaaag tcggtgggaa 120 gcaagtcaaa gctcaagccg tggacaatac taaaatcacc taaaacagga ggcaccatt 179 <210> 27 <211> 129 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for eno <222> (1)..(129) <400> 27 tcgccactaa tttcaactga ttgcctcatc gaaacaagat tcgtgcaaca attgggtgta 60 gacgtgattg aagacatttg atcacgtgaa taattctagt tagctcccaa gttggcatag 120 gaggccaca 129 <210> 28 <211> 154 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for gpsI <222> (1)..(154) <400> 28 tggtgaataa aactcgtgtc gagtagcgct aaaactgata gtggggaaaa ctggagagaa 60 ctggtaaggt ttttaccgtt ctagaccgca gaaatcttcg cggcgacacc gatgatcgcc 120 gagcagaact aaacatgagg agacctactc gcat 154 <210> 29 <211> 205 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for groEL <222> (1)..(205) <400> 29 agagcatttg aagctataaa atcttgcact cacacccctt gagtgctaga aaagtagtta 60 gcactcaact aatcagagtg ccaatattga tcatcaactg cttggtgggt gaggttggtc 120 cacactcact aaccgtgccg tcgcgggcgc ctaccgggca gaagacgtga gtgtcgtcct 180 acaaatattt caggagcaca aacac 205 <210> 30 <211> 59 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for mutM2 <222> (1)..(59) <400> 30 ccgcaggcca cgcttagttt tttatcaaat cggcacaccg gctactaagg ttggtgatt 59 <210> 31 <211> 59 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for rhlE <222> (1)..(59) <400> 31 aaaagaatcg ttgtattgga atgaccctat tgtaaccgtg caacgatagt atctaagtt 59 <210> 32 <211> 101 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for rho <222> (1)..(101) <400> 32 ttcaattaca cagaagccga gttcagccat atttttcgcc cgtgatatga aaaacgggta 60 catcaccgca gcttggtctg aactgcaatg aaaggaaatc t 101 <210> 33 <211> 140 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Native promoter sequence for rne <222> (1)..(140) <400> 33 tatatttgtg ggtcggaaaa tttagacaat acagttttag attggcgcac gtacctgcgc 60 ggcggcggta ggagatcttg tccctaccag cgcccgggtg cactgctcaa tcgtggagat 120 aagaaaatag gagtgtcgct 140 <210> 34 <211> 414 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(414) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene cg1144 <400> 34 Met Ala Phe Gly Phe Phe Ser Arg Arg Lys Lys Lys Asn Lys Asp Lys 1 5 10 15 Asn Pro Asn Glu Asn Ser Ala Val Pro Ala His Ser Glu Asp Ser Pro 20 25 30 Gln Glu Val Phe Glu Gly Asn Gly Arg Gln Val Gly Asp Pro Ile Glu 35 40 45 Gln Gln Val Asp Arg Asp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Leu Pro Asp Ala Asp Leu Pro Gln Leu Asn Arg Ser Arg Ala Asn Met 65 70 75 80 Leu Arg Arg Glu Leu Glu Tyr Arg Phe Ser Leu Gln Asn Ala His Ile 85 90 95 Asn Ile Asp Gly Asn Thr Ala Met Ile Gln Arg Ser Asp Gly Gly Ala 100 105 110 Ala His Val Ser Leu Arg Thr Leu Ala Met Asn Ala Ala Gly Leu Asp 115 120 125 Asn Phe Asp Gln Leu Pro Glu Leu Val Glu Ser Phe Val His Gly Thr 130 135 140 Leu Ala Asp Ala Thr Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ala Asp Leu Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Leu Arg Leu Arg Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Gly Asp Asp Leu 165 170 175 Val Glu His Gly Leu Asp Arg Glu Ser Gln Ile Arg Asp Asp Ser Ile 180 185 190 Leu Arg Thr Phe Thr Ser Asp Met Ser Ile Ala Leu Val Leu Asp Thr 195 200 205 Glu His Ala Ile Arg Ile Gln Pro Leu Lys Glu Leu Glu Glu Phe Asp 210 215 220 Asp Leu Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ala Asp Arg Asn Thr Trp Gln Glu 225 230 235 240 Leu Tyr Asp Ala Asn Val Asp Ala Ser Phe Val Asp Ala Glu Ser Asp 245 250 255 Ser Glu Gly Ser Ser Phe Trp Ala Phe Glu Ser Asn Ser Tyr Tyr Leu 260 265 270 Gly Ser Ala Pro Leu Phe Leu Asn Asp Leu Leu Ala Lys Trp Ala Pro 275 280 285 Asp Leu Asp Gln Ser Asp Gly Val Ile Phe Ala Val Pro Asp Arg Asp 290 295 300 Leu Leu Ile Ala Arg Pro Val Thr Thr Gly Glu Asp Leu Met Asn Gly 305 310 315 320 Ile Thr Ala Met Val Arg Ile Ala Met Arg Phe Gly Leu Gly Asn Pro 325 330 335 Thr Ser Ile Ser Pro Arg Leu His Leu Leu Arg Asp Asn Gln Val Thr 340 345 350 Thr Phe Thr Asp Phe Arg Val Val Ser Pro Glu Met Glu Ala Glu Trp 355 360 365 Glu Asp Ser Ala Phe Asp Ala Pro Pro Ala Gly Ala Ile Gly Ile Glu 370 375 380 Val Arg Pro Asp Pro Tyr Leu Met Glu Arg Leu Gln Gln Gly Gly Phe 385 390 395 400 Gly Asp Phe Gly Asp Phe Gly Lys Pro Arg Asp Leu Asp Met 405 410 <210> 35 <211> 469 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(469) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene cg2453 <400> 35 Met Lys Leu Tyr Ala Ala Val Leu Asp Phe Glu Pro Val Ala Gln Glu 1 5 10 15 Phe Gly Val Glu Arg Gly Phe Asp Pro His Ile His Asp Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Ser Val Asp Arg Tyr Ala Gln Glu Arg Glu Asp Leu Leu His Met 35 40 45 Pro Phe Val Thr Ile Asp Pro Val Gly Ser Arg Asp Leu Asp Gln Ala 50 55 60 Val Leu Ile Glu Glu Ile Asp Ser Gly Phe Arg Val His Tyr Ala Ile 65 70 75 80 Ala Asp Val Ala Ala Phe Val Glu Pro Gly Ser Glu Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Ser Leu His Arg Gly Gln Thr Ile Tyr Leu Pro Asp Ser Pro Ala Arg 100 105 110 Leu His Pro Glu Glu Leu Ser Glu Asp Ala Ala Ser Leu Leu Glu Gly 115 120 125 Gln Thr Arg Pro Ala Val Val Trp Ser Ile Asp Leu Asp Glu Arg Gly 130 135 140 Glu Val Thr Ala Thr Lys Val Arg Arg Gly Leu Val Lys Ser Arg Ala 145 150 155 160 Arg Leu Asp Tyr Asp Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Asn Gly Arg Leu 165 170 175 His Pro Ser Ile Ser Leu Leu Pro Lys Val Gly Gln Leu Arg Gln Glu 180 185 190 Ser Ala Leu Arg Arg Glu Ala Val Asn Leu Ser Ile Pro Ser Gln Arg 195 200 205 Val Val Lys Val Pro Asn Asp Asp Ala Gly Glu His Tyr Glu Ile Val 210 215 220 Ile Glu Pro Arg Pro His Ile Met Asp Tyr Asn Ser Glu Ile Ser Leu 225 230 235 240 Leu Thr Gly Met Val Ala Gly Glu Met Met Val Lys Ala Gly His Gly 245 250 255 Leu Leu Arg Thr Leu Ala Pro Ala Thr Lys Glu Ser Glu Ala Thr Phe 260 265 270 Arg Ser Glu Ala Gln Ala Leu Gly Phe Glu Ile Ala Pro Glu Gln Pro 275 280 285 Ile Gly Glu Phe Leu Gln Ser Val Asp Pro Asn Thr Pro Lys Gly Met 290 295 300 Ala Ile Gln Arg Glu Ala Gln Lys Leu Leu Arg Gly Ser Gly Tyr Ala 305 310 315 320 Ser Val Lys Asn Gly Asp Ser Glu Val His Ser Gly Val Gly Gly Tyr 325 330 335 Tyr Ala His Val Thr Ala Pro Leu Arg Arg Leu Ile Asp Arg Phe Ala 340 345 350 Thr Glu His Cys Leu Ala Ile Ala Ser Gly Thr Asp Val Pro Glu Trp 355 360 365 Val Thr Arg Val Glu Glu Gln Val Leu Asp Thr Met Lys Tyr Ser Ser 370 375 380 Ile Leu Ala Ser Gln Val Asp Asn Ala Cys Leu Asp Leu Thr Glu Ala 385 390 395 400 Thr Val Leu Lys Tyr Trp Glu Gly Gln Asn Phe Asn Ala Val Val Val 405 410 415 Ala Ser Glu Pro Glu Lys Asn Ser Ala Arg Leu Phe Val Tyr Lys Pro 420 425 430 Pro Val Leu Ala Lys Cys Ile Gly Ala Pro Glu Gln Gly Thr Asn Gln 435 440 445 Glu Val Thr Leu Val Thr Ala Asn Leu Lys Lys Arg Glu Val Leu Phe 450 455 460 Ala Trp Pro Ala Asp 465 <210> 36 <211> 732 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(732) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene cshA <400> 36 Met Ser Asn Thr Glu Asn Val Asn Gly Asp Val Glu Gln Pro Asn Asn 1 5 10 15 Val Ile Ser Ser Glu Ser Gln Glu Thr Pro Gln Gly Asp Ser Ala Ser 20 25 30 Ala Asp Phe Ala Leu Glu Thr Pro Thr Asn Thr Val Glu Asp Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Glu Gly Ser Glu Glu Ile Thr Arg Val Ala Asp Thr Ser Glu 50 55 60 Asp Ala Asp Ser Ala Asp Ala Asp Asn Ala Ser Asn Val Ile Asn Glu 65 70 75 80 Asn Glu Asp Ser Ser Glu Gly Ala Asn Gln Pro Ser Asn Glu Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Glu Ala Lys Ser Gly Phe Asp Ala Leu Gly Leu Pro Glu Arg 100 105 110 Val Leu Asp Ala Val Arg Lys Val Gly Tyr Glu Thr Pro Ser Pro Ile 115 120 125 Gln Ala Gln Thr Ile Pro Ile Leu Met Glu Gly Gln Asp Val Val Gly 130 135 140 Leu Ala Gln Thr Gly Thr Gly Lys Thr Ala Ala Phe Ala Leu Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Arg Ile Asp Lys Ser Val Arg Ser Pro Gln Ala Leu Val Leu 165 170 175 Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Val Ala Asp Ser Phe Gln Ser 180 185 190 Phe Ala Asp His Val Gly Gly Leu Asn Val Leu Pro Ile Tyr Gly Gly 195 200 205 Gln Ala Tyr Gly Ile Gln Leu Ser Gly Leu Arg Arg Gly Ala His Ile 210 215 220 Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile Ile Asp His Leu Glu Lys Gly Ser 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ser Gly Leu Arg Phe Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu 245 250 255 Met Leu Asn Met Gly Phe Gln Glu Asp Val Glu Arg Ile Leu Glu Asp 260 265 270 Thr Pro Asp Glu Lys Gln Val Ala Leu Phe Ser Ala Thr Met Pro Asn 275 280 285 Gly Ile Arg Arg Leu Ser Lys Gln Tyr Leu Asn Asn Pro Ala Glu Ile 290 295 300 Thr Val Lys Ser Glu Thr Arg Thr Asn Thr Asn Ile Thr Gln Arg Phe 305 310 315 320 Leu Asn Val Ala His Arg Asn Lys Met Asp Ala Leu Thr Arg Ile Leu 325 330 335 Glu Val Thr Glu Phe Glu Ala Met Ile Met Phe Val Arg Thr Lys His 340 345 350 Glu Thr Glu Glu Val Ala Glu Lys Leu Arg Ala Arg Gly Phe Ser Ala 355 360 365 Ala Ala Ile Asn Gly Asp Ile Ala Gln Ala Gln Arg Glu Arg Thr Val 370 375 380 Asp Gln Leu Lys Asp Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Ala Thr Asp Val 385 390 395 400 Ala Ala Arg Gly Leu Asp Val Glu Arg Ile Ser His Val Leu Asn Phe 405 410 415 Asp Ile Pro Asn Asp Thr Glu Ser Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr 420 425 430 Gly Arg Ala Gly Arg Thr Gly Glu Ala Ile Leu Phe Val Thr Pro Arg 435 440 445 Glu Arg Arg Met Leu Arg Ser Ile Glu Arg Ala Thr Asn Ala Pro Leu 450 455 460 His Glu Met Glu Leu Pro Thr Val Asp Gln Val Asn Asp Phe Arg Lys 465 470 475 480 Val Lys Phe Ala Asp Ser Ile Thr Lys Ser Leu Glu Asp Lys Gln Met 485 490 495 Asp Leu Phe Arg Thr Leu Val Lys Glu Tyr Ser Gln Ala Asn Asp Val 500 505 510 Pro Leu Glu Asp Ile Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gln Ala Gln Ser Gly 515 520 525 Asp Phe Leu Leu Lys Glu Leu Pro Pro Glu Arg Arg Glu Arg Asn Asp 530 535 540 Arg Arg Arg Asp Arg Asp Phe Asp Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Asp 545 550 555 560 Arg Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Ser Arg Phe Asp Arg Asp 565 570 575 Asp Glu Asn Leu Ala Thr Tyr Arg Leu Ala Val Gly Lys Arg Gln His 580 585 590 Ile Arg Pro Gly Ala Ile Val Gly Ala Leu Ala Asn Glu Gly Gly Leu 595 600 605 Asn Ser Lys Asp Phe Gly Arg Ile Thr Ile Ala Ala Asp His Thr Leu 610 615 620 Val Glu Leu Pro Lys Asp Leu Pro Gln Ser Val Leu Asp Asn Leu Arg 625 630 635 640 Asp Thr Arg Ile Ser Gly Gln Leu Ile Asn Ile Glu Arg Asp Ser Gly 645 650 655 Gly Arg Pro Pro Arg Arg Phe Glu Arg Asp Asp Arg Gly Gly Arg Gly 660 665 670 Gly Phe Arg Gly Asp Arg Asp Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Asp Arg 675 680 685 Asp Asp Arg Gly Ser Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Asp Arg Asp 690 695 700 Asp Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly Arg Asp Asp Arg Gly Asp 705 710 715 720 Arg Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Arg Gly Gly Arg Asp 725 730 <210> 37 <211> 618 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(618) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene dnaK <400> 37 Met Gly Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 1 5 10 15 Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly 20 25 30 Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ala Lys Asn Gly Glu Val 35 40 45 Leu Val Gly Gln Ser Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg 50 55 60 Thr Ile Arg Ser Val Lys Arg His Ile Gly Thr Asp Trp Ser Val Ala 65 70 75 80 Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Thr Ser Gln Glu Ile Ser Ala Arg Thr Leu 85 90 95 Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Val Thr 100 105 110 Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Glu Asp Ser Gln Arg Gln 115 120 125 Ala Thr Lys Glu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile 130 135 140 Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Lys Gly 145 150 155 160 Glu Gln Glu Gln Thr Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175 Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Asp Gly Val Val Glu Val Arg Ala 180 185 190 Thr Ser Gly Asp Asn Glu Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Ile 195 200 205 Val Asp Trp Leu Val Glu Lys Phe Gln Ser Ser Asn Gly Ile Asp Leu 210 215 220 Thr Lys Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys 225 230 235 240 Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Ala Asn Ile Asn Leu Pro 245 250 255 Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Thr 260 265 270 Leu Ser Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Ala Arg 275 280 285 Thr Lys Thr Pro Phe Asn Gln Val Val Lys Asp Ala Gly Val Ser Val 290 295 300 Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro 305 310 315 320 Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Arg Glu Pro Asn 325 330 335 Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln 340 345 350 Ala Gly Val Leu Arg Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val 355 360 365 Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Lys 370 375 380 Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe 385 390 395 400 Thr Thr Ala Glu Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Phe Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Glu Ile Ala Thr Ala Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu 420 425 430 Leu Gly Gly Ile Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val 435 440 445 Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp 450 455 460 Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Thr Ile Gln Asp Gly Ser Gly 465 470 475 480 Leu Ser Gln Asp Glu Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His 485 490 495 Ala Asp Glu Asp Lys Lys Arg Arg Glu Glu Gln Glu Val Arg Asn Asn 500 505 510 Ala Glu Ser Leu Val Tyr Gln Thr Arg Lys Phe Val Glu Glu Asn Ser 515 520 525 Glu Lys Val Ser Glu Asp Leu Lys Ala Lys Val Glu Glu Ala Ala Lys 530 535 540 Gly Val Glu Glu Ala Leu Lys Gly Glu Asp Leu Glu Ala Ile Lys Ala 545 550 555 560 Ala Val Glu Lys Leu Asn Thr Glu Ser Gln Glu Met Gly Lys Ala Ile 565 570 575 Tyr Glu Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gln Ala Asp Ala Gly Ala 580 585 590 Glu Gly Ala Ala Asp Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Glu Asp 595 600 605 Asp Ala Ala Asp Asn Gly Glu Asp Lys Lys 610 615 <210> 38 <211> 425 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(425) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene eno <400> 38 Val Ala Glu Ile Met His Val Phe Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg 1 5 10 15 Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val Phe Leu Asp Asp Gly Ser His 20 25 30 Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Val His Glu Ala 35 40 45 His Glu Leu Arg Asp Gly Gly Asp Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu 50 55 60 Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu Glu Ile Gly Asp Glu Leu Ala Gly 65 70 75 80 Leu Glu Ala Asp Asp Gln Arg Leu Ile Asp Glu Ala Met Ile Lys Leu 85 90 95 Asp Gly Thr Ala Asn Lys Ser Arg Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly 100 105 110 Val Ser Met Ala Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp Ser Ala Gly Leu Pro 115 120 125 Leu Phe Arg Tyr Ile Gly Gly Pro Asn Ala His Val Leu Pro Val Pro 130 135 140 Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Ser Gly Val Asp 145 150 155 160 Val Gln Glu Phe Met Ile Ala Pro Ile Gly Ala Glu Thr Phe Ser Glu 165 170 175 Ala Leu Arg Asn Gly Ala Glu Val Tyr His Ala Leu Lys Ser Val Ile 180 185 190 Lys Glu Lys Gly Leu Ser Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala 195 200 205 Pro Ser Val Gly Ser Thr Arg Glu Ala Leu Asp Leu Ile Val Glu Ala 210 215 220 Ile Glu Lys Ala Gly Phe Thr Pro Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Leu 225 230 235 240 Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Phe Lys Asp Gly Thr Tyr His Phe Glu 245 250 255 Gly Gly Gln His Ser Ala Ala Glu Met Ala Asn Val Tyr Ala Glu Leu 260 265 270 Val Asp Ala Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Leu Gln Glu Asp 275 280 285 Asp Trp Glu Gly Tyr Thr Asn Leu Thr Ala Thr Ile Gly Asp Lys Val 290 295 300 Gln Ile Val Gly Asp Asp Phe Phe Val Thr Asn Pro Glu Arg Leu Lys 305 310 315 320 Glu Gly Ile Ala Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Leu Val Lys Val Asn 325 330 335 Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu Thr Phe Asp Ala Val Asp Met Ala His 340 345 350 Arg Ala Gly Tyr Thr Ser Met Met Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu 355 360 365 Asp Thr Thr Ile Ala Asp Leu Ala Val Ala Leu Asn Cys Gly Gln Ile 370 375 380 Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Ser Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Leu Leu Arg Ile Glu Gln Leu Leu Gly Asp Ala Gly Val Tyr Ala Gly 405 410 415 Arg Ser Ala Phe Pro Arg Phe Gln Gly 420 425 <210> 39 <211> 753 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(753) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene gpsI <400> 39 Met Ser Asp Val Lys Tyr Phe Glu Asp Thr Glu Phe Gly Leu Ile Glu 1 5 10 15 Ala Val Ala Thr Ile Asp Asn Gly Asp Phe Gly Thr Arg Thr Ile Arg 20 25 30 Phe Glu Thr Gly Gln Leu Ala Arg Gln Ala Asp Gly Ala Val Thr Thr 35 40 45 Tyr Leu Asp Asp Asp Thr Met Leu Leu Ala Thr Thr Thr Ala Ser Asn 50 55 60 Gln Pro Arg Glu Gly Phe Asp Phe Phe Pro Leu Thr Val Asp Val Glu 65 70 75 80 Glu Arg Met Tyr Ala Ala Gly Arg Ile Pro Gly Ser Phe Phe Arg Arg 85 90 95 Glu Gly Arg Pro Ser Thr Glu Ala Ile Leu Ala Cys Arg Leu Ile Asp 100 105 110 Arg Pro Leu Arg Pro Thr Phe Val Lys Gly Leu Arg Asn Glu Val Gln 115 120 125 Ile Val Val Thr Val Met Ser Met Asn Pro Glu Asp Tyr Tyr Asp Val 130 135 140 Val Ala Ile Asn Gly Ala Ser Ala Ala Thr Arg Ile Ser Gly Leu Pro 145 150 155 160 Val Ser Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Met Ala Leu Val Val Asp Glu 165 170 175 Lys His Pro Glu Gly Gln Trp Val Ala Phe Pro Thr His Ala Gln His 180 185 190 Glu Gln Ser Val Phe Glu Ile Val Val Ala Gly Arg Leu Val Glu Arg 195 200 205 Lys Arg Gly Asn Lys Thr Phe Ser Asp Val Ala Val Met Met Val Glu 210 215 220 Ala Gly Ala Ser Glu Asn Val Val Asn Arg Val Lys Asp Gly Ala Pro 225 230 235 240 Ala Pro Thr Glu Lys Ile Val Ser Asp Gly Leu Glu Ala Ala Lys Pro 245 250 255 Phe Ile Asp Ile Leu Cys Arg Ala Gln Glu Gly Leu Ala Gln Arg Val 260 265 270 Gly Asn Ala Ala Lys Glu Phe Pro Leu Phe Pro Pro Tyr Thr Asp Glu 275 280 285 Val Tyr Ser Ala Val Glu Arg Lys Val Ser Lys Lys Leu Ala Ser Leu 290 295 300 Leu Thr Leu Lys Ala Lys Gln Glu Arg Asp Asp Ala Thr Asn Ala Tyr 305 310 315 320 Met Glu Glu Ile Glu Ala Glu Leu Leu Pro Lys Phe Glu Ala Ser Tyr 325 330 335 Ser Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Glu Ile Arg Ala Ala Tyr Asn Ala 340 345 350 Val Met Lys Ala Ile Val Arg Arg Met Ile Leu Thr Asp His Phe Arg 355 360 365 Ile Asp Gly Arg Gly Val Thr Asp Ile Arg Asp Leu Ala Val Glu Val 370 375 380 Glu Leu Ile Pro Arg Ala His Gly Ser Ser Leu Phe Glu Arg Gly Glu 385 390 395 400 Thr Gln Ile Leu Gly Val Thr Thr Leu Asp Met Leu Lys Met Glu Gln 405 410 415 Gln Ile Asp Ser Leu Ala Pro Gly Asp Ala Lys Arg Tyr Met His His 420 425 430 Tyr Asn Phe Pro Pro Tyr Ser Thr Gly Glu Thr Gly Arg Val Gly Ser 435 440 445 Pro Lys Arg Arg Glu Ile Gly His Gly Ala Leu Ala Glu Arg Ala Val 450 455 460 Leu Pro Val Ile Pro Ser Arg Glu Glu Phe Pro Tyr Ala Ile Arg Gln 465 470 475 480 Val Ser Glu Ala Leu Gly Ser Asn Gly Ser Thr Ser Met Gly Ser Val 485 490 495 Cys Ala Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Asn Ala Gly Val Pro Leu Lys Ala 500 505 510 Pro Val Ala Gly Ile Ala Met Gly Leu Val Ser Gly Glu Ile Asp Gly 515 520 525 Lys Thr Glu Tyr Val Ala Leu Thr Asp Ile Leu Gly Ala Glu Asp Ala 530 535 540 Phe Gly Asp Met Asp Phe Lys Val Ala Gly Thr Ala Asp Phe Ile Thr 545 550 555 560 Ala Leu Gln Leu Asp Thr Lys Leu Asp Gly Ile Pro Ser Lys Val Leu 565 570 575 Ser Asp Ala Leu Glu Gln Ala Arg Asp Ala Arg Leu Thr Ile Leu Asn 580 585 590 Thr Met Ala Asp Val Ile Asn Gly Ala Asp Glu Met Ser Lys Phe Ala 595 600 605 Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Ile Pro Val Ala Lys Ile Gly Glu Leu 610 615 620 Ile Gly Pro Lys Gly Lys Asn Ile Asn Ala Leu Thr Glu Glu Thr Gly 625 630 635 640 Ala Asn Ile Ser Ile Glu Asp Asp Gly Thr Val Phe Ile Ser Ala Ala 645 650 655 Asp Gly Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ile Glu Lys Ile Asn Ala Leu Ala 660 665 670 Asn Pro Gln Leu Pro Lys Val Gly Glu Arg Phe Leu Gly Thr Val Val 675 680 685 Lys Thr Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Ser Leu Leu Pro Gly Arg Asp 690 695 700 Gly Leu Val His Ile Ser Lys Leu Gly Asn Gly Lys Arg Val Glu Lys 705 710 715 720 Val Asp Asp Val Val Lys Val Gly Glu Lys Ile Gln Val Glu Ile Ala 725 730 735 Asp Ile Asp Asn Arg Gly Lys Ile Ser Leu Val Pro Val Val Glu Glu 740 745 750 Asp <210> 40 <211> 548 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(548) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene groEL <400> 40 Met Ala Lys Ile Ile Ala Phe Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15 Lys Gly Leu Asn Thr Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Ala Trp Gly Ala Pro Thr Ile 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln 85 90 95 Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ser Asn Pro 100 105 110 Met Gly Ile Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Ala Gln Val Thr Glu 115 120 125 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Lys Glu Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Ala 130 135 140 Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Gly Ala Gln Ile 145 150 155 160 Ala Lys Ala Met Tyr Ala Val Gly Gly Gly Lys Leu Asn Lys Asp Ser 165 170 175 Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Val Glu Leu Glu Val 180 185 190 Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Ala 195 200 205 Thr Asp Met Glu Arg Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu 210 215 220 Leu Val Ser Gly Lys Ile Ser Asn Ile Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu 225 230 235 240 Glu Lys Val Met Gln Ser Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ser Glu Asp 245 250 255 Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly 260 265 270 Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg 275 280 285 Lys Ala Gln Leu Gln Asp Ile Ala Val Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile 290 295 300 Ser Glu Glu Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Asp Leu Pro Leu Leu 305 310 315 320 Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Val 325 330 335 Asp Gly Ala Gly Ser Glu Ala Gln Ile Glu Gly Arg Val Asn Gln Ile 340 345 350 Arg Val Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu 355 360 365 Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Leu Lys Val 370 375 380 Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu 385 390 395 400 Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala 405 410 415 Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Ala Ala His Val Leu Asp Asn Asp 420 425 430 Leu Glu Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Gly Val Arg Ile Val Arg Glu 435 440 445 Ala Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ala Asn Ala Gly Leu Glu 450 455 460 Pro Gly Val Val Ala Asp Lys Val Ser Gln Leu Pro Gln Gly Glu Gly 465 470 475 480 Leu Asn Ala Ala Asn Gly Glu Tyr Val Asp Leu Met Ala Ala Gly Ile 485 490 495 Asn Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser 500 505 510 Ile Ala Ala Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro 515 520 525 Gln Pro Ala Gly Ala Ala Gly Met Pro Gly Ala Asp Glu Met Gly Gly 530 535 540 Met Gly Gly Phe 545 <210> 41 <211> 548 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(109) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene groEL CP012194 homolog <400> 41 Met Ala Lys Ile Ile Ala Phe Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15 Lys Gly Leu Asn Thr Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Ala Trp Gly Ala Pro Thr Ile 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln 85 90 95 Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ser Asn Pro 100 105 110 Met Gly Ile Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Ala Gln Val Thr Glu 115 120 125 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Lys Glu Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Ala 130 135 140 Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Gly Ala Gln Ile 145 150 155 160 Ala Lys Ala Met Tyr Ala Val Gly Gly Gly Lys Leu Asn Lys Asp Ser 165 170 175 Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Val Glu Leu Glu Val 180 185 190 Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Ala 195 200 205 Thr Asp Met Glu Arg Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu 210 215 220 Leu Val Ser Gly Lys Ile Ser Asn Ile Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu 225 230 235 240 Glu Lys Val Met Gln Ser Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ser Glu Asp 245 250 255 Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly 260 265 270 Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg 275 280 285 Lys Ala Gln Leu Gln Asn Ile Ala Val Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile 290 295 300 Ser Glu Glu Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Asp Leu Pro Leu Leu 305 310 315 320 Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Val 325 330 335 Asp Gly Ala Gly Ser Glu Ala Gln Ile Glu Gly Arg Val Asn Gln Ile 340 345 350 Arg Val Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu 355 360 365 Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Leu Lys Val 370 375 380 Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu 385 390 395 400 Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala 405 410 415 Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Ala Ala His Val Leu Asp Asn Asp 420 425 430 Leu Glu Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Gly Val Arg Ile Val Arg Glu 435 440 445 Ala Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ala Asn Ala Gly Leu Glu 450 455 460 Pro Gly Val Val Ala Asp Lys Val Ser Gln Leu Pro Gln Gly Glu Gly 465 470 475 480 Leu Asn Ala Ala Asn Gly Glu Tyr Val Asp Leu Met Ala Ala Gly Ile 485 490 495 Asn Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser 500 505 510 Ile Ala Ala Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro 515 520 525 Gln Pro Ala Gly Ala Ala Gly Met Pro Gly Ala Asp Glu Met Gly Gly 530 535 540 Met Gly Gly Phe 545 <210> 42 <211> 538 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(538) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene groEL2 <400> 42 Met Ala Lys Leu Ile Ala Phe Asp Gln Asp Ala Arg Glu Gly Ile Leu 1 5 10 15 Arg Gly Val Asp Ala Leu Ala Asn Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ala Phe Gly Gly Pro Leu Val 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Ala Arg Asp Ile Asp Leu Glu Asp Pro 50 55 60 Phe Glu Asn Leu Gly Ala Gln Leu Val Lys Ser Val Ala Val Lys Thr 65 70 75 80 Asn Asp Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Leu Leu Ala Gln 85 90 95 Ala Leu Ile Ala Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Met Glu Leu Asn Lys Gly Ile Ala Ala Ala Ala Glu Lys Thr Leu Glu 115 120 125 Glu Leu Lys Ala Arg Ala Thr Glu Val Ser Asp Thr Lys Glu Ile Ala 130 135 140 Asn Val Ala Thr Val Ser Ser Arg Asp Glu Val Val Gly Glu Ile Val 145 150 155 160 Ala Ala Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asp Gly Val Val Thr Val Glu 165 170 175 Glu Ser Gln Ser Ile Glu Thr Ala Leu Glu Val Thr Glu Gly Ile Ser 180 185 190 Phe Asp Lys Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Asp Asn Asp Thr 195 200 205 Gln Gln Ala Val Leu Asp Asn Pro Ala Val Leu Leu Val Arg Asn Lys 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Pro Asp Phe Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Val Glu 225 230 235 240 Ser Asn Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Pro 245 250 255 Leu Gln Thr Leu Val Val Asn Ser Ile Arg Lys Thr Ile Lys Val Val 260 265 270 Ala Val Lys Ser Pro Tyr Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Phe Met Asp 275 280 285 Asp Leu Ala Ile Val Thr Lys Ala Thr Val Val Asp Pro Glu Val Gly 290 295 300 Ile Asn Leu Asn Glu Ala Gly Glu Glu Val Phe Gly Thr Ala Arg Arg 305 310 315 320 Ile Thr Val Ser Lys Asp Glu Thr Ile Ile Val Asp Gly Ala Gly Ser 325 330 335 Ala Glu Asp Val Glu Ala Arg Arg Gly Gln Ile Arg Arg Glu Ile Ala 340 345 350 Asn Thr Asp Ser Thr Trp Asp Arg Glu Lys Ala Glu Glu Arg Leu Ala 355 360 365 Lys Leu Ser Gly Gly Ile Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala Thr Glu 370 375 380 Thr Glu Val Asn Asp Arg Lys Leu Arg Val Glu Asp Ala Ile Asn Ala 385 390 395 400 Ala Arg Ala Ala Ala Gln Glu Gly Val Ile Ala Gly Gly Gly Ser Ala 405 410 415 Leu Val Gln Ile Ala Glu Thr Leu Lys Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Glu 420 425 430 Gly Asp Gln Lys Val Gly Val Arg Ala Leu Ala Thr Ala Leu Gly Lys 435 440 445 Pro Ala Tyr Trp Ile Ala Ser Asn Ala Gly Leu Asp Gly Ser Val Val 450 455 460 Val Ala Arg Thr Ala Ala Leu Pro Asn Gly Glu Gly Phe Asn Ala Ala 465 470 475 480 Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Leu Ile Asn Asp Gly Val Ile Asp Pro Val 485 490 495 Lys Val Thr His Ser Ala Val Val Asn Ala Thr Ser Val Ala Arg Met 500 505 510 Val Leu Thr Thr Glu Ala Ser Val Val Glu Lys Pro Ala Glu Glu Ala 515 520 525 Ala Asp Ala His Ala Gly His His His His 530 535 <210> 43 <211> 269 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(269) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene mutM2 <400> 43 Met Pro Glu Gly His Val Ile His Arg Leu Ala Gly Glu Leu Thr Lys 1 5 10 15 Asn Phe Gly Asp Thr Ile Leu Asp Ala Thr Ser Pro Gln Gly Arg Phe 20 25 30 Ala Ser Glu Ala Ala Ile Ile Asn Gly His Arg Ile Ala Val Ala Glu 35 40 45 Ala Tyr Gly Lys His Leu Phe Val Glu Phe Asp Ala Asp His Pro Glu 50 55 60 His Ile Leu Tyr Ile His Leu Gly Leu Ile Gly Thr Leu Gln Phe Glu 65 70 75 80 Pro Ala Glu Glu Thr Arg Gly Gln Ile Arg Leu His Leu Ser Asp Gly 85 90 95 Glu Ile Ala Ala Asn Leu Arg Gly Pro Gln Trp Cys Arg Leu Ile Thr 100 105 110 Asp Ala Glu His Thr Gln Ala Ile Gly Lys Leu Gly Ala Asp Pro Ile 115 120 125 Arg Asp Asp Ala Asp Pro Glu Pro Ile Arg Ile Lys Val Gln Arg Ser 130 135 140 Gly Arg Ser Ile Gly Ser Leu Leu Met Asp Gln Lys Leu Phe Ala Gly 145 150 155 160 Val Gly Asn Ile Tyr Arg Ala Glu Thr Leu Phe Arg Leu Gly Ile Ser 165 170 175 Pro Phe Thr Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Ala Gln Phe Arg Ser Ile 180 185 190 Trp Ala Asp Leu Val Gly Leu Met Lys Asp Gly Val Val Ala Gly Arg 195 200 205 Ile Asp Thr Val Arg Pro Glu His Thr Pro Glu Ala Met Gly Arg Pro 210 215 220 Pro Arg Lys Asp Asp His Gly Gly Glu Val Tyr Thr Tyr Arg Arg Thr 225 230 235 240 Gly Gln Glu Cys Phe Leu Cys Ala Thr Pro Ile Lys Glu Gln Val Met 245 250 255 Glu Gly Arg Asn Leu Phe Trp Cys Pro Gly Cys Gln Arg 260 265 <210> 44 <211> 424 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(424) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene rhlE <400> 44 Val Ser Ser Glu Ser Pro Arg Pro Thr Phe Thr Glu Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Val Glu Ile Thr Asp Ala Leu Glu Ala Leu Gly Ile Asn Arg Thr Phe 20 25 30 Ala Ile Gln Glu Tyr Thr Leu Pro Ile Ala Leu Asp Gly His Asp Phe 35 40 45 Ile Gly Gln Ala Arg Thr Gly Met Gly Lys Thr Tyr Gly Phe Gly Val 50 55 60 Pro Leu Leu Asp Arg Val Phe Asp Ser Ala Asp Val Ala Ala Thr Asp 65 70 75 80 Gly Thr Pro Arg Ala Leu Val Ile Val Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val 85 90 95 Gln Val Gly Asp Asp Leu Gln Arg Ala Ala Thr Asn Leu Pro Leu Lys 100 105 110 Ile Phe Thr Phe Tyr Gly Gly Thr Pro Tyr Glu Glu Gln Ile Asp Ala 115 120 125 Leu Lys Val Gly Val Asp Val Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Leu Leu 130 135 140 Asp Leu His Lys Arg Gly Ala Leu Ser Leu Asp Lys Val Ala Ile Leu 145 150 155 160 Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Asp Leu Gly Phe Leu Pro Asp 165 170 175 Ile Glu Lys Ile Leu Arg Ala Leu Thr His Gln His Gln Thr Met Leu 180 185 190 Phe Ser Ala Thr Met Pro Gly Ala Ile Leu Thr Leu Ala Arg Ser Phe 195 200 205 Leu Asn Lys Pro Val His Ile Arg Ala Glu Thr Ser Asp Ala Ser Ala 210 215 220 Thr His Lys Thr Thr Arg Gln Val Val Phe Gln Ala His Lys Met Asp 225 230 235 240 Lys Glu Ala Ile Thr Ala Lys Ile Leu Gln Ala Lys Asp Arg Gly Lys 245 250 255 Thr Ile Ile Phe Ala Arg Thr Lys Arg Thr Ala Ala Gln Val Ala Glu 260 265 270 Asp Leu Ala Ser Arg Gly Phe Ser Val Gly Ser Val His Gly Asp Met 275 280 285 Gly Gln Pro Ala Arg Glu Lys Ser Leu Asn Ala Phe Arg Thr Gly Lys 290 295 300 Ile Asp Ile Leu Val Ala Thr Asp Val Ala Ala Arg Gly Ile Asp Val 305 310 315 320 Asp Asp Val Thr His Val Ile Asn Tyr Gln Thr Pro Asp Asp Pro Met 325 330 335 Thr Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Ala Gly His Asn Gly 340 345 350 Thr Ala Val Thr Leu Val Gly Tyr Asp Glu Thr Leu Lys Trp Thr Val 355 360 365 Ile Asp Asn Glu Leu Glu Leu Gly Gln Pro Asn Pro Pro Gln Trp Phe 370 375 380 Ser Thr Ser Pro Glu Leu Leu Glu Ala Leu Asp Ile Pro Glu Gly Val 385 390 395 400 Thr Glu Arg Val Gly Pro Pro Thr Lys Val Leu Gly Gly Thr Ala Pro 405 410 415 Arg Pro Pro Arg Arg Thr Arg Lys 420 <210> 45 <211> 810 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(810) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene rho <400> 45 Val Thr Thr Thr Asp Asn Thr Ala Ala Asn Gln Gly Glu Leu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Arg Leu Pro Asp Leu Arg Lys Ile Ala Ala Asp Leu Gly Leu Lys 20 25 30 Gly Thr Ser Ala Leu Arg Lys Gly Asp Leu Ile Asn Ala Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Lys Pro Thr Ala Ala Ala Lys Lys Thr Ser Pro Arg 50 55 60 Lys Ala Pro Ser Arg Thr Arg Ala Thr Gln Pro Ser Ala Pro Val Glu 65 70 75 80 Gln Ala Gln Glu Ala Pro Ala Gln Thr Ser Thr Ala Pro Ala Ser Ala 85 90 95 Pro Ser Glu Glu Thr Pro Ala Ala Pro Ala Arg Arg Gly Arg Arg Arg 100 105 110 Val Thr Thr Thr Ala Thr Thr Pro Glu Pro Ala Ala Pro Ala Gln Ser 115 120 125 Gln Pro Ala Glu Ala Gln Pro Ala Gln Thr Gln Ala Ala Gln Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Pro Val Ala Ala Lys Glu Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asn Thr 145 150 155 160 Gln Gly Gln Ser Gln Gly Gln Ala Gln Gly Asp Glu His Asp Asp Arg 165 170 175 Phe Glu Ser Arg Ser Ala Ala Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg Gln Arg 180 185 190 Gln Ile His Arg Asp Gly Asp Asp Asn Ala Asn Ala Asn Thr Glu Ser 195 200 205 Glu Gln Asn Thr Pro Ala Gln Asn Ala Thr Ala Gln Ala Glu Ser Glu 210 215 220 Gln Thr Ala Ala Pro Ala Gln Ala Glu Ala Ala Glu Gln Asn Gln Asn 225 230 235 240 Asp Asn Ser Glu Ser Ser Glu Asn Arg Ser Asp Asn Tyr Arg Asn Asn 245 250 255 Asn Arg Arg Ser Arg Asn Asn Arg Asn Asn Arg Asn Tyr Arg Asp Asn 260 265 270 Asn Glu Ser Ser Asp Asn Ala Gly Gln Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp 275 280 285 Asn Asn Gln Ala Arg Ser Glu Asp Asn Asn Asp Asp Arg Arg Ser Arg 290 295 300 Asn Asn Arg Asn Asn Asp Arg Asn Asp Arg Asn Asn Arg Asn Tyr Arg 305 310 315 320 Asp Asn Asn Glu Ser Ser Asp Asn Ala Gly Gln Ser Ser Asn Asp Asp 325 330 335 Ala Asp Asn Asn Gln Ala Arg Ser Glu Asp Asn Asn Asp Asp Arg Arg 340 345 350 Ser Arg Asn Asn Arg Asn Asn Asp Arg Asn Asp Arg Asn Asp Arg Asn 355 360 365 Tyr Arg Asp Asn His Asn Asp Asp Asn Asp Asp Arg Arg Asn Arg Arg 370 375 380 Gly Arg Arg Asn Arg Arg Gly Arg Asn Asp Arg Asn Asp Arg Asp Asn 385 390 395 400 Arg Asp Asn Arg Asp Asn Arg Asp Asn Ser Asn Asp Gly Asp Asn Asn 405 410 415 Gln Gln Asp Glu Leu Gln Gln Val Ala Gly Ile Leu Asp Ile Val Asp 420 425 430 His Asn Val Ala Phe Val Arg Thr Thr Gly Tyr His Ala Ala Pro Ser 435 440 445 Asp Val Phe Val Ser Asn Gln Leu Ile Arg Arg Met Gly Leu Arg Ser 450 455 460 Gly Asp Ala Ile Glu Gly Gln Val Arg Met Asn Gln Gly Gly Gly Asn 465 470 475 480 His Asn Asn His Gly Arg Asn Arg Gln Lys Tyr Asn Asn Leu Val Arg 485 490 495 Val Glu Met Val Asn Gly Leu Pro Ala Glu Glu Thr Arg Asn Arg Pro 500 505 510 Glu Phe Gly Lys Leu Thr Pro Leu Tyr Pro Asn Gln Arg Leu His Leu 515 520 525 Glu Thr Glu Gln Lys Ile Leu Thr Thr Arg Val Ile Asp Leu Ile Met 530 535 540 Pro Ile Gly Lys Gly Gln Arg Ala Leu Ile Val Ser Pro Pro Lys Ala 545 550 555 560 Gly Lys Thr Thr Ile Leu Gln Asn Ile Ala Asn Ala Ile Ser Thr Asn 565 570 575 Asn Pro Glu Cys Tyr Leu Met Val Val Leu Val Asp Glu Arg Pro Glu 580 585 590 Glu Val Thr Asp Met Gln Arg Ser Val Asn Gly Glu Val Ile Ala Ser 595 600 605 Thr Phe Asp Arg Pro Pro Ser Glu His Thr Ala Val Ala Glu Leu Ala 610 615 620 Ile Glu Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gln Gly Gln Asp Val Val Val 625 630 635 640 Leu Leu Asp Ser Ile Thr Arg Leu Gly Arg Ala Tyr Asn Asn Ser Ser 645 650 655 Pro Ala Ser Gly Arg Ile Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Asn Ala Leu 660 665 670 Tyr Pro Pro Lys Arg Phe Leu Gly Ala Ala Arg Asn Ile Glu Asn Gly 675 680 685 Gly Ser Leu Thr Ile Ile Ala Thr Ala Met Val Glu Thr Gly Ser Ala 690 695 700 Gly Asp Thr Val Ile Phe Glu Glu Phe Lys Gly Thr Gly Asn Ala Glu 705 710 715 720 Leu Lys Leu Asp Arg Lys Ile Ser Glu Arg Arg Val Phe Pro Ala Val 725 730 735 Asp Val Asn Pro Ser Gly Thr Arg Lys Asp Glu Leu Leu Leu Asn Pro 740 745 750 Asp Glu Ala Arg Ile Met His Lys Leu Arg Arg Ile Leu Ser Ala Leu 755 760 765 Asp Asn Gln Gln Ala Ile Asp Leu Leu Ile Lys Gln Leu Lys Lys Thr 770 775 780 Lys Ser Asn Ala Glu Phe Leu Met Gln Val Ala Ser Ser Ala Pro Met 785 790 795 800 Ala Gly Thr Glu Lys Glu Glu Asp Tyr Ser 805 810 <210> 46 <211> 1021 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1021) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene rne <400> 46 Val Pro Asn Asn Lys Ala Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Ala Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Glu Phe Asp Arg Asp Ser Leu Ser Glu Lys Thr Arg Val 20 25 30 His Gln Leu Ala Lys Arg Leu Gly Met Val Ser Lys Asp Val Val Val 35 40 45 Ala Leu Asp Gly Ile Gly Leu Val Lys Val Ala Gln Ser Asn Leu Ser 50 55 60 Lys Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asp Ala Leu Ser Gln Pro Val Leu 65 70 75 80 Asn Ala Ala Pro Ala Ala Val Pro Asp Val Glu Pro Val Glu Lys Ile 85 90 95 Arg Arg Arg Val Glu Lys Asn Val Glu Asn Glu Ile His Gln Ile Glu 100 105 110 Glu Lys Val Glu Arg Glu Leu Ala Ala Val Ala Gln Pro Thr Asp Phe 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Arg Glu Glu Val Thr Ala Glu Leu Leu Glu Asp Ile 130 135 140 Val Pro Glu Ile Thr Pro Ala Pro Val Glu Ala Pro Val Tyr Thr Pro 145 150 155 160 Ile Phe Val Ala Pro Ala Val Val Pro Thr Glu Asn Val Gln His Thr 165 170 175 Asp Asp Glu Gln Ala Arg Glu Arg Thr Ala Arg Lys Arg Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Ala Glu Ala Glu Thr Val Thr Glu 195 200 205 Val Ser Glu Glu Ala Ser Thr Ser Glu Val Glu Glu Val Asn Glu Pro 210 215 220 Ile Gly Ile Lys Gly Ser Thr Arg Leu Glu Ala Gln Arg Arg Arg Arg 225 230 235 240 Thr Glu Met Arg Glu Glu Asn Lys Lys Arg Arg His Val Val Ser Thr 245 250 255 Gln Glu Phe Met Glu Arg Arg Glu Ser Met Glu Arg Arg Met Ile Val 260 265 270 Arg Glu Arg Gln Arg His Asp His Pro Gly Leu Val Thr Gln Val Gly 275 280 285 Val Leu Glu Asp Asp Gln Leu Val Glu Gln Phe Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Met Ser Met Val Gly Asn Ile Tyr Leu Gly Arg Val Gln Asn Val 305 310 315 320 Leu Pro Ser Met Glu Ala Ala Phe Ile Asp Ile Gly Lys Gly Arg Asn 325 330 335 Gly Val Leu Tyr Ala Gly Glu Val Asp Trp Lys Ala Ala Gly Leu Gly 340 345 350 Gly Arg Gly Arg Arg Ile Glu Gln Ala Leu Lys Ala Gly Asp Gln Val 355 360 365 Leu Val Gln Val Ser Lys Asp Pro Leu Gly His Lys Gly Ala Arg Leu 370 375 380 Thr Thr Gln Ile Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Leu Val Tyr Val Pro Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ser Ala Gly Ile Ser Arg Lys Leu Pro Gly Pro Glu Arg Lys 405 410 415 Arg Leu Lys Glu Ile Leu Gly Arg Val Val Pro Ala Gln Gly Gly Thr 420 425 430 Ile Ile Arg Thr Ala Ala Glu Gly Val Ser Glu Glu Asn Ile Ala Ala 435 440 445 Asp Val Asn Arg Leu His Thr Leu Trp Glu Gln Ile Lys Glu Arg Thr 450 455 460 Ala Lys Glu Lys Lys Ser Arg Gly Ser Lys Pro Ile Thr Met Tyr Glu 465 470 475 480 Glu Pro Asp Met Leu Val Lys Val Ile Arg Asp Leu Phe Asn Glu Asp 485 490 495 Phe Thr Ser Leu Ile Val Asp Gly Asp Arg Ala Trp Asn Thr Val Arg 500 505 510 Ala Tyr Ile Gln Ser Val Ala Pro Asp Leu Val Ser Arg Val Glu His 515 520 525 Phe Asp Arg Ala Asp Phe Asp Gly Lys Asp Ala Phe Glu Ala Phe Asp 530 535 540 Leu Asn Thr Gln Leu Glu Glu Ala Leu Ser Arg Lys Val Asn Leu Pro 545 550 555 560 Ser Gly Gly Ser Leu Ile Ile Asp Arg Thr Glu Ala Met Thr Val Ile 565 570 575 Asp Val Asn Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Lys Gly Gly Gly Asn Leu Glu 580 585 590 Glu Thr Val Thr Leu Asn Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Ile Val Arg 595 600 605 Gln Met Arg Leu Arg Asp Leu Gly Gly Met Ile Val Val Asp Phe Ile 610 615 620 Asp Met Val Leu Pro Glu Asn Gln Glu Leu Val Leu Arg Arg Leu Asn 625 630 635 640 Glu Ala Leu Glu Asn Asp Arg Thr Arg His Gln Val Ser Glu Val Thr 645 650 655 Ser Leu Gly Leu Val Gln Met Thr Arg Lys Arg Ile Gly Ala Gly Leu 660 665 670 Leu Glu Thr Phe Ser Ser Pro Cys Glu His Cys Glu Gly Arg Gly Ile 675 680 685 Ile Val His Val Asp Pro Val Asp Thr Val Asp Glu Arg Val Glu Ala 690 695 700 Lys Ala Glu Glu Arg Ser Arg Arg His Gln Arg Ser Asn Ser Thr Glu 705 710 715 720 Lys Ala Ala Ala Glu His Pro Met Val Val Ala Met Arg Asp Leu Val 725 730 735 Glu Ser Asp Glu His Asp Leu Asp Gln Glu Phe Glu Glu Leu Ala Ala 740 745 750 Ser Val Ile Val Leu Asp Asp Ser Asp Leu Asp Asp Val Val Asn Asp 755 760 765 Lys Leu Asp Glu Pro Glu Arg Ile Leu Ala Glu Ser Thr Val Glu Pro 770 775 780 Glu Glu Gly Pro Arg Arg Arg Ala Arg Arg Gln Arg Gln Glu Ser Ala 785 790 795 800 Ala Asp Asp Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ala Ala Val Asp Ile Ala Ser 805 810 815 Glu Glu Asp Pro Asp Glu Pro Ser Gly Ser Ser Tyr Val Ser Asp Leu 820 825 830 Glu Ala Glu Pro Ile Ala Pro Val Val Glu Lys Ala Ala Glu Pro Val 835 840 845 Ala Glu Pro Thr Ala Asp Tyr Glu Lys Ala Arg Ala Glu Phe Glu Ala 850 855 860 Ser Pro Arg Arg Arg Arg Lys Thr Arg Gly Asn Ser Arg Ser Asp His 865 870 875 880 Ala Pro Lys Pro Glu Asp Phe Ala Pro Val Val Glu Glu Val Ala Glu 885 890 895 Thr Pro Val Lys Thr Pro Ala Arg Lys Ala Pro Arg Arg Asn Arg Pro 900 905 910 Ser Glu Leu Ser Ser Gly Ala Pro Ser Ser Ala Pro Leu Thr Arg Asn 915 920 925 Arg Arg Arg Ala Val Arg Arg Gln Leu Val Glu Ala Pro Glu Thr Val 930 935 940 Val Glu Ile Ala Pro Glu Ala Ala Pro Glu Gln Val Ala Glu Pro Gln 945 950 955 960 Val Glu Phe Asp Gln Pro Asp Asn Arg Arg Lys Arg Arg Arg Ala Val 965 970 975 Arg Val Thr Ala Ala Pro Val Glu Lys Lys Val Ala Ser Thr Ser Asn 980 985 990 Ala Arg Ala Pro Lys Lys Glu Pro Gln Ala Ala Ser Thr Thr Asn Pro 995 1000 1005 Gly Arg Arg Arg Arg Ala Thr Arg Arg Gly Pro Arg Ser 1010 1015 1020 <210> 47 <211> 718 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(718) <223> Translated Polypeptide for RNA degradation/processing gene cg2160/ RNAse J <400> 47 Met Asn Asp Ser Arg Asn Arg Gly Arg Lys Val Thr Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Pro Pro Glu Ala Gly Gln Glu Asn His Leu Asp Thr Pro Val Phe Gln 20 25 30 Ala Pro Asp Ala Ser Ser Asn Gln Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala 35 40 45 Gly Asn Asp Asn Arg Asp Ala Ala Gln Gly Ala Gln Gly Ser Gln Asp 50 55 60 Ser Gln Gly Ser Gln Asn Ala Gln Gly Ser Gln Asn Arg Glu Ser Gly 65 70 75 80 Asn Asn Asn Arg Asn Arg Ser Asn Asn Asn Arg Arg Gly Gly Arg Gly 85 90 95 Arg Arg Gly Ser Gly Asn Ala Asn Glu Gly Ala Asn Asn Asn Ser Gly 100 105 110 Asn Gln Asn Arg Gln Gly Gly Asn Arg Gly Asn Arg Gly Gly Gly Arg 115 120 125 Arg Asn Val Val Lys Ser Met Gln Gly Ala Asp Leu Thr Gln Arg Leu 130 135 140 Pro Glu Pro Pro Lys Ala Pro Ala Asn Gly Leu Arg Ile Tyr Ala Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ile Ser Glu Ile Gly Arg Asn Met Thr Val Phe Glu Tyr Asn 165 170 175 Asn Arg Leu Leu Ile Val Asp Cys Gly Val Leu Phe Pro Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Pro Gly Val Asp Leu Ile Leu Pro Asp Phe Gly Pro Ile Glu Asp 195 200 205 His Leu His Arg Val Asp Ala Leu Val Val Thr His Gly His Glu Asp 210 215 220 His Ile Gly Ala Ile Pro Trp Leu Leu Lys Leu Arg Asn Asp Ile Pro 225 230 235 240 Ile Leu Ala Ser Arg Phe Thr Leu Ala Leu Ile Ala Ala Lys Cys Lys 245 250 255 Glu His Arg Gln Arg Pro Lys Leu Ile Glu Val Asn Glu Gln Ser Asn 260 265 270 Glu Asp Arg Gly Pro Phe Asn Ile Arg Phe Trp Ala Val Asn His Ser 275 280 285 Ile Pro Asp Cys Leu Gly Leu Ala Ile Lys Thr Pro Ala Gly Leu Val 290 295 300 Ile His Thr Gly Asp Ile Lys Leu Asp Gln Thr Pro Pro Asp Gly Arg 305 310 315 320 Pro Thr Asp Leu Pro Ala Leu Ser Arg Phe Gly Asp Glu Gly Val Asp 325 330 335 Leu Met Leu Cys Asp Ser Thr Asn Ala Thr Thr Pro Gly Val Ser Gly 340 345 350 Ser Glu Ala Asp Val Ala Pro Thr Leu Lys Arg Leu Val Gly Asp Ala 355 360 365 Lys Gln Arg Val Ile Leu Ala Ser Phe Ala Ser Asn Val Tyr Arg Val 370 375 380 Gln Ala Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Ser Asn Arg Lys Val Ala Phe 385 390 395 400 Asn Gly Arg Ser Met Ile Arg Asn Met Glu Ile Ala Glu Lys Leu Gly 405 410 415 Tyr Leu Lys Ala Pro Arg Gly Thr Ile Ile Ser Met Asp Asp Ala Ser 420 425 430 Arg Met Ala Pro His Lys Val Met Leu Ile Thr Thr Gly Thr Gln Gly 435 440 445 Glu Pro Met Ala Ala Leu Ser Arg Met Ala Arg Arg Glu His Arg Gln 450 455 460 Ile Thr Val Arg Asp Gly Asp Leu Ile Ile Leu Ser Ser Ser Leu Val 465 470 475 480 Pro Gly Asn Glu Glu Ala Val Phe Gly Val Ile Asn Met Leu Ala Gln 485 490 495 Ile Gly Ala Thr Val Val Thr Gly Arg Asp Ala Lys Val His Thr Ser 500 505 510 Gly His Gly Tyr Ser Gly Glu Leu Leu Phe Leu Tyr Asn Ala Ala Arg 515 520 525 Pro Lys Asn Ala Met Pro Val His Gly Glu Trp Arg His Leu Arg Ala 530 535 540 Asn Lys Glu Leu Ala Ile Ser Thr Gly Val Asn Arg Asp Asn Val Val 545 550 555 560 Leu Ala Gln Asn Gly Val Val Val Asp Met Val Asn Gly Arg Ala Gln 565 570 575 Val Val Gly Gln Ile Pro Val Gly Asn Leu Tyr Val Asp Gly Val Thr 580 585 590 Met Gly Asp Ile Asp Ala Asp Ile Leu Ala Asp Arg Thr Ser Leu Gly 595 600 605 Glu Gly Gly Leu Ile Ser Ile Thr Ala Val Ile Asp Asn Arg Thr Gly 610 615 620 Arg Leu Leu Glu Arg Pro Thr Val Gln Thr Ser Gly Phe Ser Glu Asp 625 630 635 640 Ala Lys Ser Met Met Gly Glu Val Thr Glu Leu Ser Glu Thr Thr Met 645 650 655 Asn Asp Leu Ala Ala Glu Gly Glu Asn Asp Pro Tyr Arg Met Val Gln 660 665 670 Gln Leu Arg Arg Lys Leu Ser Arg Phe Val Glu Gln Lys Trp Lys Arg 675 680 685 Gln Pro Val Ile Met Pro Thr Val Ile Pro Met Thr Ala Glu Thr Thr 690 695 700 His Ile Gly Asp Asp Glu Val Arg Ala Ser Arg Glu Ser Leu 705 710 715

Claims (62)

  1. a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드, 및
    b. RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 향상된 산업 성능을 갖는 유전자 조작 숙주 세포로서,
    이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되는 유전자 조작 숙주 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자는 내인성 유전자인 유전자 조작 숙주 세포.
  3. 제 1 항에 있어서,
    이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터인 유전자 조작 숙주 세포.
  4. 제 3 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자인 유전자 조작 숙주 세포.
  5. 제 1 항에 있어서,
    이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 6로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고, RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 유전자 조작 숙주 세포.
  6. 제 1 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 10), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), c- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 18), d- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 20), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 11), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), g- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), h- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), i- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), j- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 19), k- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), l- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), m- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 12), n- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 15), o- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 17), p- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 19), q- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 14), r- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 13), s- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 19), t- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 21), u- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 14), v- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 20), w- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), x- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9), 및 y- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 18)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 조작 숙주 세포.
  7. 제 1 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), b- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), c- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), d- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), e- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 조작 숙주 세포.
  8. 제 1 항에 있어서,
    이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고, RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 유전자 조작 숙주 세포.
  9. 제 1 항에 있어서,
    이종성 프로모터는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터이고 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 유전자 조작 숙주 세포.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속하는 유전자 조작 숙주 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 유전자 조작 숙주 세포.
  12. 제 1 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 5% 더 높은 포화 바이오매스를 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  13. 제 1 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 10% 더 높은 포화 바이오매스를 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  14. 제 1 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 포화 바이오매스이며, 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 20% 더 높은 포화 바이오매스를 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  15. 제 1 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자를 생산하는 유전자 조작 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신인 유전자 조작 숙주 세포.
  17. 제 15 항에 있어서,
    유기산은 숙시네이트,락테이트, 또는 피루베이트인 유전자 조작 숙주 세포.
  18. 제 15 항에 있어서,
    알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올인 유전자 조작 숙주 세포.
  19. 제 15 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  20. 제 15 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 3% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  21. 제 15 항에 있어서,
    강화된 산업 성능은 생성물 수율이며, 여기서 유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 6% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타내는 유전자 조작 숙주 세포.
  22. 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법.
  23. 생체 분자 수율을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며,
    유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율에 비해 높은 생체 분자 수율을 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는 방법.
  24. 포화 바이오매스를 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며,
    유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양된 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스에 비해 증가된 포화 바이오매스를 나타내며, 대조군 숙주 세포는 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는 방법.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자는 내인성 유전자인 방법.
  26. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  27. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 방법.
  29. 제 23 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), b- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 17), c- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 20), d- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  30. 제 23 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a-(SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 11), 및 f- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 23 항에 있어서,
    이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6이고, RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 방법.
  32. 제 24 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 10), b- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), c- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), d- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 18), e- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 17), f- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 19), g- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), h- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14), i- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 19), j- (SEQ ID NO: 5:: SEQ ID NO: 14), k- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 13), l- (SEQ ID NO: 6:: SEQ ID NO: 19), m- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 21), 및 n- (SEQ ID NO: 8:: SEQ ID NO: 14)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  33. 제 24 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 조합은 a- (SEQ ID NO: 1:: SEQ ID NO: 14), b- (SEQ ID NO: 2:: SEQ ID NO: 13), c- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 11), 및 d- (SEQ ID NO: 3:: SEQ ID NO: 14)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 제 24 항에 있어서,
    이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1이고 RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20인 방법.
  35. 제 23 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
  36. 제 23 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
  37. 제 23 항 및 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체 분자는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신인 방법.
  39. 제 37 항에 있어서,
    유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트인 방법.
  40. 제 37 항에 있어서,
    알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올인 방법.
  41. 향상된 산업 성능을 갖는 유전자 조작 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는
    a. RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    b. (a)의 폴리뉴클레오타이드의 개시 코돈의 돌연변이;를 포함하며
    돌연변이는 폴리뉴클레오타이드의 내인성 개시 코돈을 상이한 개시 코돈으로 대체하는 유전자 조작 숙주 세포.
  42. 제 41 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 조작 숙주 세포.
  43. 제 41 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 19인 유전자 조작 세포.
  44. 제 42 항에 있어서,
    내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈은 'ATG' 또는 'GTG,'로부터 'TTG'로 변화되는 유전자 조작 세포.
  45. 제 41 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속하는 유전자 조작 세포.
  46. 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 유전자 조작 세포.
  47. 제 41 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자를 생산하는 유전자 조작 숙주 세포.
  48. 제 47 항에 있어서,
    아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신인 유전자 조작 숙주 세포.
  49. 제 47 항에 있어서,
    유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트인 유전자 조작 숙주 세포.
  50. 제 47 항에 있어서,
    알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올인 유전자 조작 숙주 세포.
  51. 제 47 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타내는 유전자 조작 세포.
  52. 생체 분자 또는 포화 바이오매스의 수율을 증가시킬 수 있는 숙주 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 숙주 세포를 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 변형시키는 단계는 내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈을 돌연변이시키는 것을 포함하고, 여기서 변형은 유전자 조작 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며;
    유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 생체 분자 수율과 비교하여 생체 분자 수율을 증가시키거나 또는 유전자 조작 숙주 세포는 대조군 숙주 세포의 포화 바이오매스과 비교하여 보다 높은 포화 바이오매스를 달성하고, 대조군 숙주 세포는 유전자 조작 숙주 세포의 개시 코돈 돌연변이를 포함하지 않으며, 유전자 조작 숙주 세포 및 대조군 숙주 세포는 동일한 조건하에서 배양되는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    내인성 RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자인 방법.
  54. 제 52 항에 있어서,
    RNA 분해 유전자는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자인 방법.
  55. 제 53 항에 있어서,
    내인성 RNA 분해 유전자의 개시 코돈은 'ATG' 또는 'GTG'로부터 'TTG'로 변화되는 방법.
  56. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
  57. 제 52 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
  58. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체 분자는 아미노산, 유기산 및 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서,
    아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신인 방법.
  60. 제 58 항에 있어서,
    유기산은 숙시네이트, 락테이트, 또는 피루베이트인 방법.
  61. 제 58 항에 있어서,
    알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올인 방법.
  62. 제 58 항에 있어서,
    유전자 조작 숙주 세포는 동일한 조건에서 배양될 때, 상기 이종성 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 결핍된 유전자 동일 숙주 세포보다 적어도 약 2% 더 높은 생체 분자의 수율을 나타내는 방법.
KR1020197003175A 2016-07-05 2017-06-27 Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란 KR20190027843A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662358201P 2016-07-05 2016-07-05
US62/358,201 2016-07-05
PCT/US2017/039452 WO2018009372A1 (en) 2016-07-05 2017-06-27 Genetic perturbation of the rna degradosome protein complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190027843A true KR20190027843A (ko) 2019-03-15

Family

ID=60913117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197003175A KR20190027843A (ko) 2016-07-05 2017-06-27 Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11549096B2 (ko)
EP (1) EP3481853A4 (ko)
JP (1) JP2019519243A (ko)
KR (1) KR20190027843A (ko)
WO (1) WO2018009372A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHODS OF PRODUCING A GLUCOSE PERMEASE BANK AND USES THEREOF
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
EP3481853A4 (en) 2016-07-05 2020-01-15 Zymergen Inc. GENETIC DISORDERS OF THE RNA-DEGRADOSOME-PROTEIN COMPLEX
EP3625351A1 (en) * 2017-05-19 2020-03-25 Zymergen Inc. Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph
KR20200026878A (ko) 2017-06-06 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 균류 균주를 개량하기 위한 htp 게놈 공학 플랫폼
US11028401B2 (en) 2018-06-06 2021-06-08 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi
JP2023094496A (ja) * 2021-12-23 2023-07-05 委子 陌間 抗菌・ウイルス治療薬の製造方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126842A1 (en) * 1998-08-07 2004-07-01 Marc Dreyfus Mutant E. coli strains, and their use for producing recombinant polypeptides
US6962989B1 (en) * 1999-07-08 2005-11-08 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins
US20060269975A1 (en) 1999-07-16 2006-11-30 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in DNA replication, protein synthesis, and pathogenesis
US6713289B2 (en) * 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
DE10154177A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-08 Basf Ag Gene die für neue Proteine codieren
EP1790721A4 (en) * 2004-09-09 2008-12-10 Res Inst Innovative Tech Earth DNA FRAGMENT HAVING A PROMOTING FUNCTION
US7498413B2 (en) 2006-01-06 2009-03-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize antimicrobial protein useful for enhancing plant resistance to pathogens
GB0611444D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Medical Res Council Technology Rnase H2 complex and genes therefor
EP2395087A1 (en) 2010-06-11 2011-12-14 Icon Genetics GmbH System and method of modular cloning
US9803221B2 (en) * 2011-09-30 2017-10-31 Enchi Corporation Engineering microorganisms to increase ethanol production by metabolic redirection
EP2873725B1 (en) 2013-11-15 2016-09-07 Samsung Electronics Co., Ltd Genetically Engineered Yeast Cell Producing Lactate Including Acetaldehyde Dehydrogenase, Method of Producing Yeast Cell, and Method of Producing Lactate Using the Same
EP3143153A4 (en) 2014-05-16 2018-01-03 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial approach for the production of 5-hydroxytryptophan
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
EP3481853A4 (en) 2016-07-05 2020-01-15 Zymergen Inc. GENETIC DISORDERS OF THE RNA-DEGRADOSOME-PROTEIN COMPLEX

Also Published As

Publication number Publication date
US20190194769A1 (en) 2019-06-27
US11549096B2 (en) 2023-01-10
EP3481853A4 (en) 2020-01-15
WO2018009372A1 (en) 2018-01-11
EP3481853A1 (en) 2019-05-15
JP2019519243A (ja) 2019-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20190027843A (ko) Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란
KR102345899B1 (ko) 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
KR102345898B1 (ko) 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
Chien et al. Cloning, functional organization, transcript studies, and phylogenetic analysis of the complete nitrogenase structural genes (nifHDK2) and associated genes in the archaeon Methanosarcina barkeri 227
KR102400332B1 (ko) 정제 화학약품의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물
KR102321146B1 (ko) 정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물
KR20180011313A (ko) 정제 화학약품의 개선된 제조를 위한 재조합 미생물
Narberhaus et al. Three disparately regulated genes for σ32‐like transcription factors in Bradyrhizobium japonicum
KR20180011324A (ko) 알라닌의 개선된 제조를 위한 재조합 미생물
US20240067997A1 (en) Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph
US20240158820A1 (en) Fermentative production of n-butylacrylate using alcohol acyl transferase enzymes
CN100355778C (zh) 玉米根优先启动子及其用途
Lee et al. Cloning and characterization of two groESL operons of Rhodobacter sphaeroides: transcriptional regulation of the heat-induced groESL operon
CN113166741A (zh) Dna文库的多重确定性组装
US20210115500A1 (en) Genotyping edited microbial strains
EP3044591B1 (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
US20210332396A1 (en) Genetic elements in enterococcus spp. to produce dopamine
JP5813073B2 (ja) シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法
MXPA02007431A (es) Factores de transcripcion de raiz y metodos de uso.
EP1112370A1 (en) Maize sina orthologue-1 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right