CN116057186A - 用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主dna残留的质粒靶点、引物探针、试剂盒及方法 - Google Patents

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CN116057186A CN202280005530.8A CN202280005530A CN116057186A CN 116057186 A CN116057186 A CN 116057186A CN 202280005530 A CN202280005530 A CN 202280005530A CN 116057186 A CN116057186 A CN 116057186A
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Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点、引物探针、试剂盒及方法。所述质粒靶点选自质粒Ori和KanR基因中的一种或两种，所述Ori元件具有SEQ ID NO.1的基因序列，所述KanR基因具有能够编码KanR肽链的基因序列，其中所述KanR具有SEQ ID NO.2‑5的氨基酸序列。本申请还涉及该质粒靶点的引物探针、试剂盒及使用方法。本申请提供有效的检测靶点(Ori和KanR基因)，并提供了准确的检测扩增体系，实现了对细胞成品宿主DNA残留的检测，解决了病毒载体端检测宿主残留，检测值与实际差异大的问题。

Description

用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点、引物探针、试剂盒及方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点、引物探针、试剂盒及方法。
背景技术
细胞和基因疗法已经成为继抗体药物之后生物医药最热门的产业领域。据FDA统计，近期进入早期临床开发阶段的细胞和基因疗法数目激增，预计每年将接收超过200份IND申请。截至2021年12月6日，FDA共批准22款细胞和基因疗法产品。
有多种病毒载体被用于细胞和基因疗法，包括腺病毒、慢病毒和腺相关病毒等。这些载体大都使用HEK293T细胞进行生产，残留DNA就会作为杂质存在于载体终产品中。各国监管机构都对宿主残留DNA的限量做出了相应的规定。例如2020版《中国药典》指出，应检测宿主细胞DNA等工艺相关杂质的残留量，并将其控制在可接受的水平[人用基因治疗制品总论；中国药典(三部)2020版]。国家药品监督管理局药品审评中心生物制品药学部2020年发布的《基因转导与修饰系统药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》建议申请人将非致瘤细胞的残留DNA限度定为小于10ng/剂。
在以病毒为载体的CAR-T和TCR-T细胞疗法中，由于细胞成品与HEK293T均为人源DNA，并且相对于细胞成品中的DNA总量，宿主DNA残留量(HCD)比例低，难以检测到准确数值。目前采用的方法还是检测病毒制剂中的宿主DNA残留，通过严格控制病毒制剂中HCD量来保证细胞制剂中HCD不超标。但过于严格控制病毒制剂HCD使得工艺探索过程繁琐且成本昂贵。
因此，在本领域中仍然需要一种能够准确、便捷地对细胞制剂中的宿主DNA残留进行检测的手段。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够检测出细胞成品中宿主DNA残留的方法。在本发明中，以细胞成品的宿主DNA残留来优化相关的工艺，减少过量的工艺要求，最终降低成本。具体而言，根据本发明的方法，先在病毒制剂中检测出宿主DNA残留(R1)，通过检测质粒在病毒制剂中残留(P1)和细胞制剂中的残留(P2)，来计算细胞培养过程中细胞外DNA清除率进而来计算出细胞制剂中宿主DNA在细胞制剂中的残留：R2＝R1*(P2/P1)。
在第一方面，本申请提供了一种用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点，所述质粒靶点选自质粒Ori元件和KanR基因中的一种或两种。在一些实施方案中，所述Ori元件具有SEQ ID NO.1的基因序列，所述KanR基因具有能够编码Kan R肽链的基因序列。在一些进一步的实施方案中，所述KanR基因具有SEQ ID NO.2-5的基因序列。在一些其他的实施方案中，除了本文中公开的基因序列，所述KanR基因还可以为其他能够编码Kan R肽链的衍生序列，该衍生序列与本申请公开的基因序列的相似度保持在80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，还更优选99％以上。在一些实施方案中，可以使用包含Ori元件的质粒作为载体，例如PUC19、PUC18、PMD18-T等。在一些实施方案中，可以对前述引物探针进行荧光标记，例如如5’HEX、3’BHQ1；5’VIC、3’BHQ1；5’TAMRA、3’BHQ2；5’ROX、3’BHQ3；5’CY5、3’BHQ2或5’CY5、3’BHQ3等。
在一些实施方案中，所述细胞制剂选自TCR-T、CAR-T、CAR-NK和CAR-M细胞制剂，所述病毒制剂选自慢病毒和腺病毒。
在第二方面，本申请提供了一种根据第一方面所述的用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点的引物探针，对于质粒Ori元件，所述引物探针选自SEQIDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的一种；对于质粒KanR基因，所述引物探针选自SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11中的一种。
在第三方面，本申请提供了一种用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的试剂盒，其包括根据第二方面所述的引物探针。
在第四方面，本申请提供了一种检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的方法，其可包括以下步骤：检测病毒制剂中的宿主DNA残留(R1)、利用第二方面所述的引物探针检测病毒制剂中的质粒残留(P1)以及检测细胞制剂中的质粒残留(P2)来计算细胞培养过程中细胞外DNA清除率，然后按下式计算细胞制剂中宿主DNA在细胞制剂中的残留：R2＝R1*(P2/P1)。
在一些实施方案中，利用残留DNA检测试剂盒来检测病毒制剂中的宿主DNA残留(R1)。
在一些实施方案中，利用第二方面所述的引物探针检测病毒制剂中的质粒残留(P1)包括以下步骤：1)引物设计；2)利用质粒载体制备包含Ori和/或KanR元件的定量标准品；3)将Ori或KanR元件的引物探针配置成引物混合物，加入扩增混合物进行扩增，得到扩增标准曲线；以及4)根据扩增标准曲线计算病毒制剂中的质粒残留(P1)。
在一些实施方案中，利用Ori或KanR元件的引物检测细胞制剂中的质粒残留。
综上所述，本申请能实现以下有益技术效果中的至少一种：
1.提供了一种检测细胞治疗细胞成品中宿主DNA残留的方法。检测病毒载体和细胞成品中的质粒残留，根据二者比值，计算出了在病毒载体到细胞成品的工艺过程中，残留DNA的清除率。根据DNA清除率和对病毒载体宿主DNA含量的检测，计算出细胞成品中宿主DNA的残留。实现了对细胞成品宿主DNA残留的检测，解决了病毒载体端检测宿主残留，检测值与实际差异大的问题。
2.提供了质粒残留检测的方法，提供有效的检测靶点(Ori和KanR元件)，并提供了准确的检测扩增体系。
附图说明
图1是现有技术中生产CAR-T和TCR-T细胞疗法制剂的一般工艺流程图；
图2是实施例1Ori引物体系标准曲线扩增图；
图3是实施例1KanR引物体系标准曲线扩增图；
图4-8分别是实施例2加入100ul稀释20倍、540倍、1620倍和4860倍的病毒感染Jurkat细胞流式检测结果；
图9是实施例2病毒稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍的质粒残留检测结果；
图10是实施例2小鼠PBMC细胞制剂的质粒残留扩增图；
图11显示实施例3小鼠PBMC细胞制剂的细胞成品流式检测结果；
图12是实施例3KanR引物检测病毒载体的质粒残留的扩增图；
图13是实施例3KanR引物系统检测细胞成品中的质粒残留扩增图；
图14是实施例4Ori引物检测慢病毒质粒残留扩增图；
图15是实施例4Kan引物检测慢病毒质粒残留扩增图；
图16是实施例4CD3细胞制剂的流式检测结果；
图17是实施例4Ori引物体系检测细胞成品中的质粒残留扩增图；
图18是实施例4KanR引物体系检测细胞成品中的质粒残留扩增图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，本领域的普通技术人员将会理解，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
生产CAR-T和TCR-T细胞疗法制剂的主要步骤包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR/TCR基因转移、体外T细胞扩增，以及最后的末端工艺和冷冻保存，详见图1的工艺流程图。在该工艺中，病毒载体到细胞成品的过程会经历细胞换液，或者在细胞培养过程中宿主细胞DNA降解。病毒中的宿主DNA残留会比细胞成品中的高，因此检测值不能反应实际的宿主DNA残留。药典中只对成品中的宿主DNA残留有要求，当病毒载体中残留值高于药典要求时，只能在病毒工艺上减少宿主DNA含量。减少病毒载体的宿主DNA残留需要进行繁杂的工艺摸索，比如通过添加DNA酶降解来处理。然而，随着DNA酶加量过多，会引起DNA酶残留过高的问题以及加大后续病毒载体纯化工艺的难度，对工艺要求和成本带来非常大的挑战。同时，在病毒制剂过程中就需要要求HCD值达到细胞制剂的要求，要求过于苛刻，因为在病毒添加到细胞中转导并细胞培养过程中，残留DNA会随着换液等操作进行清除。
因此，如果能开发一种检测方法准确的计算出清除率，可得到细胞制剂中准确的HCD值，对于评价细胞制剂是否符合药典要求以及指导病毒工艺摸索，制定病毒质量放行标准有重要价值。
对此，本申请的发明人进行了大量的研究。在研究过程中，本发明人意识到，细胞制剂成品TCR T是人源性，病毒宿主DNA残留也是人源性，所以无法区分在细胞制剂所提取的DNA是加入病毒引入的宿主DNA残留还是TCR T细胞制剂本身来源。同时，本发明人在研究过程中发现，病毒与细胞成品中的残留质粒和残留宿主DNA，在病毒载体到细胞成品的过程中有相同的减少比例，即清除率。因此，通过检测细胞成品和病毒载体中的质粒残留，通过比较两者质粒残留的比例，就能计算从细胞工艺工程中的宿主DNA残留的清除率。然后根据病毒载体中的宿主DNA残留量及DNA清除率，就能确定细胞成品中的宿主DNA残留量，如以下示意出的。
Figure BDA0004046271260000051
质粒和宿主DNA在细胞工艺过程中有相同的DNA清除率，也即从病毒载体到细胞成品，质粒残留和宿主DNA残留有相同的剩余比例。计算公式：宿主DNA残留＝细胞成品中质粒残留/病毒载体中质粒残留*质粒载体中宿主DNA残留。
也就是说，通过检测在病毒阶段的非人源性质粒残留及细胞制剂阶段的质粒残留来计算残留DNA清除效率，能够间接计算细胞制剂中宿主DNA残留。在此基础上，本申请的发明人完成了本发明。
具体而言，本发明提供了一种能够检测出细胞制剂中宿主DNA残留的方法。在该方法中，以细胞成品的宿主DNA残留来优化相关的工艺，减少过量的工艺要求，最终降低成本。先在病毒制剂中检测出宿主DNA残留(R1)，通过检测质粒在病毒制剂中的残留(P1)和细胞制剂中的残留(P2)来计算细胞培养过程中细胞外DNA清除率，然后进一步计算出细胞制剂中宿主DNA在细胞制剂中的残留：R2＝R1*(P2/P1)。通过这样的方式，能够快捷、准确地检测出细胞制剂中的DNA残留率。同时，准确检测成品中宿主DNA残留量，产品在符合药典要求的前提下，能够更好的对病毒工艺和细胞工艺做指导。
下面将参考实施例对本发明进行进一步的详细说明。本领域的普通技术人员将会理解，给出这些实施例的目的仅仅是为了便于其理解和实施本发明，而无异于将本发明的保护范围限制于这些具体的实施例。
实施例1以质粒上Ori、KanR元件为靶点检测质粒残留
1)引物设计
如表1所示，分别针对Ori(SEQ ID NO.1)和KanR(SEQ ID NO.3)设计检测引物探针:
表1：Ori(SEQ ID NO.1)和Kan R(SEQ ID NO.3)的检测引物探针
靶点 序列号 引物探针 荧光标记
Ori-F SEQ ID NO.6 GTTTGCCGGATCAAGAGCTAC
Ori-R SEQ ID NO7 GGCCTAACTACGGCTACACT
Ori-P SEQ ID NO.8 CTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGG 5’FAM3’BHQ1
Kan-F SEQ ID NO.9 CGCAATCACGAATGAATAACGGT
Kan-R SEQ ID NO.10 CCAGACTTGTTCAACAGGCCA
Kan-P SEQ ID NO.11 ACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCAT 5’FAM,3’BHQ1
引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，然后进行HPLC纯化。
2)定量标准品制备
将KanR(SEQ ID NO.3)序列连接到载有Ori元件的PUC57载体来制备包含Ori和Kan靶点的定量标准品。提取质粒，然后用Nanodrop 2000(美国Thermofisher公司)测浓度。取1ug质粒，以限制性内切酶QuickCutTM EcoR I(宝生物工程(大连)有限公司，货号1611)酶切线性化后，根据酶切质粒加量和质粒分子量，稀释质粒浓度至3E8copies/ul，每支100ul分装，制得质粒标准品。
3)qPCR扩增体系及检测
将Ori或KanR基因的引物探针配置成20x Primer MIX混合物。混合物中上、下游引物及探针的浓度分别为8μM、8μM和4μM。
扩增混合物为Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(宝生物工程(大连)有限公司，货号RR390A)。分别用Ori和Kan引物配置20ul反应体系，具体加样量见表2。
表2：扩增体系配置
组分 加量/μl
<![CDATA[Premix Ex Taq<sup>TM</sup>(Probe qPCR)]]> 10
20x Primer MIX 1
无核酸酶水 6
取10ul步骤2)中的质粒标准品，加90μl EASY Dilution(for Real Time PCR)(宝生物工程(大连)有限公司，货号9160)稀释质粒质粒标准品，配置成3E7 copies/ul溶液。继续10倍梯度稀释，制成STD0、STD1、STD2、STD3、STD4，STD5浓度分别为3E6 copies/ul、3E5copies/ul、3E4 copies/ul、3E3 copies/ul、3E2 copies/ul和30copies/ul。
取qPCR管(96孔板)，每孔分装17μl，每个浓度标准品加3ul。利用QTOWER3G荧光定量PCR仪(德国Analytik Jena AG公司)进行检测。扩增程序见下表3。
表3：扩增程序
Figure BDA0004046271260000071
*：收集荧光信号(选择与探针对应的荧光通道)
4)扩增结果
扩增结果见下表4。由表4可见，Ori和Kan引物的扩增效率都大于0.9，线性R2大于0.98，标准品理论值与根据标准曲线的计算浓度差异在80％-120％之内。这表明引物及标准品扩增良好。
表4：Ori和Kan引物扩增结果
Figure BDA0004046271260000072
Ori引物体系标准曲线扩增图见附图2。Kan引物体系标准曲线扩增图见附图3。
5)定量限
将Ori和Kan引物分别扩增STD5浓度质粒，重复扩增20次，均成功扩增，且CV值小于10％，其说明检测定量限小于30copies/ul。
实施例2方法验证：小鼠TCR-T成品中宿主DNA残留检测与质粒残留计算的结果的比较
提供该实施例的目的是证明根据本发明的方法能真实反映细胞制剂中宿主DNA残留数值，证明方法可靠准确。验证思路为：按照生产人TCR T细胞制剂工艺，但将初始投料的人PBMC换成鼠源PBMC，加入病毒(准确测出宿主DNA残留(R1)及质粒残留(P1))，并按照相同T细胞激活扩增灌流及清洗工艺进行生产，最后获得鼠源TCR-T细胞。此时，细胞制剂是既可以准确测出质粒残留(P2)又可以测出人源的宿主DNA残留(R2-TRUE)。然后，将根据P2/P1*R1＝R2计算出的R2与实际测量的R2-TRUE的对比。
1、模拟人TCR T工艺生产小鼠TCR T：
1)初始病毒滴度及R1、P1测量值
利用四质粒系统(包装质粒pMD2.G(Addgene Plasmid#12259)、pRSV-Rev(AddgenePlasmid#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene Plasmid#12251)购自Addgene，转移质粒为经改造的pLenti.PGK.chFP.W(addgene Plasmid#51008)，其中加入了目的TCR基因)共转染HEK293T细胞，包装病毒。纯化后病毒感染Jurkat细胞来检测感染滴度。
(1)病毒滴度检测Jurkat细胞密度为5×10^5cells/mL，并将细胞铺于24孔细胞培养板中，每孔1mL；从-80℃取出慢病毒，置于4℃解冻。解冻完成后混匀，用DMEM培养基稀释病毒，每孔添加100μL病毒稀释液，设置4个稀释度，稀释倍数3。十字交叉混匀，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养48h±2h。收集培养后细胞，标记抗体后，流式细胞仪检测。根据阳性率计算病毒滴度。
滴度计算数据选择：选择阳性率介于1％～20％间的组别用于滴度计算；
滴度计算公式：Titer(TU/mL)＝N*P*D/V
其中：
N＝慢病毒感染前细胞数目；
P＝细胞阳性率(1％～20％)；
V＝每孔细胞感染慢病毒的体积；
D＝稀释倍数，稀释10倍，D＝10；稀释100倍，D＝100；
TU＝转导单位(Transduction unit)。
流式检测结果如下表5，病毒的滴度为2.54E+08TU/ml。
表5：流式检测结果
Figure BDA0004046271260000081
图4-8分别对应加入100ul稀释20倍、540倍、1620倍和4860倍病毒感染Jurkat细胞流式检测结果。
(2)病毒中宿主DNA检测
用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(货号SK030203D100，湖州申科生物技术有限公司)提取DNA，取50ul样本用于提取，50ul洗脱液洗脱，其他按试剂盒说明书操作。用湖州申科生物技术有限公司HEK293残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(PCR-荧光探针法)(货号：1101104)检测病毒载体中宿主DNA残留。
经qPCR扩增检测，宿主HEK293T DNA残留检测值是3.51E6 fg/ul。
(3)病毒中质粒残留检测以Ori引物检测系统检测病毒载体的质粒残留，按实施例1配置扩增体系和扩增标准曲线。病毒样本处理样本以无核酸酶水10倍梯度稀释，分别检测病毒稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍的质粒残留结果，检测结果见于图9。
表6：病毒稀释后的质粒残留检测结果
Ct值 浓度
稀释10倍 21.14 1.13E5 copies/ml
稀释100倍 20.93 1.30E5 copies/ml
稀释1000倍 23.19 2.82E4 copies/ml
稀释10000倍 26.80 2.47E3 copies/ml
稀释100000倍 31.37 1.13E2 copies/ml
从图9可见，稀释10倍时，扩增存在抑制。随着稀释倍数增多，病毒载体中的抑制PCR的成分被稀释检测值升高。但是，随着稀释倍数的继续增多，也会造成样品的损耗。根据检测结果，病毒稀释1000倍检测最合适。根据稀释倍数计算，慢病毒中质粒残留浓度为2.82E7copies/ul。
2)T细胞激活与病毒转导
(1)小鼠CD4+/CD8+细胞分离
收集127只免疫缺陷鼠NCG外周血和脾脏，用小鼠淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物技术股份有限公司，货号DKW33-R0100)按说明书操作，于无菌条件下分离PBMC。用CD4/CD8(TIL)MicroBeads,mouse(美国Miltenyi，货号130-116-480)磁珠分选CD4+/CD8+细胞。最终获得CD4+/CD8+细胞96ml，细胞密度2E6/ml。
(2)细胞激活
在Sepax C-Pro Cell Processing System(美国cytiva公司)上使用C-Pro CT-60.1 Processing Kit(美国cytiva公司)套件完成细胞激活。用细胞培养基X-VIVO培养基(含IL-2200IU/mL，CTS血清替代品2％)将细胞重悬为2E6cell/ml进行激活。加入400ulDynabeadsTM小鼠T活化剂CD3/CD28(美国Thermofisher公司，货号11456D)。在C-Pro中激活30min后，将激活后细胞转入
Figure BDA0004046271260000101
(美国Wilson Wolf公司，货号81100-CS)中。将G-Rex转移至37 1C、5 0.5％CO2培养箱培养24 6h。
(3)病毒转导
取步骤(1)制备的慢病毒至室温解冻。使用取样袋取样至细胞计数器内计数，结果如下：
总细胞密度：1.88E6/mL
活细胞密度：1.68E6/mL
总活细胞数：1.68E8(96mL)
按病毒感染复数(MOI)2:1加入2.54E8 TU/ml病毒1.27ml。补充64mlX-VIVO培养基(含IL-2200IU/mL，CTS血清替代品2％)(美国龙沙生物技术有限公司，货号BE02-053Q)将细胞密度调整为1E6 cell/ml。持G-Rex细胞培养装置水平方向轻柔画圈混匀，分散底部可能团聚的细胞，随后转移至37℃、5％CO2培养箱培养48h。完成转导过程。
3)T细胞扩增培养灌流及洗涤灌装
使用GatheRex Liquid Handling(美国Wilson Wolf公司，货号80000E)将G-Rex细胞培养装置瓶内液体挤压入转导细胞暂存袋内。将细胞暂存带置于磁力架(CTSTMDynaMagTM Magnet，货号:12102，美国thermo公司)的磁力板上，去除激活磁珠。去除磁珠后，将细胞袋10L置于匹配托盘上，将细胞扩增系统Xuri(Xuri Cell Expansion System W25，美国Cytiva公司)连接废液袋(20～30L)。培养基和去磁珠袋的接管卡扣锁紧后，使用Y型接管连接，挂架子上待进液。设置Xuri W25参数，将细胞悬液、培养基通过蠕动泵导入Xuri细胞袋，使袋内总体积为1L，袋内细胞密度约1E6/mL。灌流培养8天后，培养体积达到10L，收获细胞。取样袋取3ml流式检测阳性率及细胞计数。活细胞密度为9.13E5 cell/ml，活细胞总数约1E10cell。流式检测阳性率为91％。
使用Sefia S-2000细胞处理仪(美国cytiva公司)及其配套的FlexCell程序软件收获扩增的转导T细胞。经过浓缩、洗涤和冷冻制剂后，得到350ml活细胞细胞密度2E7cell/ml，分装到7个细胞冻存袋中，每袋50ml。将细胞冻存袋在VIA Freeze Quad中冷冻保存，然后转移到液氮储存器中。
4)T细胞制剂P2及R2-TRUE测量值
取一袋冻存细胞用于质粒残留和宿主DNA残留检测。细胞制剂解冻混匀后，取50ul用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(湖州申科生物技术有限公司，货号SK030203D100)提取DNA，以50ul洗脱液洗脱，其他按说明书操作。提取后DNA分别用Ori引物系统检测质粒残留，用湖州申科生物技术有限公司Human残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测宿主293T DNA残留。
以Ori引物检测系统检测病毒载体的质粒残留，按实施例1配置扩增体系和扩增标准曲线。质粒残留检测值为1.87E3copies/ul，结果见表7。
表7：质粒残留检测结果
Ct值 浓度
细胞制剂质粒残留 27.22 1.87E3 copies/ul
取步骤(3)制备的小鼠TCR-T细胞制剂，其质粒残留扩增图见图10。
用湖州申科生物技术有限公司Human残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测步骤(3)制备的细胞制剂的宿主DNA残留，检测结果为2.32E2 fg/ul。
5)P2/P1*R1＝R2计算出的R2与实际测量的R2-TRUE的对比步骤(1)使用1.27ml病毒载体转导，最后步骤(3)获得细胞制剂350ml。慢病毒中的宿主DNA残留和质粒残留随着病毒转导过程而引入至细胞中，随着细胞扩增，灌流培养和最终的洗涤制成细胞制剂，质粒残留和宿主DNA残留都在减少。
细胞制剂中质粒残留总量P2/慢病毒中质粒残留总量P1＝1.83％
细胞制剂中宿主DNA残留总量R2/慢病毒中宿主DNA残留总量R1＝1.82％
从计算结果上看，宿主DNA残留和质粒DNA残留的剩余比例是相同的，说明在整个细胞工艺过程中，DNA残留的清除比例是一样的。可以根据细胞制剂中质粒的剩余比例和慢病毒中宿主DNA残留量，来计算细胞制剂中宿主DNA残留，即R2＝R1*(P2/P1)。对比结果见下表8。
表8：残留量对比结果
Figure BDA0004046271260000111
实施例3采用手工方法制备小鼠TCR-T细胞，检测比较残留DNA的剩余比例
1、小鼠PBMC分离
抽取免疫缺陷小鼠OTI外周血0.8ml，以小鼠淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物技术股份有限公司，货号DKW33-R0100)按说明书操作，于无菌条件下分离PBMC。
2、在24孔板中，用含1mL 200U/mL Recombinant mouse IL-2(美国Thermofisher公司，货号PMC0021)Advanced RPMI 1640培养基(美国Thermofisher公司，货号12633-012)接种1E6步骤1分离的PBMC细胞，同时加入2ul DynabeadsTM小鼠T活化剂CD3/CD28(货号11456D，美国Thermofisher公司)，于5％CO237℃培养箱培养。
3、48小时后，根据细胞计数的结果，按MOI 2:1加入病毒。细胞总数为7.5E5，加入5.9ul实施例2中用到的病毒载体(感染滴度2.54E8 TU/ml)。于5％CO237℃培养箱中培养24h后，将细胞300g离心，弃上清，用1mL 200U/mL Recombinant mouse IL-2(美国Thermofisher公司，货号PMC0021)Advanced RPMI 1640培养基(美国Thermofisher公司，货号12633-012)重悬细胞。于5％CO237℃培养箱中继续培养。
4、之后每两天对培养的细胞进行计数，当细胞增殖至2.5E6 cells/mL时，用含200U/mL Recombinant mouse IL-2(美国Thermofisher公司，货号PMC0021)Advanced RPMI1640培养基，控制细胞密度为0.5E6/mL。病毒转染的第十天，收获细胞，300g离心，用PBS缓冲液(美国Thermofisher公司，货号10010-023)清洗两次后，细胞计数后，以细胞冻存液(深圳市达科为生物技术股份有限公司，货号UH-M1002-050)重悬细胞，获得8.5mL密度为1E7/mL的细胞成品。流式检测阳性率为90.1％。
细胞成品流式检测结果见图11，其中阳性率90.1％。
5、用Kan引物检测病毒载体的质粒残留，按实施例1配置扩增体系和扩增标准曲线。病毒样本处理样本以无核酸酶水10倍梯度稀释，稀释1000倍后用于检测。
病毒中质粒残留总量＝检测的浓度*稀释倍数(1000)*病毒载体体积
病毒中质粒残留总量计算结果见下表9。
表9：病毒中质粒残留总量计算结果
Figure BDA0004046271260000121
该实施例中Kan引物检测病毒载体的质粒残留的扩增图见图12。
取50ul细胞制剂，用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(湖州申科生物技术有限公司，货号SK030203D100)提取DNA，以50ul洗脱液洗脱，其他按说明书操作。用Kan引物检测细胞成品中的质粒残留，按实施例1配置扩增体系和扩增标准曲线。质粒残留总量检测结果见下表10。
表10：质粒残留总量检测结果
Figure BDA0004046271260000122
Kan引物系统检测细胞成品中质粒残留扩增图见图13。
6、用湖州申科生物技术有限公司Human残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测步骤5中用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(湖州申科生物技术有限公司，货号SK030203D100)提取的DNA，检测细胞成品中的宿主DNA残留。检测值为3.38E2 fg/ul。
病毒中质粒DNA残留总量P1＝1.71E8 copies；
细胞成品中质粒DNA残留总量P2＝2.43E7 copies；
由实施例2可知，病毒中宿主DNA残留总量R1＝3.51E6 fg/ul*5.9ul＝2.07E7 fg；
细胞成品中宿主DNA残留总量R2＝3.38E2 fg/ul*8.5ml＝2.87E6 fg。
细胞成品中质粒DNA残留总量P2与病毒中质粒DNA残留总量P1的比值(P2/P1＝14.21％)与细胞成品中宿主DNA残留总量R2与病毒中宿主DNA残留总量R1的比值(R2/R1＝13.86％)几乎相等，相差小于5％。
以上结果表明，经过病毒转导，细胞扩增培养，洗涤等步骤之后，宿主DNA残留与质粒DNA残留的减少比例是相等的。
根据宿主DNA残留计算的工艺过程中宿主DNA的清除率与根据质粒结果计算的质粒DNA清除率有差异在5％以内。说明质粒DNA的变化可以反应宿主HEK293T DNA的变化，以质粒的变化来计算细胞成品中的宿主DNA残留是可行的。
实施例4应用本方法检测计算TCR-T实际生产中成品的宿主DNA残留(细胞制剂生产中的实际应用)
1、病毒制剂情况：滴度P1 R1
慢病毒成品滴度为5.15×108TU/mL。
1)病毒中宿主DNA检测
用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(湖州申科生物技术有限公司，货号SK030203D100)提取DNA，取50ul样本用于提取，50ul洗脱液洗脱，其他按试剂盒说明书操作。用湖州申科生物技术有限公司Human残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测病毒载体中宿主DNA残留。
经qPCR扩增检测，宿主HEK293T DNA残留是3.67E4 fg/ul。
1)病毒中质粒残留检测
分别以Ori引物体系和Kan引物体系检测病毒载体质粒残留。病毒成品稀释1000倍后，按实施例1配置扩增体系和上机检测。病毒载体总量检测结果见下表11。
表11：病毒载体总量检测结果
Figure BDA0004046271260000131
Figure BDA0004046271260000141
Ori引物检测慢病毒质粒残留扩增图见图14。Kan引物检测慢病毒质粒残留扩增图见图15。
2、细胞制剂生产过程
1)T细胞激活
将CD3细胞进行激活，取3E8 CD3阳性细胞(误差范围±10％)，将CD3/CD28激活磁珠，添加至细胞中，使CD3细胞与磁珠比例达到1:1。置于Sepax Cpro细胞处理仪(美国Cytiva公司)中孵育30min，孵育密度CD3阳性细胞3E6 cells/mL。将细胞转移至G-rex细胞培养装置中，控制激活密度为2E6 cells/mL。将G-rex细胞培养装置转移到37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h，完成激活过程。
2)T细胞转导
使用取样袋从G-Rex取样至细胞计数器内计数，结果如下：
总细胞密度：1.63E6/mL
活细胞密度：1.16E6/mL
总活细胞数：1.74E8(150mL)。
将慢病毒载体转移至室温解冻，然后根据病毒滴度报告，按照MOI＝2，加入0.68ml慢病毒。将定量的慢病毒载体与转导培养基混匀完成病毒载体稀释溶液的配制。
通过接管的方式将细胞病毒载体混合物转移至G-rex细胞培养装置中，再用X-VIVO(含IL-2 200IU/mL 2％CTS血清替代品)培养基将密度调整至1E6 cells/mL。将G-rex细胞培养装置转移到37±1℃、5±0.5％CO2二氧化碳培养箱中培养48±6h，完成转导过程。
从二氧化碳培养箱中取出转导后的细胞，用培养基将密度调整至1E6 cells/mL，将G-rex细胞培养装置转移到37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h。
3)细胞扩增
使用GatheRex Liquid Handling(美国Wilson Wolf公司，货号80000E)将G-Rex瓶内液体挤压入转导细胞暂存袋内。将细胞暂存带置于磁力架(CTSTM DynaMagTM Magnet，货号:12102，美国thermo公司)的磁力板上，去除激活磁珠。去除磁珠后，细胞袋10L置于匹配托盘上，利用Xuri细胞扩增系统(Xuri Cell Expansion System W25，美国Cytiva公司)连接废液袋(20～30L)。将培养基和去磁珠袋的接管卡扣锁紧后，使用Y型接管连接，挂架子上待进液。设置Xuri W25参数，将细胞悬液、培养基通过蠕动泵导入Xuri细胞袋，使袋内总体积为1L，袋内细胞密度约1E6/mL。从培养体系1000mL培养至5000mL，维持5000mL的培养体系直到CAR阳细胞数≥1.5E10cells。
使用Sefia S-2000细胞处理仪(美国cytiva公司)及其配套的FlexCell程序软件收获扩增的转导T细胞。经过浓缩、洗涤和冷冻制剂后，得到352ml活细胞细胞密度5E7cell/ml，分装到7个细胞冻存袋，每袋50ml。细胞冻存袋在VIA Freeze Quad中冷冻保存，然后转移到液氮储存器中。细胞制剂流式检测，阳性率为83.1％。检测结果见图16。
3、细胞制剂P2及R2的计算值
1)细胞制剂中质粒残留的检测
分别以Ori引物体系、KanR引物体系检测细胞成品中质粒的残留量。用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(货号SK030203D100，湖州申科)提取DNA，取50ul样本用于提取，50ul洗脱液洗脱，其他按试剂盒说明书操作。病毒中质粒残留总量＝检测的浓度*稀释倍数(1000)*病毒载体体积，细胞成品中的质粒残留总量＝检测的浓度*稀释倍数(1)*细胞成品体积。检测结果如下表12。
表12：细胞成品中的质粒残留总量检测结果
Figure BDA0004046271260000151
Ori引物体系检测细胞成品中的质粒残留扩增图见图17。Kan引物体系检测细胞成品中的质粒残留扩增图见图18。
按Ori检测结果计算，细胞成品中质粒残留总量P2：慢病毒中质粒残留总量P1＝1.93％；
按KanR基因检测结果计算，细胞成品中质粒残留总量P2：慢病毒中质粒残留总量P1＝1.85％；
慢病毒中宿主DNA残留浓度为3.67E4 fg/ul，共用病毒680ul。慢病毒中宿主DNA残留总量R1为2.50E7 fg。
以Ori检测结果，根据公式R2＝R1*(P2/P1)，计算得细胞制剂中宿主DNA残留总量R2为4.83E5 fg。
以KanR基因检测结果，根据公式R2＝R1*(P2/P1)，计算得细胞制剂中宿主DNA残留总量R2为4.63E5 fg。
从病毒载体看宿主DNA残留为25ng，超过了指导原则要求的小于10ng/剂的要求。对细胞成品的检测宿主DNA残留不到1ng，远低于指导原则的限度要求。病毒载体到细胞成品的工艺过程中，不同的生产工艺，对病毒载体中带入的宿主DNA残留的变化也不同，通过检测比较细胞制剂中的质粒残留总量和慢病毒中引入的质粒残留总量，可以准确评估细胞成品中的宿主DNA残留。
以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
SEQ ID NO.1基因序列
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA
SEQ ID NO.2氨基酸序列
SRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYGKPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGKTAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDASDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGIADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF
SEQ ID NO.3 KanR基因序列1
ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
SEQ ID NO.4 KanR基因序列2
ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCTGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
SEQ ID NO.5 KanR基因序列3
ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA

Claims (10)

1.一种用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点，其特征在于所述质粒靶点选自质粒Ori元件和KanR基因中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的质粒靶点，其特征在于，所述Ori元件具有SEQ ID NO.1的基因序列，所述KanR基因具有能够编码Kan R肽链的基因序列。
3.根据权利要求2所述的质粒靶点，其特征在于，所述KanR基因具有SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的基因序列。
4.根据权利要求1所述的质粒靶点，其特征在于，所述细胞制剂选自TCR-T、CAR-T、CAR-NK和CAR-M细胞制剂，所述病毒制剂选自慢病毒和腺病毒。
5.一种根据权利要求1-4中任意一项所述的用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点的引物探针，其特征在于，对于质粒Ori元件，所述引物探针包括序列SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；对于质粒KanR基因，所述引物探针包括序列SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。
6.一种用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的试剂盒，其特征在于包括根据权利要求5所述的引物探针。
7.一种检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的方法，其特征在于包括以下步骤：检测病毒制剂中的宿主DNA残留(R1)、利用权利要求1-5中任意一项所述的引物探针检测病毒制剂中的质粒残留(P1)以及检测细胞制剂中的质粒残留(P2)来计算细胞培养过程中细胞外DNA清除率，然后按下式计算细胞制剂中宿主DNA在细胞制剂中的残留：R2＝R1*(P2/P1)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用残留DNA检测试剂盒来检测病毒制剂中的宿主DNA残留(R1)。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用权利要求1-5中任意一项所述的引物探针检测病毒制剂中的质粒残留(P1)包括以下步骤：
引物设计；
利用质粒载体制备包含Ori和/或Kan靶点的定量标准品；
将Ori或KanR基因的引物探针配置成引物混合物，加入扩增混合物进行扩增，得到扩增标准曲线；
根据扩增标准曲线计算病毒制剂中的质粒残留(P1)。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用Ori或KanR基因的引物检测细胞制剂中的质粒残留。
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