CN108103245B - 检测慢病毒质量指标组合的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及慢病毒载体的滴度检测方法。公开了一种采用序列特异性引物和荧光染料进行实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR和RT‑qPCR)的质量指标检测方法、所用引物、标准品。该测定方法高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳，解决了真核生物基因工程和基因治疗领域的载体定量不准确的限制问题。具有检测时间短，操作步骤简便，而且不需要扩增后的分析过程，与Taqman探针方法比较，SYBR Green I不需要设计合成荧光探针，简化了设计，且降低了成本，结合溶解曲线分析，可判断反应的特异性。

Description

检测慢病毒质量指标组合的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及慢病毒载体的滴度检测方法。
背景技术
慢病毒载体是一种反转录病毒载体，与传统的病毒载体相比，慢病毒载体均匀分布于基因组内，从而降低了其激活宿主内源性基因的几率。病毒载体是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。
现有技术中，测定慢病毒滴度的主要方法有流式细胞术(FACS)、酶联免疫(ELISA)法、金标试纸法和定量PCR法。其中FACS法是该方法可准确测定重组慢病毒的实际感染能力，所测滴度数据能准确反应病毒滴度的实际值，但该方法需要重组慢病毒表达标记基因(如绿色荧光蛋白eGFP)，不能测定无标记基因重组慢病毒。ELISA法仅仅测定慢病毒的颗粒数，并没有测定慢病毒对靶细胞的实际感染能力，因此ELISA法测定的是慢病毒的物理滴度而非实际(生物)滴度。此外，由于病毒悬液中含有一定的游离的P24蛋白，因此ELISA法通常过高地估计病毒滴度。绝对定量PCR法可测定病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上较准确地反应慢病毒、尤其是无标记基因的慢病毒的实际滴度。但该方法样本需求量大，影响因素多，数据重复性差，对于不能在体外大量增殖培养的靶细胞并不适宜。
慢病毒制备的过程中，通常用病毒的滴度来衡量慢病毒的质量。包括慢病毒滴度在内的慢病毒质量指标的准确测定成为基因治疗领域的技术发展的限制环节。基因治疗生物技术领域仍需要开发一种高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳的慢病毒质量指标测定方法。
发明内容
为实现本发明开发一种采用序列特异性引物和荧光染料进行实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR和RT-qPCR)的高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳的慢病毒质量指标测定方法的目的，本发明采用如下技术方案
本发明的第一方面提供了一种检测慢病毒质量指标的方法，包括步骤：
(一)针对慢病毒质量指标组合中各指标的特异性引物对组合的制备；1.设计针对慢病毒质量指标组中各指标的特异性引物对组合；
2.在实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)上，根据溶解曲线筛选出特异性引物。
(二)标准曲线的制作；
其中，所述慢病毒质量指标组合包括病毒RNA总拷贝数、T细胞总拷贝数、有复制能力的慢病毒拷贝数和宿主细胞基因组DNA残留。
所述步骤(二)标准曲线的制作包括步骤
1.准备针对慢病毒质量指标组中各指标的标准品原料
2.根据以下公式，计算出初始标准品拷贝数/μL：
Figure BDA0001547489300000031
3.首先通过梯度稀释制备组合中每一标准品的一系列不同拷贝数的稀释标准品，形成不同标准品原料的系列稀释标准品组合；
4.标准曲线的制作:用特异性引物测定步骤3所得系列标准品的qPCR荧光数值，分别用各质量指标拷贝数的对数值为横坐标，用测定的所述标准品组合中各稀释度的标准品的qPCR荧光数值作为纵坐标制作标准曲线做出标准曲线。
所述标准品原料包括检测病毒RNA总拷贝数的标准品、检测T细胞总拷贝数的标准品、检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品和检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品；
其中所述检测病毒RNA总拷贝数的标准品来自载体质粒，所述检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品来自包膜质粒，所述检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品是SV40Large T-pUC57质粒；所述检测T细胞的总拷贝数的标准品包括携带部分ALB基因组序列的pUC57-ALB基因组重组载体和部分pUC57-ALB mRNA重组载体，所述pUC57是携带人基因组中SV40大T抗原(SV40large T antigen)的序列的重组pUC57载体。
(三)样品的测定
所述利用一步法实时荧光定量qPCR检测慢病毒质量的方法，具体包括如下步骤：
(1)模板DNA或RNA的提取：
提取待测样品的DNA或RNA，可用病毒RNA/DNA提取试剂盒(如Takara的MiniBESTViral RNA DNA Extraction Kit)按供应商提供的说明书抽提。在一些实施例中，待测样品为慢病毒；在一些实施例中，待测样品为嵌合抗原受体细胞。
(2)qPCR：在Roche
Figure BDA0001547489300000041
96上进行qPCR测定，读
取待测样品和标准品(一系列梯度)的qPCR荧光数值。
反应体系：
Figure BDA0001547489300000051
*：模板为质粒标准品或待测样品DNA。
反应条件为：
Figure BDA0001547489300000052
(3)测定溶解曲线
(4)数据分析，计算拷贝数：在标准曲线上计算出具体待测样品相应的拷贝数。
第一方面的慢病毒的质量指标检测方法具有检测时间短，操作步骤简便，而且不需要扩增后的分析过程，与Taqman探针方法比较，SYBR Green I不需要设计合成荧光探针，简化了设计，且降低了成本，结合溶解曲线分析，可判断反应的特异性。
第二方面，本发明提供了用于检测权利要求1所述的慢病毒质量指标组合的qPCR引物对组合，所述检测慢病毒RNA总拷贝数的qPCR引物对组合，检测T细胞总拷贝数的qPCR引物对组合，检测复制能力的慢病毒拷贝数的qPCR引物对组合，和检测宿主细胞基因组DNA残留的qPCR引物对组合；
其中，所述检测慢病毒RNA总拷贝数的qPCR引物对组合包括选自如下SEQ ID No.1～17所示的引物对组合：
Figure BDA0001547489300000061
Figure BDA0001547489300000071
Figure BDA0001547489300000081
检测T细胞总拷贝数的qPCR引物对选自如SEQ ID No.18～23所示：
Figure BDA0001547489300000082
Figure BDA0001547489300000091
检测复制能力的慢病毒拷贝数的qPCR引物对选自如SEQ ID No.24～27所示的引物对组合：
Figure BDA0001547489300000092
Figure BDA0001547489300000101
检测宿主细胞基因组DNA残留的qPCR引物对选自如SEQ ID No.28～32所示的引物对组合：：
Figure BDA0001547489300000102
Figure BDA0001547489300000111
其中，所述检测病毒RNA总拷贝数的引物(如SEQ ID No 1～17所示)是根据慢病毒转导所用的载体质粒的序列设计；所述检测T细胞的总拷贝数的qPCR引物和RT-qPCR引物(如SEQ ID No 18～23所示)是根据人T细胞基因组中ALB基因序列设计；所述检测有复制能力的慢病毒拷贝数的qPCR引物(如SEQ ID No 24～27所示)是根据慢病毒转导所用的包膜质粒的序列设计；所述设计了检测宿主细胞基因组DNA残留的qPCR引物(如SEQ ID No 28～32所示)是根据人基因组中SV40大T抗原(SV40large T antigen)的序列设计。
本发明的第三方面提供一种用于检测第一方面所述的慢病毒质量指标组合的标准品组合，其包括检测病毒RNA总拷贝数的标准品、检测T细胞总拷贝数的标准品、检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品和检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品。其中
所述检测病毒RNA总拷贝数的标准品来自载体质粒，所述检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品来自包膜质粒。
在一具体实施例中，所述检测T细胞总拷贝数的标准品包括ALB gDNA-pUC57质粒和ALB mRNA-pUC57质粒；在一具体实施例中所述检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品是SV40Large T-pUC57质粒；在一具体实施例中所述检测T细胞的总拷贝数的标准品是携带部分ALB基因组序列的ALB gDNA-pUC57质粒重组载体，在一具体实施例中所述检测T细胞的总拷贝数的标准品是携带部分ALB mRN序列的重组载体pUC57-ALB mRNA；在一具体实施例中所述pUC57是携带人基因组中SV40大T抗原(SV40large T antigen)的序列的重组pUC57载体。
在标准品制备方面，除了检测病毒RNA总拷贝数的标准品来自载体质粒，检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品来自包膜质粒之外，本发明还创造性将部分ALB基因组序列和部分ALB mRNA序列分别构建到pUC57载体上，从而使该载体可以方便地作为T细胞的总拷贝数的标准品，同理，本发明也创造性得将人基因组中SV40大T抗原(SV40large Tantigen)的序列构建到pUC57载体上，从而使得检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品也是质粒。
本发明的第四方面，提供了第一方面所述的慢病毒的质量指标组合、第二方面所述的特异性引物对组合和第三方面所述的标准品组合在真核细胞基因工程、基因治疗中的应用。
有益效果
本发明提供了检测慢病毒质量(包括：检测病毒RNA总拷贝数、检测病毒整合到T细胞的拷贝数、检测有复制能力的慢病毒拷贝数、检测宿主细胞基因组残留拷贝数等)的系列检测方法，采用序列特异性引物和荧光染料SYBR Green I进行实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR和RT-qPCR)，方便快捷，灵敏度高；除qPCR仪器外，不需要其他昂贵的仪器设备；SYBRGreen I不需要设计合成荧光探针，简化了设计，成本低；本发明的一系列用于检测慢病毒质量的特异性引物对组合，特异性好。本发明还创造性的将T细胞总拷贝数的标准品和宿主细胞基因组残留的标准品构建成了质粒，极大方便了标准品的制备和梯度稀释。
具体实施方式
下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。
实施例1：实时荧光定量qPCR检测病毒RNA总拷贝数的方法
检测慢病毒RNA总拷贝数的qPCR引物为SEQ ID No1～No 17，其中SEQ ID No1-No9引物特异于位于载体质粒的EF-1a启动子，SEQ ID No 10～No 13引物特异于位于载体质粒的WPRE，SEQ ID No14～17引物特异于位于特定针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)部分。
具体步骤如下：
(1)模板DNA的提取：用病毒RNA/DNA提取试剂盒(Takara的MiniBEST Viral RNADNA Extraction Kit)提取待测慢病毒样品的总DNA。具体步骤见试剂盒说明书。DNA稀释到200ng/μL和100ng/μL。(2)反转录反应(RT)：用反转录试剂盒(Takara PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time))，以total RNA为模板转录得到cDNA。具体步骤见试剂盒说明书。
(3)标准品的梯度稀释：根据以下公式，计算出载体质粒的初始标准品拷贝数/μL:
Figure BDA0001547489300000141
(4)通过梯度稀释制备组合中每一标准品的一系列不同拷贝数的稀释标准品，形成如下比例的不同标准品原料的系列稀释标准品组合
在一具体实施例中，将标准品在初始浓度基础上做如下梯度稀释
分别稀释到拷贝数为的108、107、106、105、104、103、102。
(5)qPCR：在Roche
Figure BDA0001547489300000151
96上进行待测样品和一系列
梯度稀释的标准品的qPCR，记录荧光值，反应结束后要测定溶解曲线。
反应体系为如表所示：
Figure BDA0001547489300000152
*：模板为质粒标准品或待测样品DNA。
反应条件为：
Figure BDA0001547489300000153
Figure BDA0001547489300000161
(5)数据分析，计算待测样品的拷贝数。
病毒拷贝数(Copies/ml)＝稀释系数(Dilution factor)×每毫升拷贝数(copies/ml)**
*：稀释系数Dilution factor＝(RNA体积(ul)/样本体积(ul))×(RT反应体积(ul)/RT反应的RNA体积(ul))×(1000ul/ml)/(qPCR-template体积(ul))
**：每毫升拷贝数copies number(copies/ml)：若样品原样和10倍稀释样都有Q-PCR结果(分别为Copies No.1和Copies No.2)，则取两者均值，即每毫升拷贝数(copies/ml))＝(Copies No.1+10Copies No.2)/2。
实施例2：实时荧光定量qPCR检测病毒整合到嵌合抗原受体T细胞的拷贝数的方法
检测病毒整合到T细胞的拷贝数的qPCR引物为SEQ ID No18～No 23。其中SEQ IDNo18～No21引物的模板为T细胞基因组，qPCR测定；SEQ ID No22-23引物对应的模板为T细胞RNA；要进行RT-qPCR。
具体步骤如下：
(1)模板DNA或RNA的提取：用病毒RNA/DNA提取试剂盒(Takara的MiniBEST ViralRNA DNA Extraction Kit)提取待测嵌合抗原受体T细胞样品的DNA或RNA，DNA或RNA样品各稀释到200ng/μL和100ng/μL。
(2)标准品的梯度稀释：根据以下公式，计算出载体质粒的初始标准品拷贝数/ul:
Figure BDA0001547489300000171
检测T细胞总拷贝数的标准品是自己构建的ALB gDNA-pUC57质粒或ALB mRNA-pUC57质粒。
通过梯度稀释制备一系列不同拷贝数的稀释标准品，拷贝数分别为108、107、106、105、104、103、102
(3)qPCR：适用于引物SEQ ID No18～No21。在Roche
Figure BDA0001547489300000172
96上进行待测样品和标准品(一系列梯度)的qPCR，反应结束后测定溶解曲线。
反应体系：
Figure BDA0001547489300000181
*：模板为标准品或待测样品DNA。
反应条件为：
Figure BDA0001547489300000182
Figure BDA0001547489300000191
(4)RT-qPCR适用于引物SEQ ID No18～No21。qPCR的模板为以RNA为模板的反转录(RT)产物，其他同(3)。RT反应采用反转录试剂盒(Takara的PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)进行，具体步骤参见相应产品的说明书。
(5)数据分析，计算拷贝数。
实施例3：实时荧光定量qPCR检测有复制能力的慢病毒拷贝数的方法
检测有复制能力的慢病毒拷贝数的qPCR引物为SEQ ID No24～No 27，引物位于包膜质粒的VSV-G。
具体步骤如下：
(1)模板DNA的提取：用病毒RNA/DNA提取试剂盒(Takara的MiniBEST Viral RNADNA Extraction Kit)提取待测样品的DNA。DNA稀释到200ng/ul和100ng/ul。
(2)标准品的梯度稀释：根据以下公式，计算出载体质粒的初始标准品拷贝数/μL
Figure BDA0001547489300000201
通过梯度稀释制备一系列不同拷贝数的稀释标准品，拷贝数分别为107、106、105、104、103、102、101
检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品是包膜质粒。
(3)qPCR：在Roche
Figure BDA0001547489300000203
96上进行待测样品和标准品(一系列梯度)的qPCR，反应结束后要测定溶解曲线。
反应体系：
Figure BDA0001547489300000202
*：模板为质粒标准品或待测样品DNA。
反应条件为：
Figure BDA0001547489300000211
(4)数据分析，计算拷贝数。
实施例4：实时荧光定量qPCR检测宿主细胞基因组DNA残留的方法
检测宿主细胞基因组DNA残留的qPCR引物为SEQ ID No28～No32，位于SV40大T抗原(SV40large T antigen)。
具体步骤如下：
(1)模板DNA的提取：用病毒RNA/DNA提取试剂盒(Takara的MiniBEST Viral RNADNA Extraction Kit)提取待测慢病毒样品的DNA。DNA稀释到200ng/ul和100ng/ul。
(2)标准品的梯度稀释：根据以下公式，计算出载体质粒的初
始标准品拷贝数/μL
Figure BDA0001547489300000221
通过梯度稀释制备一系列不同拷贝数的稀释标准品，拷贝数分别为107、106、105、104、103、102、101
检测慢病毒RNA总拷贝数的标准品是自己构建的SV40large
T-pUC57质粒。
(3)qPCR：在Roche
Figure BDA0001547489300000223
96上进行待测样品和标准品
(一系列梯度)的qPCR，反应结束后要测定溶解曲线。
反应体系：
Figure BDA0001547489300000222
Figure BDA0001547489300000231
*：模板为质粒标准品或待测样品DNA。反应条件为：
Figure BDA0001547489300000232
(4)数据分析，计算拷贝数。

Claims (1)

1.一种检测慢病毒质量指标组合的方法，包括步骤：
(一)针对慢病毒质量指标组合中各质量指标的特异性引物对组合的制备；
(二)标准曲线的制作；
(三)样品的测定；
(四)数据分析，计算各指标的拷贝数；
其特征在于，
所述慢病毒质量指标组合包括病毒RNA总拷贝数、T细胞总拷贝数、有复制能力的慢病毒拷贝数和宿主细胞基因组DNA残留；
所述步骤(二)标准曲线的制作包括步骤
1.准备针对病毒质量指标组中各指标的标准品原料；
2.根据以下公式，计算出标准品原料的初始拷贝数/μL：
Figure FDA0003086888110000011
3.通过梯度稀释制备组合中每一标准品的一系列不同拷贝数的稀释标准品，形成不同标准品原料的系列稀释标准品组合
4.各质量指标的标准曲线的制作：用特异性引物测定标准品的qPCR荧光数值，分别用各质量指标拷贝数的对数值为横坐标，用测定的所述标准品组合中各稀释度的标准品的qPCR荧光数值作为纵坐标制作标准曲线；
所述标准品原料组合包括检测病毒RNA总拷贝数的标准品、检测T细胞总拷贝数的标准品、检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品和检测宿主细基因组DNA残留的标准品；
所述检测病毒RNA总拷贝数的标准品来自载体质粒，所述检测有复制能力的慢病毒拷贝数的标准品来自包膜质粒,所述检测宿主细胞基因组DNA残留的标准品是SV40 Large T-pUC57质粒，所述检测T细胞总拷贝数的标准品包括携带部分ALB基因组序列的重组质粒ALBgDNA-pUC57质粒和ALB mRNA-pUC57,其中,所述质粒pUC57是携带人基因组中SV40大T抗原(SV40 large T antigen)的序列的重组pUC57载体；
所述样品的测定采用一步法实时荧光定量qPCR检测慢病毒质量的方法，包括步骤:
(1)模板DNA或RNA的提取；(2)测定和记录待测样品和一系列浓度梯度的标准品的qPCR荧光数值；(3)测定溶解曲线; (4)数值分析与计算。
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