CN108265117B - BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种BCR‑ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途,所述的候选参考物质制备时,先设计引物,采用分子克隆技术构建含有BCR‑ABL1融合基因e14a2亚型的重组质粒候选参考物质;经酶切电泳、测序验证后,实时荧光定量PCR进行均匀性和稳定性评价;评定测量不确定度。本发明制备了一种均匀、稳定的BCR‑ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质,可用于慢性粒细胞白血病BCR‑ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准,也可用于临床实验室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价,使不同临床实验室的检测结果具有可比性,促进临床检验的标准化。
Description
技术领域
本发明涉及一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的特征性分子标志物是由埃布尔森小鼠白血病病毒癌基因(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog1,ABL1)和断裂点簇集区(break point cluster region,BCR)易位形成的BCR-ABL1融合基因[1]。BCR基因不同的断裂位点产生了多种BCR-ABL1亚型,其中最常见是的e14a2亚型,由BCR的e14外显子和ABL1的外显子a2断裂形成[2]。近年来,应用分子生物学技术靶向检测BCR-ABL1为CML的诊断、治疗疗效以及微小残留病灶的动态监测提供了依据。
实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)是目前检测融合基因BCR-ABL1的常见方法,标准化的缺乏使实验室间检测结果存在较大差异。部分国内实验室通过自建质粒标准品(质控品)提高本实验室检测结果的质量。但是不同实验室引物设计的位置不同,导致该标准品仅能在各自实验室使用,且自建标准品的定值不够精准。还有一些实验室与国内权威实验室进行样本交换检测,获得转换因子(convert factor,CF)用于调整实验室的检测结果,这种做法在一定程度上促进了检测结果的一致化。但操作过程比较繁琐,且检测程序的改变可影响CF值。
参考物质是指适用于校准、对其他物质赋值或标称特性检查、具有一种或多种足够均匀和稳定特性的物质。狭义上,参考物质是使用有效程序提供一个或多个指定的特性值及其测量不确定度和溯源性的物质,可用于量值溯源和正确度评价,促进实验室检测的标准化。目前,我国尚无BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种均匀、稳定,并含有准确定值和测量不确定度结果的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型候质粒选参考物质及其制备方法和用途。
本发明的技术解决方案是:
一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质,其特征是:核苷酸序列为:
tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaaatacagcctgacggtg。
一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:包括下列步骤:
(1)用于扩增BCR-ABL1融合基因e14a2亚型基因的重组质粒引物:
上游引物:TGTCGGAGCAGGAGTCAC
下游引物:CACCGTCAGGCTGTATTT
(2)BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建:
TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA,逆转录成cDNA后扩增目的片段,经1%琼脂糖凝胶回收与pGEM-T Easy载体4℃过夜连接。连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞,涂于含X-gal和IPTG的LB固体培养基,LB固体培养基中含氨苄青霉素100ng/mL,37℃倒置培养12~16h;挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基,LB固体培养基中含氨苄青霉素100ng/mL,37℃过夜震荡培养后提取质粒,制备质粒候选参考物质;经酶切和测序验证;PCR扩增体系与条件:模板cDNA 2μL,10μmol/L的上下游引物各1μL,10mmol/L的dNTPs0.5μL,5U/ul的Taq酶0.2μL,25mmol/L的MgCl2 1.5μL,10×buffer 2.5μL,ddH2O 16.3μL,共25μL;反应条件:95℃预变性3min,95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环,最后72℃延伸10min。
所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证,验证方法:
(1)紫外分光光度法
应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、260nm、280nm的吸光度值A230、A260、A280,通过A260/A230、A260/A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度;质粒经紫外分光光度法测得A260/A230为2.37,A260/A280为1.80,质粒纯度良好;
(2)琼脂糖凝胶电泳法
将EcoRI、PstI酶切的质粒候选参考物质溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳,成像分析,酶切质粒电泳条带单一,无杂带,并无其他DNA、RNA污染。
所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度检测,检测方法:
回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质,用TE缓冲液作为空白对照,应用紫外/可见分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、320nm处吸光度值,根据公式(1)计算质粒候选参考物质溶液的拷贝数浓度:
Copynumber=(A260-A320)×50×NA/Mplasmid (1)
公式中50为双链DNA浓度的转换因子,ng/μL或μg/mL;NA为阿伏加德罗常数;Mplasmid为质粒分子的摩尔质量。
所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性检测,方法如下:
(1)标准曲线制作
将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108~102cp/μL系列,绘制RQ-PCR检测标准曲线,应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量;RQ-PCR反应体系和条件:质粒溶液2μL,10μmol/L上下游引物各0.6μL,10μmol/L探针0.4μL,2×Premix Ex Taq10μL,ddH2O 6.4μL,共20μL;95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸30s,45个循环;
其中上下游引物为:
上游引物:GGGCTCTATGGGTTTCTGAATG
下游引物:CGCTGAAGGGCTTTTGAACTC
探针:FAM-ATCGTCCACTCAGCCAC-MGB;
(2)均匀性分析
将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106cp/μL,分装-70℃保存;根据CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》随机抽取10管分装的质粒候选参考物质进行瓶间均匀性研究,应用RQ-PCR法测定,每管重复测量3次;瓶内均匀性:随机抽取一管质粒,从上层、离液面2~5mm的中间、管底分别吸取5次样本检测,每次2μL。测量结果应用方差分析统计;
(3)稳定性分析
采用同步稳定性研究设计,根据运输要求,将质粒候选参考物质4℃和20~25℃室温保存1、2、4、5天,-20℃保存1、2、3、4周后检测其浓度;每个温度每个时间段5管,每管测量3次。
所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定,方法如下:
BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度主要由三部分组成:质粒候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度、质粒候选参考物质的不均匀性引起的不确定度、质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度;其中浓度测量引入的不确定度分为A类评定和B类评定,A类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度,B类评定包括紫外可见分光光度计波长、比色杯内径的不确定度、摩尔消光系数、阿伏加德罗常数、质粒分子量引入的不确定度;均匀性分析中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb,因此不均匀性引入的不确定度根据公式计算14,n为测量次数,VMS组内为组内自由度;不稳定性引入的不确定度根据uits=s(b1)×t计算,s(b1)为斜率的标准偏差,t为监测时间;分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准不确定度,再乘以包含因子k,95%置信区间,k=2,得其扩展不确定度。
一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在慢性粒细胞白血病BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准中的应用。
一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在临床实验室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价中的应用。
本发明制备了一种均匀、稳定的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质。该候选参考物质可用于慢性粒细胞白血病BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准,也可用于临床实验室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价,使不同临床实验室的检测结果具有可比性,促进临床检验的标准化。BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀、稳定,并含有准确定值和测量不确定度结果。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是BCR-ABL融合基因e14a2亚型候选参考物质的不确定度分量示意图。
图2是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型PCR产物电泳图。
图3是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质酶切电泳图;其中a.1泳道为DL5000 DNA maker,2泳道为质粒候选参考物质经EcoRI酶切后的片段(大片段为T-easy空载体,小片段为BCR-ABL1目的片段,1074bp(加酶切位点))。b.BCR-ABL1融合基因质粒候选参考物质经PstI酶切电泳图,1泳道为DL5000 DNA maker,2为质粒PstI酶切后的片段(4070bp)。
图4是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测序的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型目的片段测序比对图。
图5是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测序的BCR-ABL1目的片段测序峰图。方框中为上下游引物位点。
图6是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒标准品的标准曲线.
图7是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒标准品均匀性扩增曲线。
具体实施方式
一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质,核苷酸序列为:
tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaaatacagcctgacggtg。
按照下述方法制备BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质
材料和方法:
2.1试剂和仪器
TRIzol提取液(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒(美国Thermo FisherScientific公司),pGEM-T Easy vector、X-gal(美国Promega公司),Taq酶、LB肉汤、琼脂糖、IPTG(上海生工生物工程有限公司),Premix Ex Taq(日本Takara公司),感受态DH5α(北京全式金生物技术有限公司),胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(美国Omega公司),限制性内切酶EcoRI、PstI(美国New England Biolabs公司)。
PCR扩增仪(Bio-Rad PTC-200),RQ-PCR仪(Roche Cobas z 480),紫外/可见分光光度计(Hitachi U-3310),核酸蛋白分析仪(Hitachi U-0080D)
2.2引物设计
根据GenBank中BCR(NM_004327)和ABL1(NM_005157)的基因序列,应用Primer 6软件设计引物用于构建BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的重组质粒,引物序列覆盖目前绝大部分文献所报道以及国内外主要试剂盒的扩增区域。应用Beacon Designer7软件设计RQ-PCR法检测所用引物和探针以评价质粒均匀性和稳定性,引物序列见表1,并由上海生工生物工程有限公司合成。
表1 本发明所需的引物和探针序列
2.3 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建
TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA,逆转录成cDNA后扩增目的片段(引物序列见表1),经1%琼脂糖凝胶回收与pGEM-T Easy载体4℃过夜连接。连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞,涂于含X-gal和IPTG的LB固体培养基(含氨苄青霉素100ng/mL),37℃倒置培养12~16h,挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基(含氨苄青霉素100ng/mL)37℃过夜震荡培养后提取质粒,制备质粒候选参考物质。经酶切和测序验证。PCR扩增体系与条件:模板cDNA2μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,dNTPs(10mmol/L)0.5μL,Taq酶(5U/ul)0.2μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,10×buffer 2.5μL,ddH2O 16.3μL,共25μL。反应条件:95℃预变性3min,95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环,最后72℃延伸10min。
2.4 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证
2.4.1紫外分光光度法
应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、260nm、280nm的吸光度值A230、A260、A280,通过A260/A230、A260/A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度。高纯度DNAA260/A230应大于2.0,A260/A280应大于1.8。
2.4.2琼脂糖凝胶电泳法
将EcoRI、PstI酶切的质粒候选参考物质溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳,成像分析,观察有无杂带判断纯度。
2.5 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度检测
回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质,用TE缓冲液作为空白对照,应用紫外/可见分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、320nm处吸光度值,根据公式(1)计算质粒候选参考物质溶液的拷贝数浓度。
Copynumber=(A260-A320)×50×NA/Mplasmid (1)
公式中50为双链DNA浓度的转换因子(ng/μL或μg/mL),NA为阿伏加德罗常数,Mplasmid为质粒分子的摩尔质量。
2.6 BCR-ABL1e14a融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性研究
2.6.1标准曲线制作
将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108~102cp/μL系列,绘制RQ-PCR检测标准曲线,应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量。RQ-PCR反应体系和条件:质粒溶液2μL,上下游引物(10μmol/L)各0.6μL,探针(10μmol/L)0.4μL,2×Premix Ex Taq10μL,ddH2O 6.4μL,共20μL。95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸30s,45个循环。
2.6.2均匀性研究
将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106cp/μL,分装-70℃保存。根据CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》随机抽取10管分装的质粒候选参考物质进行瓶间均匀性研究,应用RQ-PCR法测定,每管重复测量3次。瓶内均匀性:随机抽取一管质粒,从上层、中间(离液面2~5mm)、管底分别吸取5次样本检测,每次2μL。测量结果应用方差分析统计。
2.6.3稳定性研究
采用同步稳定性研究设计,根据运输要求,将质粒候选参考物质4℃和室温(20~25℃)保存1、2、4、5天,-20℃保存1、2、3、4周后检测其浓度。每个温度每个时间段5管,每管测量3次。
2.7 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定
BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度(图1)主要由三部分组成:质粒候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度;质粒候选参考物质的不均匀性引起的不确定度;质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度。浓度测量引入的不确定度可分为A类评定和B类评定,A类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度,B类评定包括紫外可见分光光度计波长、比色杯内径的不确定度、摩尔消光系数、阿伏加德罗常数、质粒分子量引入的不确定度。均匀性研究中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb,因此不均匀性引入的不确定度根据公式计算,n为测量次数,VMS组内为组内自由度。不稳定性引入的不确定度根据uits=s(b1)×t计算,s(b1)为斜率的标准偏差,t为监测时间。分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准不确定度,再乘以包含因子k(95%置信区间,k=2)得其扩展不确定度。
结果:
3.1 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质构建
以BCR-ABL1forward+BCR-ABL1reverse为引物,扩增出1055bp目的片段(图2)。构建的质粒候选参考物质经EcoRI、PstI酶酶切验证(图3),同时送上海生工生物工程有限公司和华大基因测序公司测序,序列比对完全正确(图4)。
3.2 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型候选参考物质纯度验证
质粒经紫外分光光度法测得A260/A230为2.37,A260/A280为1.80,质粒纯度良好。同时,酶切质粒电泳条带单一,无杂带,并无其他DNA、RNA污染(图3)。
3.3 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型候选参考物质均匀性和稳定性研究
3.3.1均匀性研究
应用RQ-PCR绘制质粒候选参考物质标准曲线(图6),图7为质粒均匀性实验扩增曲线。SPSS 20方差分析结果显示瓶内、瓶间F检验值小于F临界值,质粒均匀性良好(表2)。瓶内均匀性结果组间均方小于组内均方,表明不存在瓶内不均匀性,因此不计入测量不确定度的评定。
表2 质粒候选参考物质均匀性统计结果
3.3.2稳定性研究
将不同温度的质粒候选参考物质进行浓度检测,应用线性模型进行稳定性评价,在自由度n-2=2,p=0.95时,t0.95,n-2=4.3,当|b1|<t0.95,n-2.s(b1),表明斜率不显著,未检测到不稳定性(表3)。
表3 短期稳定性研究统计结果
表中b1为稳定性线性模型中直线的斜率,b0为截距,s(b1)为斜率的标准偏差。
3.4 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度测定
应用紫外/可见分光光度计测定质粒候选参考物质的吸光度,经公式(1)计算其质量浓度为24.44ng/μL,拷贝数浓度为5.56×109copies/μL。
3.5 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定
各个分量的不确定度值见表4。
表4 不确定度各分量结果
3.6扩展不确定度
将各个分量合成相对标准不确定度为
Uc=6.194%
扩展不确定度,取k=2,
U=2×6.194%×5.56×106=0.69×106cp/ul
总结:
RQ-PCR法检测BCR-ABL1融合基因是CML临床诊断和治疗疗效监测的重要手段,但有研究表明同一样本在不同实验室检测结果可相差10倍,可比性差,因此检测标准化是目前面临的主要问题。
狭义的参考物质不同于通常所说的质控品和标准品,必须通过准确定值并赋予测量不确定度。可用于量值溯源和正确度评价,促进实验室检测的标准化。我国还未见国家级BCR-ABL1参考物质相关报道。
本发明构建的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质经测序验证序列完全正确,实验中阳性转化菌经二次平板分离再挑取单个菌落保证菌液的纯度;未监测到不均匀性和不稳定性。本发明采用的Hitachi U-3310紫外/可见分光光度计钬玻璃滤光片经中国计量科学研究院校准,波长和比色杯校准证书由江苏省南通市计量检定测试所提供,滤光片波长示值及透射比波长示值均已进行期间核查,移液器采用称重法用超纯水对其进行体积校准。这些保证了候选参考物质定值的准确性和可溯源性。本研究中测量不确定度的评定采用GUM法,计算影响测量不确定度的每个分量,最后根据不确定度传播律合成标准不确定度。稀释引入的不确定度为移液器的不确定度,均匀性和稳定性引入的不确定度评定根据CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,核酸常用的保存条件为-20℃,故稳定性不确定度评定选择-20℃。
本发明构建的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质序列覆盖目前绝大部分文献所报道以及国内外主要试剂盒的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型检测区域,质量浓度为24.44ng/uL,稀释后拷贝数浓度为5.56(±0.69)×106copies/μL,且均匀、稳定。可用于RQ-PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准,也可用于临床实验室RQ-PCR检测方法的性能评价,促进我国BCR-ABL1检测结果标准化。
Claims (7)
1.一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:包括以下步骤:
(1)用于扩增BCR-ABL1融合基因e14a2亚型基因的重组质粒引物:
上游引物:TGTCGGAGCAGGAGTCAC
下游引物:CACCGTCAGGCTGTATTT
(2)BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建:
TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA,逆转录成cDNA后扩增目的片段,经1%琼脂糖凝胶回收与pGEM-T Easy载体4℃过夜连接;连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞,涂于含X-gal和IPTG的LB固体培养基,LB固体培养基中含氨苄青霉素100ng/mL,37℃倒置培养12~16h;挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基,LB固体培养基中含氨苄青霉素100ng/mL,37℃过夜震荡培养后提取质粒,制备质粒候选参考物质;经酶切和测序验证;PCR扩增体系与条件:模板cDNA 2μL,10μmol/L的上下游引物各1μL,10mmol/L的dNTPs0.5μL,5U/μl的Taq酶0.2μL,25mmol/L的MgCl2 1.5μL,10×buffer 2.5μL,ddH2O 16.3μ L,共25μL;反应条件:95℃预变性3min,95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环,最后72℃延伸10min;
所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度、浓度、均匀性和稳定性、以及不确定度评定;
BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质核苷酸序列为:
tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaaatacagcctg acggtg。
2.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证,验证方法:
(1)紫外分光光度法
应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、260nm、280nm的吸光度值A230、A260、A280,通过A260/A230、A260/A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度;质粒经紫外分光光度法测得A260/A230为2.37,A260/A280为1.80,质粒纯度良好;
(2)琼脂糖凝胶电泳法
将EcoRI、PstI酶切的质粒候选参考物质溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳,成像分析,酶切质粒电泳条带单一,无杂带,并无其他DNA、RNA污染。
3.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度检测,检测方法:
回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质,用TE缓冲液作为空白对照,应用紫外/可见分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、320nm处吸光度值,根据公式(1)计算质粒候选参考物质溶液的拷贝数浓度:
Copynumber=(A260-A320)×50×NA/Mplasmid (1)
公式中50为双链DNA浓度的转换因子,ng/μL或μg/mL;NA为阿伏加德罗常数;Mplasmid为质粒分子的摩尔质量。
4.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性检测,方法如下:
(1)标准曲线制作
将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108~102cp/μL系列,绘制RQ-PCR检测标准曲线,应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量;RQ-PCR反应体系和条件:质粒溶液2μL,10μmol/L上下游引物各0.6μL,10μmol/L探针0.4μL,2×Premix Ex Taq 10μL,ddH2O 6.4μL,共20μL; 95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸30s,45个循环;
其中上下游引物为:
上游引物:GGGCTCTATGGGTTTCTGAATG
下游引物:CGCTGAAGGGCTTTTGAACTC
探针:FAM-ATCGTCCACTCAGCCAC-MGB;
(2)均匀性分析
将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106 cp/μL,分装-70℃保存;根据CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》随机抽取10管分装的质粒候选参考物质进行瓶间均匀性研究,应用RQ-PCR法测定,每管重复测量3次;瓶内均匀性:随机抽取一管质粒,从上层、离液面2~5mm的中间、管底分别吸取5次样本检测,每次2μL;测量结果应用方差分析统计;
(3)稳定性分析
采用同步稳定性研究设计,根据运输要求,将质粒候选参考物质4℃和20~25℃室温保存1、2、4、5天,-20℃保存1、2、3、4周后检测其浓度;每个温度每个时间段5管,每管测量3次。
5.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法,其特征是:所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定,方法如下:
BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度主要由三部分组成:质粒候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度、质粒候选参考物质的不均匀性引起的不确定度、质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度;其中浓度测量引入的不确定度分为A类评定和B类评定,A类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度,B类评定包括紫外可见分光光度计波长、比色杯内径的不确定度、摩尔消光系数、阿伏加德罗常数、质粒分子量引入的不确定度;均匀性分析中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb,因此不均匀性引入的不确定度根据公式计算,n为测量次数,VMS组内为组内自由度;不稳定性引入的不确定度根据uits=s(b1)×t计算,s(b1)为斜率的标准偏差,t 为监测时间;分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准不确定度,再乘以包含因子k,95%置信区间,k=2,得其扩展不确定度。
6.一种权利要求1所述的制备方法制备的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在慢性粒细胞白血病BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准中的应用。
7.一种权利要求1所述的制备方法制备的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在临床实验室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价中的应用。
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CN201810093324.2A CN108265117B (zh) | 2018-01-31 | 2018-01-31 | BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途 |
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Application publication date: 20180710 Assignee: MACCURA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: AFFILIATED HOSPITAL OF NANTONG University Contract record no.: X2024980011451 Denomination of invention: BCR-ABL1 fusion gene e14a2 subtype plasmid candidate reference material and its preparation method and application Granted publication date: 20200901 License type: Common License Record date: 20240808 |
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