CN110894524A - 一种快速制备基因突变参考品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速制备基因突变参考品的方法。本发明所述的制备方法可从高突变比例参考品仅采用一步即可稀释至目标所需的低突变比例参考品，无需对稀释得到的参考品进行突变比例验证，相对于常规方法，也无需先稀释出多个突变比例梯度然后再逐一验证，具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

Description

一种快速制备基因突变参考品的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种利用野生型基因组DNA和突变型DNA快速制备基因突变参考品的方法。

背景技术

在癌症治疗领域，多个基因所携带的特定突变型与癌症靶向治疗药物的疗效密切相关，因此基因突变检测具有重要的临床意义，基因突变检测技术也已得到广泛的应用。在基因突变检测技术的开发及验证过程中，均需要使用含有靶基因突变的参考品，用于检测试剂的开发及性能验证，其特征是尽可能模拟临床样本，含有不同的且已知的突变比例。

由于待检测的基因突变型常常种类繁多，而直接从临床中获取阳性样本的突变型种类大多仅为常见热点突变型且可用的量非常有限，难以提供来源稳定、满足源源不断需求的量的参考品，因此常通过分子克隆构建突变型质粒(其中含有的靶基因均为突变型)来实现任何所需的突变型序列。另外，由于参考品应尽可能模拟实际样本的基因构成，而质粒仅含有非常有限的基因(例如仅含有靶基因突变位点上下游的一部分序列)且无法涵盖整个基因组，因此常常通过混合基因组DNA和突变质粒的方式来制备基因突变参考品。

当使用突变质粒与基因组DNA混合制备突变参考品时，如果需要从较高突变比例参考品配制成较低突变比例参考品(突变比例指的是突变型靶基因占总的靶基因拷贝数的比例)，无法简单的按照两者的突变比例倍数来计算出稀释比例。具体来说，如果将分别含有80％、50％、40％、20％靶基因突变的参考品(均是通过突变质粒与野生型基因组DNA混合制备得到的)，分别与相同DNA质量浓度的野生型基因组DNA按1∶1的体积比例混合，得到的不是理想中的40％、25％、20％、10％突变比例的参考品，而是通过实测后发现得到的突变比例分别是66％、33％、25％、11％。

由此可见，为了得到目标所需的较低突变比例的参考品，常规方法是：将含有较高突变比例的参考品与不同比例的野生型基因组DNA分别混合，再将制备得到的一系列参考品一同进行突变比例的测定(通过数字PCR、高通量测序等)，然后找到突变比例符合需求的参考品。

目前对于基因突变参考品中的靶基因突变比例的精确测定，常用数字PCR、高通量测序等实现，且每个测定反应的费用均较高，因此，在按照常规方法制备突变参考品时，需要配制出多个梯度再逐一测定突变比例，此过程复杂、突变比例测定的样品较多导致验证过程长、验证费用高，从而大大制约了突变参考品的制备效率。如果为了节省费用而不对稀释得到的突变参考品的靶基因实际突变比例进行任何测定，则突变参考品的实际突变比例可能大大偏离预期，造成用这些参考品得到的实验结果失真。

鉴于此，目前亟需能够快速、简便、准确的制备基因突变参考品的方法。特提出本发明。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用野生型基因组DNA和突变型DNA快速制备基因突变参考品的方法，其包括以下步骤：

(1)从细胞系或临床样本中提取野生型基因组DNA；

(2)获取突变型DNA，可通过分子克隆技术构建含有靶基因突变序列的质粒(简称突变质粒，其中靶基因为100％突变型)并提取质粒DNA，或者，通过PCR获得含有靶基因突变序列的PCR产物(其中靶基因为100％突变型)并纯化PCR产物DNA；

(3)通过拷贝数估算，配制出所需DNA浓度的初始阳性参考品，其特征是突变比例较高(例如50％～90％)；

(4)通过数字PCR或高通量测序等技术测定初始阳性参考品中靶基因的实际突变比例(称为a，0＜a≤1)；

(5)将相同DNA浓度的初始阳性参考品与野生型基因组DNA按1∶Q的体积比混合，即可仅通过一步稀释得到目标所需的任意较低突变比例(称为b，0＜b＜a)的阳性参考品，其中Q＝(1/b-1)/(1/a-1)-1。

优选地，上述野生型基因组DNA是血浆游离DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明针对突变质粒、PCR产物(其中靶基因均为100％突变型)均适用，因此可根据需要，构建出含有任意所需突变序列的突变质粒，进而配制出含有任意所需突变型的参考品。

(2)本发明制备的突变参考品含有野生型DNA成分，可最大程度模拟实际临床DNA样本的特征，避免了当仅使用突变质粒和野生型质粒制备突变参考品时所造成的参考品与实际临床样本之间在序列构成等性质方面的差异。

(3)本发明采用了数字PCR或高通量测序等技术精确测定突变参考品中的靶基因突变比例，相对于仅进行理论估算的配制方式而言，本发明对参考品中实际突变比例的确定更加准确、客观。

(4)采用本发明，仅需针对较高突变比例的初始阳性参考品进行一次突变比例的测定，随后仅需采用一步，即可配制得到不超过初始阳性参考品的突变比例的任意较低突变比例的参考品，配制过程非常快速、简单，配制时间短。

(5)本发明所述的基因突变参考品配制方法，无需针对稀释后得到的较低突变比例的参考品再次进行突变比例的实际测定，相对于常规方法，省去了先制备出多个含有不同突变比例梯度的参考品然后再逐一对其突变比例进行测定的繁杂过程，具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

具体实施方式

一.获取野生型基因组DNA

可通过商品化试剂盒提取体外培养的细胞系或临床样本中的野生型基因组DNA，随后通过适当的方法(例如微量分光光度计、荧光染料法等)测定DNA的质量浓度。

二.获取突变型DNA

1.通过分子克隆技术构建含有靶基因突变序列的质粒(简称突变质粒，其中靶基因为100％突变型)并提取质粒DNA。质粒中的插入片段长度应满足后续测定参考品突变比例的数字PCR或高通量测序技术所需。

2.也可以选择通过PCR获得含有靶基因突变序列的PCR产物(其中靶基因为100％突变型)并纯化PCR产物DNA。PCR产物的长度应满足后续测定参考品突变比例的数字PCR或高通量测序技术所需。

3.通过适当的方法(例如微量分光光度计、荧光染料法等)测定质粒DNA或PCR产物DNA的质量浓度。

三.配制初始阳性参考品

1.根据拷贝数估算，配制出所需DNA质量浓度的、所含突变比例较高(例如50％～90％)的突变参考品，即初始阳性参考品。

2.拷贝数估算所用的参数包括：

(1)在野生型基因组DNA中，野生型靶基因含量约为330拷贝/ng。

(2)突变型DNA(质粒或PCR产物)中，突变型靶基因拷贝浓度(拷贝/μl)＝突变型DNA质量浓度/分子量×阿伏伽德罗常数。其中DNA质量浓度由上述流程测定，单位为g/μl；分子量可由质粒和PCR产物的碱基序列精确计算得到，单位为g/mol。

示例：如果需要配制出10ng/μl含50％靶基因突变的初始阳性参考品，则可将野生型基因组DNA稀释至20ng/μl，然后与一定浓度的突变型DNA按1∶1的体积比混合；所需突变型DNA浓度计算过程：由于突变比例为50％，所以突变型靶基因拷贝浓度＝野生型靶基因拷贝浓度＝10ng/μl×330拷贝/ng＝3300拷贝/μl＝突变型DNA质量浓度/分子量×阿伏伽德罗常数，再根据已知的分子量即可计算出配制所需的突变型DNA的质量浓度。

四.通过数字PCR或高通量测序等技术准确测定初始阳性参考品中靶基因的实际突变比例。

由于初始阳性参考品是根据理论估算的参数配制的，为了确保参考品突变比例的准确，可使用数字PCR或高通量测序等技术测定初始阳性参考品中靶基因的实际突变比例，称其为a，0＜a≤1。

五.配制出不超过初始阳性参考品突变比例的任意所需突变比例的阳性参考品

1.计算Q值

设目标所需参考品的突变比例为b，0＜b＜a，则Q＝(1/b-1)/(1/a-1)-1。

2.将初始阳性参考品与野生型基因组DNA稀释至相同的DNA质量浓度，随后按1∶Q的体积比混合两者，即可仅通过一步稀释得到目标所需的突变比例为b的阳性参考品。

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例

BRAF和KRAS基因突变参考品(突变比例为5％)的制备和验证

1.采用本发明所述的方法，将BRAF和KRAS基因均为野生型的细胞系(293T)基因组DNA，与分别含有BRAF或KRAS热点突变的质粒混合(突变型见下表)，制备出初始阳性参考品，通过NGS技术测定其中的靶基因突变比例，结果见下表。也可将基因组DNA通过超声仪(Covaris)制备成cfDNA。

2.采用本发明所述的方法，分别计算配制到5％突变比例的参考品所对应的Q值(见下表)。

3.按照计算出的Q值，分3个批次，分别独立制备出5％突变比例的参考品，再次用NGS技术验证参考品中的实际突变比例是否符合预期，结果见下表1。

表1：初始阳性参考品NGS实测突变比例、Q值及目标参考品实测突变比例

以上结果首先表明：当使用突变质粒与野生型DNA配制初始突变型样本并测得靶基因突变比例时，无法通过突变比例的倍数进行稀释比例的推算，例如，在此例中当初始突变比例为约80％时，不能通过与相同质量浓度的野生型DNA按照约16倍体积比例的稀释来得到预期5％的突变比例，而是需要通过(按照本发明方法)至少70倍的稀释(详见上表)方可得到实测为5％的突变比例。由此可见，在实际应用中，当使用突变质粒与野生型DNA配制初始突变型样本时，无法通过“从突变比例倍数来推算稀释比例”的方法配制出符合预期的较低突变比例的参考品。

以上结果同时表明按照本发明方法稀释后的突变参考品实测突变比例均在目标突变比例(5％)的±20％以内，表明采用本发明所述方法得到的突变参考品的突变比例准确性好，配制后无需再次通过NGS确认结果，相对于常规方法大大节省了验证所需的步骤和费用，且多批次独立配制参考品结果的重现性强，非常适合实际应用(例如配制量不足时可再次按Q值配制，配出后也无需通过NGS再次验证突变比例)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速制备基因突变参考品的方法，其包括以下步骤：

(1)从细胞系或临床样本中提取野生型基因组DNA；

(2)获取突变型DNA；

(3)通过拷贝数估算，配制出所需DNA浓度的初始阳性参考品；

(4)测定初始阳性参考品中靶基因的实际突变比例a；

(5)将相同DNA浓度的初始阳性参考品与野生型基因组DNA按1∶Q的体积比混合，获得所需的突变比例为b的阳性参考品，其中0＜b＜a，并且Q＝(1/b-1)/(1/a-1)-1。

2.权利要求1所述的方法，其中突变型DNA是通过如下方法获得的：通过分子克隆技术构建含有靶基因突变序列的质粒，并提取质粒DNA，其中靶基因为100％突变型。

3.权利要求1所述的方法，其中突变型DNA是通过如下方法获得的：通过PCR获得含有靶基因突变序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA，其中靶基因为100％突变型。

4.权利要求1所述的方法，其中野生型基因组DNA是血浆游离DNA。