CN110878333A - 一种制备基因突变参考品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备基因突变参考品的方法。本发明所述的制备方法首先将突变型和野生型基因组DNA按至少两种比例混合,测定配出的参考品的突变比例,计算拟合直线的斜率和截距;随后即可按照目标所需,配制出不超过初始突变型基因组DNA突变比例的任意突变比例的突变参考品,无需对稀释得到的参考品进行突变比例验证。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体的说,涉及一种利用突变型基因组DNA和野生型基因组DNA制备基因突变参考品的方法。
背景技术
在癌症治疗领域,多个基因所携带的特定突变型与癌症靶向治疗药物的疗效密切相关,因此基因突变检测具有重要的临床意义,基因突变检测技术也已得到广泛的应用。在基因突变检测技术的开发及验证过程中,均需要使用含有靶基因突变的参考品,用于检测试剂的开发及性能验证,其特征是尽可能模拟临床样本,含有不同的且已知的突变比例。
当使用分别从突变型和野生型临床样本或细胞系中提取出的基因组DNA进行混合,制备得到含有不同突变比例的突变型参考品时,需要对参考品的突变比例进行定量(突变比例指的是突变型靶基因占总的靶基因拷贝数的比例)。尤其是当突变型临床样本或细胞系中的靶基因拷贝数存在异常增加或减少时,如果需要从较高突变比例参考品配制成较低突变比例参考品,无法简单的按照两者的突变比例倍数来计算出稀释比例。
由此可见,为了得到目标所需的较低突变比例的参考品,常规方法是:将含有较高突变比例的参考品与不同比例的野生型基因组DNA分别混合,再将制备得到的一系列参考品一同进行突变比例的测定(通过数字PCR、高通量测序等),然后找到突变比例符合需求的参考品。
目前对于基因突变参考品中的靶基因突变比例的精确测定,常用数字PCR、高通量测序等实现,且每个测定反应的费用均较高,因此,在按照常规方法制备突变参考品时,需要配制出多个梯度再逐一测定突变比例,此过程复杂、突变比例测定的样品较多导致验证过程长、验证费用高,从而大大制约了突变参考品的制备效率。如果为了节省费用而不对稀释得到的突变参考品的靶基因实际突变比例进行任何测定,则突变参考品的实际突变比例可能大大偏离预期,造成用这些参考品得到的实验结果失真。
鉴于此,目前亟需能够快速、简便、准确的制备基因突变参考品的方法。特提出本发明。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种利用突变型基因组DNA和野生型基因组DNA制备基因突变参考品的方法,其包括以下步骤:
(1)从细胞系或临床样本中提取初始突变型基因组DNA、野生型基因组DNA,稀释至相同的目标质量浓度;
(2)将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R(R≥0)的体积比例混合,R至少取两个不同的值,分别对应配出至少两例待测参考品;
(3)通过数字PCR或高通量测序等技术测定上述至少两例待测参考品中靶基因的实际突变比例(称为a,0<a≤1);
(4)将上述至少两对R和1/a的数值分别作为自变量和因变量,通过常规方法(包括常用软件)计算得到两者拟合直线的斜率(s)和截距(n);
(5)将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R的体积比例混合,即可仅通过一步稀释制备出不超过初始突变型基因组DNA突变比例的任意靶基因突变比例(称为b)的参考品,其中R=(1/b-n)/s。
本发明所述的方法也适用于突变型DNA和野生型DNA均是血浆游离DNA(cell freeDNA)的情况。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明针对基因组DNA(gDNA)、血浆游离DNA(cell free DNA)均适用。
(2)本发明制备的突变参考品含有基因组DNA成分,可最大程度模拟实际临床DNA样本的特征,避免了参考品与实际临床样本之间在序列构成等性质方面的差异。
(3)本发明采用了数字PCR或高通量测序等技术精确测定突变参考品中的靶基因突变比例,相对于仅进行理论估算的配制方式而言,本发明对参考品中实际突变比例的确定更加准确、客观。
(4)采用本发明,仅需针对最少两例参考品进行突变比例的测定,随后仅需采用一步,即可配制得到不超过初始突变型参考品的突变比例的任意较低突变比例的参考品,配制过程非常快速、简单,配制时间短。
(5)本发明所述的基因突变参考品配制方法,无需针对稀释后得到的较低突变比例的参考品再次进行突变比例的实际测定,相对于常规方法,省去了先制备出多个含有不同突变比例梯度的参考品然后再逐一对其突变比例进行测定的繁杂过程,具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。
具体实施方式
一.获取突变型基因组DNA和野生型基因组DNA
可通过商品化试剂盒提取体外培养的细胞系或临床样本中的突变型基因组DNA(其中靶基因突变比例无需达到100%)、野生型基因组DNA,随后通过适当的方法(例如微量分光光度计、荧光染料法等)测定DNA的质量浓度,并稀释至相同的目标质量浓度。
二.配制待测参考品
将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R(R≥0)的体积比例混合,R至少取两个不同的值,分别对应配出至少两例待测参考品。例如R分别取1、4,则分别将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶1、1∶4的体积比例混合,得到两例待测参考品。如果R取值为0,则直接将初始突变型基因组DNA作为待测参考品。
三.通过数字PCR或高通量测序等技术测定上述至少两例待测参考品中靶基因的实际突变比例。
由于初始突变型参考品中的靶基因突变比例未知、突变型参考品中靶基因的拷贝数是否发生异常增加或减少也是未知的,所以为了确保后续配出的参考品突变比例的准确,使用数字PCR或高通量测序等技术测定上述至少两例初始突变型参考品中靶基因的实际突变比例,称其为a,0<a≤1。
四.将上述至少两对R和1/a的数值分别作为自变量和因变量,通过常规方法(包括常用软件,例如excel)计算得到两者拟合直线的斜率(s)和截距(n)。
五.配制出不超过初始突变型参考品突变比例的任意目标所需突变比例的阳性参考品
将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R的体积比例混合,即可仅通过一步稀释制备出不超过初始突变型基因组DNA突变比例的任意靶基因突变比例(称为b)的参考品,其中R=(1/b-n)/s。
下面结合具体实施例,对本发明进一步阐述。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照本领域技术人员熟知的常规条件,或者按照制造厂商建议的条件。
实施例
EGFR基因突变参考品(突变比例为1%)的制备和验证
1.采用本发明所述的方法,提取肺癌细胞系H1975(含EGFR基因L858R突变,且EGFR存在基因扩增)、肺癌细胞系H1650(含EGFR基因19外显子缺失突变,简称19del,且EGFR存在基因扩增)、293T细胞系(其中EGFR基因为野生型)的基因组DNA(gDNA),也可将基因组DNA通过超声仪(Covaris)制备成cfDNA。分别取R=0、R=4各配制两例待检参考品,通过NGS技术测定其中的靶基因突变比例,结果见下表。
2.采用本发明所述的方法,分别计算配制到1%突变比例的gDNA或cfDNA参考品所对应的R值(见下表)。
3.按照上表计算出的R值,分3个批次,分别独立制备出1%突变比例的参考品,再次用NGS技术验证参考品中的实际突变比例是否符合预期,结果见下表。
以上结果首先表明:由于癌细胞系存在异质性,并非单克隆,因此初始突变比例不一定是100%,例如在此例中当R=0时,测定的即为癌细胞系自身携带的靶基因突变比例,在60%~80%,不能按100%进行理论推算;其次,当初始突变型样本的靶基因突变比例已知但靶基因存在基因拷贝数异常(例如此例中均是发生基因扩增,即靶基因拷贝数异常增加)时,无法通过突变比例的倍数进行稀释比例的推算,例如,在此例中当初始突变比例为75.8%时,不能通过与相同质量浓度的野生型DNA按照75.8倍体积比例的稀释来得到预期1%的突变比例,而是需要通过(按照本发明方法)197.4倍的稀释方可得到实测为1%的突变比例。在实际应用中,初始突变型样本的靶基因突变比例及靶基因是否存在拷贝数异常均是无法通过理论推算而得到的;即使初始突变型样本的靶基因突变比例已通过实测得到,但如果不将靶基因是否存在拷贝数异常的信息纳入考虑,则也无法通过“从突变比例倍数来推算稀释比例”的方法配制出符合预期的较低突变比例的参考品。
以上结果同时表明:通过本发明方法稀释得到的突变参考品实测突变比例在0.89%~1.29%之间,均在目标突变比例(1%)的±30%以内,表明采用本发明所述方法得到的突变参考品的突变比例准确性好,配制后无需再次通过NGS确认结果,相对于常规方法大大节省了验证所需的步骤和费用,且多批次独立配制参考品结果的重现性强,非常适合实际应用(例如配制量不足时可再次按R值配制,配出后也无需通过NGS再次验证突变比例)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种制备基因突变参考品的方法,其包括以下步骤:
(1)从细胞系或临床样本中提取初始突变型基因组DNA、野生型基因组DNA,稀释至相同的目标质量浓度;
(2)将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R的体积比例混合,其中R≥0,并且至少取两个不同的值,分别对应配出至少两例待测参考品;
(3)测定上述至少两例待测参考品中靶基因的实际突变比例a;
(4)将上述至少两对R和1/a的数值分别作为自变量和因变量,计算得到两者拟合直线的斜率s和截距n;
(5)将相同DNA质量浓度的初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA按1∶R的体积比例混合,获得所需的靶基因突变比例为b的基因突变参考品,其中基因突变比例b不超过初始突变型基因组的DNA突变比例,并且R=(1/b-n)/s。
2.权利要求1所述的方法,其中突变型基因组DNA和野生型基因组DNA均是血浆游离DNA。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111718979A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-09-29 | 嘉兴雅康博医学检验所有限公司 | 基因扩增参考品及其应用 |
CN114134217A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-03-04 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种配制检出限样本和企业参考品的方法、系统及设备 |
CN115404266A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-29 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种基于人源细胞的不同突变率标准品制备方法 |
CN116355991A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-06-30 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 一种用于检测点突变、插入和缺失突变的rna参考品及其制备方法与应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009051842A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | The Johns Hopkins University | Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna |
CN103451268A (zh) * | 2012-05-31 | 2013-12-18 | 上海市儿童医院 | 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法 |
CN109628595A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-16 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009051842A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | The Johns Hopkins University | Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna |
CN103451268A (zh) * | 2012-05-31 | 2013-12-18 | 上海市儿童医院 | 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法 |
CN109628595A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-16 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
鲍芸等: "CYP3A5基因检测质控品制备及其应用研究" * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111718979A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-09-29 | 嘉兴雅康博医学检验所有限公司 | 基因扩增参考品及其应用 |
CN111718979B (zh) * | 2020-07-24 | 2021-03-23 | 嘉兴雅康博医学检验所有限公司 | 基因扩增参考品及其应用 |
CN114134217A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-03-04 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种配制检出限样本和企业参考品的方法、系统及设备 |
CN115404266A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-29 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种基于人源细胞的不同突变率标准品制备方法 |
CN115404266B (zh) * | 2022-09-29 | 2023-08-11 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种基于人源细胞的不同突变率标准品制备方法 |
CN116355991A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-06-30 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 一种用于检测点突变、插入和缺失突变的rna参考品及其制备方法与应用 |
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