CN117434044B - 一种pcr仪荧光串扰系数标定方法及装置与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PCR仪荧光串扰系数标定方法及装置与应用。本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法包括：提供染料标定板，其包括多个装载不同浓度目标荧光染料体系的反应管；运行PCR扩增程序，采集对应目标荧光染料的光学通道以及非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据；消除背景值；获取目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，从而对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定。本发明只需将荧光染料标定板放置在待标定的荧光定量PCR仪，便可以自动准确地完成对该台仪器的多个光学通道的串扰系数标定。
Description
技术领域
本发明是关于一种PCR仪荧光串扰系数标定技术，具体而言，是关于一种多通道PCR仪荧光串扰系数标定方法及装置、实时荧光定量PCR方法与相关应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种根据DNA半保留复制原理在体外扩增待测样本中特定核酸片段的分子生物学技术，实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR）是在PCR反应体系中针对一种特定核酸片段加入一种报告基团，当特定核酸片段每经历一个反应循环（也就是经历一次复制后）报告基团发出的荧光信号强度就会增强一次，荧光定量PCR仪的光学通道可以通过检测待测样本每个反应循环后的荧光信号强度变化，实现对反应产物量变化的实时监测，并生成反应上述关系的扩增曲线图，如图1所示，图中横坐标代表反应循环数，纵坐标代表荧光信号强度，光学通道通常与报告基团为一一对应关系，当实时荧光定量聚合酶链式反应结束时，根据光学通道是否有生成扩增曲线可以判断待测样本中是否有对应的核酸片段。
多重核酸检测技术是在同一个PCR反应体系中同时加入多种报告基团，对待测样本的多个不同的特定核酸片段分别进行扩增产物量变化的监测。多通道荧光定量PCR仪是实现多种扩增产物量变化监测的重要仪器，多通道荧光定量PCR仪是指装载有多个不同光学通道的荧光定量PCR仪。
多重核酸检测技术要求qPCR反应体系单管内能兼容更多的报告基团，由于常用的报告基团波长差距小，因此不同的光学通道有可能对同一个报告基团实现荧光激发，使其发出荧光信号并被光学通道检测到。因而在使用多通道荧光定量PCR仪检测时常常存在荧光串扰问题，即便是qPCR反应体系单管内仅容有一种报告基团，当不同光学通道去对qPCR反应体系单管检测时，因为荧光串扰问题会生成多条扩增曲线，致使检测结果判定为该qPCR反应体系单管内容有多种报告基团，也就是有多种核酸片段，待测样本定性、定量结果出现不准确的状况。荧光串扰问题是一个不可避免的问题，目前无法通过仪器结构的改进设计完全解决该问题。
因此，目前需要改进多重核酸检测技术，以提供正确的检测结果，或者说是提供正确的扩增曲线图，帮助用户产生正确的判定结论。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种PCR仪荧光串扰系数标定方法。
本发明的另一目的在于提供一种PCR仪荧光串扰系数标定装置。
本发明的另一目的在于提供一种实时荧光定量PCR方法。
本发明的另一目的在于提供一种实时荧光定量PCR数据处理装置。
本发明提供的PCR仪荧光串扰系数标定方法，可以在荧光定量PCR仪投入使用前计算目标基团对其他串扰通道的串扰系数并将串扰系数标定在荧光定量PCR仪中形成串扰算法，在荧光定量PCR仪投入使用后，串扰通道接收的荧光信号值是将真实荧光信号值代入串扰算法计算得出的处理荧光信号值，从而将串扰通道的扩增曲线消除，保证最终呈现给用户的扩增曲线是准确的，帮助用户做出正确的结果判定。
具体而言，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PCR仪荧光串扰系数标定方法，该方法是用于标定目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，所述方法包括：
提供染料标定板，所述染料标定板包括至少一种目标荧光染料体系区，每种目标荧光染料体系区包括至少一组目标荧光染料体系组，每组目标荧光染料体系组包括多个装载不同浓度目标荧光染料体系的反应管，其中，多个所述反应管中的一个所述反应管被配置为背景管，所述背景管装载浓度为零的目标荧光染料体系；装载浓度不为零的目标荧光染料体系的反应管为标定管；
对染料标定板的反应管运行PCR扩增程序，分别采集标定管及背景管的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据以及非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据；
将采集的标定管的荧光信号数据消除背景值；
以消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，从而对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定。
本发明中，除特别说明外，所述目标荧光染料意指作为标定标的的荧光染料，所述非目标荧光染料光学通道意指待标定串扰系数的光学通道。例如，所述的方法用于标定VIC荧光染料对PCR仪的FAM光学通道的荧光串扰系数时，VIC荧光染料即为目标荧光染料，FAM光学通道即为非目标荧光染料光学通道，相应地，PCR仪的VIC光学通道即为对应目标荧光染料的光学通道。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述PCR仪包括至少一个对应目标荧光染料的光学通道以及至少一个非目标荧光染料光学通道。在一些具体实施例中，所述PCR仪可包括2个或3-6个非目标荧光染料光学通道，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法可同时标定目标荧光染料对多个非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述每组目标荧光染料体系组包括装载至少两种不同浓度目标荧光染料体系的标定管，所述以消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，从而对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定的过程包括：对于每个浓度目标荧光染料体系的标定管分别获得消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值数据，以多个比值数据的均值作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数K。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述每组目标荧光染料体系组包括装载至少两种、至少3种或至少4种浓度目标荧光染料体系的标定管。作为一些更优选的实施方案，所述每组目标荧光染料体系组包括装载5-10种浓度目标荧光染料体系的标定管。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，每组目标荧光染料体系组所包括的装载不同浓度目标荧光染料体系的标定管，其中最高浓度的体系中目标荧光染料被激发产生的荧光被对应目标荧光染料的光学通道接收到的荧光值为3000-30000。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，多个不同浓度目标荧光染料体系的标定管，其中目标荧光染料的浓度可分散（例如按含量比例分散，或是梯度分散）在零至最高浓度之间。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，各反应管的目标荧光染料体系采用qPCR预混液添加或不添加目标荧光染料制备而成。所述的qPCR预混液包括但不限于TaqMan Mix，可以是自行配制的常规PCR反应体系溶液，也可以是商购的PCR反应体系溶液。每个反应管的目标荧光染料体中的目标荧光染料包括但不限于FAM、VIC、ROX、CY5、CY3、TAMRA中的任意一种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述目标荧光染料体系中还可根据需要含有凝胶物质。所述凝胶物质可用于维持荧光染料在体系中的分散均匀性。可以理解，凝胶物质的种类选择应不与本发明的荧光染料发生化学反应，仅仅是物理混合。例如，所述凝胶物质可包括但不限于明胶、卡拉胶和结冷胶中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述目标荧光染料体系中还可根据需要含有石墨粉。加入适量的石墨粉可以降低荧光染料的荧光信号强度，避免荧光染料本身荧光信号强度超出荧光定量PCR仪的光学通道的工作范围，致使光学通道失灵，无法采集到准确的荧光信号。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述染料标定板包括两种或更多种目标荧光染料体系区。多种目标荧光染料体系区的目标荧光染料种类可相同或不同。根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述染料标定板的每种目标荧光染料体系区可包括两组或更多目标荧光染料体系组。多组目标荧光染料体系组的目标荧光染料种类可相同或不同。当多种目标荧光染料体系区的目标荧光染料种类和/或多组目标荧光染料体系组的目标荧光染料种类相同时，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法可将相同种类相同浓度目标荧光染料的多个反应管作为平行实验管，所获取的荧光信号数据可以是多个平行实验管数据的平均值。当多种目标荧光染料体系区的目标荧光染料种类和/或多组目标荧光染料体系组的目标荧光染料种类存在两种或更多种时，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法可用于分别标定两种或更多种荧光染料对PCR仪的非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，所述染料标定板可配置一个背景管，也可配置多个背景管作为平行管。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法，还包括确定荧光串扰关系式的过程，该过程包括：
以同一浓度目标荧光染料体系的标定管的消除背景值后的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据为横坐标，以非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据为纵坐标，利用多个浓度目标荧光染料体系的数据，在坐标系中进行最小二乘法拟合生成拟合曲线，获得拟合曲线的关系式：Y=K´×X+b，并令K´取值等于本发明所述的目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数K，从而确定荧光串扰关系式为Y=K×X+b。
在本发明的一些优选实施方案中，确定荧光串扰关系式的过程中包括利用至少2个、至少3个、至少4个或5-10个（例如5、6、7、8、9或10个）不同浓度目标荧光染料体系的数据。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，运行PCR扩增程序时，PCR扩增反应循环数大于等于20，对于同一反应管，采集PCR扩增时多个循环点的荧光信号求取平均值作为该反应管对应的荧光信号数据。在本发明的一些优选实施方案中，PCR扩增反应循环数为30-80，更优选为30-50。可采集每个循环数的荧光信号求取平均值，也可采取间接几个循环数例如每2个循环数、每3个循环数、每4个循环数或是每5个循环数等的荧光信号求取平均值。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法中，每种目标荧光染料体系区包括两组及以上的目标荧光染料体系组，将每组中同一浓度的目标荧光染料体系的反应管的荧光信号数据求取均值作为该浓度的目标荧光染料体系的荧光信号数据。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种实时荧光定量PCR方法，所述方法包括利用PCR仪运行PCR扩增程序的过程，其中所述PCR仪采用如本发明所述的方法进行了荧光串扰系数标定。
根据本发明的具体实施方案，本发明的实时荧光定量PCR方法，运行PCR扩增程序的过程中，非目标荧光染料光学通道接收到的荧光值为经过串扰算法处理后的荧光值Y´，其中，所述串扰算法为Y´=Fm-K×(Vm-VN）-b，其中：
Fm为非目标荧光染料光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
Vm为对应目标荧光染料的光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
VN为反应循环数为0时对应目标荧光染料的光学通道接收到的真实荧光值，
K为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，
b为前述确定的荧光串扰关系式Y=K×X+b中的常数。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种能用于实现本发明所述的PCR仪荧光串扰系数标定方法的染料标定板，所述染料标定板包括至少一种目标荧光染料体系区，每种目标荧光染料体系区包括至少一组目标荧光染料体系组，每组目标荧光染料体系组包括多个装载不同浓度目标荧光染料体系的反应管，其中至少一个所述反应管被配置为背景管，所述背景管装载浓度为零的目标荧光染料体系。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的染料标定板，包括至少2个、至少3各、至少4个、至少5个或至少6个目标荧光染料体系区。多个目标荧光染料体系区可作为平行实验反应。或者，各目标荧光染料体系区可各自独立地对应不同种类目标荧光染料，该染料标定板可用于标定两种或更多种荧光染料对PCR仪的非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的染料标定板，每种目标荧光染料体系区包括至少2组、至少3组、至少4组或至少5组或至少6组目标荧光染料体系组。多个目标荧光染料体系组可作为平行实验反应。或者，各目标荧光染料体系组可各自独立地对应不同种类目标荧光染料，此方案的染料标定板可用于标定两种或更多种荧光染料对PCR仪的非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的染料标定板，每组目标荧光染料体系组包括装载至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同浓度目标荧光染料体系的标定管，对于每个浓度目标荧光染料体系的标定管分别获得消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值数据，以多个比值数据的均值作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数K。优选地，多个不同浓度目标荧光染料体系的标定管可以按照其中目标荧光染料浓度大小依序排列。本发明种对相邻浓度管之间的浓度差不要求特别规律限定，不必须按照PCR扩增反应中不同反应循环数下对应的荧光染料浓度进行设定，可以按照任意规律进行递减设定。也可以模拟在PCR扩增反应中不同反应循环数下对应的荧光染料浓度进行设定，浓度越高代表反应循环数越大。优选地，控制其中最高浓度的体系中目标荧光染料被激发产生的荧光被对应目标荧光染料的光学通道接收到的荧光值为3000-30000。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PCR仪荧光串扰系数标定装置，所述装置包括：
数据获取模块，用于获取染料标定板的反应管运行PCR扩增程序的数据；其中所述数据为本发明中所述的标定管及背景管的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据以及非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据；
消除背景数据模块，用于将标定管的荧光信号数据消除背景值；
荧光串扰系数计算模块，用于计算消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数；
荧光串扰系数标定模块，用于以所述的目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定装置中，荧光串扰系数标定模块对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定时，采用串扰算法使得非目标荧光染料光学通道接收到的荧光值为经过串扰算法处理后的荧光值Y´；
其中，所述串扰算法为Y´=Fm-K×(Vm-VN）-b，其中：
Fm为非目标荧光染料光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
Vm为对应目标荧光染料的光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
VN为反应循环数为0时对应目标荧光染料的光学通道接收到的真实荧光值，
K为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，
b为前述确定的荧光串扰关系式Y=K×X+b中的常数。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种计算机设备，其包括：存储器和处理器，所述存储器和所述处理器之间互相通信连接，所述存储器中存储有计算机指令，所述处理器通过执行所述计算机指令，从而执行本发明所述的PCR仪荧光串扰系数标定方法和/或实时荧光定量PCR方法。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种非暂态计算机可读存储介质，所述非暂态计算机可读存储介质存储有计算机指令，所述计算机指令被处理器执行时实现本发明所述的PCR仪荧光串扰系数标定方法和/或实时荧光定量PCR方法。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机指令，所述计算机指令被处理器执行时实现本发明所述的PCR仪荧光串扰系数标定方法和/或实时荧光定量PCR方法。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的PCR仪荧光串扰系数标定方法包括：
S1：制备染料标定板
1）使用TaqMan Mix稀释1种荧光染料（FAM、VIC、ROX、CY5、CY3、TAMRA任意一个）作为目标荧光染料，按照一定比例加TaqMan Mix（模拟真实的实验环境）依次稀释，稀释N个浓度，编号为管1至管N，管1至管N的浓度依次递减，管N浓度为0仅含有TaqMan Mix，N≥5；（以下以FAM荧光染料作为目标荧光染料进行说明）
2）在管1至管N中依次加入适量的凝胶体；凝胶体为任何可呈凝胶状且不与荧光染料发生化学反应的物质，例如明胶、卡拉胶和结冷胶中的至少一种；
3）将步骤2）中的管1至管N放置在振荡混匀器上进行混匀，以使荧光染料均匀分散并固定在管1至管N的混合体系中（即荧光染料、TaqMan Mix和凝胶体的混合体），荧光染料均匀分散在混合体系中，当荧光定量PCR仪的光学通道采集管内荧光信号时采集结果会更准确；
4）在步骤3)的管1至管N中分别加入适量的石墨粉再次在振荡混匀器上进行振荡混匀，以将石墨粉分散在管1至管N的混合体系中，完成染料标定板的制备。本发明中，加入石墨粉可以降低荧光染料的荧光信号强度，避免荧光染料本身荧光信号强度超出荧光定量PCR仪的光学通道的工作范围。
S2：使用染料标定板进行荧光定量PCR仪的串扰系数标定
5）将染料标定板放置在待标定的荧光定量PCR仪上，运行PCR扩增程序，PCR扩增程序可按表1所示执行，在PCR扩增程序运行过程中，每个反应循环中FAM光学通道（对应目标荧光染料的光学通道）、VIC光学通道（非目标荧光染料光学通道）、CY5光学通道（非目标荧光染料光学通道）等光学通道均对管1至管N采集一次荧光信号，总共30个反应循环（也可以更多或更少），FAM光学通道对管1至管N分别采集了30个荧光信号值，VIC光学通道对管1至管N分别采集了30个荧光信号值，CY5光学通道对管1至管N分别采集了30个荧光信号值，其他光学通道也对管1至管N分别采集了30个荧光信号值；
6）FAM光学通道采集的荧光信号值处理，FAM光学通道采集管1的30个荧光信号值求取平均值，记作F1，同理，FAM光学通道采集管2至管N的30个荧光信号值求取平均值，记作F2～FN；VIC光学通道、CY5光学通道、其他光学通道采集的荧光信号值均作如FAM通道同样的处理，分别记作V1～VN，C1～CN，……；
7）消除背景值，得出下列数组：
数组1：XFN1=F1-FN，XFN2=F2-FN，XFN3=F3-FN，XFN4=F4-FN，……，XFN（N-1)=FN-1-FN；
数组2：YVN1=V1-VN，YVN2=V2-VN，YVN3=V3-VN，YVN4=V4-VN，……，YVN（N-1)=VN-1-VN；
数组3：YCN1=C1-CN，YCN2=C2-CN，YCN3=C3-CN，YCN4=C4-CN，……，YCN（N-1)=CN-1-CN；
8）以消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数。具体地，例如，使用数组2的数据分别除以数组1对应同一管的数据得到FAM荧光染料对VIC光学通道的荧光串扰系数。具体为：
8.1）YVN1÷XFN1=K1，YVN2÷XFN2=K2，YVN3÷XFN3=K3，YVN4÷XFN4=K4，……YVN（N-1)÷XFN（N-1)=KN-1得到处理后的数组（K1，K2，K3，K4，……，KN-1)；
8.2）对上述数组（K1，K2，K3，K4，……，KN-1)求取平均值，得出KFV，KFV即为FAM荧光染料对VIC光学通道的荧光串扰系数；
8.3）进一步，可在坐标系中对点（XFN1，YVN1)、（XFN2，YVN2)、（XFN3，YVN3)、（XFN4，YVN4)、……、（XFN（N-），YVN（N-1）)进行最小二乘法拟合生成拟合曲线，并计算出拟合曲线的关系式YVN=K´×XFN+b，令K´=KFV确定荧光串扰关系式YVN=KFV´×XFN+b；
9）同理，对数组1和数组3作如步骤8）的处理，得出KFC，KFC即为FAM荧光染料对CY5光学通道的荧光串扰系数。
表1、PCR扩增程序
此外，在步骤1）中可以制备多组管1至管N，每组管1至管N均进行步骤2）-步骤6）的处理，在步骤6）之后、步骤7）之前增加步骤6.1)，步骤6.1）为：
多组管1至管N会产生多个F1～FN，多个F1取平均值作为最终的F1，同理得出F2～FN，V1～VN，C1～CN，……，这样可进一步提升串扰系数的精准度。
如上示例性介绍了FAM荧光染料在VIC光学通道和CY5光学通道内的串扰系数标定，同理可以进行FAM荧光染料对任意光学通道的串扰系数标定。同理还可以进行其他荧光染料对任意光学通道的串扰系数标定。
本发明的荧光串扰系数标定方法，可以适用在任何一台荧光定量PCR仪上，操作者只需将包含一种或多种荧光染料的荧光染料标定板放置在待标定的荧光定量PCR仪，便可以自动准确地完成对该台仪器的多个光学通道的串扰系数标定。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的实时荧光定量PCR方法，利用完成串扰系数标定后的荧光定量PCR仪，再次对仅含有目标荧光染料报告基团的PCR扩增体系运行PCR扩增反应，并通过多个光学通道分别监测PCR扩增产物量变化时，仅有目标荧光染料光学通道会生成扩增曲线，非目标荧光染料光学通道（也就是串扰光学通道）不会生成扩增曲线。因为串扰光学通道每个反应循环接收到的荧光值Y是均已经经过串扰算法处理后的处理荧光值，均为同一值，因此会生成一条直线而非扩增曲线。
本发明中，当目标荧光染料对串扰光学通道存在串扰时，串扰光学通道接收到的荧光值会随目标荧光染料的浓度变化而变化，同时呈现正相关变化，例如，上述实施例中FAM 荧光染料对VIC光学通道存在串扰时，VIC光学通道接收到的荧光值随FAM荧光染料的浓度变化的变化关系式为YVN=KFV×XFN+b，也就是YVNm=Vm-VN=KFV×（Fm-FN）+b那么VN=Vm-KFV(Fm-FN）-b，FAM荧光染料对VIC光学通道的串扰算法为：Y´=Vm-KFV×(Fm-FN）-b=VN。
这样在每一个反应循环中，串扰光学通道接收到的荧光值Y´均为VN，也就是反应循环数为0时，串扰光学通道接收到的真实荧光值，最终串扰光学通道生成的扩增曲线其实为一条直线，而不是扩增曲线，仅有目标荧光染料光学通道生成了扩增曲线。
综上所述，本发明的荧光串扰系数标定方法及实时荧光定量PCR方法，最终展现出的扩增曲线为仅有目标荧光染料报告基团对应的目标荧光染料光学通道的扩增曲线，检测结果判定即为该PCR扩增体系为仅含有目标荧光染料报告基团的扩增体系，也就是仅含有目标荧光染料报告基团对应的核酸片段，不存在串扰光学通道对应的核酸片段，判定结果准确，从而解决了现有技术中提到的荧光串扰问题。
附图说明
图1为现有技术荧光定量PCR的扩增曲线图。
图2显示本发明一具体实施例中的拟合曲线。
图3展示本发明一具体实施例中对16个VIC荧光染料混合体系做PCR扩增实验过程中，VIC光学通道和FAM光学通道的检测结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
在本发明的以下示例性实施例中，主要以VIC荧光染料作为目标荧光染料、以FAM光学通道作为非目标荧光染料光学通道为例，对标定VIC荧光染料对PCR仪的FAM光学通道的荧光串扰系数进行了描述。可以理解，本领域技术人员可以根据本发明的教导对目标荧光染料、非目标荧光染料光学通道做出各种改变和变化。
实施例1
S1：制备染料标定板
1）提供一块初始染料标定板，初始染料标定板为由多个空的反应管组成的一块板材，随后使用qPCR预混液（鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司，货号102001002）作为TaqManMix，使用TaqMan Mix与VIC荧光染料进行混合并依次稀释，稀释出8个浓度（按照如下荧光染料与TaqMan Mix的体积比例配制：35μL染料+15μLTaqMan Mix、30μL染料+20μLTaqManMix、25μL染料+25μLTaqMan Mix、20μL染料+30μLTaqMan Mix、15μL染料+35μLTaqMan Mix、10μL染料+40μLTaqMan Mix、5μL染料+45μLTaqMan Mix、50μLTaqMan Mix），将8个浓度的稀释液分别装填到不同的反应管中，并编号为管1至管8，其中管1至管8中的稀释液浓度为依次递减趋势，管8中稀释液浓度为0即仅含有TaqMan Mix。各管中的实际浓度可以是未知的，因为在实际做实验以及后续用户执行该实验时均是不考虑各管中的实际浓度，只保证管1至管8的浓度为依次递减趋势即可，这样足以完成荧光串扰系数的标定；
2）在管1至管8中依次加入等体积（例如1μL）的明胶，明胶不与VIC荧光染料发生化学反应；
3）将步骤2）中的管1至管8放置在振荡混匀器上进行混匀，以使VIC荧光染料均匀分散并固定在管1至管8的混合体系中（混合体系就是VIC荧光染料、TaqMan Mix和明胶的混合体）；
4）在步骤3)的管1至管8中分别加入等体积（例如2μL）的石墨粉再次在振荡混匀器上进行振荡混匀，以将石墨粉分散在管1至管8的混合体系中，完成染料标定板的制备。
S2：使用制备好的染料标定板对多通道荧光定量PCR仪的FAM光学通道进行荧光串扰系数标定，也即标定VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数
5）将染料标定板放置在待标定的多通道荧光定量PCR仪上，运行PCR扩增程序，PCR扩增程序按表2执行，总共运行30个循环；
表2、PCR扩增程序
在每个循环后，VIC光学通道对管1至管8均采集一次荧光信号值，FAM光学通道也对管1中管8均采集一次荧光信号值；
6）30个循环结束后，对VIC光学通道采集到的管1的30个荧光信号值求取平均值，记作V1，也对VIC光学通道采集到的管2、管3、管4、管5、管6、管7、管8的30个荧光信号值分别求取平均值，记作V2～V8；
30个循环结束后，对FAM光学通道采集到的管1的30个荧光信号值求取平均值，记作F1，也对FAM光学通道采集到的管2、管3、管4、管5、管6、管7、管8的30个荧光信号值分别求取平均值，记作F2～F8；
数据如表3所示：
表3
7）得出下列表4所示数组：
表4
8）处理数组1和数组2得到VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数。具体为：
8.1）Y1÷X1=K1=0.075236，
Y2÷X2=K2=0.074540，
Y3÷X3=K3=0.071995，
Y4÷X4=K4=0.069217，
Y5÷X5=K5=0.064944，
Y6÷X6=K6=0.084381，
Y7÷X7=K7=0.059392
得到处理后的数组（K1，K2，K3，K4，K5，K6，K7)
8.2）求取数组（K1，K2，K3，K4，K5，K6，K7)的均值K，K即为VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数，K=（K1+K2+K3+K4+K5+K6+K7)/7=0.071386
8.3）在坐标系中对点（X1，Y1)、（X2，Y2)、（X3，Y3)、（X4，Y4)、（X5，Y5)、（X6，Y6)、（X7，Y7)进行最小二乘法拟合生成拟合曲线（图2），并计算出拟合曲线的关系式：Y=K´×X+b，
Y=0.0752×X-35.031，令K´=K=0.071386
至此，完成了VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数（K）标定以及荧光串扰关系式确定。荧光串扰关系式为Y=K×X+b，即Y=0.071386×X-35.031。
此外，在步骤6）之后、步骤7）之前可增加步骤6.1)，相关操作如下：
在制备染料标定板时，制备管1至管8以及管1´至管8´，管1与管1´相同，管2与管2´相同，管3与管3´相同，管4与管4´相同，管5与管5´相同，管6与管6´相同，管7与管7´相同，管8与管8´相同，此处相同是指管中的混合体系完全相同，且荧光染料浓度相同；即，设置平行反应管；
在PCR扩增的每个循环后，VIC光学通道对管1至管8以及管1´至管8´均采集一次荧光信号值，FAM光学通道也对管1中管8以及管1´至管8´均采集一次荧光信号值；
30个循环结束后，对VIC光学通道采集到的管1的30个荧光信号值求取平均值，记作V1´´，对VIC光学通道采集到的管1´的30个荧光信号值求取平均值，记作V1´，求取V1´´和V1´的平均值，记作最终的V1，同理计算V2～V8，F1～F8。
这样做可以进一步提升荧光串扰系数（K）的精准度。实际操作中，每个反应管的荧光染料浓度即便完全一样，光学通道在采集荧光信号值时也可能会存在差别，不能保证不同反应管同荧光染料浓度下采集到的荧光信号值完全一样，存在着最终计算得出的同一光学通道对同一荧光染料的串扰系数不一样的情况，本发明中增加反应管的数量，计算多个反应管中同一荧光染料浓度的各自的荧光信号值均值后再求取均值作为最终的荧光信号值（也就是V1～V8，F1～F8），可以提升后续荧光串扰系数的精准度。
上述实施例中给出了两组梯度稀释的稀释液的方案，即管1至管8和管1´至管8´，本发明中还可以设计更多组，例如三组，即管1至管8、管1´至管8´和管1´´至管8´´，V1的计算则为：管1的30个荧光信号值均值、管1´的30个荧光信号值均值，管1´´的30个荧光信号值均值，三个均值再求取均值记作最终的V1，同理可得V2～V8，F1～F8。
利用本发明提供的上述荧光串扰系数标定方法完成多通道荧光定量PCR仪的FAM光学通道的荧光串扰系数标定后，也就是完成VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数的标定后，再次对仅含有VIC光学通道对应的目标基团的PCR扩增体系运行PCR扩增反应，并通过VIC光学通道和FAM光学通道监测PCR扩增产物量变化时，其中，FAM光学通道每个反应循环后接收到的荧光值Y´是均已经经过串扰算法处理后的处理荧光值，所述串扰算法为Y´=Fm-K×(Vm-VN）-b，其中：
Fm为FAM光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
Vm为VIC光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
VN为反应循环数为0时VIC光学通道接收到的真实荧光值，
K为VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰系数，
b为VIC荧光染料对FAM光学通道的荧光串扰关系式（Y=K×X+b）中的常数。
本发明中，当VIC荧光染料对FAM光学通道存在荧光串扰时，FAM光学通道接收到的荧光信号值会随荧光染料的浓度变化而变化，同时呈现正相关变化，变化关系式为Y=0.071386×X-35.031，也就是Y=Fm-FN=K×（Vm-VN）+b，那么FN=Fm-K×(Vm-VN）-b，（FN为FAM光学通道在反应循环数为0时接收到的真实荧光值），而本发明的串扰算法为：Y´=Fm-K×(Vm-VN）-b，Y´=FN，这样在每一个反应循环后，FAM光学通道接收到的荧光值是处理荧光值Y´，均为FN，是一个定值，最终FAM光学通道生成的扩增曲线其实为一条直线，而不是扩增曲线，仅有VIC光学通道生成了扩增曲线。
图3展示了上述实施例中对16个VIC荧光染料混合体系做PCR扩增实验过程中，VIC光学通道和FAM光学通道的检测结果。可以看到在16次实验中，均是仅有VIC光学通道有扩增曲线生成，FAM光学通道因为标定完串扰系数、串扰算法后展示给用户的是未有扩增曲线生成，消除了荧光串扰的干扰。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由请求保护范围及其等效形式所限定。
Claims (11)
1.一种PCR仪荧光串扰系数标定方法，该方法是用于标定目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，其特征在于，所述方法包括：
提供染料标定板，所述染料标定板包括至少一种目标荧光染料体系区，每种目标荧光染料体系区包括至少一组目标荧光染料体系组，每组目标荧光染料体系组包括多个装载不同浓度目标荧光染料体系的反应管，其中，多个所述反应管中的一个所述反应管被配置为背景管，所述背景管装载浓度为零的目标荧光染料体系；装载浓度不为零的目标荧光染料体系的反应管为标定管；
对染料标定板的反应管运行PCR扩增程序，分别采集标定管及背景管的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据以及非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据；
将采集的标定管的荧光信号数据消除背景值；
以消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，从而对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定；
其中，所述每组目标荧光染料体系组包括装载至少两种不同浓度目标荧光染料体系的标定管；
所述以消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，从而对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定的过程包括：
对于每个浓度目标荧光染料体系的标定管分别获得消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值数据，以多个比值数据的均值作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数K；
其中，所述方法还包括确定荧光串扰关系式的过程，该过程包括：
以同一浓度目标荧光染料体系的标定管的消除背景值后的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据为横坐标，以非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据为纵坐标，利用多个浓度目标荧光染料体系的数据，在坐标系中进行最小二乘法拟合生成拟合曲线，获得拟合曲线的关系式：Y=K´×X+b，并令K´取值等于所述的目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数K，从而确定荧光串扰关系式为Y=K×X+b。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述每组目标荧光染料体系组包括装载5-10种浓度目标荧光染料体系的标定管，其中最高浓度的体系中目标荧光染料被激发产生的荧光被对应目标荧光染料的光学通道接收到的荧光值为3000-30000。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，运行PCR扩增程序时，PCR扩增反应循环数大于等于20，对于同一反应管，采集PCR扩增时多个循环点的荧光信号求取平均值作为该反应管对应的荧光信号数据。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每种目标荧光染料体系区包括两组及以上的目标荧光染料体系组，将每组中同一浓度的目标荧光染料体系的反应管的荧光信号数据求取均值作为该浓度的目标荧光染料体系的荧光信号数据。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各反应管的目标荧光染料体系采用qPCR预混液添加或不添加目标荧光染料制备而成。
6.一种实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括利用PCR仪运行PCR扩增程序的过程，其中所述PCR仪采用权利要求1-5任一项所述的方法进行了荧光串扰系数标定；
其中，运行PCR扩增程序的过程中，非目标荧光染料光学通道接收到的荧光值为经过串扰算法处理后的荧光值Y´，其中，所述串扰算法为Y´=Fm-K×(Vm-VN)-b，其中：
Fm为非目标荧光染料光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
Vm为对应目标荧光染料的光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
VN为反应循环数为0时对应目标荧光染料的光学通道接收到的真实荧光值，
K为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，
b为权利要求1中确定的荧光串扰关系式Y=K×X+b中的常数。
7.一种能用于实现权利要求1-5任一项所述的PCR仪荧光串扰系数标定方法的染料标定板，其特征在于，所述染料标定板包括至少一种目标荧光染料体系区，每种目标荧光染料体系区包括至少一组目标荧光染料体系组，每组目标荧光染料体系组包括多个装载不同浓度目标荧光染料体系的反应管，其中至少一个所述反应管被配置为背景管，所述背景管装载浓度为零的目标荧光染料体系。
8.一种PCR仪荧光串扰系数标定装置，其特征在于，所述装置包括：
数据获取模块，用于获取染料标定板的反应管运行PCR扩增程序的数据；其中所述数据为权利要求1-5任一项中的标定管及背景管的对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据以及非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据；
消除背景数据模块，用于将标定管的荧光信号数据消除背景值；
荧光串扰系数计算模块，用于计算消除背景值后的非目标荧光染料光学通道的荧光信号数据与对应目标荧光染料的光学通道的荧光信号数据的比值，作为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数；
荧光串扰系数标定模块，用于以所述的目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定；
其中，荧光串扰系数标定模块对荧光定量PCR仪进行串扰系数标定时，采用串扰算法使得非目标荧光染料光学通道接收到的荧光值为经过串扰算法处理后的荧光值Y´；
其中，所述串扰算法为Y´=Fm-K×(Vm-VN）-b，其中：
Fm为非目标荧光染料光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
Vm为对应目标荧光染料的光学通道在反应循环数为m时接收到的真实荧光值，
VN为反应循环数为0时对应目标荧光染料的光学通道接收到的真实荧光值，
K为目标荧光染料对非目标荧光染料光学通道的荧光串扰系数，
b为权利要求1中确定的荧光串扰关系式Y=K×X+b中的常数。
9.一种计算机设备，其特征在于，所述设备包括：存储器和处理器，所述存储器和所述处理器之间互相通信连接，所述存储器中存储有计算机指令，所述处理器通过执行所述计算机指令，从而执行权利要求1至6任一项所述的方法。
10.一种非暂态计算机可读存储介质，其特征在于，所述非暂态计算机可读存储介质存储有计算机指令，所述计算机指令被处理器执行时实现权利要求1至6任一项所述的方法。
11.一种计算机程序产品，其特征在于，所述计算机程序产品包括计算机指令，所述计算机指令被处理器执行时实现权利要求1至6任一项所述的方法。
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