KR20220034618A - 오염 지수를 이용한 양성 대조군 주형 오염에 의한 위양성 평가 시스템 - Google Patents

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KR20220034618A
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이혜민
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(주) 하임바이오텍
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Abstract

본 발명은 실시간 핵산증폭반응을 이용하는 분자진단시 양성 대조군(Positive Control, PC) 주형(Template)에 의해 검체나 시약이 오염된 경우 발생하는 위양성 반응을 효과적으로 평가하는 방법에 관한 것으로서, 양성 대조군 주형에 포함된 타겟 검출을 위한 유전자 서열의 내부에 오염 확인을 위한 유전자 서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.
검체를 이용한 분자진단에서 사용되는 프라이머와 프로브 구성시 양성 대조군 주형에 의한 오염확인을 위한 별도의 프라이머와 형광 채널을 사용하지 않고 내부 대조군(Internal Control, IC)의 검출에 사용되는 형광체와 동일한 형광체(Fluorophore) 또는 유사한 파장대의 형광체를 사용하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 다종의 타겟을 동일한 반응 튜브에서 동시 다중 반응시 분자진단 장비에서 사용가능한 형광채널을 모두 타겟 검출에 이용할 수 있는 장점을 가진다.
뿐만 아니라, 양성 대조군 주형의 오염 지수(Contamination Index, CIPCT) 계산을 통하여 오염 정도를 보다 정량적으로 평가가 가능하다.

Description

오염 지수를 이용한 양성 대조군 주형 오염에 의한 위양성 평가 시스템{SYSTEM FOR EVALUATING FALSE POSITIVES DUE TO CONTAMINATION OF POSITIVE CONTROL TEMPLATE USING CONTAMINATION INDEX}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응을 비롯한 형광 프로브를 사용하는 분자진단 시 양성 대조군 핵산 주형에 의한 교차 오염 여부 판단이 가능한 위양성 판단 방법에 관한 것으로써, 양성대조군 주형 내에 타겟 유전자 서열과는 구분되는 별도의 교차 오염 여부의 판단에 사용하는 외인성 오염 판단 유전자 서열을 삽입시키고, 이 서열과 상보적으로 결합하는 형광 프로브를 타겟 검출을 위한 시료 반응 용기에 포함시켜 양성 대조군 주형에 의한 시료 또는 시약의 오염에 기인한 위양성 여부를 판단할 수 있다.
중합효소 연쇄반응과 같은 핵산 증폭기술은 유전체 내의 특정 서열부분만을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 방법으로서 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)과 같은 감염성 질환, 유전적 질환과 같은 비감염성 질환의 진단을 비롯하여 약물유전학 검사, 혈액 선별 검사, 법의학 검사 등 의학분야 및 농/축/수산업 등 다양한 산업분야에서 광범위하게 응용이 되고 있다. 특히, 실시간 중합효소 연쇄반응법은 핵산의 증폭 정도에 따라 프로브(probe)에 결합되어 있는 리포터(reporter)라 불리는 형광체(fluorophore)의 형광 세기를 실시간으로 측정하여 제공하기 때문에 최근에 더욱 널리 사용이 되고 있는 추세이다.
실시간 핵산 증폭 반응 중 널리 이용되는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time Polymerase Chain Reaction, real-time PCR)은 주형 DNA에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer) 사이에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 형광체를 가진 프로브가 핵산 증폭 과정에서 발광하는 원리를 이용한다. 실시간 중합효소 연쇄 반응에서 가장 많이 이용되는 태그맨 프로브(TaqMan® probe)는 5’ 말단에 형광물질인 리포터가 결합되어 있고 3’ 말단에는 형광 상쇄물질인 소광체(quencher)가 결합된 약 25 내지 30 bases의 올리고머(oligomer)이다. TaqMan® probe는 Annealing 단계에서 타겟 DNA에 특이적으로 결합하고 소광체에 의해 형광을 발하지 못하다가 다음 과정인 신장(extension) 단계에서 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 기능에 의해 타겟 DNA에 상보적으로 결합된 프로브가 가수분해되고 이로 인해 소광체에 의해 발광이 억제되었던 리포터가 형광을 발하게 되는 원리이다.
핵산 증폭을 이용하는 분자 진단 검사는 임상 시료 검사용 반응 튜브와 병행하여 별도의 양성 대조군(Positive Control) 반응 튜브와 음성 대조군(Negative Control) 반응 튜브를 구성해야 하며, 검사하고자 하는 임상 시료를 넣은 반응 튜브내에 내부 대조군(Internal Control) 타겟도 함께 검출이 되도록 설계되어야 한다. 양성 대조군으로 이용되는 주형은 검출하고자 하는 타겟 유전자 서열을 인위적으로 합성하여 벡터(Vector) 내에 삽입하여 제작하는 것이 일반적이며 유전자 검사 시 양성 대조군 반응 튜브에는 검사 시료 대신 양성 대조군 타겟이 일정한 농도로 첨가되어 핵산 증폭 반응이 진행이 된다.
분자 진단 검사 실험실에서는 많은 수의 임상 시료를 오랜 기간 동안 반복적으로 수행하는 것이 일반적이며 이러한 반복 시험을 장기간 진행하는 동안 시험자에 의해 양성 대조군 주형 핵산이 포함된 용액의 용기의 개폐 또는 피펫팅(Pipetting) 작업시 눈에 보이지 않는 미세한 비말이 발생할 가능성이 상존하며 이러한 비말은 검사하고자 하는 시료나 분자 진단 시약 내로 확산되어질 수 있다. 뿐만 아니라, 분자 진단 검사를 거친 양성 대조군내의 타겟 유전자 서열은 핵산 증폭 반응전에 비하여 이론적으로 1012배 증가된 양의 타겟 수를 가지게 되므로 검사 후 부적절한 처리나 작업자의 실수 등 많은 요인에 의해서 음성 시료나 시약이 양성 대조군 주형에 의해 오염이 되면 음성으로 판정되어야 할 시료가 양성으로 판정되는 위양성 결과를 초래하게 된다. 실례로 2020년 WHO에서 팬더믹을 선언한 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19) 진단검사에서도 여러 차례 위양성 결과가 보고된 바 있다.
다양한 교차 오염 원인 중 타겟 핵산 증폭 산물에 의한 교차 오염의 위험을 줄이기 위해서 중합 효소 연쇄 반응시 첨가되는 디옥시티미딘 삼인산(deoxythymidine triphosphate, dTTP) 대신 디옥시우리딘 삼인산(deoxyuridine triphosphate, dUTP)를 사용하고 Uracil-N-glycosylase(UNG)를 사용하여 앞서 진행된 핵산 증폭 산물의 교차 오염에 의한 위양성을 상당부분 예방할 수 있으며, 핵산 증폭 반응 전후에 DNA 제거 용액을 사용하거나 임상 시료나 양성 대조군 첨가 작업을 시약 준비하는 공간과 물리적으로 분리된 장소에서 진행함으로써 교차오염을 상당 부분 예방할 수 있다. 그러나, 이러한 교차오염을 줄이거나 예방하기 위한 방법을 모두 동원하여도 양성대조군에 의한 교차 오염 가능성을 완전히 배제할 수는 없으며, 실시간 핵산 증폭 반응 시 양성 대조군에 의한 위양성 여부를 즉시 판단할 수 있는 방법이 요구된다.
본 발명은 형광 프로브를 사용하는 다양한 실시간 핵산 증폭 반응(예, real-time PCR)에 의한 분자 진단에 있어서 양성대조군의 핵산 주형에 의한 검사 시료의 오염 여부 판단이 가능한 양성대조군 주형내의 유전자 서열의 구성과 이를 이용한 위양성 여부를 판별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 형광 프로브를 사용하는 실시간 핵산 증폭 반응을 이용한 진단 검사 시 타겟의 검출에 사용되는 프로브에서 사용하는 형광 채널 이외에 별도의 형광 채널을 사용하지 않고 위양성 여부를 판별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 방법으로, a) 타겟 유전자 서열 및 오염 판단 유전자 서열을 포함하는 양성 대조군 유전자가 포함된 양성 대조군을 준비하는 단계, b) 검체로부터 유전자를 수득하여 검사 대상군을 준비한 후 상기 검사 대상군에 내부 대조군 유전자를 첨가하는 단계 및 c) 상기 양성 대조군 및 검사 대상군에 타겟 유전자, 오염 판단 유전자 및 내부 대조 유전자와 각각 결합 가능한 프로브를 첨가한 후 실시간 핵산 증폭반응(PCR) 진행하는 단계를 포함하고, 상기 오염 판단 유전자 및 내부 대조 유전자 각각과 결합 가능한 프로브의 가수분해에 따라 동일한 파장에서 발광하는 것을 특징으로 하는, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, d) 상기 c) 단계의 핵산 증폭반응 결과 내부 대조군 유전자와 결합하는 프로브에 결합된 형광체의 파장에서 발광하는 경우 실시간 핵산 증폭 반응이 정상적으로 진행되었음을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, e) 상기 d) 단계의 내부 대조군 유전자와 결합 가능한 프로브가 발광하는 파장에서, 추가적인 형광 세기가 확인되는 경우 양성 대조군에 의해 검사 대상군이 오염되었음을 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 오염 판단 유전자 서열은 15 내지 40bp 길이를 갖는 DNA 또는 RNA 서열이다.
또한, 본 발명의 상기 프로브는 핵산 올리고머가 형광체(fluorophore) 및 소광체(quencher)와 결합된 것인, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 프로브는 상기 타겟 유전자 서열의 증폭을 위한 정방향 또는 역방향 프라이머에 의해 가수분해되어 형광이 나타나는 태그맨(TaqMan) 프로브, 태그맨 MGB 프로브, 상보적인 서열과 결합된 상태에서 RNase H에 의해 절단된 후 프라이머에 의해 가수분해되어 형광을 발생시키는 사이클링 프로브(Cycling Probe), 상보적인 서열과 결합된 상태에서 형광을 발하는 분자 비콘(Molecular Beacon), 스콜피온 프로브(Scorpion probe), 및 프렛(FRET) 원리를 이용하는 핵산 올리고머를 포함하는 프로브로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 프로브로 구성될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면 내부 대조군 유전자와 상보적인 프로브에 결합하는 형광체는 오염 판단 유전자 서열과 상보적인 프로브에 결합하는 형광체와 동일하거나, 발광 시 동일한 파장대를 갖는 형광체로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, RT-qPCR 또는 qPCR반응을 통한 진단 검사에서 내부 대조군 주형의 검출은 내부 대조군의 형광 값이 다시 증가하는 시점 (Ct 값)이 5 이상, 35이하의 값을 가지며, 이후, PCR 사이클이 1 내지 10 사이클 범위일 때, 형광 값(FI, Fluorescence Intensity 또는 RFU, Relative Fluorescence Units)이 일정한 값에 도달하여 유지되도록 내부 대조군 검출을 위한 프로브의 양을 조절할 수 있다.
본 발명 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법의 일 실시예에 따르면 내부 대조군 검출에 사용된 형광 값(FI, Fluorescence Intensity 또는 RFU, Relative Fluorescence Units)이 일정하게 유지되다가 다시 증가하는 현상에 의해 양성 대조군에 의한 오염 여부를 판단할 수 있다.
또한, 상기 내부 대조군의 형광 값이 최초 증가하는 시점 (Ct 값) 의해 오염 정도를 반정량적으로 평가하고, 상기 양성 대조군 주형에 의한 오염의 정도는 하기 수학식 1에 의해 정량적으로 산출되는, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법이 제공된다.
<수학식 1>
Figure pat00001
본 발명에서 제안하고 있는 양성 대조군 핵산 주형을 사용하고 검체의 핵산 추출물에서 타겟 검출시 양성 대조군 핵산 주형내의 오염 판단에 사용하기 위하여 내부 대조군 타겟의 검출에 사용되는 리포터 형광체와 동일한 파장대의 형광체를 사용하면, 검체 또는 시약이 양성대조군 핵산 주형에 의해 오염된 경우 설계된 내부 대조군 타겟의 증폭에 따른 형광 증폭 시그널 보다 높은 최종 형광 값에 의해 위양성 여부를 판단할 수 있으므로 핵산 증폭 반응을 통한 진단 검사의 정확성과 신뢰성을 높일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 위양성을 판단하기 위한 별도의 프라이머를 첨가하지 않을 수 있고, 양성 대조군(PC)의 검출을 위하여 내부 대조군 검출에 사용되는 프로브의 리포터 형광체와 동일한 파장대의 형광체를 리포터로 사용하기 때문에 다중 검출(multiplex detection)을 이용하는 분자 진단 시약의 설계와 개발에 있어서 양성 대조군 주형의 검출에 필요한 별도의 형광 채널을 사용하지 않아도 되므로 다중 검출 타겟 수에 제한을 받지 않는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 오염 지수 계산에 의해 양성 대조군 주형에 의한 오염이 결과에 미친 정도를 정량적으로 평가가 가능하다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 검체에서 추출된 핵산에서 타겟 유전사 서열을 검출하기 위하여 별도의 형광채널을 사용하지 않고 내부 대조군과 동일한 리포터 형광체를 사용하는 프로브 구성의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 검체나 시약이 양성대조군에 의해 오염되었을 경우, 실시간 핵산증폭반응시 검출이 되기 위하여 양성대조군으로 사용되는 벡터(Vector)내에 오염 판단용 프로브(Probe for contamination check)가 상보적으로 결합하는 부위의 상대적인 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3은, 본 발명의 다른 실시예에 따른 벡터(Vector)내의 위양성 판단을 위한 프로브(Probe for contamination check)의 상대적인 위치를 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 벡터(Vector)내의 위양성 판단을 위한 프로브(Probe for contamination check)의 상대적인 위치를 보여주는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 양성 대조군 주형과 타겟 검출을 위한 프라이머와 프로브를 구성하였을 때, 양성 대조군 주형에 의한 검체나 시약의 오염이 없는 경우, 태그맨(TaqMan®) 프로브를 이용한 실시한 핵산 증폭 반응에서 예상되는 양성 시료의 타겟 핵산의 증폭 곡선이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 양성 대조군 주형과 타겟 검출을 위한 프라이머와 프로브를 구성하였을 때, 양성 대조군 주형에 의한 검체나 시약의 오염이 없는 경우, 태그맨(TaqMan®) 프로브를 이용한 실시한 핵산 증폭 반응에서 예상되는 음성 시료의 타겟 핵산 증폭 곡선이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 양성 대조군 주형과 타겟 검출을 위한 프라이머와 프로브를 구성하였을 때, 양성 대조군 주형에 의한 검체나 시약이 오염된 경우, 태그맨(TaqMan®) 프로브를 이용한 실시한 핵산 증폭 반응에서 예상되는 음성 시료의 타겟 핵산 증폭 곡선이다.
도 8은 본 발명에 따라 제작한 양성 대조군 주형의 설계를 보여주는 모식도이다.
도 9은 실시예에 따라 양성 대조군 주형과 프라이머 및 프로브를 제작한 후 인위적으로 음성 시료를 양성 대조군으로 오염 시킨 후 실험적으로 확인한 타겟의 실시간 증폭 곡선이다.
도 10은 실시예에 따라 타겟 gRNA의 농도를 달리하는 양성 시료에서 일정농도의 양성 대조군 주형으로 오염시킨 후 실험적으로 확인한 타겟의 실시간 증폭 곡선이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지의 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해서 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
실시간 핵산 증폭 반응을 이용한 질병 등의 분자 진단에 있어서, 사용하는 시약의 정확성과 신뢰성을 담보하기 위하여 양성대조군(Positive Control, PC) 반응을 병행하고 있으며, 확인하고자 하는 타겟 유전자 서열이 삽입된 플라스미드(Plasmid) DNA가 양성 대조군 주형으로 많이 이용되고 있다.
본 명세서에서 "양성 대조군"은 상기 "타겟 유전자 서열"이 존재하는 대조군이다. 본 발명에 따르면 양성 대조군의 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 결과와 상기 검사 대상군의 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 결과를 분석하여 검사 대상군의 양성 여부를 분석할 수 있다. 또한, 본 발명의 "양성 대조군 유전자 서열"은 양성 대조군에서 이용되는 유전자 서열을 의미한다.
본 명세서에서 "타겟 유전자 서열"이란, 검출하고하는 특정 유전자 서열을 의미하고, "오염 판단 유전자 서열"이란, 임의의 유전자 서열로 양성 대조군의 유전자 서열에 삽입되는 유전자 서열을 의미하며, 타겟 유전자 서열과는 다른 서열을 갖는다. 대조군의 유전자 서열에서 "오염 판단 유전자 서열"은 "타겟 유전자 서열"의 측면, "다수 개의 타겟 유전자 서열" 사이, 또는 하나의 "타겟 유전자 서열" 내부에 위치할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 기술자의 수준에 따라 변형되어 사용될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 "양성"이란 타겟 유전자 서열이 존재하는 것을 의미하며, "위양성"이란 타겟 유전자 서열이 존재하지 않음에도 양성으로 판정되는 것을 의미한다. 본 발명에서는 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여, 타겟 유전자 서열이 존재하는 경우, 타겟 유전자 서열의 위치에서 발현(또는 발광)을 하게 되며, 타겟 유전자 서열의 위치에서 발현을 하는 경우 "양성"이라 판단할 수 있다.
본 명세서에서 "오염"이란, "양성 대조군"의 유전자 서열이 공기 중 또는 실험 도구 등을 통해 "검사 대상군"에 유입되는 것을 의미한다. 이 경우, "검사 대상군"에 타겟 유전자 서열이 존재하지 않는 경우에도 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 결과 "양성"으로 나타날 수 있는데, 이러한 경우의"양성"을 "위양성"이라 한다.
분자 진단 시험에서 "내부 대조군(Internal Control, IC)"은 내부 양성 대조군(Internal Positive Control, IPC)으로 불리기도 하며, 병원체 등 표적이 있는 동일한 반응 튜브에서 동시에 추출 및 증폭되어 표적의 정확한 핵산 증폭을 위한 반응 혼합물의 기능을 입증하기 위해 사용된다. "내부 대조군 유전자"는 내부 대조군으로 쓰이는 유전자를 의미하며, 임의의 유전자 서열을 이용할 수 있으나, 오염 판단 유전자 서열 및 타겟 유전자 서열과는 상이하다.
본 명세서에서 "프로브"란, 특정 유전자 서열의 존부를 확인하기 위하여 첨가되는 DNA또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편(또는 단편)을 의미한다. 본 발명에서 상기 프로브는, 형광체 및 소광체(Quencher)와 결합할 수 있다. 일반적인 실험 방식에 따르면, 프로브는, 특정 유전자 서열에 결합하며, 해당 유전자 서열의 합성 개시에 따라 프로브는 떨어져 나가고 형광체 및 소광체가 프로브로부터 떨어져 나와 형광을 나타낸다. 이때 형광의 세기를 분석하여 해당 유전자 서열의 존부를 판단할 수 있다.
본 발명에서 "프로브"는 타겟 유전자 서열, 오염 판단 유전자서열 및 내부 대조군 유전자 서열에 각각 상보적인 서열로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 상기 오염 판단 유전자 서열 및 내부 대조군 유전자 서열에 각각 결합할 수 있는 프로브는 동일한 형광체 또는 동일한 파장대를 갖는 형광체와 결합할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 오염 판단 유전자 서열이 검사 대상군에 존재하지 않는 경우, 즉 위양성이 아닌 경우, 내부 대조군 유전자와 상보적인 프로브에 결합한 형광체의 형광 세기만 나타나므로 일정한 형광 세기가 관찰될 것이다.
그러나, 상기 오염판단 유전자 서열이 검사 대상군에 존재하는 경우, 즉 위양성의 경우, 내부 대조군 유전자와 상보적인 프로브에 결합한 형광체의 형광 세기가 나타날 것이며, 이와 함께 오염 판단 유전자 서열과 상보적인 프로브에 결합한 형광체의 형광 세기 역시 나타날 것이다. 이때 각 형광체의 파장대는 동일할 것이므로, 위양성이 아닌 경우 내부 대조군 유전자와 상보적인 프로브에 결합한 형광체의 형광 세기보다 강한 형광 세기가 나타날 것이며, 형광이 중첩적으로 관찰될 수 있다.
감염성 질환의 분자진단에 있어서, 양성 대조군 주형은 핵산 증폭 반응을 수행하는 과정에서 소량이라도 오염되면 감염 여부를 알고자 하는 검체가 병원체에 감염되지 않았음에도 양성 결과를 초래하는 위양성 반응을 초래할 수 있다.
이에 본 발명에서는, 양성 대조군에 특정 유전자 서열인 오염 판단 유전자 서열을 삽입하고, 검사 대상군에서의 오염 판단 유전자 서열 존부를 검출하여 위양성 여부를 판단하는 방법을 제공한다.
더 나아가 본 발명에서는, 검사 대상군의 유전자 검사가 진행 여부를 확인하기 위한 내부 대조군을 사용하며, 검사 대상군 내에 내부 대조군을 혼합하여 유전자 검사 후 내부 대조군 유전자 서열이 존재하는 경우 반응이 정상적으로 진행되었음을 알 수 있는 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 실시간 핵산 증폭 반응 시 타겟 유전자를 검출하기 위한 프로브와 내부 대조군을 검출하기 위한 이중 표지된(dual-labeled) 프로브 및 양성 대조군에 의한 검사 대상군의 오염 시 이를 검출하기 위한 이중 표지된(dual-labeled) 프로브의 구성을 보여준다. 도 1의 110은 타겟을 검출하기 위한 리포터로서 400nm - 800nm 사이의 형광을 발하는 형광체(fluorophore)이며, FAM, HEX, TET, JOE, CY3, CY5, CAL Fluor560, CAL Flour610, ATTO565 NHS-ester, ROX NHS-ester, TexasRed NHS-ester 및 Yakima Yellow 등의 형광체가 주로 이용되지만 이에 한정되지는 아니하며 프로브의 5' 말단에 공유결합 되어 있다. 프로브의 3' 말단에는 소광체(Quencher)가 공유 결합하고 있으며 광원에 의해 여기된 상태(excited state)의 형광체로부터 근접거리에 위치할 경우 FRET(Fφrster resonance energy transfer)을 통해 형광체의 형광을 억제하게 된다. 소광체(Quencher)로 사용되는 물질은 Black Hole Quencher(BHQ1, BHQ2, BHQ3), Blackberry Quencher(BBQ650), Dabcyl and Eclipes quencher 등이 많이 이용되지만 이에 한정하지는 아니하며 FRET을 통하여 형광체의 형광을 억제할 수 있는 모든 물질이 해당될 수 있다.
양성 대조군(PC) 주형에 의한 오염 여부를 판단하기 위한 프로브는 내부 대조군의 검출에 사용되는 프로브와 동일한 형광 파장대를 가지는 리포터를 사용하지만 별도의 프라이머를 사용하지 않는 것을 특징으로 한다.
도 2는 도 1에 제시된 타겟 검출을 위한 프로브 구성시 벡터(Vector)를 이용하여 플라스미드 형태의 양성 대조군 주형 제작시 포함되어야 하는 타겟 유전자 서열 및 오염 여부 확인을 위한 프로브와 상보적으로 결합될 유전자 서열의 상대적인 위치를 도식화 한 것이며, 정방향 프라이머(Forward Primer)가 Taq DNA 중합효소에 의해 신장될 때 5' 엑소뉴클라제(exonuclease) 활성에 의해 타겟 검출용 프로브가 가수 분해됨에 따라 소광체(Quencher)와 물리적인 거리가 멀어지게 되어 R1 리포터는 형광 신호를 발하게 되며 핵산 증폭 사이클이 증가할수록 신호는 증가하게 된다. 오염 확인을 위해 사용되는 프로브는 역방향 프라이머의 신장시 분해되도록 하기 위하여 역방향 프라이머가 신장되는 방향에 위치시키는 것이 바람직하다.
본 발명에서 제안하는 오염 여부 확인을 위한 프로브와 상보적으로 결합될 유전자 서열의 상대적인 위치는 도 2에 한정하지 않으며, 도 3 및 도 4와 같이 구성이 가능하다. 도 2, 도 3 그리고 도 4의 예시에 의하면, 오염 판단 유전자 서열은 타겟을 검출하기 위한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제안하는 방식으로 양성 대조군 주형을 준비하고 타겟 검출을 위한 프라이머와 프로브를 구성하게 되면, 검체나 시약이 양성 대조군 주형에 의해 오염되지 않은 경우, 도 5 및 도 6에 묘사된 내부 대조군의 형광 증폭 곡선 형태를 보이게 된다. 그러나, 양성 대조군 주형에 의해 검체나 시약이 오염이 된 경우, 도 7에 묘사된 형태와 같이 일정한 형광값에 도달했던 내부 대조군의 핵산 증폭 곡선이 재 증가하는 현상이 나타나므로 타겟 검출에 의한 핵산 증폭 곡선이 나타나더라도 내부 대조군의 핵산 증폭 곡선 형태에 의해 위양성 여부의 판단이 가능하다.
보다 바람직하게는 본 발명자가 개발한 하기 수학식 1에 기술된 오염 인덱스(CIPCT)를 이용하여 보다 정량적으로 오염이 결과에 미친 정도를 평가할 수 있다.
<수학식 1>
Figure pat00002
CI PCT : 양성 대조군 주형의 오염 지수 (Contamination Index of Positive Control Template)
F IC_end : 내부 대조군의 최종 반응 사이클에서의 형광 값(RFU)
F IC_st : 초기에 일정 수준에 도달한 내부 대조군의 형광 값(RFU)
F Target : 타겟의 최종 형광 값(RFU)
COVID-19 진단을 위한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 프로브의 구성과 양성 대조군 주형의 제조 및 음성 시료의 양성 대조군 주형에 의한 오염 모사 실험
SARS-CoV-2의 모든 아종의 검출을 위하여 S gene에 대해 NCBI에서 blast를 진행하고 NCBI에 등재된 sequence 변이가 적어서 검출률이 높은 영역을 선택하여 프라이머와 프로브를 선정하였다. SARS-CoV-2 검출을 위한 프라이머 및 프로브와의 반응을 피할 수 있는 외인성 유전자 서열(exogenous sequence)를 이용하여 내부 대조군 주형(ICT)의 서열은 다음과 같이 설계하였으며 이의 검출을 위한 프라이머 및 프로브 및 오염 확인을 위한 프로브 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
ICT: 5'- ACCACTTAGCTTGAGCACGAAGACAGACTGTCGTCGTCCGTCAGA
CTTACGTAGGAGCACCAGGAATCT-3'
실시예 1에서 사용한 프라이머 프로브 서열 정보
Primer/Probe Sequence (5' → 3')
Forward Primer for Target GGCACAGGTGTTCTTACTGAGT
Reverse Primer for Target GTCTGTGGATCACGGACAG
Probe for Target AGTAGTGTCAGCAATGTCTCTGCCAA
Forward Primer for IC ACCACTTAGCTTGAGCACGA
Reverse Primer for IC AGATTCCTGGTGCTCCTACG
Probe for IC ACAGACTGTCGTCGTCCGTCAGACT
Probe for Contamination Check ACATAACGCCCGGGATAACAGAGCTG
양성 대조군 주형은 도 8에 나타낸 바와 같이 타겟의 프라이머와 프로브 및 오염 확인을 위한 프로브 서열을 구성하여 pBHA Vector에 삽입시켰다.
실시예에서 사용된 프로브는 TaqMan Probe이며 네오프로브(Neoprobe, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
실시예 1에서 사용한 프로브의 리포터와 소광체의 구성
Probe 5' Reporter 3' Quencher
Probe for Target FAM BHQ1
Probe for IC Cal Red 610 BHQ2
Probe for Contamination Check Cal Red 610 BHQ2
실시예에서는 음성 시료를 이용한 real-time RT-PCR시 10 copy/μl 농도의 양성 대조군 주형을 인위적으로 5 μl를 반응액에 첨가하여 반응액의 오염을 모사하였고 반응액의 조성은 표 3에 나타내었다.
실시예 1에 따른 PCT에 의한 오염 모사를 위한 반응액 조성 테이블
Component Concentration Volume (μl)
2x Master Mix for RT-qPCR - 10
Forward Primer for Target 20 μM 0.5
Reverse Primer for Target 20 μM 0.5
Probe for Target 5 μM 0.5
Forward Primer for IC 3 μM 0.5
Reverse Primer for IC 3 μM 0.5
Probe for IC 1 μM 0.5
Probe for Contamination Check 5 μM 0.5
ICT (Internal Control Template) 107 copy/ μl 1
PCT (Positive Control Template) 10 copy/μl 5
D.W. - 0.5
Total 20
Bio-Rad CFX96TM Touch 장비를 이용하여 표 4의 반응 공정에 따라 RT-qPCR을 진행하였고 결과는 도 9에 나타내었다.
실시예 1에 따른 RT-PCR 반응 절차
Step Temperature Time Cycle(사이클)
Reverse Transcription 50 ℃ 20 min 1
Initial Denaturation 95 ℃ 10 min 1
Denaturation 95 ℃ 15 sec 45
Annealing and Extension 60 ℃ 30 sec
도 7에서 예측한 바와 같이 도 9에서 반응액이 양성 대조군 주형에 의해 오염된 경우, 일정한 RFU에 도달했던 내부 대조군의 핵산 증폭 곡선이 한 번 더 증폭이 되면서 보다 높은 RFU 값에 도달하는 현상을 관찰할 수 있었으며 오염확인을 위한 부가적인 형광을 사용하지 않고도 충분히 양성 대조군 주형에 의한 오염 확인이 가능함을 확인하였다.
양성 시료의 양성 대조군 주형에 의한 오염 모사
검사실에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 진단시, 음성 검체뿐만 아니라 양성 검체도 양성 대조군 주형에 의해 오염이 될 수 있다. 양성 검체는 VIRCELL에서 구매한 AMPLIRUN® CORONAVIRUS SARS-CoV-2 RNA를 사용하여 양성 대조군 주형에 의한 오염 발생시 양성 검체에서의 타겟 증폭 곡선을 도 10에 나타내었다. 기타 실험 조건은 실시예 1에서와 동일하며, 검체에 포함된 SARS-CoV-2 RNA와 양성 대조군 주형의 농도는 표 5에 나타내었다.
양성대조군 주형에 의한 양성 시료의 오염 모사를 위한 반응액내 SARS-CoV-2 RNA와 양성대조군 주형의 농도
# Positive Control Template SARS-CoV-2 RNA
a 5 copy / μl 5 x 10 copy / μl
b 5 copy / μl 5 x 102 copy / μl
c 5 copy / μl 5 x 103 copy / μl
d 5 copy / μl 5 x 104 copy / μl
도 10 의 a -d 의 반응 결과에서 검체의 양성 정도(COVDI-19의 경우 감염된 정도)가 높아질수록 양성 대조군 주형에 의한 오염에 의해 일정 수준에 도달한 내부 대조군의 RFU 값이 재 증폭 하는 정도는 약하게 상승하는 경향을 보였으며 내부 대조군의 RFU 값의 재 증폭 형태를 통하여 양성 대조군 주형에 의한 오염이 조금 있더라도 진양성으로 판정을 하는 것이 타당할 것이다.
오염 지수에 의한 오염의 정량적 평가
실시예 1과 실시예 2의 결과를 토대로 내부 대조군의 RFU값과 검출 타겟의 RFU 값을 이용하여 양성 대조군 주형에 의한 오염 정도를 판단하기 위한 수식에 따라 오염 지수(CIPCT)를 계산하고 표 6에 나타내었다.
타겟 유전자의 양과 오염된 양성 대조군 주형의 상대적 양에 따른 CIPCT
# Target conc. / PCT conc. CIPCT
실시예 1 0 0.893019
실시예 2 (a) 10 0.423811
실시예 2 (b) 100 0.396939
실시예 2 (c) 1,000 0.177335
실시예 2 (d) 10,000 0.04226
표 6에서 알 수 있는 바와 같이 음성 검체가 양성 대조군 주형에 의해 오염되었을 경우에는 CIPCT 값은 0.893으로 계산되었다. 이는 프라이머와 프로브의 타겟에 혼성화되는 효율 및 프로브에 공유 결합되어 있는 리포터들의 상대적 형광 효율 등의 영향으로 사료되며, 프라이머 및 프로브의 농도 조절 등을 통하여 최적화가 이루어 진다면 이론적인 값인 1에 수렴할 것으로 사료된다.
양성 검체가 양성 대조군 검체에 의해 오염된 상황을 모사한 실시예 2에서의 CIPCT 는 가장 큰 값이 0.42로 나타났으며, CIPCT 가 0에 수렴할수록 양성 검체에서 오염된 양성 대조군 주형에 의한 영향은 무의미해짐을 알 수 있다. 양성 대조군 주형에 의한 오염 지수를 이용하면, 결과 그래프의 시각적인 형태만으로 판정이 모호한 경우에도 위양성 판단의 기준을 제시(예를 들어, CIPCT 값이 0.5 이상인 경우에는 위양성이 강하게 의심되므로 재시험 실시) 할 수 있으며, 분자진단키트의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며, 본 발명의 목적을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
110 타겟 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열을 갖는 프로브에 결합하는 형광체
120 소광체
130 내부 대조군 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열을 갖는 프로브에 결합하는 형광체

Claims (10)

  1. 형광 프로브를 사용하는 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법에 있어서,
    a) 타겟 유전자 서열 및 오염 판단 유전자 서열을 포함하는 양성 대조군유전자가 포함된 양성 대조군을 준비하는 단계;
    b) 검체로부터 유전자를 수득하여 검사 대상군을 준비한 후 상기 검사 대상군에 내부 대조군 유전자를 첨가하는 단계; 및
    c) 상기 양성 대조군 및 검사 대상군에 타겟 유전자, 오염 판단 유전자 및 내부 대조 유전자와 각각 결합 가능한 프로브를 첨가하고, 실시간 핵산 증폭반응(PCR) 진행하는 단계를 포함하고,
    상기 오염 판단 유전자 및 내부 대조 유전자 각각과 결합 가능한 프로브의 가수분해에 따라 동일한 파장에서 발광하는 것을 특징으로 하는, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    d) 상기 c) 단계의 핵산 증폭반응 결과 내부 대조군 유전자와 결합하는 프로브에 결합된 형광체의 파장에서 발광하는 경우 실시간 핵산 증폭 반응이 정상적으로 진행되었음을 확인하는 단계를 더 포함하는,
    실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    e) 상기 d) 단계의 내부 대조군 유전자와 결합 가능한 프로브가 발광하는 파장에서, 추가적인 형광 세기가 확인되는 경우 양성 대조군에 의해 검사 대상군이 오염되었음을 판별하는 단계를 포함하는,
    실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 오염 판단 유전자 서열은 15bp 내지 40bp의 길이를 갖는 DNA 또는 RNA 서열인, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로브는 핵산 올리고머가 형광체(fluorophore) 및 소광체(quencher)와 결합된 것인, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 프로브는
    상기 타겟 유전자 서열의 증폭을 위한 정방향 또는 역방향 프라이머에 의해 가수분해되어 형광이 나타나는 태그맨(TaqMan) 프로브, 태그맨 MGB 프로브, 상보적인 서열과 결합된 상태에서 RNase H에 의해 절단된 후 프라이머에 의해 가수분해되어 형광을 발생시키는 사이클링 프로브(Cycling Probe), 상보적인 서열과 결합된 상태에서 형광을 발하는 분자 비콘(Molecular Beacon), 스콜피온 프로브(Scorpion probe), 및 프렛(FRET) 원리를 이용하는 핵산 올리고머를 포함하는 프로브로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 프로브인, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    내부 대조군 유전자와 상보적인 프로브에 결합하는 형광체는 오염 판단 유전자 서열과 상보적인 프로브에 결합하는 형광체와 동일하거나, 발광 시 동일한 파장대를 갖는 형광체인, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    RT-qPCR 또는 qPCR반응을 통한 진단 검사에서 내부 대조군 주형의 검출은 내부 대조군의 형광 값이 최초로 증가하는 시점 (Ct 값)이 5 이상, 35이하의 값을 가지며,
    이후 10 사이클 이내에, 형광 값(FI, Fluorescence Intensity 또는 RFU, Relative Fluorescence Units)이 일정한 값에 도달하여 유지되도록 내부 대조군 검출을 위한 프로브의 양을 조절하는 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    내부 대조군 검출에 사용된 형광 값(FI, Fluorescence Intensity 또는 RFU, Relative Fluorescence Units)이 일정하게 유지되다가 다시 증가하는 현상에 의해 양성 대조군에 의한 오염 여부를 판단하는, 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 내부 대조군의 형광 값이 다시 증가하는 시점 (Ct 값) 의해 오염 정도를 반정량적으로 평가하고,
    상기 양성 대조군 주형에 의한 오염이 결과에 미친 정도는 하기 수학식 1에 의해 산출되고, 정량적인 평가가 가능한 실시간 핵산 증폭 반응에 의한 위양성 판별 방법:
    <수학식 1>
    Figure pat00003
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