CN112280839A - 检测靶点数多于荧光通道数的实时pcr技术及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并可增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种核酸分析技术，特别涉及检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基础研究和临床实践。多种PCR技术，尤其是实时荧光PCR技术，在临床上基因定性与定量分析中更是扩展了基因检测的范围。目前临床常用的荧光PCR仪，主要为提供4种或5种荧光通道，一般检测可以利用一个荧光通道作为内参，其余3种或4种荧光通道用于检测待测标本；或者，可以利用外在标准曲线的定性和定量方法。现有的核酸检测分析技术存在如下缺陷：
1)检测靶点数量有限，在4通道仪器中，现有技术中最高检测3～4个靶点；
2)检测敏感性不高；
3)出现假阳性检测结果；
4)不耐突变。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明在于提供检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用，其能够提高实时PCR用于定性鉴定特定基因序列的敏感性和特异性的目的。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：
1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；
2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；
3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及
4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。
作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针。
作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用非特异荧光染料。
作为优选，所述非特异荧光染料是Sybr Green。
作为优选，在检测RNA标本时，采用实时荧光rt-PCR。
作为优选，在检测DNA标本时，采用实时荧光PCR。
作为优选，存在两种以上的待测靶点的荧光通道中加入至少两个与所述待测靶点相对应的探针。
作为优选，在存在两种以上的待测靶点的荧光通道中，该荧光通道中有N个待测靶点以及与所述待测靶点相对应的N个探针，其中，探针混合液中的每个探针的浓度为探针工作液的1/N。
作为优选，所述荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针。
如上述所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术在核酸定性与定量分析中的应用。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参仅仅使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力；
2、本发明采用全新的技术方案，在需要使用内参时可以引入待测基因作为内参，消除了内参占用荧光通道的传统做法，增加内参种类提高检测特异性和可靠性，同时内参还具有参与待测标本定性和定量分析的指标价值；
3、本发明将现有单一荧光PCR反应中探针的使用个数和待测靶点的个数，从传统的受到荧光通道个数的限制扩展到多于荧光通道的个数，提高了实时PCR平台基因检测的覆盖范围；
4、与现有的实时PCR定量分析时利用外在定量曲线参比的方式不同，本发明通过提高靶点检测容量为内置不同种类不同比例的待测基因片段作为定性和定量对照提供了可能，一方面可以提高检测结果的可靠性，同时不同标本与空白对照的比例关系，还为排除污染等假阳性提供信息。
附图说明
图1为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图一；
图2为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图二；
图3为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图三；
图4为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图四；
图5为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图五；
图6为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图六；
图7为实施例1的模板8818的扩增曲线图；
图8为实施例1的模板17616的扩增曲线图；
图9为实施例1的混合模板的扩增曲线图；
图10为实施例2的扩增曲线图；
图11为实施例3的扩增曲线图；
图12为实施例4的扩增曲线图；
图13为75个循环扩增之前的36个混合模板各特异性分子探针的Real-Time PCR扩增曲线图；
图14为75个循环扩增之后的36个混合模板各特异性分子探针的Real-Time PCR扩增曲线图；
图15为稀释前后，扩增曲线完全一致的两个模板A6,B12；
图16为稀释前后，扩增曲线迁移的模板B6；
图17为稀释扩增前后，扩增曲线往后移的模板C5；
图18为36个混合模板的Srbr Green荧光通道与C5荧光通道的单独的特异性分子探针扩增曲线图。
具体实施方式
参照附图对本发明做进一步说明。
本实施例公开了检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点，且该荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针或者非特异荧光染料；其中，荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针，非特异荧光染料是Sybr Green；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。另外，上述技术方案，该实时PCR技术适用于4荧光通道、5荧光通道以及6荧光通道的PCR仪；另外，在检测RNA标本时，其采用实时荧光rt-PCR；在检测DNA标本时，其采用实时荧光PCR。
Sybr Green染料在核酸定性和定量分析中得到广泛应用。当Sybr Green用于定量PCR分析时，现有技术通常可与融解曲线结合，用于提高定性分析的能力。然而，目前的实时PCR仪没有Sybr Green与TaqMan探针或分子信标探针联合使用的选择。作为实际应用，优选地，在联合其他探针时，Sybr Green的荧光信号可以利用6-FAM通道获取。在选定特定荧光通道的PCR完成之后，PCR产物可以重新在Sybr Green选项下进行溶解曲线分析。
TaqMan实时荧光PCR技术，在核酸的定性与定量分析中具有很大优势，相对比较敏感，用时不长，即可用于DNA的分析，也可用于RNA的分析。随着4通道和5通道或6通道荧光PCR仪器的推广应用，PCR用于核酸分析的通量也相应得到提高。针对特定情形待测样本中核酸片段数量有限如新冠病毒检测时的阳性率较低，本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了内参使用非靶点序列和内参单独占用一个荧光通道的缺点，并增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力。
任一荧光通道检测到荧光信号且低于一定的Ct(或者Cq)值时，即提示待测标本中存在待测基因片段的可能。而不同通道Ct值相互关系的变化，尤其是在有使用内参时，内参所在通道Ct值的变化关系，是判断信号来源真实性且具有否决价值的指标。内参所在通道荧光Ct值由大到小或者不同内参Ct值的翻转，是样本真实性的定性指标，该翻转的具体程度和具体Ct值，是样本中待测基因片段定量的指标。
不同通道检测不同数量的靶点，无论有无内参的引入，不同通道的荧光强度和荧光阈值循环数，都会相应有所体现。内参具有排除假阴性的功能，不同通道不同靶点数，则具有排除假阳性的功能。以下表1的不同靶点组合为例，当内参拷贝数分别为300，100，30拷贝时，待测样本中无靶点和不同拷贝靶点的多种情形，均涉及到四个通道荧光曲线的相互关系，一方面定量，同时也对假阴性和假阳性的定量具有判断价值。
表1
本申请总的设计思路为：4个荧光通道，第一个荧光通道用300拷贝季节性流感的RNA内参，其两个作用，一是监控逆转录反应是否工作，RNA是否逆转录为DNA，二是作为大部分标本(双病毒感染或流感感染除外)constant variable,恒量。第二个荧光通道用100拷贝DNA分子，新冠病毒的一个靶点A。第三个荧光通道用30拷贝DNA，新冠病毒的另一个靶点B。设计的巧妙在于第三通道除了有探针检测新冠靶点B之外，另外设计同样波长的探针探测新冠靶点C，D，E。这样第三个通道在没有新冠的标本时，扩增曲线在三个内参的最右边。因为模板量是300，100，30。而一旦标本中有新冠病毒，则第三个通道就以4倍的速度向左位移(检测了四个靶点)，如此，第三通道的扩增曲线就会超越第二通道，超越第一通道。当然一旦标本是阳性且标本中的目标基因拷贝数等于或大于10拷贝时，第四通道的扩增曲线会出现在最左边，因为检测32个靶点，即相当于320或者更多拷贝。
上述表1所述的设计，对于不同标本，可以表现为附图1～6所示的情形，在标本中待测目的基因片段为0时，三种内参的荧光PCR扩增曲线如图1所示，300拷贝的流感内参曲线在最左边，中间时100拷贝的新冠内参A片段，右边是新冠30拷贝的新冠内参B片段。参照图2所示，三个内参均没有显示可检测到的荧光信号，是扩增不工作的结果，对应临床检测是假阴性的来源之一。参照图3所示，第四通道检测到了荧光信号，但由于三个内参扩增曲线没有相应的位移，显示为临床检测的假阳性来源之一。当样本中含有靶基因时，如果标本中只有新冠靶基因，则流感300拷贝内参曲线表现为一个衡量，扩增曲线不随样本中新冠靶点拷贝数而位移，所以在图4～图6中，流感内参扩增曲线保持不动。荧光通道检测内参新冠B片段，这一荧光通道同时还有三个探针检测新冠的C，D，E基因片段，所以检测新冠B基因的通道3的扩增曲线，随着标本中新冠靶基因拷贝输的增加，扩增曲线从右向左移动，从三条内参曲线在0拷贝时位于最右边，逐渐向左方位移，30拷贝时两条含有新冠内参的扩增曲线向左移动靠近流感内参曲线，100拷贝时一条含有新冠B基因片段内参的扩增曲线位移到流感内参曲线左侧，300拷贝时两条含有新冠内参的扩增曲线都位移到流感内参曲线左侧。通道4检测32个靶标，所以扩增曲线只要标本目标拷贝数高于10拷贝，扩增曲线都位于三条内参曲线的左侧。
本发明通过增加内参种类，使用不同比例的内参，单一荧光检测多个靶点，不同荧光通道检测靶点保持特定比例关系，使待测样本在实际检测时，各荧光通道的Ct值动态反映待测靶点的定性和定量信息，构成动态彩色多维分析识别体系。这种不同荧光通道信息的相互关系，包含多种恒量和变量及其随样本中待测核酸性质而改变。其中的恒量有两种，即内参的比例和各种荧光通道设定的检测靶点多少的比例。变量主要是指待测标本中各种待测片段的多少和完整性，待测靶点之外的其他核酸成分多少的影响，以及待测标本中非核酸成分的影响。动态彩色二维码技术，通过对单一荧光通道荧光信号随时间变化的维度，以及不同荧光通道随时间变化的荧光信号强度的相互比例关系的维度，分析待测样本中不同靶点的有无和多少。这一新技术方案，在实际应用(如新冠核酸检测，艾滋病病毒检测)中，将极大降低假阴性，提高阳性检出率。同时，不同荧光通道中检测到的阳性荧光信号，若与内参设置和靶点设置的比例关系不符，则提示污染导致的假阳性的可能。
本发明用于基因定性分析时，对于待测样本只存在排他性单一待测基因时，通过采用一个待测目标基因或基因组对应一种或一种以上检测荧光通道，这样达到提高检测待测靶点远远多于荧光PCR仪器的通道的效果。如4通道的荧光PCR仪器，可以检测15中不同的目标基因或基因组。其探针与目标基因的对应关系如下表2：(其中：abcd代表荧光颜色通道，1-15代表待测目标)
表2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | |
| a | a | a | a | a | a | a | a | a | |||||||
| b | b | b | b | b | b | b | b | b | |||||||
| c | c | c | c | c | c | c | c | c | |||||||
| d | d | d | d | d | d | d | d | d |
本发明用于定量分析时，可以对一个基因或基因组的多个基因片段设计多重PCR扩增和相应的荧光探针显示，或采用Sybr Green与片段特异性探针结合的定性定量方案，如实施例所进行的对新冠病毒的检测一样，达到提高检测敏感性的效果。
部分荧光实时PCR检测试剂盒，如下表3所示的新冠测试试剂盒，不含内标。不含内标的检测，无法排除样本中具有抑制核酸扩增的成分导致的扩增低效率。因此，不含内标的试剂盒的阳性结果可以接受，而阴性结果则存在假阴性的可能。同样理由，含有内标而定量参考依赖外在定量曲线的定量数据决定的阴性判断，也无法排除特定待测标本中存在抑制核酸扩增或抑制部分特定序列核酸扩增导致的偏差。本发明方案采用内置定量内参，并直接采用待测靶标作为内参，提高了排除假阴性与假阳性的能力。
表3
与现有的实时荧光PCR技术比较，本发明专利具有敏感性高、测定基因覆盖范围广，因而抗基因突变的能力相对较强，具有一定抗污染能力和排除假阴性较强等优势，即可用于特定基因片段的定性分析，也可用于定量分析，在生物医学和环境监控等多个领域具有实用价值。
实施例1，与引物等距离双探针同样荧光标记检测两个不同片段实验。
上述技术方案中，作为优选，存在两种以上的待测靶点的荧光通道中加入至少两个与所述待测靶点相对应的探针。
实验材料：设计并合成8818与17616号DNA作为模板，并设计各自的TaqMan分子探针以及各自的特异性引物，其中探针5末端距离上游引物的距离均为4个碱基。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验步骤：实验分为3管，模板8818管，模板17616管，和双模板混合管。其中模板8818与模板17616管分别加入各自的1X的探针工作液，模板8818与模板17616混合管加入各自2X的探针工作液的混合溶液，保证混合之后的等体积情况下所包含的探针浓度与单独模板管的探针浓度保持一致。分别取浓度为10-6ng/μL的8818和17616作为单独Real-TimePCR的DNA模板，配置2X10-6ng/μL的8818与17616作为混合实验的DNA模板，保证两个模板混合之后，DNA上样的拷贝数与单独实验组保持一致。分别配置1X的8818与17616的探针工作液，工作液的配置如下：上游特异性引物(10μM)：4.5μL；下游特异性引物(10μM)：4.5μL；特异性分子探针(1μM)：1μL；补足水至50μL，震荡离心待用。配置2X的8818与17616的探针工作液，工作液配置如下：上游特异性引物(10μM)：4.5μL；下游特异性引物(10μM)：4.5μL；特异性分子探针(1μM)：1μL；补足水至50μL，震荡离心待用。配置好的探针工作液放入避光的离心管中，-20℃保存。取10-6ng/μL的8818与17616以及2X10-6 ng/μL的8818与17616的混合模板各3μL加入到PCR反应体系，取1X的8818与17616以及8818与17616的2X混合探针工作液各2μL至PCR反应体系，2×Taq PCR Master Mix 10μL，补足水至总体积20μL。PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共40个循环。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表1。
实验结果：如图7所示，探针8818的荧光值为0.04，Ct值为25左右；如图8所示，探针17616的荧光值为0.08；Ct值为25左右，如图9所示，混合模板混合探针的荧光值为0.12，Ct值为21左右。
实验结论：探针距离引物的距离相等，有可能在退火与延伸期收集荧光。多探针减少Ct值，有可能提高检测敏感性。
实施例2：与引物非等距离三探针联合使用实验。
上述技术方案中，作为优选，在存在两种以上的待测靶点的荧光通道中，该荧光通道中有N个待测靶点以及与所述待测靶点相对应的N个探针，其中，探针混合液中的每个探针的浓度为探针工作液的1/N。
实验材料：选取12994，9678，19851号DNA作为模板，设计并合成各自的特异性引物及特异性TaqMan分子探针。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验步骤：实验分为两管，其中探针混合浓度为1/3的为一管，探针混合浓度为1/1的为一管。分别配置1X的12994，9678，19851的探针工作液，各取10μL混合得到探针混合液，保证混合之后的溶液每微升所包含的探针浓度等于1X的探针工作液的1/3。工作液的配置如下：上游特异性引物(10μM)：4.5μL；下游特异性引物(10μM)：4.5μL；特异性分子探针(1μM)：1μL；补足水至50μL，震荡离心待用。
分别配置3X的12994，9678，19851的探针工作液，各取10μL混合，保证混合之后的溶液每微升所包含的探针的量与1X的探针浓度相一致。
工作液的配置如下：上游特异性引物(10μM)：4.5μL；下游特异性引物(10μM)：4.5μL；特异性分子探针(3μM)：1μL；补足水至50μL，震荡离心待用。分别取浓度为3X10-6 ng/μL的12994，9678，19851作为混合模板，保证3个模板混合之后的拷贝数都为一致。取3X10-6ng/μL的12994，9678，19851的混合模板3μL加入到反应体系，取1X与3X的12994，9678，19851的探针工作液混合溶液各2μL至PCR反应体系，2×Taq PCR Master Mix 10μL，补足水至总体积20μL。PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共40个循环。
实验结果：如图10所示，下方蓝色曲线为三探针均使用一分之一浓度的扩增曲线，上方灰色曲线为三探针均采用三分之一各自浓度的扩增曲线。两条扩增曲线的Ct值相同，但荧光所到达的最大值不同，后者明显高于前者。
实验结论：设置延伸后收集荧光，与引物不等距的同样荧光标记的多个探针联合应用时需要减少探针的用量。对本实验三探针联合使用时，各探针均采用三分之一浓度的效果优于都用一分之一的情形。
实施例3：多模板4通道联合检测实验。
作为优选，Hex荧光通道检测2～32个待测靶点；Sybr Green荧光通道检测2～33个待测靶点；Cy5荧光通道检测1～4个待测靶点；Texas Red荧光通道检测1个靶点。具体的，8模板4通道联合检测实验如下：
实验材料：选取1号，8号，流感，12994，9678，19851，18615，4230号DNA作为模板，设计并合成各自的特异性引物及特异性TaqMan分子探针。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验步骤：实验共一管，配置4X10-6 ng/μL12994,9678,18615,4230的DNA模板，各取10μL制成混合模板，保证每微升里所包含的拷贝数与单独实验组的拷贝数相一致。配置模板的5X的探针工作液，配置5X10-6 ng/μL19851的DNA模板，1号模板以及流感模板。分别取10μL流感，8号以及1号DNA模板；配置5X流感，8号以及1号模板5X的探针工作液，各取5μL探针工作液至混合模板中，加水补足至50μL，保证每微升的混合溶液中所包含的的DNA模板的拷贝数与探针浓度都与单独实验的拷贝数与探针浓度相等。取2μL内参加入到PCR反应体系中，取3μL混合模板加入到PCR反应体系中，2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10μL，取上游公共引物与下游公共引物各0.5μL至PCR反应体系，补足水至总体积20μL。PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共40个循环，其PCR扩增如图5所示。
实验结果：如图11所示，曲线由低到高分别为Texas Red检测的流感靶点；Cy5检测的8号靶点；Hex检测的19851，12994，9678，18615以及1号靶点；Sybr Green检测的19851，12994，9678，18615，1号以及8号靶点。4种荧光通道所检测的靶点数不同，检测靶点数越多，Ct值越小。
实验结论：多种荧光，多个探针，混合多种模板时，荧光通道检测的靶点越多，Ct值越小，Sybr Green检测的靶点最多，Ct值最小。
实施例4，模板量效关系测试实验。
实验材料：选取1号，8号，流感，12994，9678，19851，18615，4230号DNA作为模板，设计并合成各自的特异性引物及特异性TaqMan分子探针。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验步骤：实验共分为两管，一管为浓度为1/1的混合模板，一管为浓度为1/100的混合模板。分别取浓度为3X10-6 ng/μL的12994，9678，19851作为混合模板，保证3个模板混合之后的拷贝数都为一致。将混合后的模板稀释一百倍(取5μL稀释至500μL)。分别取混合前和混合后的DNA模板3μL至PCR反应体系，2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10μL，取1μL公共引物至PCR反应体系，补足水至总体积20μL。PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共40个循环，其PCR扩增图如上所示。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验结果：如图12所示，混合模板浓度为1/1的的Ct值比浓度为1/100的Ct值左移了8个循环左右，符合Real-Time PCR的量效关系。
实验结论：我们所选取的各DNA模板，符合Real-Time PCR的量效关系。
实施例5，用实时PCR替代高通量测序部分效能的实验。
实验材料：选取1，3，7，8，9，10，11，12，730，2065，2841，4052，4230，4988，8476，8818，9311，9678，11352，12637，13917，15968，16368，16888，17290，17616，18367，18615，18886，19138，19851，23351，25203，27073，28379共36个DNA为模板，设计并合成各自的特异性引物及特异性TaqMan分子探针。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验步骤：将36个模板混合成混合模板，稀释50万倍，扩增25个循环，再将得到的产物稀释50万倍，在扩增25个循环，将得到的产物继续稀释50万倍，再扩增25个循环。PCR上样体系为2X Taq Master Mix 12.5μL，DNA模板取1μL，上下游公共引物各加入0.4μL，加水补足至25μL。PCR反应体系为95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火10秒，72℃延伸10秒，40个循环。72℃终延伸2分钟。将经过约75个循环扩增的终产物与之前的混合模板作为DNA模板进行Real-Time PCR，实验共分为73管，其中前36管为扩增之前的36个混合模板的DNA模板，后36管为扩增之后的36个混合模板的DNA模板，前72管分别加入各个DNA模板的特异性分子探针，第73管为扩增之后的36个混合模板中加入非特异性荧光染料Sybr Green。配置36个模板各自的探针工作液，工作液的配置如下：上游特异性引物(10μM)：4.5μL；下游特异性引物(10μM)：4.5μL；特异性分子探针(1μM)：1μL；补足水至50μL，震荡离心待用。取混合模板3μL至PCR反应体系，取1X的36个模板各自的探针工作液各2μL至PCR反应体系，2×Taq PCR Master Mix 10μL，补足水至总体积20μL。第73管的PCR上样体系2×NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus 10μL，36个DNA混合模板取3μL，上下游公共引物各加入0.4μL，加水补足至20μL。PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共40个循环。PCR扩增见附图8～13。模板，引物以及各自的探针均由上海生工合成，序列见表4。
实验结果：如图13～18所示，经过50×50×50万倍稀释以及75轮扩增之后的混合模板与稀释扩增之前的混合模板，其相同的特异性分子探针的Ct值表现出前移，后移，重叠三种趋势。而作为加入非特异性荧光染料Sybr Green的混合模板孔的Ct值明显高于加入特异性分子探针的Ct值。
实验结论：通过上述实验，实时PCR可以对多重PCR的各个子扩增元的扩增效率进行评价。在本实验中，36个不同的扩增片段，大部分再扩增75个循环后，彼此比例保持相对稳定。实时PCR的这一新功能，一定程度上可以替代高通量测序的部分效能，用于评价多重PCR反应体系是否具有均衡扩增。
综上所述，与现有技术相比，本申请具有以下优势：
1、本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参仅仅使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力；
2、本发明采用全新的技术方案，在需要使用内参时可以引入待测基因作为内参，消除了内参占用荧光通道的传统做法，增加内参种类提高检测特异性和可靠性，同时内参还具有参与待测标本定性和定量分析的指标价值。本发明将现有单一荧光PCR反应中探针的使用个数和待测靶点的个数，从传统的受到荧光通道个数的限制扩展到多于荧光通道的个数，提高了实时PCR平台基因检测的覆盖范围；
3、与现有的实时PCR定量分析时利用外在定量曲线参比的方式不同，本发明通过提高靶点检测容量为内置不同种类不同比例的待测基因片段作为定性和定量对照提供了可能，一方面可以提高检测结果的可靠性，同时不同标本与空白对照的比例关系，还为排除污染等假阳性提供信息；
4、除了设置的阳性内参外，不同待测基因靶点所用荧光通道的不同比例关系，也构成一种动态内参指标。由于不同序列的核酸无论是核糖核酸还是脱氧核糖核酸在环境中的半衰期均各不相同，本发明采用的不同比例方案，可以作为结果分析时评估不同靶点在待测标本中相对比例的依据。另外，随着不同试剂盒的使用，构成试剂盒待测片段的完整性和数量信息可以反馈用于试剂盒的更新和改进，保留相对稳定的靶点和剔除变异较大的靶点，使试剂盒所选择的待测靶点能提供尽可能多的信息。
表4新冠特异性模板序列、引物和探针序列
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在PCR仪的多个荧光通道中存在：
1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；
2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；
3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及
4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道不相同。
2.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针。
3.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用非特异荧光染料。
4.根据权利要求3所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述非特异荧光染料是Sybr Green。
5.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在检测RNA标本时，采用实时荧光rt-PCR。
6.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在检测DNA标本时，采用实时荧光PCR。
7.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：存在两种以上的待测靶点的荧光通道中加入至少两个与所述待测靶点相对应的探针。
8.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在存在两种以上的待测靶点的荧光通道中，该荧光通道中有N个待测靶点以及与所述待测靶点相对应的N个探针，其中，探针混合液中的每个探针的浓度为探针工作液的1/N。
9.根据权利要求2所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针。
10.如权利要求1～9中任一项所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术在核酸定性与定量分析中的应用。
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