CN106868140B

CN106868140B - 多重荧光定量pcr的方法

Info

Publication number: CN106868140B
Application number: CN201710121610.0A
Authority: CN
Inventors: 虞之龙; 刘玚; 邱海维
Original assignee: Beijing Kubo Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Kubo Technology Co ltd
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2037-03-02
Also published as: CN106868140A

Abstract

本发明提供了一种多重荧光定量PCR的方法。该方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮热循环，10≤N≤50；每轮热循环后对PCR产物进行程序升温，获得多个目标PCR扩增片段形成的混合片段的熔解曲线；计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。该方法能利用单个光学采集通道的数据实现对各目标扩增片段进行准确检测和定量，且不受目标片段数量、多个目标片段的解链温度是否已知或是否接近的限制。

Description

多重荧光定量PCR的方法

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR领域，具体而言，涉及一种多重荧光定量PCR的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称为PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。利用该PCR技术，可以在体外由非常少量的DNA通过热循环生成大量的DNA。PCR技术包括若干个重复的循环，每个循环包括模板的解链、引物与模板的杂交和引物的延伸步骤。

多重PCR通过加入多对引物，来实现单个PCR反应体系中对多个目标片段的扩增。同步的扩增反应减小了实验的成本，缩短了PCR分析的总时间，同时也减小了实验之间的差异，降低了交叉污染的风险，因此在DNA检测领域有着广泛的应用。

传统的PCR和多重PCR仅能对扩增的最终产物进行定量，存在一定的限制。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System简称为QPCR)是在普通PCR体系中加入荧光化学物质对每次热循环后产物的总量进行测定，其结果可以较快取得且数据较为稳定。通过实时检测样品的荧光强度，可以精确的反推出待测样品中的特定DNA序列的初始浓度。

现有技术中，有些QPCR使用双链DNA染料对扩增产物进行定量。这类染料自身几乎没有荧光，在单链DNA存在的情况下，也没有荧光。只有在与双链DNA结合后，这类染料能产生很强的荧光。然而，这类染料无法识别特定的序列，因此无法对多种扩增产物分别进行定量。为了避免这一缺点，多重QPCR通常使用多个荧光标记的特异性探针。探针能够结合到产物中间的特定序列，并在扩增过程中水解而产生荧光。通过使用荧光标记的特异性探针对特定的扩增产物进行定量，使得多重QPCR成为可能。

尽管如此，基于荧光探针的多重QPCR还是存在一定的限制。首先探针需要标记上不同的荧光染料，仪器也需要具备多个光学检测通道。由于染料的发射光谱特性和仪器光学检测通道的规格，可以相互组合的染料种类和数量存在一定的限制。通道之间的串扰也可能导致检测准确度的下降。此外，合成荧光标记探针、配置一台可以采集多个通道的QPCR仪器，都需要增加不少的经济成本。

因此，需要有一种新的多重荧光定量PCR的方法，以解决现有技术中在单个荧光检测通道下进行多重QPCR时存在的普适性低以及准确度差的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种多重荧光定量PCR的方法，以解决现有技术中的多重荧光定量PCR方法普适性差及准确度不够的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多重荧光定量PCR的方法，该方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50；每轮PCR热循环后，对PCR产物进行程序升温，获得多个目标片段形成的混合片段的熔解曲线；根据混合片段的熔解曲线，计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据各单一目标片段的扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。

进一步地，通过对混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量。

进一步地，通过利用公式(2)对混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量：

公式(2)，在公式(2)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，n表示目标片段的数量，n为≥2的整数，i为自然数，参数a_i表示第i个的目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b_i表示第i个目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c_i表征第i个目标片段在温度为Tm_i±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm_i表示第i个目标片段的熔解温度，e为自然常数。

进一步地，获得公式(2)的步骤包括：建立各单一目标片段的熔解曲线；利用公式(1)对各单一目标片段的熔解曲线进行拟合；将各单一目标产物的熔解曲线的拟合公式进行叠加，得到公式(2)；

公式(1)，在公式(1)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，参数a表示对应的单一目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b表示对应的单一目标片段产物的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c表征对应的单一目标片段在温度为Tm±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm表示对应的单一目标片段的熔解温度，e为自然常数。

进一步地，程序升温是按照0.5～10℃/s的升温速率从起点温度升至终点温度。

进一步地，起点温度为40～90℃，终点温度为60～100℃。

进一步地，每一轮PCR热循环后，在对PCR产物进行程序升温的过程中，对PCR产物的荧光强度进行采集，从而获得混合片段的熔解曲线。

进一步地，采集的速率为0.2～100点/秒。

进一步地，将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增的步骤中，同一扩增体系中包括双链DNA染料。

进一步地，建立各单一目标片段的熔解曲线的步骤包括：利用各单一目标片段对应的单一引物对进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，其中，每一轮PCR热循环的步骤包括：85～100℃的解链以及解链之后的40～75℃的延伸；在任意一轮PCR热循环后，优选在最后一轮热循环后，采集各单一目标片段的PCR产物的荧光强度，建立各单一目标片段的熔解曲线。

应用本发明的技术方案，通过在单个QPCR反应中，在每个热循环后，加入一个升温的过程，以获取多个目标产物混合的熔解曲线，通过对混合的熔解曲线的分析来获取每一热循环后不同产物的含量，进一步获取不同产物的初始含量，进而实现了对多个PCR扩增的目标片段进行定量。本发明的多重QPCR方法，可以利用单个光学采集通道的数据，在不受目标片段数量的限制，也不受多个目标片段的解链温度是否已知或是否接近的限制的情况下，实现对各目标片段进行准确检测和定量。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了单一目标片段的PCR扩增产物的荧光强度随温度变化的熔解曲线的示意图；

图2示出了多个不同的目标片段的PCR扩增产物分别扩增时随温度变化具有不同的熔解曲线的示意图；

图3示出了多个不同的目标片段的PCR扩增产物在同一体系中扩增时显示为多种不同目标片段各自熔解曲线的叠加；

图4示出了现有的QPCR的扩增循环过程的示意图，每轮循环包括95℃解链和60～70℃的延伸步骤，荧光采集发生在延伸步骤结束时；

图5示出了本发明的QPCR的扩增循环过程的示意图，每轮循环包括95℃解链和60～70℃的延伸步骤，延伸步骤结束后增加一个程序升温的过程，荧光强度在此期间采集；

图6示出了本发明的利用单一目标引物对进行PCR扩增建立的各单一目标片段的扩增产物含量随扩增循环数变化的扩增曲线示意图；

图7示出了本发明的利用对熔解曲线的负一阶导曲线上每一个目标片段对应的峰面积进行积分，以积分值表征各个目标片段的含量的示意图；

图8示出了本发明的利用熔解曲线的负一阶导曲线上每一个目标片段对应的峰高度表征各个目标片段的含量的示意图；

图9示出了本发明实施例1的三个目标片段各自分别扩增后得到单一目标片段的熔解曲线及混合在同一体系中扩增得到的混合熔解曲线图；

图10示出了本发明的实施例1利用拟合公式(2)对图7中每轮PCR热循环后的混合片段的熔解曲线中的各单一目标片段的含量(以对应的荧光强度值来体现)进行计算，得到各单一目标片段每轮PCR热循环后的含量(以对应的荧光强度值来体现)，从而建立的各目标片段的扩增曲线；

图11示出了本发明的实施例1根据图10所述的扩增曲线建立的各单一目标片段的Ct值与起始浓度的关系曲线；

图12示出了本发明的实施例1利用图7所示的方法获得扩增曲线后，建立的各单一目标片段的Ct值与起始浓度的关系曲线；

图13示出了本发明的实施例1利用图8所示的方法获得扩增曲线后，建立的各单一目标片段的Ct值与起始浓度的关系曲线；

图14示出了本发明的实施例2中采用本发明的多重QPCR的方法检测得到的实验结果与传统的单一目标片段的QPCR检测实验结果一致；

图15示出了本发明的实施例2中采用本发明的多重QPCR的方法，利用图7所示方法检测得到的实验结果与传统的单一目标片段的QPCR检测实验结果一致；以及

图16示出了本发明的实施例2中采用本发明的多重QPCR的方法，利用图8所示方法检测得到的实验结果与传统的单一目标片段的QPCR检测实验结果一致。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

名称解释：

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。

扩增曲线：PCR扩增过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中显示目标片段含量的实时荧光强度为纵坐标所建立的曲线。

基线：指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，在扩增曲线上呈现为水平，该水平部分为基线，表示反应荧光明显增加前的背景荧光值。

阈值/荧光阈值/设定阈值：阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它作为荧光检出界限，可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。

Ct值(Cycle threshold，循环阈值)：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

Tm值(Melting Temperature，解链温度或熔解温度)：DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。

熔解曲线：在存在双链DNA结合染料时，对双链DNA进行加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，达到Tm温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物的Tm值不同，因而可以用来鉴别PCR产物的特异性。

如背景技术所提到的，现有的多重QPCR方法存在定量不准确的缺陷，为了改善这一状况，发明人对现有的多重QPCR方法进行了深入分析，发现现有技术中在使用双链DNA染料进行多重QPCR时，对于多个目标片段含量的检测，是通过在每个热循环延伸的步骤后，增加与检测目标个数相同数量个温度平台，这些温度为各个目标检测片段的熔解温度所分隔。然后通过在相应温度下读取荧光值，利用目标片段的熔解温度不同来计算定量。比如，多重PCR检测的目标片段为A、B和C 3个，且已知三个目标片段的熔解温度分别为65℃、75℃和85℃，因此，在每轮热循环之后，在60℃下所检测到的荧光强度为A+B+C三个片段的总量，增加一个在70℃下的荧光强度检测，可以获得B+C两个片段的荧光强度值，而再增加一个在80℃的荧光强度检测，即可获得目标片段C的荧光强度。这样可以获得每轮热循环后各目标片段的含量。但该方法的问题是：

1)需要预先知道每个目标检测片段的熔解温度，才能设置循环过程中检测点的温度。

2)目标检测片段熔解温度较为接近时，无法选择合适的温度进行检测区分。比如，三个目标片段的熔解温度分别为75℃、78℃和80℃时。

3)只使用和目标检测片段数相同数量的温度点的荧光进行计算(例如，检测2个片段时，只读取2个温度点下的荧光强度，检测3个片段时，只读取3个温度点下的荧光强度)，数据点有限。同时没有考虑到荧光背景随着温度的变化，从而造成计算结果准确度不高。

本发明的发明人试图从增加读取荧光强度的温度点的数量以及荧光强度随温度变化特性等各种对目标片段的荧光强度产生影响的因素考虑，来提高现有多重QPCR的检测准确度及普适性。具体研究过程如下。

双链DNA染料在双链DNA片段存在的情况下会产生荧光，当双链DNA解链成单链时，荧光消退。如图1所示，当温度从延伸温度75℃开始逐渐上升时，某一目标片段的荧光强度值逐渐下降。且当温度接近目标片段的熔解温度时，体系的荧光强度值将发生显著的下降。不同扩增片段具有不同的熔解温度，因此呈现出不同形状的熔解曲线，如图2所示。

为了准确地体现各单一目标片段的荧光强度随温度变化的特性，发明人将影响单一目标片段的荧光强度随温度变化的因素分别用不同的参数来表示，并将各因素对荧光强度的综合影响体现在以下公式(1)中，即用如下的公式(1)对单一目标片段的熔解曲线进行拟合，

上述公式(1)中，自变量x为温度，因变量y为相对荧光强度，参数a某单一目标片段的含量对应的荧光强度，参数b为该单一目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数Tm为该单一目标片段的熔解温度，参数c为该单一目标片段在熔解温度附近(如温度在Tm±5℃范围内)荧光强度下降速率，参数d为背景荧光强度，e为自然常数。

上述公式(1)中，a与目标片段含量呈正比，d与体系相关。参数b、c、Tm具有目标扩增片段的特异性，比如A、B和C三个目标片段，参数b、c、Tm为各目标片段所固有的特性，并不因其是单独进行QPCR，还是合在一起进行多重QPCR而发生变化。因而，根据单一目标片段的熔解曲线上的多个温度x与对应的相对荧光强度y之间的关系，即可利用公式(1)求出参数a、b、c、d和Tm。

进一步地，当这些单一目标片段混合在一起时，熔解曲线将呈现为这些产物的熔解曲线的叠加，如图3所示。因此对于n种目标片段的混合物的熔解曲线，用如下的公式2进行拟合即为：

上述公式(2)中，自变量x为温度，因变量y为观察到的相对荧光强度，n表示目标片段的数量，n为≥2的整数，i为自然数，参数a_i为第i个目标片段的含量对应的荧光强度，参数b_i为第i个目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c_i为第i个目标片段在熔解温度附近(如温度在Tm_i±5℃范围内)荧光强度的下降速率，参数d为背景荧光强度，参数Tm_i为第i个目标片段的熔解温度，e为自然常数。

拟合可以得到参数a_i。具体在拟合过程中，将单一目标片段进行相同的PCR扩增作为阳性对照，然后利用公式(1)计算出各单一目标片段的参数b_i、c_i和Tm_i，将各单一目标片段的参数b_i、c_i和Tm_i代入拟合公式(2)中，即可计算得到各单一目标片段的a_i。

对待测样品的每个热循环后的熔解曲线进行拟合，即可获得样品在每个热循环后，各个单一目标片段的含量，由此可得到每一种目标片段的扩增曲线，进一步利用扩增曲线对样品中各单一目标片段的模板的初始含量进行定量。

比如，待测的目标片段有A、B和C三个，共进行40个热循环，则可以获得A片段从第1个热循环到第40个热循环共40个荧光强度，同样地，B片段和C片段也各有40个荧光强度，因而，对于A片段而言，可以获得其荧光强度随热循环数的增加而变化的扩增曲线，B片段和C片段也可获得其扩增曲线。后续即可按照单一目标片段的QPCR定量方法获得其扩增模板的起始量。

下面结合具体的实验流程来进一步说明本发明的实现方案：

一个常规的QPCR循环过程包括85～100℃的解链以及解链之后的40～75℃的延伸。比如，如图4所示，包括95℃的解链和60～70℃的延伸。为了获得目标片段的熔解曲线，通常在最后一轮热循环步骤结束后，增加一个从延伸温度到解链温度的升温过程并在此过程中采集荧光，从而获得该目标片段的熔解曲线。

而本发明，为了获取每一轮热循环后混合的目标片段的熔解曲线特性，因而在每一轮热循环的延伸步骤结束后，加入一个程序升温的过程，从40～90℃的起点温度升温至60～100℃。根据仪器设备性能和实验需求的不同可以合理设定升温的速率，优选按照0.5～10℃/s的升温速率从起点温度升至终点温度。升温速率越慢，所得到的熔解曲线越准确，但反应所需要的时间也越长，同时过长的反应时间可能对反应体系造成不良的影响。综合仪器设备的性能和实验需求，可以合理设定荧光采集的速率。荧光采集速率越高，所得到的熔解曲线越准确，但产生的数据量也越大。本发明优选将荧光采集的速率设定为0.2～100点/秒。

在一些更优选的实施例中，如图5所示，升温的起点在60～80℃之间，升温的终点在80～95℃中间。更优选升温程序的温度范围为70～95℃，升温的速率设定在0.1～3.0℃/s。在该升温期间进行荧光强度的采集，采集的速率可以是0.5～30点/秒。

具体分析时，首先对同一实验中的单一引物的阳性对照组进行分析。可以选取出现扩增后的任意一轮热循环后的熔解曲线数据，优先选取最后一轮热循环后的熔解曲线数据，利用公式(1)进行拟合，得到单一引物下每一个目标片段对应的参数b、c和Tm。之后对多个目标片段的混合片段的熔解曲线数据采用公式(2)进行拟合，其中参数b_i、c_i和Tm_i来自的单一引物的阳性对照组的拟合结果。然后拟合获得各个单一目标片段的定量值a_i。对实验中每个循环后的熔解曲线进行拟合，可以获得每个样品中各个目标片段在每个循环后的定量值，从而获得每个样品中各个目标片段的扩增曲线(如图6所示)，进一步计算出Ct值，从而获得各目标片段的起始浓度。

上述对单一引物的阳性对照组进行分析，建立单一目标片段的熔解曲线的步骤中，选取任意一轮热循环后的熔解曲线数据的涵义并非从第1轮热循环到第N轮热循环中的任意一轮。本领域技术人员清楚的是，荧光定量PCR检测的过程中，根据目标片段特性的不同，通常前几轮热循环后目标片段的量比较少，其荧光信号难以与本底信号区分，通常是作为本底信号的，因而此处的任意一轮指的是，高出本底荧光信号之后的任意一轮热循环。在实际操作中，由于随着热循环数的增加，目标片段的含量越多，其荧光强度越强，检测的荧光强度也越准确。因而，优选采用最后一轮热循环后的熔解曲线数据。

需要说明的是，在本发明所建立的在每一轮热循环之后增加程序升温获得多个目标片段的混合片段的熔解曲线的发明思想基础上上，利用该混合片段的熔解曲线获取各单一目标片段的含量的方法并不局限于上述所提到的公式(2)的拟合方法，还可以采用对熔解曲线的负一阶导曲线进行分析，对曲线上每一个目标片段对应的峰面积进行积分，以积分值表征各个目标片段的含量，如图7所示，图中阴影部分的面积即代表各个目标片段的含量。也可以采用熔解曲线负一阶导曲线中，每个目标片段对应的峰高度来表征各个目标片段的含量，如图8所示。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

多重QPCR法测定全基因组DNA溶液中的DUF1220和DYS14基因片段浓度

1.体系配置

1.1样品准备：某单一来源男性全基因组DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至10ng/μl，在此基础上进行5倍浓度梯度稀释，获得DNA浓度分别为10ng/μl,2ng/μl,0.4ng/μl,0.08ng/μl及0.016ng/μl溶液。

1.2引物溶解：用于目标片段扩增的上下游引物共6条，具体见表1。

表1：

各引物溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，成对引物等比例混合，溶液中正、反向引物终浓度均为2μM。

1.3反应溶液配制：分别对五个不同浓度样品进行QPCR实验，反应溶液成分组成见表2。其中内参DNA模板序列见表3。

表2：

表3：

2.QPCR扩增过程

PCR体系扩增反应为95℃5min预变性；40个循环：95℃5s变性；60℃15s退火延伸，75～90℃恒定速率升温获取熔解曲线，升温速率为0.2℃/s，采集间隔为1s。

3.数据分析

取仅包含DUF1220、DYS14或内参基因(Internal Positive Control,IPC)引物的实验组作为阳性对照，取最后一个循环的熔解曲线数据，如图9所示。根据公式1进行拟合，得到三者扩增片段对应的参数b、c和Tm，具体见表4所示.

表4：

	b	c	Tm
				DUF1220	0.0078	1.8535	84.79
DYS14	0.0056	1.6640	90.09
				IPC	0.0001	1.8657	80.69

对所有样本在所有循环的熔解曲线数据，如图9中的混合曲线所示，根据公式2进行拟合，得到每一个循环后，每个样品中三种基因的扩增片段含量。一个典型的样品在经过本方法的多重QPCR后，三种基因的扩增曲线如图10所示。由此可以计算出样品中3种目标片段的Ct值，结果如表5所示。

表5：

由此计算得到了该体系下的DUF1220基因和DYS14基因检测工作曲线，如图11所示。

此外，也可以采用对熔解曲线的负一阶导曲线进行分析，对曲线上每一个目标片段对应的峰进行积分，以积分值表征各个目标片段的含量。结果如表6所示。

表6：

由此计算得到了该体系下的DUF1220基因和DYS14基因检测工作曲线，如图12所示。

此外，还可以采用熔解曲线负一阶导曲线中，每个目标片段对应的峰高度来表征各个目标片段的含量。结果如表7所示。

表7：

由此计算得到了该体系下的DUF1220基因和DYS14基因检测工作曲线，如图13所示。

从结果上比较，使用公式2拟合计算的结果相对较好。

实施例2

多重QPCR法测定男女全基因组DNA混合溶液中的男、女基因含量比例。

1.体系配置

1.1样品准备：

某单一来源男性全基因组DNA样本和某单一来源女性全基因组DNA样本使用10mMTris-HCl缓冲溶液分别稀释至25ng/μl，在此基础上进行5倍、25倍、125倍、500倍及1000倍稀释。使用男性DNA 1000倍稀释溶液分别与女性DNA的6中浓度溶液等体积混合，得到女、男DNA比例分别为1000：1，500：1，125：1，25：1，5：1和1：1的溶液。

1.2引物溶解：

具体引物同实施例1。各引物溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，成对引物等比例混合，溶液中正、反向引物终浓度均为2μM。

1.3反应溶液配制：

分别对6中男女DNA混合样品及男、女DNA单一样品1000倍稀释溶液进行QPCR实验，PCR反应体系的组成如表2所示。

2.QPCR扩增过程

PCR体系扩增反应为95℃5min预变性；40个循环：95℃5s变性；60℃15s退火延伸，75-95℃恒定速率升温获取熔解曲线，升温速率为0.2℃/s，采集间隔为1s。

3.数据分析

方法同实施例1。取仅包含DUF1220、DYS14或IPC内参基因引物的实验组作为阳性对照，取最后一个循环的熔解曲线数据，根据公式1进行拟合，得到三者扩增片段对应的参数b、c和Tm，代入公式2进行拟合，得到每一个循环后，每个样品中三种基因的扩增片段含量。由此可以计算出样品中3种目标片段的Ct值。单一QPCR的结果如表8所示，使用本方法的多重QPCR结果如表9所示。

表8：

表9：

从表8和表9的数据可以看出，使用本发明的方法的进行多重QPCR的实验结果与传统的单一QPCR实验结果一致，根据上述结果计算得到每个样品中男性与女性DNA的浓度值，如图14所示，与实际情况符合良好。

此外，也可以采用对熔解曲线的负一阶导曲线进行分析，对曲线上每一个目标片段对应的峰进行积分，以积分值表征各个目标片段的含量。单一QPCR的结果如表10所示，多重QPCR结果如表11所示。

表10：

表11：

根据上述结果计算得到每个样品中男性与女性DNA的浓度值，如图15所示。

此外，还可以采用熔解曲线负一阶导曲线中，每个目标片段对应的峰高度来表征各个目标片段的含量。单一QPCR的结果如表12所示，多重QPCR结果如表13所示。

表12：

表13：

根据上述结果计算得到每个样品中男性与女性DNA的浓度值，如图16所示。

从结果上比较，使用公式2拟合计算的结果相对较好。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在单个QPCR反应中，利用单个光学采集通道的数据，在每个热循环后，加入一个升温的过程，以获取多个目标DNA扩增产物混合的熔解曲线，通过对混合的熔解曲线的分析来获取每一热循环后不同产物的含量，进一步获取不同产物的初始含量，进而实现了对多个PCR扩增的目标片段进行定量。本发明的多重QPCR方法不受目标片段数量的限制，也不受多个目标片段的解链温度是否已知或是否接近的限制，都能够对各目标片段进行准确检测和定量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京酷搏科技有限公司

<120> 多重荧光定量PCR的方法

<130> PN63409KBKJ

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acatagcgac agattacaac attagtattg 30

<210> 7

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参DNA模板正向序列

<400> 7

aagcgtgata ttgctctttc gtatagttac catggcaatg cttagaacaa tactaatgtt 60

gtaatctgtc gctatgt 77

<210> 8

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参DNA模板反向序列

<400> 8

acatagcgac agattacaac attagtattg ttctaagcat tgccatggta actatacgaa 60

agagcaatat cacgctt 77

Claims

1.一种多重荧光定量PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：

将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，且所述同一扩增体系中包括双链DNA染料；

每一轮PCR热循环后，对PCR产物进行程序升温；

在对所述PCR产物进行程序升温的过程中，对所述PCR产物的荧光强度进行采集，从而获得所述多个目标片段形成的混合片段的熔解曲线；

建立各单一目标片段的熔解曲线，利用公式(1)对各所述单一目标片段的熔解曲线进行拟合；

将各所述单一目标产物的熔解曲线的拟合公式进行叠加，得到所述公式(2)；

在所述公式(1)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，参数a表示对应的单一目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b表示对应的单一目标片段产物的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c表征对应的单一目标片段在温度为Tm±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm表示对应的单一目标片段的熔解温度，e为自然常数；

在所述公式(2)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，n表示目标片段的数量，n为≥2的整数，i为自然数，参数a_i表示第i个的目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b_i表示第i个目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c_i表征第i个目标片段在温度为Tm_i±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm_i表示第i个目标片段的熔解温度，e为自然常数；

利用公式(2)对所述混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算所述每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；

根据各单一目标片段的扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据所述Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升温是按照0.5～10℃/s的升温速率从起点温度升至终点温度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述起点温度为40～90℃，所述终点温度为60～100℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述PCR产物的荧光产物进行采集的速率为0.2～100点/秒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，建立各单一目标片段的熔解曲线的步骤包括：利用各单一目标片段对应的单一引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，其中，每一轮PCR热循环的步骤包括：85～100℃的解链以及解链之后的40～75℃的延伸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在最后一轮PCR热循环后，采集各单一目标片段的PCR产物的荧光强度，建立各所述单一目标片段的熔解曲线。