CN101603094A - 利用解链特征图谱检测多重荧光pcr产物的方法及产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用不同目的基因片段具有不同的解链特征图谱、通过荧光定量PCR同时检测多个基因的方法，包括：根据待测的多个目的基因序列分别设计多对引物；配制包含双链DNA特异性的荧光染料的多重荧光PCR扩增的反应体系；在反应体系中，用多对引物同时分别扩增多个目的基因，扩增同时设立阳性对照；记录待测样本和阳性对照荧光定量PCR的解链特征图谱，并通过将待测基因的解链特征图谱与阳性样本的解链特征图谱作比较，根据解链特征峰判定待测基因是否是阳性样本所对应的目的基因产物。同时提供利用该方法的检测试剂盒。本发明能同时检测2－10个目的基因，并具有成本低、无需合成探针、耗时短、结果分析简单便捷、应用领域极其广泛的优点。

Description

利用解链特征图谱检测多重荧光PCR产物的方法及产品

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用解链特征图谱检测多重荧光PCR产物的方法及其产品，该方法可以在一个荧光定量PCR反应中同时检测多个荧光PCR扩增的基因产物。更具体的说，该方法利用不同目的基因片段在解链过程中生成的不同的解链特征图谱，运用荧光定量PCR方法，针对多个基因同时进行检测。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：(1)在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

荧光定量PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，使PCR的扩增及其分析在同一封闭的系统下完成，具有特异性好、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、假阳性低、操作简单、交叉污染机会少、不污染环境(不需要使用EB)等优点，因此其应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。目前研究的热点有：

1.1微小残留病变的检测    肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变(MRD)的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。荧光定量PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病(AML)最常见的染色体异常是交互易位t(8；21)(q22；q22)，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用荧光定量PCR来检测融合基因有助于对这些病人的MRD进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病(CML)的BCR-ABL融合基因；急性淋巴细胞性白血病(ALL)的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤(FL)的染色体易位t(14；18)(q32；q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于荧光定量PCR方法的应用，随着技术的发展，荧光定量PCR的运用将不断地扩大。

1.2细胞因子的表达分析    细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应(包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素(IL-1～IL-23)，干扰素(IFN-α，IFN-γ等)，集落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，肿瘤生长因子(TGF-β等)和化学因子(MCP-1，MIP-1等)。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而real-time反转灵PCR(RT-PCR)以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。

1.3肿瘤耐药基因表达的研究    对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞对耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有：ATP结合盒基因超家族(ATP-binding cassettesuperfamily)的膜转运蛋白介导的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)，多药耐药相关蛋白(MRP)，肺耐药相关蛋白(LRP)，乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶(Topo)，谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，蛋白激酶C(PKC)，脱氧胞嘧啶核苷激酶(deoxycytidine kinase)等，凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc等。多药耐药(MDR)是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time反转录PCR(RT-PCR)是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。

1.4病毒感染的定量监测    扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。荧光定量PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较多的是在器官移值中对使用免疫抑制剂的病人用Real-time Q-PCR来定量测定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病人中用荧光定量PCR检测CMV感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗CMV药物治疗能使血中的病毒含量下降，荧光定量PCR对于快速定量骨移植病人的CMV感染和监测CMV复活是一个有用的工具。

1.5基因表达研究    由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子(TPO)在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢(ITP)、再生障碍性贫血(AA)和特发性血小板多症(ET)等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPO mRNA水平明显升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO的作用提供了依据。日本Shimokawa等也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。

1.6免疫组份分析  对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。

1.7基因突变及多态性的研究    美国Ibrahim等1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。

1.8其他方面    日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbcl拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因(pla)的实验方法。

但是，在荧光定量PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用荧光定量PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。另外，与传统的PCR技术相比，荧光定量PCR的不足之处是：(1)由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)需要用不同的荧光素来标记不同的探针，而Real-time PCR中荧光的发射光谱是很难实现对不同荧光探针的区分，因此相对地限制了荧光定量PCR的对多个基因检测的应用能力；(3)目前荧光定量PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。

针对荧光定量PCR的优缺点，近年来又发展了多重荧光PCR技术。多重荧光PCR是在同一反应体系中加入多个引物对和探针，同时检测多个目的基因的方法，该方法可以方便的进行一管多检，从而达到省时省力的目的。但是，多重荧光PCR技术仍然需要引入探针，并且需要杂交过程，存在检测成本高、操作繁琐、检测基因数目有限的缺点，已经不能适应针对同一待检样品中同时检测多个目的基因的需求。

因此，目前需要一种能结合多重荧光定量PCR技术的优点，同时又不需要探针的快速PCR检测法，以适应目前分子生物学检测领域的多基因的快速鉴定的需要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，基于目前的荧光定量PCR分析多基因领域的迫切要求，发明人根据在荧光定量PCR的引物扩增目的基因过程中所产生的解链特征图谱(strandsdissociation characteristic spectrum，SDCS或dissociation characteristic spectrum，DCS)，与阳性对照基因的解链特征图谱进行对比，以得出在单一体系中同时检测多个基因而不需要探针的技术。

因此，本发明的第一个目的是提供一种利用解链特征图谱以检测多重荧光定量PCR产物的试剂盒，其中包括：待测基因模板，阳性对照基因，目的基因N的引物对，能结合DNA双链而不结合单链的荧光染料、PCR反应缓冲液，其中反应缓冲液含有MgCl ₂、dNTPs、DNA扩增聚合酶，引物浓度范围为50-5000nM，目的基因N为2-10个目的基因，优选2-7个，更优选3-5个。

在一个实施方案中，所述的荧光染料是能结合DNA双链而不结合单链的荧光染料，优选是Beyond Green I荧光染料。

在另一个实施方案中，如果需要，还包含用于扩增内参基因(即内源性的参照基因)的引物。其中，内参基因优选微管蛋白基因、肌动蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖体蛋白基因。

在一个具体实施方案中，所述的待测基因模板可以是来自同一基因组的模板，也可以是来自多个基因组的模板，优选来自2-3个基因组的模板。

在另一个具体实施方案中，如果需要，所述的试剂盒还包含产品说明书。

在另一个具体实施方案中，如果涉及cDNA的扩增产物，则反应缓冲液含有MgCl ₂、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶。

本发明的第二个目的是提供一种利用上述试剂盒，通过解链特征图谱检测荧光定量PCR反应产物的方法，包括：

(1)根据待测的多个目的基因序列分别设计多对引物；

(2)配制包含双链DNA特异性的荧光染料的多重荧光PCR扩增的反应体系；

(3)在反应体系中，用步骤(1)的多对引物同时分别扩增多个目的基因，扩增同时设立阳性对照；

(4)记录待测样本和阳性对照荧光定量PCR的解链特征图谱，并通过相互比较以判断待测样本中的目的基因；

其中，所述的解链特征图谱是PCR反应完成后，将反应液从60℃缓慢升温至100℃，升温速率为0.2℃/s，每升高0.2℃连续记录荧光值的变化，最终将温度的变化与荧光值的变化求负倒数(-dF/dT)后对温度作图，可得到扩增产物的解链特征图谱，其中所述的荧光值表示每50％量的DNA双链发生解链后所测定的荧光读数值；和

其中判定标准为：将待测基因的解链特征图谱与阳性样本的解链特征图谱作比较，根据特征峰判定待测基因是否是阳性样本所对应的目的基因产物。

在一个方案中，其中所述的荧光值表示每50％量的DNA双链发生解链后所测定的荧光读数值；所述的判断标准为：检测阳性对照样本，调整每组引物(目的基因和/或内参基因的引物)在多重PCR反应中的浓度，使每个待测基因在荧光定量PCR反应的解链特征图谱中的峰高与内参的峰高基本一致，以该引物浓度进行待测样品的多重荧光降落PCR扩增，将所得的解链特征图谱与阳性样本的解链特征图谱作比较，出现了哪个特征峰就判定为存在阳性样本所对应的目的基因产物。

在一个具体实施方案中，PCR扩增的反应条件优选是95℃预变性5min，然后95℃，30s；64℃，30s；68℃，30s，35个循环。

在另一个具体实施方案中，所述的染料是能结合DNA双链而不结合单链的荧光染料，优选是1×Beyond Green I(1∶10,000)(购自毅新兴业(北京)科技有限公司，产品目录号：BY-FG-01)。

在另一个具体实施方案中，该荧光的激发光源优选为96个绿色发光二极管(LED)，激发范围是470-505nm，荧光检测器采用光电倍增管(PMT)，灵敏度极高。

在另一个具体实施方案中，多重荧光降落PCR扩增基因序列的反应体系为：

待测物      模板     0.5μl

            正向引物    1μl

目的基因1

            反向引物    1μl

            正向引物    1μl

目的基因2

            反向引物    1μl

            正向引物    1μl

目的基因N

            反向引物    1μl

            反应缓冲液  11.25μl

            水          补足至25或50μl

其中，引物浓度范围为50-5000nM，目的基因N为2-10个目的基因，优选2-7个，更优选3-5个。其中当N≥3时，反应体系为50μl(甚至100μl)。

在另一个具体实施方案中，所述的目的基因选自转基因生物(GMO)中的基因(如经济作物中的转基因、食品中的转基因)、经济作物或食品中的多致病菌基因、细胞因子基因、表达的mRNA、抗药或耐药基因、多SNP、疾病或病毒的多个特征基因等等。其中，目的基因可以是来自同一基因组，也可以来自不同的基因组。

还在一个具体实施方案中，所述的目的基因是大鼠视网膜组织中SAP97和alpha-CaMKII基因，所述的内参基因是大鼠β-actin基因，所述的引物分别是SAP97-F/R、CaMKII-F/R：GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、Rat actin beta-F/R。

还在另一个具体实施方案中，所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米BT11中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因P-35S和hsp70 intron的联合片段(280bp)，所述的引物分别是玉米Maximizer 176-F/R、玉米Bt11 F/R、玉米MON810-F/R。

定义

术语“荧光值”表示每50％的DNA双链发生解链后所测定的荧光读数值，该荧光优选的激发光源为96个绿色发光二极管(LED)，激发范围是470-505nm，荧光检测器采用光电倍增管(PMT)，灵敏度极高。

术语“解链特征图谱”(strands dissociation characteristic spectrum，SDCS或dissociationcharacteristic spectrum，DCS)，表示当每升高0.2℃记录荧光值，最终将温度的变化与荧光值的变化求负倒数后对温度作图。由于不同目的基因具有特征性解链荧光值温度，因此只要这些温度之间具有一定温度差(例如大于3-30℃，优选大于3-10℃，更优选3-5℃)，就能得到该目的基因的特征峰值。将多个目的基因同时进行检测，则得到区分度或置信度好的峰值图。

术语“荧光染料”是一种非特异性的结合于双链DNA小沟的染料，最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。该荧光染料，与杂交探针比较，不需要设计特定的序列，其检测原理是：荧光染料与双链DNA结合后，其荧光强度大大增强。在PCR反应体系中加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子荧光信号极弱，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因此，本发明可使用已有的荧光染料，例如1×Beyond Green I(1∶10,000)(毅新兴业(北京)科技有限公司，产品目录号：BY-FG-01)。

术语“内参基因”，又名内源性的参照基因，其和引物的作用在于检测多个目的基因(N为2-10，优选3-5)时，通过内参基因及其引物消除体系中的背景或噪音，以确定目的基因的引物具体浓度。一旦已经确定了待测基因数目和引物的合适浓度后，反应体系中可不包括内参基因的引物。一般而言，内参基因选自与目的基因具有相同基因组来源的持家基因(house-keeping gene)，由于内参基因与目的基因都来自同一总基因组，因此目的基因的扩增模板也是内参基因的模板。另外，如果内参基因与目的基因分属于不同的基因组，但因为内参基因属于所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的基因(如微管蛋白基因、肌动蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等)，因此，来自不同基因组的目的基因的扩增模板，同样也可作为内参基因的模板。通过将内参基因与目的基因同时进行平行扩增，以消除反应的抑制剂和确保样品中靶基因的成功扩增；另外，在定量分析中，内参基因也可用来估计样品中靶基因的总量，因此其作用在于确定体系中的引物浓度、估计靶基因总量、优化反应条件。

有益效果

与传统的多重荧光定量PCR相比，本发明的创新点在于同时检测多个基因过程中无需设计多个探针，通过利用不同目的基因片段的序列不同因而其扩增的解链特征图谱不同这个特性，通过比较待测样本与阳性标本的解链特征图谱来判断待测基因的有无。本发明具有操作简便、重复性高、交叉污染少等优点。

相比于传统的方法，本发明具有成本低(无需合成多个探针)、耗时短(可在一次反应中检测2-10个基因)、结果分析简单便捷(只需对照阳性样本的解链特征图谱即可判断目的基因的有无)、应用领域极其广泛的优点。

因此，本发明可检测转基因生物(GMO)中的基因(转入经济作物中或转基因食品中的筛选基因、标记基因)、经济作物或食品中的多致病菌基因、细胞因子基因、表达的mRNA、抗药或耐药基因、多SNP、疾病或病毒的多个特征基因等等。相比于传统的方法，具有成本低(无需合成多个探针)、耗时短(可在一次反应中检测2-10个基因)、结果分析简单便捷(只需对照阳性样本的解链特征图谱即可判断目的基因的有无)、应用领域极其广泛的优点。今后必将在疾病检测和各种病原检测中得到更加广泛的应用。

附图说明

图1-5：检测大鼠视网膜组织中SAP97和alpha-CaMKII基因的解链特征图谱，其中X轴表示解链温度，Y轴表示荧光值，特征峰值表示对应扩增产物的解链温度。

图6：用于验证多重荧光PCR的解链特征图谱的凝胶电泳结果，其中泳道1-5为Y1-Y5反应体系，泳道M(Marker)为分辩率为100bp的分子量标记(自上向下依次是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。

图7：检测转基因玉米Maximizer 176、BT11、MON810中外源基因或标记基因的解链特征图谱，其中X轴表示解链温度，Y轴表示荧光值，特征峰值表示对应扩增产物的解链温度。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。

实施例一检测大鼠视网膜组织中SAP97和alpha-CaMKII基因的表达

实验材料：所用的荧光染料购自1×BEYOND Green I(1∶10,000)(毅新兴业(北京)科技有限公司)；反应缓冲液(内含MgCl ₂、dNTPs、DNA高保真扩增聚合酶等)。

实验步骤：

(一)、根据《分子克隆实验指南》第3版(萨姆布鲁克著，金冬雁译，科学出版社)的方法以从大鼠视网膜组织中提取RNA，经逆转录后生成的cDNA为模版。其中，为了优化反应条件，以大鼠β-actin为内参基因。

(二)、设计引物信息：

SAP97-F：CCCTCCACACCACAGGCAAAT

SAP97-R：GCAGCTGCTCCTCCCGTGATAAT

CaMKII-F：GGCCTGTGGCGTCATCCTGTAT

CaMKII-R：GGACGGGTTGATGGTCAGCAT

内参基因(Rat actin beta)F：5-cacccgcgagtacaaccttc-3

内参基因(Rat actin beta)R：5-cccatacccaccatcacacc-3

(三)反应体系参见表1，其中设计5个内参引物的浓度梯度Y1-Y5，从中选取最适引物组。

表1：反应体系

待测基因		Y1(μl)	Y2(μl)	Y3(μl)	Y4(μl)	Y5(μl)
								cDNA模板	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
SAP97	正向引物	1	1	1	1	0
								反向引物	1	1	1	1	0
CaMKII	正向引物	1	1	1	1	0
								反向引物	1	1	1	1	0
内参	正向引物	0.25	0.5	0.75	1	1
								反向引物	0.25	0.5	0.75	1	1
	反应缓冲液	11.25	11.25	11.25	11.25	11.25
								水补齐至总量	25	25	25	25	25

(四)、反应条件为：

95℃  5min

(95℃ 30s 64℃ 30s 68℃ 30s  Plate read)35cycles

60℃-100℃每升高0.2℃记录一次荧光值生成的解链特征图谱。

(五)、实验结果及分析

1、荧光PCR结果分析

1)图1所示，Y1内参引物终浓度为50nM，其他引物为200nM，解链特征图谱出三个峰。其中84℃表示SAP97的解链特征峰，86.6℃为alpha-CaMKII解链特征峰，91.8℃为内参基因大鼠β-actin的解链特征峰(下同)，这三个峰值95％置信区间无重叠，特征峰清晰，并且内参引物优势不明显。

2)图2所示，Y2内参引物终浓度为100nM，其他引物为200nM，解链特征图谱出三个峰，三个峰值95％置信区间无重叠，特征峰清晰，但内参引物峰占优势，较为不适宜采用该检测体系。

3)图3所示，Y3内参引物终浓度为150nM，其他引物为200nM，解链特征图谱出三个峰，但内参引物峰占优势，并且84℃的峰值已经不明显，已经不适合采用该检测体系。

4)图4所示，Y4内参引物终浓度为200nM，其他引物为200nM，解链特征图谱只有内参基因大鼠β-actin的91.8℃峰值的较为明显，并且待测基因SAP97和CaMKII置信区间重叠，无特征峰，这表明内参占绝对优势，已经不适合采用该检测体系。

5)图5所示，Y5只有内参基因大鼠β-actin及其引物，这清晰显示91.8℃峰值为内参基因的特征峰。Y5用于作为内参对照，并验证cDNA。

因此，从上确定最适合的反应体系为Y1。

2、电泳检测结果分析

将上述PCR产物，按照常规方法进行琼脂糖凝胶电泳检测。其中泳道1-5为表1中的Y1-Y5反应体系，泳道M(Marker)为分辩率100bp的分子量标记(自上向下依次是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，SAP97是227bp、大鼠β-actin是207bp、CaMKII是181bp，因此中间条带为内参大鼠β-actin。

如图6所示：

1)Y1泳道内三条待测基因清晰可见，分别为227bp的SAP97、207bp的大鼠β-actin、181bp的CaMKII。电泳结果表明使用Y1体系进行多重荧光PCR，能够有效检测出待测基因SAP97、CaMKII和内参基因大鼠β-actin。

2)Y2泳道内，内参基因占优势，并且CaMKII已经不明显，内参抑制作用开始增强。

3)Y3泳道内，内参基因占优势，并且CaMKII和SAP97不明显，表明内参抑制作用更为增强，该体系已经不适合用于检测。

4)Y4泳道内，内参基因占绝对优势，并且没有CaMKII和SAP97，表明该体系已经不适合用于检测。

5)Y5泳道为内参对照泳道，只有内参引物，做对比，验证cDNA。

因此，作为荧光PCR的结果验证，电泳结果分析证实通过解链特征图谱所确定的Y1体系中的引物浓度比例为最适引物浓度。

实施例二转基因玉米Maximizer 176、BT11、MON810的检测

为了检测玉米中是否含有外源的转基因，使用本方法对多种玉米种属的外源标记基因或筛选基因同时进行多重荧光PCR检测。

实验材料：所用的荧光染料购自1×BEYOND Green I(1∶10,000)(毅新兴业(北京)科技有限公司)；反应缓冲液(内含MgCl ₂、dNTPs、1.5U AmpliTaq Gold DNApolymerase、0.3U的AmpErase UNG酶等)。

(一)、基因组DNA的提取

基因组DNA用cetyltrimethy lammonium bromide的方法从0.1g植物组织中分离得到；DNA浓度用Gene-Quant RNA/DNA Calculator(Amersham Pharmacia BiotechEurope GmbH，Freiburg，Germany)测得，并经琼脂糖凝胶电泳和EB染色与已知的lambda phage标准品比较而进一步确认。

(二)、设计引物信息：

玉米Maximizer 176-f：GTG GAC AGC CTG GAC GAG AT

玉米Maximizer 176-r：TGC TGA AGC CAC TGC GGA AC

用于扩增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。

玉米Bt11-f：TCC TTG TCC TTG ACA CAG TTT CTG

玉米Bt11-r：GAT GTC ACT AGT CCG AGA ACG AA

用于扩增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。

由于上述两端引物扩增crylA(b)基因的不同序列，因此解链特征图谱不同于玉米Maximizer 176的外源的目的基因crylA(b)。

玉米MON810-f：TGA TGT GAT ATC TCC ACT GACG

玉米MON810-r：CGG CAA GTA ATC AGC ACA G

用于扩增外源的目的基因P-35S和hsp70 intron两个基因连接的一段，共280bp。

(三)、反应体系参见表2：

表2反应体系

待测基因	引物	(μl)
			玉米Maximizer的crylA(b)	正向引物(150nM)	2
	反向引物(150nM)	2
			玉米Bt11的crylA(b)	正向引物(50nM)	2
	反向引物(50nM)	2
			玉米MON810的P-35S和hsp70 intron	正向引物(200nM)	2
	反向引物(150nM)	2
				反应缓冲液	33
	水补齐至总量	50

(四)、反应条件为：

95℃  5min

(95℃ 30s 64℃ 30s 68℃ 30s Plate read)35cycles

60℃-100℃每升高0.2℃记录一次荧光值生成的解链特征图谱。

(五)、实验结果及分析

如图所示，用Maximizer 176、Bt11和MON810特异性PCR体系做三重PCR反应，解链特征图谱出三个峰。其中76.9℃表示MON80的解链特征峰，85.2℃表示Bt11的解链特征峰，88.9℃表示Maximizer176的解链特征峰，其相应的扩增片段的解链温度分别相差8.3℃、3.7℃和12℃，95％置信区间无重叠。因此，在表2的适当引物浓度下，完全可以清晰的区分各特异性扩增片段的解链特征峰，说明这种技术也可用于三重PCR反应。

综合实施例1-2，相比于传统的方法，本发明具有成本低(无需合成多个探针)、耗时短(可在一次反应中检测2-10个基因)、结果分析简单便捷(只需对照阳性样本的解链特征图谱即可判断目的基因的有无)、应用领域极其广泛的优点。

Claims (10)

1.一种利用解链特征图谱以检测多重荧光定量PCR产物的试剂盒，包含：

待测基因模板、阳性对照基因、目的基因N的引物对、能结合DNA双链而不结合单链的荧光染料、PCR反应缓冲液；

其中反应缓冲液含有MgCl₂、dNTPs、DNA扩增聚合酶；

目的基因N为2-10个目的基因。

2.权利要求1的试剂盒，其中目的基因N为2-7个，更优选3-5个。

3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述的荧光染料是Beyond Green I荧光染料。

4.权利要求3的试剂盒，其中还包含用于扩增内参基因的引物对，所述的内参基因选自微管蛋白基因、肌动蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖体蛋白基因。

5.权利要求3的试剂盒，用于扩增eDNA的反应缓冲液含有MgCl₂、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶。

6.利用前述的试剂盒，通过解链特征图谱检测荧光定量PCR反应产物的方法，包括：

(1)根据待测的目的基因序列分别设计引物；

(2)配制包含双链DNA特异性的荧光染料的多重荧光PCR扩增的反应体系；

(3)在反应体系中，用步骤(1)的引物同时分别扩增目的基因，扩增同时设立阳性对照；

(4)记录待测样本基因和阳性对照的荧光定量PCR的解链特征图谱，并通过相互比较以判断待测样本中的目的基因；

其中，所述的解链特征图谱是PCR反应完成后，将反应液从60℃缓慢升温至100℃，升温速率为0.2℃/s，每升高0.2℃连续记录荧光值的变化，最终将温度的变化与荧光值的变化求负倒数(-dF/dT)后对温度作图，可得到扩增产物的解链特征图谱；和

判定标准为：将待测基因的解链特征图谱与阳性样本的解链特征图谱作比较，根据特征峰判定待测基因是否为阳性样本所对应的目的基因产物。

7.权利要求6的方法，其中PCR扩增的反应条件优选是95℃预变性5min，然后95℃，30s；64℃，30s；68℃，30s，35个循环。

8.权利要求6或7的方法，其中所述的目的基因选自转基因生物(GMO)中的基因(转入经济作物中或转基因食品中的筛选基因、标记基因)、经济作物或食品中的多致病菌基因、细胞因子基因、表达的mRNA、抗药或耐药基因、SNP、疾病或病毒的多个特征基因等等。其中，目的基因可以是来自同一基因组，也可以来自不同的基因组。

9.权利要求8的方法，其中所述的目的基因是大鼠视网膜组织中SAP97和alpha-CaMKII基因，所述的内参基因是大鼠β-actin基因，所述的引物分别是SAP97-F/R、CaMKII-F/R：GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、Rat actin beta-F/R。

10.权利要求8的方法，其中所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米BT11中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因P-35S和hsp70intron的联合片段(280bp)，所述的引物分别是玉米Maximizer 176-F/R、玉米Bt11 F/R、玉米MON810-F/R。

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