CN110514629A - 一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法 - Google Patents

一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明在已制作的细胞生物印迹聚合物膜基础上，进一步对其表观单分子性质和作为传感器机制深入研究。制作出的高保真性的印迹聚合物膜，通过叶酸受体连接Ligprobe后，再经过RCA滚环扩增信号扩增表征，在微观分子程度上印迹聚合物与模板细胞的高度契合；生物印迹能够在纳米尺度上区分靶分析物的总体大小和表面特征，由于纳米尺度的差异，在此基础上生物印迹具有区分微米尺度上相同的细胞的能力，意味着印迹聚合物膜可能用作生物传感器，可应用在基于细胞表面膜蛋白种类差异分离细胞，这种差异可作为基于生物印迹的癌症诊断工具，本研究还制作基于印迹聚合物膜的电化学传感装置，该装置成本低廉，便于操作并可反复使用，在生物传感领域具有十分广阔的应用前景。

Description

一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法。
发明背景
生物印迹能够在纳米尺度上区分靶分析物的总体大小和表面特征，由于纳米尺度的差异，生物印迹具有区分微米尺度上相同的细胞的能力意味着可能用作生物传感器，可应用在基于细胞表面蛋白质的细微差异分离细胞，这种差异可能用作为基于生物印迹的癌症诊断工具。
细胞印迹在聚合物上形成的分子印迹聚合物(MIP)可作为细胞和组织成像的“塑性抗体”的应用，可以特异性定位和定量这些分子在固定的和活的细胞和组织上的亚结构，在基础生物学和医学诊断中，需要不断定位和量化特定的分子靶标，生物成像包括定位和定性或定量测定细胞内和靶细胞上的靶分子，在这种情况下，蛋白质及其相互作用的动力学和定位研究是令人非常感兴趣的领域，大部分研究目的以获得关于它们功能的信息或检测异常，同时分子印迹聚合物也被用于活细胞成像。
本发明中，在已制作的细胞生物印迹聚合物膜基础上，进一步对其表观单分子性质和作为传感器机制深入研究。制作出的高保真性的印迹聚合物膜，通过叶酸受体连接Ligprobe后，再经过RCA滚环扩增信号扩增表征，证明在微观分子程度上印迹聚合物与模板细胞的高度契合；生物印迹能够在纳米尺度上区分靶分析物的总体大小和表面特征，由于纳米尺度的差异，在此基础上生物印迹具有区分微米尺度上相同的细胞的能力，意味着印迹聚合物膜可能用作生物传感器，可应用在基于细胞表面膜蛋白种类差异分离细胞，这种差异可能用作为基于生物印迹的癌症诊断工具，本发明还制作基于印迹聚合物膜的电化学传感装置，该装置成本低廉，便于操作并可反复使用，在生物传感领域具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法。
技术方案：
如附图1所示：本研究在制作完整保真的印迹聚合物膜的基础上，对其进行表观单分子层面的研究分析，具体实验操作如下。制备印迹聚合物膜后，先超声清洗，再用PBS缓冲液清洗1～3次，除去印迹表面的残留物质，随后加入 10μL含引物Ligprobe的DNA上样液(最终浓度为200nM)，加入上样液的时候使溶液均匀铺开，随后将印迹聚合物膜放置在水浴锅烧杯中，孵育在温度为30℃的条件下，时间为1h，在引物DNA与印迹膜孵育的过程中，时刻观察毋使印迹聚合物表面水分蒸发干净，若水分减少可加入PBS缓冲液保持湿润。取出孵育后的印迹聚合物膜后，用PBS缓冲清洗1～2次洗去未结合的Ligprobe，为防止溶液中残留的Ligprobe影响后续实验及观察。配制200μL RCA的滚环扩增的反应溶液，在印迹聚合物膜上加入所配制的滚环扩增反应体系，继续将印迹聚合物膜放置在水浴锅的烧杯中，反应在温度为30℃的条件下，两个小时，在反应的过程中仍旧需要保持印迹聚合物表面湿润，毋使印迹聚合物表面反应液蒸发干净，若水分减少可加入Reaction buffer缓冲液保持液体环境。取出上述RCA的滚环扩增反应后的印迹聚合物膜，在室温条件下吸出剩余的反应溶液，随后用PBS缓冲液清洗1～3次，再使用绿色荧光DNA染料FTag-2(G)染料染色。向印迹聚合物膜上加入200μL FTag-2(G)工作液(浓度为10μM)和载样缓冲液，使FTag-2(G)与样品中DNA充分结合，FTag-2(G)工作液加入量为总上样量相同，室温放置20min，随后吸出剩余的染色溶液，再用PBS缓冲液清洗1～3次，放置在荧光显微镜下观察，如不能及时观察，应用铝膜包裹减少荧光淬灭，在12h内荧光观察。
本研究所用的寡核苷酸合成与纯化由上海生工生物工程有限公司完成，序列如下：SEQ ID NO 1：
Ligprobe(5，-(folic acid)(Spacer 18)TTTTTTTTAGACACTATATGACA-3，)，SEQ IDNO 2：CDNA， (5，(PO4)TCGTTTTAGCTTGCTGAGGCTGATTTACTAGCTTGCTGAGGCTG CCTGATGTCATATAGTGTCTAAA-3，)，并且所有的DNA序列都经过高效液相层析纯化(HPLC)。RCA滚环扩增实验原理验证
RCA滚环扩增是新近发展起来的一种常温核酸扩增方法，由于其反应条件简洁，无需PCR仪繁琐的步骤，已获得了非常广阔的应用，在核酸检测中具有很大的潜力和应用价值。在初始引物的存在下，以环状DNA为模板，通过特定酶的催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含若干重复的模板互补片段。
本实验为扩大引物Ligprobe与印迹聚合物膜结合后的信号，采用了RCA 滚环扩增技术。当Ligprobe与印迹聚合物结合后，其末端的引物可做为复制起始位点，在环状CDNA模板及φ29酶存在的条件下，利用溶液中的dNTPs合成单链DNA。在溶液条件下，该反应结果如附图2所示，
附图为不同溶液RCA滚环扩增后的产物经过凝胶电泳后的图像，完整反应体系1×为50μL，分别含有10μL浓度为200nM的Ligprobe，2.5μL浓度为1 μM的CDNA，5μL浓度为10mM的dNTPs，1μL浓度为10U/μL的φ29酶， 10μL浓度为5×的RB(Reaction buffer)及21.5μL的ddH2O，电泳条件为80V， 30min。条带①为分子量100～10000bp的Maker；条带②为未加入φ29酶的反应结果，其他条件一样，最下边两条为未反应的Ligprobe和环状CDNA；条带④为未加入环状CDNA；条带③和⑤分别为正常条件下在25℃和30℃的进行反应的结果，由于RCA滚环扩增后的DNA分子量十分巨大，约10000bp，因此其扩增产物留在点样孔中。
印迹聚合物表观单分子识别的荧光表征
在经过RCA滚环扩增的印迹聚合物膜上加入200μL FTag-2(G)绿色荧光染料，染色20min，随后吸出剩余的染色溶液，再用PBS缓冲液清洗1～3次，放置在荧光显微镜下观察，激发波长为450～490nm，放射波长的峰点是在 509nm，结果如附图3所示。
附图3为印迹聚合物表观单分子经过RCA滚环扩增后的荧光图，图a为对照组，图b为实验组。从实验组可以清晰的观察出印迹聚合物膜结合Ligprobe，再经过RCA滚环扩增和FTag-2(G)绿色荧光染色后的丝状荧光，本结果证明了该实验方案的可行性和准确性。
基于细胞印迹膜的电化学传感实验原理
利用优化后，具有良好导电性能的聚二甲基硅氧烷制作出高度保真性的印迹聚合物膜后，将其固定在电极表面，制作出入附图4所示的基于细胞印迹膜的电化学传感器。本实验用MCF-7细胞作为模板细胞，将其印迹底物固定在检测电极表面后，置入含正常状态的MCF-7细胞(浓度为106个/mL)检测液中，电化学检测均采用CHI600D电化学工作站及传统的三电极系统，其中修饰印迹聚合物膜电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极为对电极。EIS 扫描电位0.224V，振幅5mV，频率范围：0.01Hz～10kHz，使用的电解质均为PBS。
印迹聚合物膜的电化学检测
附图5为基于印迹聚合物膜的电化学检测Electrochemical ImpedanceSpectroscopy(EIS)图，浅红色线条为裸金电极，表面未修饰东西，所以扫描结果为一条直线；蓝色线条为在裸金电极表面修饰一层导电印迹聚合物膜，其阻抗值比较低；玫瑰色线条为修饰印迹聚合物膜后的电极捕获到靶细胞的阻抗图，具有很大的阻抗值，本结果证实了该检测装置的可靠性与准确性。
本发明在制作高度保真性的印迹聚合物膜的基础上，进一步对其表观单分子深入研究，经过RCA滚环扩增信号，证明在微观分子程度上印迹聚合物与模板细胞的高度契合，生物印迹可以根据纳米级特征来区分细胞类型，而不仅仅是细胞的微观尺寸和形状；同时制作基于印迹聚合物膜的电化学传感装置，由于其成本低，操作简单，可反复利用，因此该装置在未来生物检测领域具有非常大的潜在应用。
附图说明
图1：印迹聚合物表观单分子识别实验原理
图2：RCA滚环扩增电泳图
图3：印迹聚合物表观单分子识别荧光图
图4：基于细胞印迹膜的电化学传感实验原理图
图5：印迹聚合物膜的电化学检测结果(EIS)图
具体实施方法
制备方法包括如下步骤：
制为进一步证明印迹聚合物对模板细胞的选择性，本研究利用模板细胞膜在印迹聚合物上印迹成型的表面蛋白分子印迹，对其叶酸受体进行RCA滚环扩增，扩增目标产物，随后对扩增后的DNA进行荧光染色并观察，操作步骤如下，先经过玻片硅烷化、细胞处理、细胞固定后印迹聚合物膜的制备。
印迹聚合物膜的制备
配制PDMS固化混合物(单体∶交联剂＝10∶1)，若发现有气泡，可超声 5～10min脱气，使液体粘稠均匀透彻且无气泡。然后将该固化混合物旋涂到细胞培养皿上(100mm×20mm)上约0.5cm厚度适宜，左右轻微晃动(若发现有气泡可超声3～5min脱气)，静止2min使PDMS表面平整无凸起和凹陷，随后将培养皿放到恒温箱中，PDMS固化混合物在80℃下预固化3分钟后立即取出，再将制作的灭活后的细胞玻片水平轻轻压入PDMS固化混合物中，并在80℃下保持4小时，然后放在25℃下固化24小时。随后取出固化细胞后的PDMS培养皿，用镊子将玻片缓慢剥离，并将留下印迹的聚合物膜浸没在装满蒸馏水的培养皿中超声处理5分钟，然后将培养皿倒扣在吸水纸上，待印迹聚合物膜表面无水分后，用原子力显微镜观察表面形态。
引物Ligprobe分子识别
制备完整的印迹聚合物膜后，先用PBS缓冲液清洗2～5次，然后加入10μ L含引物Ligprobe的DNA缓冲液(浓度为200nM)，加入的时候使溶液均匀铺开，随后将印迹聚合物膜放置在水浴锅烧杯中，保持温度为30℃，一个小时，孵育的过程中，时刻观察，毋使印迹聚合物表面水分蒸发干净，若水分减少可加入PBS缓冲液保持湿润。
基于RCA的滚环扩增
取出与引物Ligprobe的DNA缓冲液孵育一个小时的印迹聚合物膜后，用 PBS缓冲清洗1～2次除去未结合的Ligprobe，防止溶液中残留的Ligprobe影响后续实验及观察。配制50μL RCA的滚环扩增的反应溶液，总体系如下：
表RCA的滚环扩增的反应体系
在印迹聚合物膜上加入上述所配制的反应体系200μL，随后将印迹聚合物膜放置在水浴锅的烧杯中，继续保持温度为30℃，两个小时，在反应的过程中保持印迹聚合物表面湿润，毋使印迹聚合物表面反应液蒸发干净，若水分减少可加入Reaction buffer缓冲液保持液体环境。
荧光显微镜表征
在室温条件下，取出上述RCA的滚环扩增反应后的印迹聚合物膜，吸出剩余的反应溶液，随后用PBS缓冲液清洗1～3次，再使用绿色荧光DNA染料 (SYBR Green I)染料染色。向印迹聚合物膜上加入200μL FTag-2(G)染色液液(浓度为10μM)，室温放置20分钟，使FTag-2(G)与样品中DNA充分结合，随后吸出剩余的染色溶液，再用PBS缓冲液清洗2～3次，荧光显微镜观察。
基于细胞印迹的电化学传感
为更方便快捷的在印迹聚合物膜上捕获靶细胞，并实时表征出来，本研究结合了电化学工作系统，制作出电化学生物印迹膜传感器。由于电化学技术本身具有高效、灵敏、快速、高特异性、检测装置简单、结构易于微型化和集成化等优势，电化学生物传感器已成为生物传感器领域中最为活跃的应用之一。本实验设计的电化学生物印迹膜传感器兼顾电化学传感器和印迹聚合物两者的优点和长处，具有极大的潜在应用价值。
导电印迹聚合物膜的制备
在使用印迹膜附着在电极表面时，为增加印迹聚合物膜的导电性，同时不影响印迹聚合物的结构和性质，本研究提出了在印迹聚合物膜表面和内部加入金纳米颗粒的方案，预实验表明在印迹聚合物加入金纳米颗粒后，印迹聚合物的性质保持不变，同时拥有了优良的导电性，具体操作如下。
在配制PDMS固化混合物(单体∶交联剂＝10∶1)时，向刚配制的固化混合物总加入体积1/10的金纳米颗粒溶液(浓度为100nM)，若发现有气泡，可超声5～10min脱气，使液体粘稠均匀透彻且无气泡，此时溶液略显红色。为使印迹聚合物膜的上下两面具有更好的导电性，需要在培养皿底部先加入100μL 的金纳米颗粒溶液(浓度为100nM)，然后将该固化混合物旋涂到细胞培养皿上(100mm×20mm)上约0.1cm厚度适宜，左右轻微晃动(若发现有气泡可超声3～5min脱气)，静止2min使PDMS表面平整无凸起和凹陷，随后将培养皿放到恒温箱中，PDMS固化混合物在80℃下预固化3分钟后立即取出，随后在印迹聚合物上表面也加入100μL的金纳米颗粒溶液(浓度为100nM)，再经过80℃下预固化1分钟后立即取出。然后将制作的灭活后的细胞玻片水平轻轻压入PDMS固化混合物中，并在80℃下保持4小时，然后放在25℃下固化24 小时。随后取出固化细胞后的PDMS培养皿，用镊子将玻片缓慢剥离，并将留下印迹的聚合物膜浸没在装满蒸馏水的培养皿中超声处理5分钟，然后将培养皿倒扣在吸水纸上，待印迹聚合物膜表面无水分后，用原子力显微镜观察表面形态。
电极表面印迹聚合物的组装
取金电极在水虎鱼溶液(98％H2SO4与30％H2O2体积比3∶1)中浸泡5～10min 以除去电极表面吸附的有机物，双蒸水冲洗干净，在细砂纸(3000目)上打磨电极，依次用粒径为1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末加水抛光，双蒸水冲洗 3～5次，在纯水中超声5min，50％HNO3浸泡30min，在无水乙醇和纯水中各超声5min，0.5M H2SO4循环伏安扫描(0～+1.6V)至信号稳定(20圈)，最后用氮气吹干电极待用。
把制作好的印迹聚合物膜轻轻放置在上述处理后电极表面，浸泡在空白电解液(10mM Tris-HCl，pH 7.4)待用。
基于细胞印迹的电化学识别
取生长状态良好的细胞，用1mL胰蛋白酶处理2min，再用配制的1×PBS (pH 7.4)溶液洗脱胰蛋白酶酶解下来的细胞，经过800rpm离心5min，然后重悬细胞，吹打细胞使其单个均匀分散，另取10微升计数，稀释浓度至106个 /mL。本研究利用MCF-7细胞作为模板细胞，制作出高度保真的印迹聚合物，并固定在检测金电极的表面，取稀释合适浓度的MCF-7细胞与电极一起孵育 5～20min，利用电化学工作站扫描反应过程的交流阻抗图EIS。
电化学交流阻抗图EIS是一种能对电极表面发生反应过程中进行快速灵敏表征的电化学检测方法，EIS一般包括高频区的半圆部分和低频区的直线部分，其中半圆部分的直径代表电子传递阻力，直线部分与扩散过程有关。
以上详细描述了本发明关于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的基本方式的制备过程，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，只要其不违背本发明的基本通过细胞印迹对细胞进行识别和检测的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (2)

1.制作出的高保真性的印迹聚合物膜，通过叶酸受体连接Ligprobe后，再经过RCA滚环扩增信号扩增表征，在微观分子程度上印迹聚合物与模板细胞的高度契合；生物印迹能够在纳米尺度上区分靶分析物的总体大小和表面特征，意味着印迹聚合物膜可用作生物传感器，可应用在基于细胞表面膜蛋白种类差异分离细胞，这种差异作为基于生物印迹的癌症诊断工具，本发明还制作基于印迹聚合物膜的电化学传感装置。
2.本发明所用的寡核苷酸合成序列如下：Ligprobe(5，-(folic acid)(Spacer18)TTTTTTTTAGACACTATATGACA-3，)，CDNA，(5，(PO4)TCGTTTTAGCTTGCTGAGGCTGATTTACTAGCTTGCTGAGGCTGCCTGATGTCA TATAGTGTCTAAA-3，)，并且所有的DNA序列都经过高效液相层析纯化(HPLC)。
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