CN105806909A - 一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器及其构建和应用 - Google Patents

一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物电化学传感器技术领域。本发明提供了一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器及其构建和应用，该传感器包括：修饰电极、探针DNA1、与AuNPsMoS2相连接的探针DNA2、与两种探针DNA分别杂交的目标序列，目标序列的一部分与DNA1相互杂交，另一部分与DNA2相互杂交。其中，修饰电极是AuNPsMoS2复合纳米材料膜修饰的玻碳电极。该传感器的探针DNA1基于该复合材料组装在电极表面，探针DNA2也与该复合材料在溶液中连接。该传感器具有两种检测手段，检测方法一是根据电极表面组装过程中电流的变化来进行检测，检测方法二是根据电极表面组装过程中电阻的变化来进行检测。该生物传感器具有良好的灵敏性和特异性、较低的检测限和线性范围；能同时满足电流和电阻双重检测要求。

Description

一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器及其构建和应用
技术领域
本发明属于生物电化学传感器技术领域，特别涉及一种双重检测平台的构建及应用。通过制备基于AuNPsMoS2纳米DNA探针，结合经典的DNA“三明治”结构，构建具有双重检测方法的电化学DNA传感器。
背景技术
生物传感器是以生物学组件作为主要功能性元件，能够识别特定的靶物质并按照一定规律将这种感知转换成可识别信号的器件或装置。生物传感器从产生至今仅有20多年的历史，但已经很快从酶传感器和组织传感器迅速发展到特异性更加突出的免疫传感器和基因传感器(DNA传感器)。其中DNA生物传感器所检测的是核酸的杂交反应，检测特定核酸序列的关键是设计一段寡核苷酸序列作为探针，这段探针能够专一地与其进行杂交，而与其它非特异性序列不杂交。对靶序列杂交的特异性和敏感性，一直是核酸检测工作者的研究中心。DNA生物传感器的结构包括一个靶序列识别层和一个信号换能器。若以DNA或DNA辅材为靶序列识别层，电化学电极为信号转换器，以电势或电流等为特征检测信号的生物传感器就是电化学DNA生物传感器。
电化学DNA生物传感器通过将单链DNA探针固定在电极表面，电极作为信号传导器将电极表面所发生的杂交反应通过信号变化导出。由于DNA在大多数时候是电化学惰性的，电化学检测DNA可以分为直接检测和间接检测，直接检测依据在于DNA与电极表面存在直接的电子转移，间接检测是通过在加入氧化还原媒介来实现电子传递，这些电活性识别组分可以选择性地与单链DNA作用，所以电化学DNA传感器通常是以检测这些电化学活性组分的信号来分析杂交反应的。这些电活性组分可以是电活性小分子物质，也可以是一些电活性纳米材料。
目前，有关纳米材料的合成和应用方面的研究进展迅速。纳米材料的引入，使得电化学传感器的灵敏度和选择性都有了很大的提高。纳米电化学生物传感器是将纳米材料作为一种新型的生物传感介质，与特异性分子识别物质如酶、抗原抗体、DNA等相结合，并以电化学信号为检测信号的分析器件。由于纳米材料比表面积大、表面反应活性高、表面原子配位不全等导致表面的活性位点增加、催化效率提高、吸附能力增强，为DNA传感研究提供了新研究途径。与传统的传感器相比，新型纳米材料DNA传感器不仅体积更小、速度更快、而且精度更高、可靠性更好。
使用纳米材料构建生物检测平台是生物检测器的发展趋势，但是现有的纳米材料生物传感器还存在诸多问题。实际检测条件中，由于检测环境复杂，要求生物传感器具有良好的灵敏性和特异性，尤其是在目标分子浓度较低时，也能很精确的检测到目标分子，即要求生物传感器具有较低的检测限，而且该传感器的构建对目标序列具有双重检测手段
发明内容
鉴于现有技术中存在上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种具有双重检测手段的电化学DNA生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器基于AuNPsMoS2纳米复合材料构建，结合经典的DNA“三明治”结构，构建具有双重检测方法的电化学DNA传感器。所述生物传感器能够实现对特定目标序列的特异性检测，具有较低的检测限。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器，该生物传感器包括：修饰电极、探针DNA1、与AuNPsMoS2相连接的探针DNA2、与两种探针DNA分别杂交的目标序列，目标序列的一部分与DNA1相互杂交，另一部分与DNA2相互杂交。其中修饰电极是在玻碳电极表面修饰AuNPsMoS2复合材料。
所述生物传感器是基于AuNPsMoS2复合材料构建的双重检测平台，探针DNA1基于该复合材料组装在电极表面，探针DNA2也与该复合材料在溶液中连接。
上述生物传感器是一个DNA双检测平台，有两种检测方式：检测方法一是，通过在修饰电极表面逐步组装的过程，使电极表面富集大量带负电荷的DNA，引入与DNA特异结合的带正电荷的离子作为电化学指示剂，通过组装前后电极表面离子的信号变化指示DNA杂交反应的进行，电化学信号增强，则说明检测到目标序列；检测方法二是，引入与DNA带同样负电荷的离子作为指示剂，通过组装过程中电极表面的离子信号变化来指示反应的进行，电化学信号减弱，则说明检测到目标序列。
上述生物传感器在使用时的电化学指示剂有两种，其中一种为带正电荷的离子，另一种为带负电荷的离子，所带的正电荷离子为Ru(NH3)6 3+，负电荷离子为[Fe(CN)6]3-/4-。
本发明还提供了上述基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
(1)玻碳电极的处理：依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨电极，在超纯水中超声2min，氮气吹干备用；
(2)修饰电极的处理：在处理好的玻碳电极表面滴加5μLAuNPsMoS2，室温下晾干；
(3)探针DNA1组装：将探针DNA1分散在10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，滴加探针DNA1至修饰电极表面，盖上电极帽，在恒温箱中培育，取出电极用冲洗缓冲液对电极进行冲洗；
(4)探针DNA2组装：将探针DNA2分散在10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，将所制备的AuNPsMoS2复合材料离心纯化，取180μL复合材料与20μLDNA2混合，在混匀仪中恒温振荡培育，再离心纯化以备用；
(5)“三明治”结构组装：将与材料组装完成后的DNA2与目标序列混合后，滴加在修饰上DNA1的修饰电极表面，恒温培育形成“三明治”结构传感器。
所述Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4，采用以下步骤制备：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2MHCl调节pH至7.4后，加入140mmol/LNaCl和5mmol/LMgCl2混合即得Tris-HCl缓冲溶液。
所述冲洗缓冲液为10mmol/LTris-HCl，采用以下步骤制备：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2mol/LHCl调节pH至7.4即得冲洗缓冲液。
上述步骤(3)中，培育时间为16h；上述步骤(4)中，培育温度为25℃；上述步骤(5)中，培育时间为1h，培育温度为37℃。
本发明还提供了使用上述基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器检测目标序列的方法。所述DNA生物传感器可用于检测目标序列，具有双重检测手段，其检测步骤为：
首先在AuNPsMoS2复合材料修饰的玻碳电极表面修饰探针DNA1后进行电化学性能测试，记录此时电极表面电流值大小和阻抗值大小；其次，当修饰有DNA1的修饰电极表面再组装上与复合材料相连接的DNA2后再进行一次电化学性能测试，并记录电流值和阻抗值；最后，当组装上一定浓度的目标序列形成“三明治”结构后再对该电极进行电化学性能测试，比较每一步组装过程中，该修饰电极表面电流的变化以及阻抗的变化。
其中，(1)检测方法一所使用的检测液是在制备好的0.1mol/LpH＝7.4PB缓冲液中加100mol/L的Ru(NH3)6 3+，检测范围是-0.6V～0.1V，电化学性能测试的检测手段是差分脉冲伏安法；
(2)检测方法二所使用的检测液是5mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-，电化学性能测试的检测手段是阻抗光谱法。
所述PB缓冲液，为0.1mol/L的PB缓冲液，其pH为7.4，采用以下方法配制：配制0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4作为母液，取81mLNa2HPO4和19mLNaH2PO4混合后形成pH＝7.4的0.2mol/L的PB缓冲液，再稀释至0.1mol/L的PB缓冲液。
所述[Fe(CN)6]3-/4-检测液，采用以下方法配制：先配制好0.2mol/L的K3Fe(CN)6、0.2mol/L的K4Fe(CN)6和2mol/L的KCl，各取100L、100L、200L加至3600L的PB缓冲液中形成检测液。
本发明利用带有巯基的DNA和复合材料中所含的金属元素金之间的相互作用，在修饰电极表面滴加DNA1后通过金硫键连接，在溶液态的纳米DNA2探针也通过金硫键与AuNPsMoS2复合材料连接，再依据碱基互补配对准则，所加入的目标序列与DNA1和DNA2的部分序列杂交形成经典的DNA“三明治”结构。
未加入目标序列之前，检测方法一中所引入的Ru(NH3)6 3+在修饰电极表面产生一定的电流；在加入目标序列之后，碱基相互杂交形成双链，Ru(NH3)6 3+会特异性选择嵌入在双链DNA之间，电化学信号明显增强，对应的电流值有明显的变化。检测方法二中所引入的[Fe(CN)6]3-/4-带负电荷，DNA本身带负电荷，二者相互排斥，阻碍了信号分子在修饰电极表面的电子传递，随着整个组装过程的进行，电极表面的状态发生变化，电子传递受到阻碍，电阻也随之逐步增强。由上可知，检测方法一是根据电极表面组装过程中电流的变化来进行检测，检测方法二是根据电极表面组装过程中电阻的变化来进行检测。
两种检测手段的结果相互对应，达到了互相验证的目的，且都具有较低的检测限以及良好的线性范围。
本发明具有如下有益效果：1、生物传感器具有良好的灵敏性和特异性，尤其具有较低的检测限和线性范围；2、具有两种不同的检测方式，两种检测手段的结果相互对应，可互相验证；3、制备方法简单、检测方式快速。
附图说明
图1.基于AuNPsMoS2双重检测平台的构建的原理图；
图2.本发明实施例中采用差分脉冲伏安法检测的结果；
图3.实施例中采用电化学阻抗法检测的结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。图1是基于AuNPsMoS2复合材料的“三明治”结构的电化学生物传感器进行检测的原理图。
实施例1
在本实施例中，完成了基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器的构建和使用所述生物传感器完成目标序列的检测，主要过程如下：
首先是基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器的构建，具体过程如下所示：
(1)玻碳电极的处理：依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨电极，在超纯水中超声2min，氮气吹干备用；
(2)修饰电极的处理：在处理好的玻碳电极表面滴加5μLAuNPsMoS2，室温下晾干；
(3)探针DNA1组装：将探针DNA1分散在10mmol/L的pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中(制备方法：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2mol/L的HCl调节pH至7.4后，加入140mmol/L的NaCl和5mmol/L的MgCl2混合即得Tris-HCl缓冲溶液)，滴加探针DNA1至修饰电极表面，盖上电极帽，在恒温箱中培育，取出电极用冲洗缓冲液(制备方法：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2mol/L的HCl调节pH至7.4即得冲洗缓冲液)对电极进行冲洗；
(4)探针DNA2组装：将探针DNA2分散在10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，将所制备的AuNPsMoS2复合材料离心纯化，取180μL复合材料与20μLDNA2混合，在混匀仪中恒温(培育温度为25℃)振荡培育，再离心纯化以备用；
(5)“三明治”结构组装：将与材料组装完成后的DNA2与目标序列混合后，滴加在修饰上DNA1的修饰电极表面，恒温培育(培育时间为1h，培育温度为37℃)形成“三明治”结构传感器。
本实施例构建的生物传感器包括：修饰电极、探针DNA1、与AuNPs/MoS2相连接的探针DNA2、与两种探针DNA分别杂交的目标序列，目标序列的一部分与DNA1相互杂交，另一部分与DNA2相互杂交。其中修饰电极是在玻碳电极表面修饰AuNPs/MoS2复合材料。
然后是使用所述生物传感器完成目标序列的检测
检测方法一：检测方法一所使用的检测液是在制备好的0.1mol/L的pH＝7.4的PB缓冲液(制备方法：配制0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4作为母液，取81mLNa2HPO4和19mLNaH2PO4混合后形成pH＝7.4的0.2mol/L的PB缓冲液，再稀释至0.1mol/L的PB缓冲液)中加100mol/L的Ru(NH3)6 2+，检测范围是-0.6V～0.1V，检测手段是差分脉冲伏安法。
首先在复合材料修饰的电极表面修饰探针DNA1后进行电化学测试，记录此时电极表面电流值大小；当修饰有DNA1的修饰电极表面再组装上与复合材料相连接的DNA2后再进行一次电化学测试，并记录电流值；当组装上一定浓度的目标序列形成“三明治”结构后再对该电极进行电化学测试，比较每一步组装过程中，该修饰电极表面电流的变化。图2为本实施例中对不同浓度的目标序列进行检测的结果，其中目标序列的浓度依次为a:0；b:10fmol/L；c:1pmol/L。由图可知，上述生物传感器对目标序列具有良好的灵敏性和特异性，目标序列的浓度为10fmol/L时仍能获得显著的电流变化。
检测方法二：检测方法二所使用的检测液是5mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(制备方法：先配制好0.2mol/L的K3Fe(CN)6、0.2mol/L的K4Fe(CN)6和2mol/L的KCl，各取100L、100L、200L加至3600LPB中形成检测液)，检测手段是阻抗光谱法。
同样在组装上DNA1后对该电极进行阻抗测试，观察信号分子在电极表面的电子传递情况；当修饰上与复合材料相连接的DNA2后再对该修饰电极进行测试；当“三明治”结构组装完成后再进行电化学测试，根据组装前后电极表面状况的不同，观察电阻的变化，随着目标序列的浓度的改变，信号分子在电极表面的传递情况也随之发生变化，与之对应的电阻大小也会发生相应的变化。图3为本实施例对不同浓度的目标序列进行检测的结果，其中目标序列的浓度依次为a:0；b:10fmol/L；c:1pmol/L。由图可知，上述生物传感器对目标序列具有良好的灵敏性和特异性，目标序列的浓度为10fmol/L时仍能获得显著的电流变化。

Claims (10)

1.一种基于AuNPsMoS2的DNA生物传感器，其特征在于，该检测系统包括：修饰电极、探针DNA1、与AuNPsMoS2复合材料相连接的探针DNA2、与两种探针DNA分别杂交的目标序列，所述目标序列的一部分与DNA1相互杂交，另一部分与DNA2相互杂交；其中，所述修饰电极是AuNPsMoS2复合纳米材料膜修饰的玻碳电极，探针DNA1通过AuNPsMoS2复合材料组装在电极表面。
2.根据权利要求1所述的DNA生物传感器，其特征在于，该传感器具有两种检测手段，检测方法一是根据电极表面组装过程中电流的变化来进行检测，检测方法二是根据电极表面组装过程中电阻的变化来进行检测。
3.根据权利要求2所述的DNA生物传感器，其特征在于，所述检测方法使用的电化学指示剂有两种，其中一种为带正电荷的离子，所带的正电荷离子为Ru(NH3)6 3+，另一种为带负电荷的离子，所带的负电荷离子为[Fe(CN)6]3-/4-。
4.一种如权利要求1-3所述DNA生物传感器的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)玻碳电极的处理：依次用0.3mm和0.05mm氧化铝粉末打磨电极，在超纯水中超声依次2min，氮气吹干备用；
(2)修饰电极的处理：在处理好的玻碳电极表面滴加5μLAuNPsMoS2，室温下晾干；
(3)探针DNA1组装：将探针DNA1分散在10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，滴加探针DNA1至修饰电极表面，盖上电极帽，在恒温箱中培育，取出电极用冲洗缓冲液对电极进行冲洗；
(4)探针DNA2组装：将探针DNA2分散在10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，将所制备的AuNPsMoS2复合材料离心纯化，取180μL复合材料与20μLDNA2混合，在混匀仪中恒温振荡培育，再离心纯化，备用；
(5)“三明治”结构组装：将与材料组装完成后的DNA2与目标序列混合后，滴加在修饰上DNA1的修饰电极表面，恒温培育形成“三明治”结构传感器。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4，采用以下步骤制备：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2mol/L的HCl调节pH至7.4后，加入140mmol/LNaCl和5mmol/LMgCl2合即得Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述冲洗缓冲液为10mmol/L的Tris-HCl，采用以下步骤制备：配制10mmol/L的Tris-base，用0.2mol/L的HCl调节pH至7.4即得冲洗缓冲液。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的培育时间为16h；所述步骤(4)的培育温度为25℃；所述步骤(5)的培育时间为1h，培育温度为37℃。
8.一种使用如权利要求1-3所述的DNA生物传感器检测目标序列的方法，其特征在于，可采用两种检测方法，
其中，(1)检测方法一所使用的检测液是在制备好的PB缓冲液中加100μmol/LRu(NH3)6 3+，检测范围是-0.6V～0.1V，电化学性能测试的检测手段是差分脉冲伏安法；
(2)检测方法二所使用的检测液是[Fe(CN)6]3-/4-，电化学性能测试的检测手段是电化学阻抗法。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：检测方法一所述PB缓冲液，为0.1mol/LPB缓冲液，其pH为7.4，采用以下方法配制：配制0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4作为母液，取81mLNa2HPO4和19mLNaH2PO4混合后形成pH＝7.4的0.2mol/LPB缓冲液，再稀释至0.1mol/LPB缓冲液。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：检测方法二所述[Fe(CN)6]3-/4-检测液，采用以下方法配制：先配制好0.2mol/L的K3Fe(CN)6、0.2mol/L的K4Fe(CN)6和2mol/L的KCl，各取100μL、100μL、200μL加至3600μLPB中形成检测液。
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