CN109738500A - 纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法 - Google Patents

纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物的免标记适体电化学γ‑干扰素传感器的制备方法。滴涂该复合物于电极表面制备改性电极，γ‑干扰素适体链终端巯基通过Au‑S键与金纳米粒连接，制得复合物‑适体的改性电极。当γ‑干扰素存在时，γ‑干扰素与传感器上适体链特异性结合，导致适体发卡结构被打开伸展，可有效吸附电解液中的亚甲基蓝MB，引起MB氧化还原信号显著增强。拟合MB氧化峰电流强度与γ‑干扰素浓度间的线性关系，构建免标记适体电化学γ‑干扰素传感器。与现有技术相比，本发明方法操作简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好，可发展成为一种新颖的免标记适体电化学传感器，用于生物样品中γ‑干扰素的高灵敏和高选择性检测。

Description

纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备 方法
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器和纳米复合材料制备技术领域，具体涉及树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物及其免标记适体电化学传感器的制备方法，该传感器可用于γ-干扰素的高灵敏和高选择性检测。
背景技术：
γ-干扰素是一种细胞分泌因子，属于II型干扰素的唯一成员，也被称为巨噬细胞激活因子。γ-干扰素的分泌失调与多种疾病相关，如炎症性肠病、生殖器单纯疱疹病毒感染、阿尔茨海默病等。对γ-干扰素的敏感检测可用于研究免疫反应的活力和传染病的诊断。采用酶联免疫吸附实验定性或定量检测γ-干扰素，可判断人体是否感染结核分枝杆菌。细胞因子通常采用抗体免疫分析法检测，这些分析方法耗时较长，需要多次清洗和多步处理来获得结果。由于复杂的清洗和标记，抗体的检测难以完成对细胞分泌物的动态监测。此外，酶催化反应的效率会引起输出信号的波动，进而导致检测结果的重现性不理想和分析时间延长。
作为抗体的有效替代物，核酸适-配体具有热及化学稳定性，可再生性和易于修饰等优点，吸引了科技工作者广泛的研究兴趣。当前，基于核酸适-配体特异性结合靶分子的技术发展了一系列适体传感器，该传感器显著的特征是将寡核苷酸设计成信标，当目标分析物与之结合后直接产生信号，无需标记和清洗步骤。适配异构体生物传感器具备简易的检测过程，展现出广阔的应用前景，尤其适用于对生物样品的实时和动态检测。
核酸适体电化学传感器是以适体作为分子识别原件.采用特定方法将其固定到信号转换器上，通过电子导线连接成装置；再结合电化学方法，用于待测物的定性和定量检测。相比传统电化学分析方法，电化学适体传感器在生物分子检测方面具备灵敏度高，检测范围宽，制作简便，良好的选择性，准确性和重现性等优点。研究者开发了基于核酸适-配体的免疫球蛋白检测策略，将氧化还原探针(亚甲基蓝或二茂铁)标记的γ-干扰素适体，通过一系列电极表面改性将其组装在电极上，测定电极的电化学信号变化用于定量γ-干扰素的浓度。Liu等制备了适体功能化电极用于检测细胞分泌因子，包括γ-和α-干扰素(Y.Liu,Y.Liu,Z.Matharu,A.Rahimian,A.Revzin,Detecting multiple cell-secretedcytokines from the same aptamer-functionalized electrode,Biosensors andBioelectronics 2015,64:43–50)。Abnous等开发了基于三螺旋分子开关的电化学适体传感器用于γ-干扰素的检测，亚甲基蓝作为氧化还原探针(K.Abnous,N.M.Danesh,M.Ramezani,M.Alibolandi,K.Y.Hassanabad,A.S.Emrani,A.Bahreyni,S.M.Taghdisi,Atriple-helix molecular switch-based electrochemical aptasensor forinterferon-gamma using a gold electrode and Methylene Blue as a redox probe,Microchimica Acta 2017,184:4151–4157)。
有关干扰素检测的传感器已有相关专利报道，例如赵睿等公开了一种检测人β干扰素的生物传感器及其专用多肽的制备方法，识别元件为含有特定氨基酸序列的多肽或其衍生物(赵睿,罗佳,章群丹,刘国诠.一种检测人β干扰素的生物传感器及其专用多肽.中国发明专利.公开号CN101221185)。杨占军等基于氧化锌纳米材料开发了阻抗型免疫传感器，用于牛伽马干扰素的无标记电化学免疫分析(杨占军,秦坯芽,陈祥.基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法.中国发明专利.公开号CN104090116A)。近年来，免标记适体传感器相关研究引起了广泛的关注。相比传统适体标记型传感器，免标记适体传感器具备制作简便，适体免标记，成本低等优点。基于此，本发明设计了基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼新型纳米复合物的免标记适体电化学传感器，用于γ-干扰素的高效检测。目前，尚未有树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物，以及基于纳米复合物的免标记适体电化学γ-干扰素传感器的国内外文献和专利报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计一种制备方法简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好等优点的基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物的免标记适体电化学传感器，其制备的传感器可用于γ-干扰素的高灵敏和高选择性检测。
为了实现上述目的，本发明涉及的一种基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物的免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备工艺包括以下步骤：
1.纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)将二硫化钼(MoS2)粉末加入乙醇和蒸馏水的混合溶剂中，在水浴中超声处理，然后离心分离，去除沉淀物，制得MoS2均质分散液备用；
(2)配制氯金酸水溶液，加入聚乙二胺树状大分子(PAMAM)水溶液中，磁力搅拌混合均匀，滴加硼氢化钠水溶液，制备金纳米粒负载的树状大分子(PAMAM/AuNPs)，通过透析处理，除去残留反应物；
(3)向MoS2分散液中滴加PAMAM/AuNPs分散液，先水浴超声处理，再磁力搅拌处理，反应制得PAMAM/AuNPs/MoS2纳米复合物；
(4)在抛光打磨处理的裸玻碳电极表面滴加交联剂Nafion，滴涂纳米复合物分散液，制得PAMAM/AuNPs/MoS2改性的电极；γ-干扰素核酸适体用缓冲液稀释，加热至一定温度后冷却至室温，适体形成二级发卡结构，适体链巯基终端通过Au-S键连接至AuNPs表面；
(5)在浸没了PAMAM/AuNPs/MoS2-适体改性电极的电解液中，加入氧化还原探针亚甲基蓝MB，随着靶分子γ-干扰素加入量的增大，MB的电化学信号峰逐渐增强，拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。
步骤(1)中所述的超声功率为150～200W，频率为20～50kHz，超声时间为5～10h,MoS2均质分散液浓度为1～2mg mL-1；
步骤(2)中所述的氯金酸浓度为10～50mM,PAMAM质量浓度为0.1～1％，硼氢化钠浓度为0.5～1M，PAMAM/AuNPs分散液浓度为1～10mg mL-1；
步骤(3)中所述的超声处理时间为10～60min，搅拌处理时间为6～12h，MoS2与PAMAM/AuNPs质量浓度比为(1:10)～(1:2)；
步骤(4)中所述的适体浓度稀释至1～5μM；加热温度为50～100℃；热处理时间为1～6h；
步骤(5)中所述的γ-干扰素浓度为0～1000pg mL-1；γ-干扰素的检测限为1～3fgmL-1。
本发明的效果是：滴涂PAMAM/AuNPs/MoS2复合物于裸玻碳电极表面制备改性电极，γ-干扰素适体链巯基终端通过Au-S键连接至AuNPs表面，制得PAMAM/AuNPs/MoS2-适体的改性电极。选用MoS2为电化学反应基底，以PAMAM上生长的AuNPs作为免标记适体链结合位点，构建基于该纳米复合物的免标记电化学适体传感器。当γ-干扰素存在时，γ-干扰素与传感器上适体链特异性结合，导致适体发卡结构破坏，适体链被打开伸展，可有效吸附电解液中的MB，引起MB氧化还原信号显著增强。拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。与现有技术相比，本发明方法操作简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好，可发展成为一种新颖的免标记适体电化学传感器用于生物样品中γ-干扰素的高灵敏和高选择性检测。
附图说明：
图1为本发明涉及的树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物及其免标记适体电化学传感器的制备过程与γ-干扰素检测的原理示意图；
图2(a)为使用本发明的免标记适体电化学传感器测定不同γ-干扰素浓度存在下对应的电化学方波伏安曲线；
图2(b)为不同γ-干扰素浓度存在下，对应亚甲基蓝的氧化电流峰强度，拟合不同电流峰强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
本发明涉及的一种基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物及其免标记适体电化学传感器的制备与γ-干扰素的电化学检测，其制备工艺与原理示意图如图1所示，具体工艺步骤为：
将30毫克MoS2粉末加入乙醇/蒸馏水(体积比1:1)的混合溶剂中，在水浴中超声处理8h(180W,40kHz)，然后在3000转/分钟转速下离心20min，去除沉淀物，制得MoS2均质分散液(1.5mg mL-1)备用。配制氯金酸水溶液25mM，取10mL加入到聚乙二胺树状大分子(PAMAM,1wt％,15mL)水溶液，磁力搅拌1h混合均匀，再滴加硼氢化钠水溶液(0.5M)，直到溶液从淡黄色变成红棕色，产物经透析除去残留反应物，制得金纳米粒负载的树状大分子(PAMAM/AuNPs,1mg mL-1)备用。向MoS2分散液中滴加PAMAM/AuNPs分散液，二者质量比为1:2，先水浴超声处理30min，再磁力搅拌处理12h，反应制得PAMAM/AuNPs/MoS2纳米复合物。
在抛光打磨处理的裸玻碳电极表面滴加交联剂Nafion，滴涂纳米复合物分散液，制得PAMAM/AuNPs/MoS2改性的电极。γ-干扰素核酸适体用缓冲液稀释至5μM，然后加热至90℃，维持热处理5h后冷却至室温，适体形成二级发卡结构，适体链终端的巯基通过Au-S键连接至AuNPs表面。在浸没了PAMAM/AuNPs/MoS2-适体改性电极的电解液中，含有10mM缓冲液Tris-HCl，加入氧化还原探针亚甲基蓝MB(1mM)，随着靶分子γ-干扰素加入量的增大，MB电化学信号峰逐渐增强，拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。如图2所示，γ-干扰素浓度的线性检测范围为0.01～1000ng mL-1，检测限为3fg mL-1。
实施例2：
本实施例中基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物及其免标记适体电化学传感器的制备与γ-干扰素的电化学检测，其制备工艺与原理示意图同实施例1，具体工艺步骤为：
将30毫克MoS2粉末加入乙醇/蒸馏水(体积比1:1)的混合溶剂中，在水浴中超声处理6h(150W,30kHz)，然后在3000转/分钟转速下离心20min，去除沉淀物，制得MoS2均质分散液(1mg mL-1)备用。配制氯金酸水溶液15mM，取10mL加入到聚乙二胺树状大分子(PAMAM,0.5wt％,15mL)水溶液，磁力搅拌1h混合均匀，再滴加硼氢化钠水溶液(0.5M)，直到溶液从淡黄色变成红棕色，产物经透析除去残留反应物，制得金纳米粒负载的树状大分子(PAMAM/AuNPs,2mg mL-1)备用。向MoS2分散液中滴加PAMAM/AuNPs分散液，二者质量比为1:4，先水浴超声处理20min，再磁力搅拌处理6h，反应制得PAMAM/AuNPs/MoS2纳米复合物。
在抛光打磨处理的裸玻碳电极表面滴加交联剂Nafion，滴涂纳米复合物分散液，制得PAMAM/AuNPs/MoS2改性的电极。γ-干扰素核酸适体用缓冲液稀释至2μM，然后加热至80℃，维持热处理3h后冷却至室温，适体形成二级发卡结构，适体链终端的巯基通过Au-S键连接至AuNPs表面。在浸没了PAMAM/AuNPs/MoS2-适体改性电极的电解液中，含有10mM缓冲液Tris-HCl，加入氧化还原探针亚甲基蓝MB(1mM)，随着靶分子γ-干扰素加入量的增大，MB电化学信号峰逐渐增强，拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。如图2所示，γ-干扰素浓度的线性检测范围为0.01～500ng mL-1，检测限为2.5fg mL-1。
实施例3：
本实施例中基于树状大分子/金纳米粒/二硫化钼纳米复合物及其免标记适体电化学传感器的制备与γ-干扰素的电化学检测，其制备工艺与原理示意图同实施例1，具体工艺步骤为：
将30毫克MoS2粉末加入乙醇/蒸馏水(体积比1:1)的混合溶剂中，在水浴中超声处理10h(200W,50kHz)，然后在3000转/分钟转速下离心20min，去除沉淀物，制得MoS2均质分散液(2mg mL-1)备用。配制氯金酸水溶液50mM，取10mL加入到聚乙二胺树状大分子(PAMAM,1wt％,15mL)水溶液，磁力搅拌1h混合均匀，再滴加硼氢化钠水溶液(1M)，直到溶液从淡黄色变成红棕色，产物经透析除去残留反应物，制得金纳米粒负载的树状大分子(PAMAM/AuNPs,10mg mL-1)备用。向MoS2分散液中滴加PAMAM/AuNPs分散液，二者质量比为1:5，先水浴超声处理60min，再磁力搅拌处理12h，反应制得PAMAM/AuNPs/MoS2纳米复合物。
在抛光打磨处理的裸玻碳电极表面滴加交联剂Nafion，滴涂纳米复合物分散液，制得PAMAM/AuNPs/MoS2改性的电极。γ-干扰素核酸适体用缓冲液稀释至5μM，然后加热至90℃，维持热处理6h后冷却至室温，适体形成二级发卡结构，适体链终端的巯基通过Au-S键连接至AuNPs表面。在浸没了PAMAM/AuNPs/MoS2-适体改性电极的电解液中，含有10mM缓冲液Tris-HCl，加入氧化还原探针亚甲基蓝MB(1mM)，随着靶分子γ-干扰素加入量的增大，MB电化学信号峰逐渐增强，拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。如图2所示，γ-干扰素浓度的线性检测范围为0.01～800ng mL-1，检测限为2fg mL-1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)将二硫化钼(MoS2)粉末加入乙醇和蒸馏水的混合溶剂中，在水浴中超声处理，然后离心分离，去除沉淀物，制得MoS2均质分散液备用；
(2)配制氯金酸水溶液，加入聚乙二胺树状大分子(PAMAM)水溶液中，磁力搅拌混合均匀，滴加硼氢化钠水溶液，制备金纳米粒负载的树状大分子(PAMAM/AuNPs)，通过透析处理，除去残留反应物；
(3)向MoS2分散液中滴加PAMAM/AuNPs分散液，先水浴超声处理，再磁力搅拌处理，反应制得PAMAM/AuNPs/MoS2纳米复合物；
(4)在抛光打磨处理的裸玻碳电极表面滴加交联剂Nafion，滴涂纳米复合物分散液，制得PAMAM/AuNPs/MoS2改性的电极；γ-干扰素核酸适体用缓冲液稀释，加热至一定温度后冷却至室温，适体形成二级发卡结构，适体链巯基终端通过Au-S键连接至AuNPs表面；
(5)在浸没了PAMAM/AuNPs/MoS2-适体改性电极的电解液中，加入氧化还原探针亚甲基蓝MB，随着靶分子γ-干扰素加入量的增大，MB的电化学信号峰逐渐增强，拟合MB氧化峰电流强度与γ-干扰素浓度之间的线性关系，构建用于γ-干扰素检测的免标记适体电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的超声功率为150～200W，频率为20～50kHz，超声时间为5～10h，MoS2均质分散液浓度为1～2mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的氯金酸浓度为10～50mM，PAMAM质量浓度为0.1～1％，硼氢化钠浓度为0.5～1M，PAMAM/AuNPs分散液浓度为1～10mg mL-1。
4.根据权利要求1所述的纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的超声处理时间为10～60min，搅拌处理时间为6～12h，MoS2与PAMAM/AuNPs质量浓度比为(1:10)～(1:2)。
5.根据权利要求1所述的纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的适体浓度稀释至1～5μM；加热温度为50～100℃；热处理时间为1～6h。
6.根据权利要求1所述的纳米复合物及其免标记适体电化学γ-干扰素传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的γ-干扰素浓度为0～1000pg mL-1；γ-干扰素的检测限为1～3fg mL-1。
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