CN110346560A

CN110346560A - 一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用

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Publication number: CN110346560A
Application number: CN201910555769.2A
Authority: CN
Inventors: 曾昆; 黄哲; 韦达理; 张旭芸
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN110346560B

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用，本发明以聚酰胺‑胺树状大分子为模板合成纳米金颗粒，并以其为载体，共价连接抗体和酶分子，构建多酶信号颗粒，并将其用于免疫分析方法中。本申请通过多酶的信号放大机制，能够显著提升检测方法的灵敏度。在本发明优选的技术方案中，基于本发明的多酶信号颗粒制备的免疫层析试纸条，在经过酶显色后，信号显著放大，并可在5‑10分钟内肉眼直接判读检测结果，实现了对待测目标物的快速检测；相比于传统免疫分析方法，具有检测高效、灵敏度更高等优点。同时，检测结果肉眼可判读，具有便捷性和实用性，其应用范围更为广泛。

Description

一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

聚酰胺-胺树状大分子（Polyamidoamine，PAMAM)) 是一类高度支化、具有特定三维结构、分子尺寸和构型高度可控的树枝状大分子，其独特的分子结构与物理化学性质使之在众多领域有着广泛的应用前景。PAMAM作为新型的纳米级聚合物，其分子表面大量带正电荷的活性基团可与蛋白质共价结合，形成稳定的复合物。

免疫分析方法以抗原抗体特异性反应为基础，具有灵敏度高、方便快捷、高通量、低成本等优势，已广泛应用于临床医学、食品安全、环境检测中重要目标物的分析检测。为进一步提升分析方法的灵敏度，多酶复合物信号放大机制被引入到免疫分析方法中。纳米金颗粒是最为常用的纳米载体，然而，常规由氯金酸还原法获得的纳米金颗粒不宜稳定保存，容易聚沉，并且在纳米金颗粒上偶联抗体多是利用其物理吸附作用，偶联效率低，且抗体易失活。因此，如何获得更为优异的纳米金颗粒是一项值得研究的课题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题上高灵敏的免疫检测产品及方法，解决现有纳米金颗粒用于检测过程中检测效率低、灵敏度低，偶联效率低等问题。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种多酶信号颗粒的制备方法，所述方法包括：

（1）将氯金酸溶液和聚酰胺-胺树状大分子混合搅拌，加入硼氢化钠水溶液，搅拌后离心，离心后沉淀超纯水中分散均匀得到PAMAM-Au纳米颗粒分散液；

（2）将步骤（1）中得到的PAMAM-Au纳米颗粒分散液共价偶联抗体，与抗体充分混合后孵育、离心去除多余的抗体，超纯水重悬后加入含有生物素和巯基的DNA链，孵育后离心得到沉淀物；

（3）沉淀物超纯水重悬后加入酶标记的亲和素，室温孵育后离心，得到基于聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金的多酶信号颗粒。

优选的，所述步骤（1）中所述氯金酸溶液的浓度为20~45mmol/L，所述聚酰胺-胺树状大分子的重量百分浓度为1.0~3.0wt%；所述的氯金酸溶液和聚酰胺-胺树状大分子的体积比为1:1~5。

优选的，步骤（1）中所述聚酰胺-胺树状大分子为2.0代至5.0代中的任意一代，所述聚酰胺-胺树状大分子的末端集团为氨基或羧基，所述聚酰胺-胺树状大分子的核为乙二胺或氨。

优选的，步骤（2）中所述共价偶联抗体为采用戊二醛法或1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)法连接抗体；所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，步骤（2）中所述的DNA链为生物素和巯基分别修饰于DNA链的两端。

优选的，步骤（2）中所述的孵育条件均为4~25℃下孵育8~16h。

优选的，步骤（3）中所述的酶标记的亲和素为辣根过氧化物酶标记的亲和素或碱性磷酸酶标记的亲和素。

此外，本发明还提供了一种由上述的制备方法制备的多酶信号颗粒，所述的多酶信号颗粒以聚酰胺-胺树状大分子为模板结合氯金酸得到聚酰胺-胺包裹纳米金颗粒，共价偶联抗体、含有生物素和巯基的DNA链以及酶标记的亲和素。

本发明还提供了一种产品，所述产品包括如权利要求8所述的多酶信号颗粒。

本发明还提供了所述的多酶信号颗粒在生物检测或医疗检验中的应用，在本发明的一些实施例中，所述的生物检测或医疗检验为免疫分析。

优选的，所述免疫分析为侧流层析免疫分析方法、酶联免疫分析法、磁珠免疫分析方法；在以上分析方法中，待测物的浓度与显色值的大小成比例或将制备的多酶信号颗粒加入免疫层析试纸条中，进行层析，对比待测物的浓度高低与检测条带颜色深浅成比例；所述应用为采用灰度分析软件Quantity One读取的度值，并用Origin软件进行分析，待测物浓度与灰度值的高低成比例，从而达到免疫分析的目的。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

本发明以聚酰胺-胺树状大分子为模板合成纳米金颗粒，并以其为载体，共价连接抗体和酶分子，构建多酶信号颗粒，并将其用于免疫分析方法中。本申请通过多酶的信号放大机制，能够显著提升检测的灵敏度。在本发明优选的技术方案中，基于本发明的多酶信号颗粒制备的免疫层析试纸条，在经过酶显色后，信号显著放大，在5-10分钟内肉眼直接判读检测结果，实现了对待测目标物的快速检测；相比于传统免疫分析方法，具有检测高效、灵敏度更高等优点。同时，检测结果肉眼可判读，具有便捷性和实用性，其应用范围更为广泛。

以下，将结合说明书附图及具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。本领域技术人员能够在说明书公开内容的基础上，针对各种合理的变换得到变化后的技术方案，只要不脱离本发明的精神，各种变化后的技术方案均包括在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1为实施例2所述免疫层析试纸条的结构示意图；

图2为实施例3中免疫层析试纸条检测结果对比图；

图3为实施例3中滴加AEC显色液后的免疫层析试纸条检测结果对比图；图4为实施例4中增敏前后的卡那霉素标准曲线对比图。

具体的实施方式

以下将结合附图和具体实施方案对本发明进行详细的说明，应当理解，以下所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明的技术方案，并不用于对本发明的限定。

实施例中所需试剂：卡那霉素标准品购自国家药品食品检定研究院；四代聚酰胺-胺树状大分子（G4.0 PAMAM）和三代聚酰胺-胺树状大分子（G3.0 PAMAM）购自威海晨源分子新材料有限公司；辣根过氧化物酶标记的亲和素、碱性磷酸酶标记的亲和素、氯金酸、AEC显色液、P-硝基苯磷酸二钠底物溶液购自上海索莱宝股份有限公司；巯基和生物素修饰的DNA序列来自上海生工；碳二亚胺（EDC）、卡那霉素抗体、白蛋白抗体购自Sigma-Aldrich公司。

实施例1

在本实施例中，通过以下步骤合成基于聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒的多酶信号颗粒：将20mmol/L 的氯金酸水溶液和1.0 wt% G4.0 PAMAM按照体积比1:1的比例混合，混合溶液剧烈搅拌1小时后，加入浓度为0.5mol/L的硼氢化钠水溶液0.5mL，搅拌30分钟；常温下12000rpm/min离心10分钟，去除多余的PAMAM和硼氢化钠；获得的沉淀物在1mL的超纯水中分散均匀，即为PAMAM-Au纳米颗粒分散液；取0.5mL 制备的PAMAM-Au分散液，加入0.5mg卡那霉素单克隆抗体和20mg EDC（溶于1mL Tris-HCL，0.01mol/L，pH7.4），充分混合后4℃下孵育16h；12000r/min离心10分钟去除多余的抗体，沉淀物用1mL的超纯水重悬，获得PAMAM-Au/mAb-KAN；加入25μL浓度为1.5 μmol/L含有生物素和巯基的DNA链，充分混合后4℃下孵育16h；12000r/min离心10分钟去除多余的DNA，沉淀物用1mL的超纯水重悬后加入20μL辣根过氧化物酶标记的亲和素（60 μmol/L）室温孵育2h；12000r/min离心10 min，沉淀复溶于1mL的超纯水中，即为基于聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金的多酶信号颗粒PAMAM-Au/mAb-KAN/HRP。

实施例2

在该实施例中，通过以下步骤组装卡那霉素免疫层析试纸条：

卡那霉素包被原的合成：5mg 卡那霉素标准品，5mg 卵清白蛋白以及10mg EDC共同溶解于2mL PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）中，充分混匀后4℃下孵育24h，然后用PBS缓冲液透析24h，即得到卡那霉素包被原；

卡那霉素免疫层析试纸条的组装：用BioDot-RR120连续式喷膜仪分别喷涂检测线和质控线，其中检测线喷涂卡那霉素包被原（0.5mg/mL），质控线喷涂羊抗鼠抗体（1 mg/mL）；免疫层析试纸条结构如图1所示。

实施例3

在该实施例中，通过以下步骤对卡那霉素进行检测以及判读结果：

分别取100μL实施例1中的多酶信号颗粒PAMAM-Au/mAb-KAN/HRP 与不同浓度（150ng/mL、100 ng/mL、70 ng/mL、40 ng/mL、25 ng/mL、10ng/mL、0 ng/mL）的卡那霉素标准品100μL充分混合，然后将免疫层析试纸条插入混合溶液中，5-10分钟后判断结果。若质控线无色，则检测结果无效；图2为免疫层析试纸条检测结果对比图；图中，从上到下对应的卡那霉素的浓度依次为150ng/mL、100 ng/mL、70 ng/mL、40 ng/mL、25 ng/ mL、10ng/mL、0 ng/mL；由图2可见，显色后条带呈现灰色，随着卡那霉素标准品浓度的增加，相对应的检测线显色呈现灰度递减的状态。检测线显色的深浅与相对应的标准品含量成反比，即标准品含量越高，检测线显色越浅。

为进一步提升分析方法的灵敏度，利用多酶信号颗粒上的HRP进行显色增敏：在上述反应结束的免疫层析试纸条上滴加AEC显色液（50μL每条），反应10分钟后观察结果，图3是滴加AEC显色液后的免疫层析试纸条检测结果对比图；图中，从上到下对应的卡那霉素的浓度依次为150ng/mL、100 ng/mL、70 ng/mL、40 ng/mL、25 ng/ mL、10ng/mL、0 ng/mL；如图3所示，显色后条带呈现红色，随着卡那霉素标准品浓度的增加，相对应的检测线显色呈现灰度递减的状态。检测线显色的深浅与相对应的标准品含量成反比，即标准品含量越高，检测线显色越浅。本实施例中采用将多酶信号颗粒PAMAM-Au/mAb-KAN/HRP 与卡那霉素标准品混合后利用免疫层析试纸进行检测，在实际的操作过程中也可以将多酶信号颗粒PAMAM-Au/mAb-KAN/HRP 喷涂在免疫层析试纸烘干后直接检测卡那霉素标准品。

实施例4

在该实施例中，基于应用软件Quantity One对实施例3中检测结果进行灰度分析，表1是增敏前后条带灰度值分析对比表。

表1 灰度分析数值

标准品浓度（ng/mL）	增敏前	增敏后
			150	2634.841	6903.962
100	3356.678	8322.054
			70	3871.276	10078.497
40	3978.74	10794.631
			25	4573.205	11363.832
10	4838.335	12416.246
			0	8768.355	21042.016

如表1可知，增敏后条带的灰度值增加了约3倍。在对数坐标纸上以标准品浓度为横坐标，B/B₀（%）为纵坐标绘制卡那霉素标准曲线，图4是增敏前后的卡那霉素标准曲线对比图；如图4所示，其中B是标准品为某一浓度时对应的灰度值，B₀是标准品为0ng/mL时对应的灰度值；曲线a为增敏后的链霉素标准曲线，曲线b为卡那霉素标准曲线；经过参数拟合，可得卡那霉素标准曲线的最低检测限为0.76 ng/mL ，增敏后的检测限为0.12 ng/mL，灵敏度提高了6倍。

实施例5

在该实施例中，通过以下步骤合成基于聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒的多酶信号颗粒：将45mmol/L 的氯金酸水溶液和3.0 wt% G3.0 PAMAM按照体积比1: 5的比例在水中混合；淡黄色混合溶液剧烈搅拌2小时后，加入浓度为0.5mol/L的硼氢化钠水溶液1mL，常温下搅拌60分钟；常温下12000r/min离心10分钟，去除多余的PAMAM和硼氢化钠；将所获得的沉淀物在1mL的超纯水中分散均匀，即为PAMAM-Au纳米颗粒分散液；取1mL的PAMAM-Au纳米颗粒分散液，加入1mg白蛋白单克隆抗体，然后加入0.5% 戊二醛溶液0.2mL，25℃下孵育8h；12000r/min离心10分钟去除多余的抗体，沉淀物用1mL的超纯水重悬，获得PAMAM-Au/mAb-albumin；继续加入含有生物素和巯基的DNA链（25μL，1.5 μmol/L），充分混合后25℃下孵育16h；12000r/min离心10分钟去除多余的DNA，沉淀物用1mL的超纯水重悬后加入20μL碱性磷酸酶标记的亲和素（100 μmol/L）室温孵育2h；12000r/min离心10分钟去除多余的链霉素-ALP，沉淀物复溶于1mL的超纯水中，即为基于聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金的多酶信号颗粒PAMAM-Au/mAb-albumin /ALP。

实施例6

在该实施例中，通过常规ELISA方法对白蛋白进行检测：白蛋白多克隆抗体用碳酸盐包被液（0.05mol/L，pH9.6）稀释为10μg/mL，96孔聚苯乙烯酶标板每孔加入100 μL，4℃过夜；取出酶标板，弃去包被液，用洗涤液洗涤1次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；每孔加入150 μL封闭液（含有1%明胶的碳酸盐包被液），37℃孵育1 h；取出酶标板，弃去封闭液，在吸水纸上拍干；加入不同浓度的白蛋白标准品，每孔100 μL，每个浓度重复三次，37℃孵育30 min；弃去混合液，用洗涤液洗涤3次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；加入白蛋白单克隆抗体，每孔100 μL，37℃孵育30 min；弃去混合液，用洗涤液洗涤3次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；每孔加入100μL羊抗鼠酶标记二抗，37℃孵育30 min；弃去混合液，用洗涤液洗涤3次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；每孔加入100 μLP-硝基苯磷酸二钠底物溶液，37 ℃孵育10 min；每孔加入50 μL 2 mol/L的硫酸溶液终止反应；酶标仪检测OD_{405 nm}值。由表2看出，随着白蛋白浓度的增加，OD_{405 nm}越来越高，与白蛋白的浓度成正比。利用Origin 8.0软件对曲线进行拟合，计算得到最低检测限为38.4μg/mL，其中最低检测限为空白对照+10倍相对标准偏差。

表2.白蛋白检测结果

白蛋白浓度（μg/mL）	0	50	100	200	400	800
							OD<sub>405 nm</sub>	0.032	0.112	0.464	0.843	1.325	1.844

实施例7

在该实施例中，通过以下步骤对白蛋白进行检测：白蛋白多克隆抗体用碳酸盐包被液（0.05mol/L，pH9.6）稀释为10μg/mL，96孔聚苯乙烯酶标板每孔加入100 μL，4℃过夜；取出酶标板，弃去包被液，用洗涤液洗涤1次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；每孔加入150 μL封闭液（含有1%明胶的碳酸盐包被液），37℃孵育1 h；取出酶标板，弃去封闭液，在吸水纸上拍干；加入浓度分别为0、10、30、90、270、810μg/mL的白蛋白标准品，每孔100 μL，每个浓度重复三次，37℃孵育30 min；弃去混合液，用洗涤液洗涤3次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；加入实施例5中的PAMAM-Au/mAb-albumin/ALP（1:100稀释，稀释液为0.01mol/LPBS，pH7.4），每孔100 μL，37℃孵育30 min；弃去混合液，用洗涤液洗涤3次，每次震荡洗涤30 s，洗后在吸水纸上拍干；每孔加入100 μL P-硝基苯磷酸二钠底物溶液，37 ℃孵育10 min；每孔加入50 μL 2 mol/L的硫酸溶液终止反应，酶标仪分别检测对应的OD_{405 nm}值。表3是白蛋白检测结果对比表。

表3 .白蛋白检测结果

白蛋白浓度（μg/mL）	0	10	30	90	270	810
							OD<sub>405 nm</sub>	0.032	0.232	0.846	1.232	1.954	2.633

由表3看出，随着白蛋白浓度的增加，OD_{405 nm}越来越高，与白蛋白的浓度成正比。利用Origin 8.0软件对曲线进行拟合，计算得到最低检测限为3.2μg/mL，其中最低检测限为空白对照+10倍相对标准偏差。对比实施例6相关数据，与常规ELISA方法相比，本申请制备的PAMAM-Au/mAb-albumin /ALP显著提高了检测的灵敏度，并且缩短检测时间，显著提升检测效率。

实施例8

在该实施例中，通过常规磁珠免疫分析方法对白蛋白进行检测。首先制备白蛋白单克隆抗体包被的免疫磁珠：取500μL免疫羧基化磁珠，50mg EDC以及50mg NHS，加入2mL MES（50 mmol/Lol/L），混合搅拌 30 min；磁性分离去上清，加入2mLMES洗去多余的EDC和NHS，沉淀重悬于2 mL MES缓冲液，加入 50 μL 的白蛋白多克隆抗体（10 mg/mL），4 ℃搅拌过夜；磁性分离去上清，加入2 mL MES缓冲液，洗涤2次；加入1 mL 2 % BSA的PBS重悬，4℃保存得到包被好的免疫磁珠。

取10μL包被好的免疫磁珠于EP管中，加入不同浓度的白蛋白标准品，每管100 μL，每个浓度重复三次，37℃孵育30 min；磁性分离去上清，用洗涤液洗涤3次；加入白蛋白单克隆抗体，每管100 μL，37℃孵育30 min；磁性分离去上清，用洗涤液洗涤3次；每管加入100μL羊抗鼠酶标记二抗，37℃孵育30 min；磁性分离去上清，用洗涤液洗涤3次；每管加入100 μLP-硝基苯磷酸二钠底物溶液，37 ℃孵育10 min；每管加入50 μL 2 mol/L的硫酸溶液终止反应；酶标仪检测OD_{405 nm}值。表4是白蛋白检测结果表，由表4可见，随着白蛋白浓度的增加，OD_{405 nm}越来越高，与白蛋白的浓度成正比。计算得到最低检测限为25.3μg/mL，其中最低检测限为空白对照+10倍相对标准偏差。

表4 .白蛋白检测结果

白蛋白浓度（μg/mL）	0	25	50	100	200	400
							OD<sub>405 nm</sub>	0.029	0.122	0.346	0.734	1.155	1.523

实施例9

在该实施例中，通过以下步骤对白蛋白进行检测：取10μL实施例8中制备的免疫磁珠于EP管中，分别加入浓度为0、2、5、10、25、50μg/mL的白蛋白标准品，每管100 μL，每个浓度重复三次，37℃孵育30 min；磁性分离去上清，用洗涤液洗涤3次；加入实施例5中的PAMAM-Au/mAb-albumin/ALP（1:50稀释，稀释液为0.01mol/LPBS，pH7.4），磁性分离去上清，用洗涤液洗涤3次；每管加入100 μL P-硝基苯磷酸二钠底物溶液，37℃孵育10 min；每管加入50 μL2 mol/L的硫酸溶液终止反应；酶标仪检测OD_{405 nm}值。表5是白蛋白检测结果表，由表5可见，随着白蛋白浓度的增加，OD_{405 nm}越来越高，与白蛋白的浓度成正比。

表5 .白蛋白检测结果

白蛋白浓度（μg/mL）	0	2	5	10	25	50
							OD<sub>405 nm</sub>	0.032	0.111	0.446	0.923	1.546	2.163

利用Origin 8.0软件对曲线进行拟合，计算得到最低检测限为2.1μg/mL，其中最低检测限为空白对照+10倍相对标准偏差。相比较实施例8中常规免疫磁珠方法，采用制备的多酶信号颗粒显著增加了灵敏度（提升10倍以上），并且缩短检测时间，提升检测效率。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

Claims

1.一种多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述氯金酸溶液的浓度为20~45mmol/L，所述聚酰胺-胺树状大分子的重量百分浓度为1~3.0 wt%；所述的氯金酸溶液和聚酰胺-胺树状大分子的体积比为1:1~5。

3.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述聚酰胺-胺树状大分子为2.0代至5.0代中的任意一代，所述聚酰胺-胺树状大分子的末端集团为氨基或羧基，所述聚酰胺-胺树状大分子的核为乙二胺或氨。

4.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述共价偶联抗体为采用戊二醛法或EDC法连接抗体；所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

5.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的DNA链为生物素和巯基分别修饰于DNA链的两端。

6.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的孵育条件均为4~25℃下孵育8~16h。

7.根据权利要求1所述多酶信号颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的酶标记的亲和素为辣根过氧化物酶标记的亲和素或碱性磷酸酶标记的亲和素。

8.一种多酶信号颗粒，如权利要求1~7任一项所述制备方法制备得到的，其特征在于，所述的多酶信号颗粒以聚酰胺-胺树状大分子为模板结合氯金酸得到聚酰胺-胺包裹纳米金颗粒，共价偶联抗体、含有生物素和巯基的DNA链以及酶标记的亲和素。

9.一种产品，其特征在于，所述产品包括如权利要求8所述的多酶信号颗粒。

10.如权利要求8所述的多酶信号颗粒在生物检测或医疗检验中的应用，其特征在于，所述的生物检测或医疗检验为免疫分析，所述的免疫分析为侧流层析免疫分析方法、酶联免疫分析法、磁珠免疫分析方法。