CN108318680A - 一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒，其方法包括待测样品预处理和预处理样品检测，采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集后对样品进行磁微粒化学发光免疫检测。通过高密度富集磁珠进行预处理，可以实现对样品中包括以药物‑ADA复合体形式存在的总ADA进行检测，得以克服样品中高浓度药物蛋白的影响，提高ADA检测方法的耐药性，同时也具有化学发光免疫检测方法的快速、自动化分析的优点。试剂盒包括高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、酸化液、中和液、质控品和激发液，采用试剂盒可以快速、准确检测抗药抗体。

Description

一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断领域，特别是涉及一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
自1982年首个重组蛋白类药物批准上市以来，目前国内外共有260多种治疗性重组蛋白类药物(包括70多种治疗性单抗药物)在临床上得到了广泛应用，用于230多种适应证的治疗(Nat Biotechnol,2014.32(10):p.992-1000；Health Aff(Millwood),2015.34(2):p.210-9)。随着对治疗性重组蛋白药物的研究越来越深入，对相关药物给药过程中产生的抗体即抗药抗体(Anti-Drug Antibody，ADA)的研究越来越受到重视(Immunol Today,1986.7(12):p.367-8.；Front Immunol,2016.7:p.21.)。抗药抗体的产生，会对治疗性重组蛋白类药物的安全性和有效性带来影响，因此ADA的检测是临床用药过程中需要密切关注的指标。此外，由于治疗性重组蛋白类药物的制剂形式和成分等会对蛋白质的免疫原性产生影响，因此，在药物开发过程中(包括临床前研究和临床试验阶段)，对ADA进行检测和评价已经成为药品监管部门的常规要求(FDA,Guidance for Industry:ImmunogenicityAssessment for Therapeutic Protein Products.2014.)。
重组蛋白类药物，由于与内源性蛋白氨基酸序列的差异、蛋白结构的改变及修饰、药物剂型、药物聚合、给药间隔和给药途径等因素，均可导致抗药抗体的产生；进而使药效下降甚至丧失、药物毒性增加、过敏反应与超敏反应发生、与内源蛋白产生交叉反应等，这些均造成潜在的药效损失和安全隐患。临床证据表明，患者体内抗药抗体的浓度在低至100ng/mL的水平时，就会具有临床意义上的影响，比如改变药代/药动、带来药物安全性隐患和降低药物治疗效果(AAPS J,2013.15(1):p.30-40.)。因此在ADA浓度达到100ng/mL前，就需要对患者体内的ADA进行有效测定，以供临床决策参考。
ADA在样品中会有两种存在形式，即游离ADA和ADA-药物结合复合物。此外，快速解离抗药抗体(如IgM)是免疫反应早期出现的抗体，各种ADA检测方法均需要评价对此类抗体的检测效果。如果不能检测到快速解离抗药抗体(如IgM)，则会低估真实阳性样品中的抗药抗体水平(FDA,Guidance for Industry:Assay Development and Validation forImmunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products.2016)。常规的桥接ELISA法通常只能检测血浆中的游离ADA。为了检测与药物结合的ADA，通常需要进行样品的前处理，采用包括酸化处理或高温孵育等的方法释放ADA。
随着单抗类重组蛋白药物种类的增加，临床上日益凸显的一个挑战是，高给药浓度条件下(血药浓度可达0.1～1mg/mL)，药物蛋白干扰ADA检测。因此，评价ADA测定方法的耐药性(assay’s drug tolerance)也成为了临床药品监管部门对药物研发和上市后监管的要求(FDA,Guidance for Industry:Assay Development and Validation forImmunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products.2016)。ADA测定方法的耐药性评价可以为蛋白类药物的剂量临床试验提供最优采样时间点的确定依据(USPGeneral Chapter 1106Immunogenicity Assays–Design and Validation ofImmunoassays to Detect Anti-Drug Antibodies.)。高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰是目前ADA检测技术的巨大障碍，常规的处理方法包括亲和分离，以及利用加入高浓度药物蛋白(1mg/mL)对ADA进行饱和结合进而采用聚乙二醇PEG(polyethylene glycol)沉淀ADA-药物复合体，而后酸解并包被于多孔板，再通过加酶标药物进行ADA的检测(AAPS J,2017.19(2):p.468-474.)。
目前，对于ADA的检测方法已有报道，常用ELISA桥接检测法，其主要步骤为：微孔板包被2.0μg/mL药物，每孔100μL，4℃静置过夜；BSA封闭后，按顺序加入0.5μg/mL生物素偶联药物、Tris(pH9.6)和酸处理标准曲线、质控品及待测样品[3μL样品加入100μL300mM醋酸溶液，混匀，室温孵育(1.5±0.5)h]，在室温振板温育2-2.5h；洗板后，每孔加入稀释后的SA-HRP(偶联链霉亲和素的辣根过氧化物酶)100μL，室温温育0.5-1h；洗板后，每孔加入100μL底物(TMB)，室温避光反应18-22min，最后以1M H2SO4终止反应，加入每孔50μL，在450nm处(参比波长630nm)测定OD值(J Pharm Biomed Anal,2005.39(3-4):p.364-75.；中国药学杂志,2017.52(1):p.14-19.)。现有ELISA方法存在不足之处是：只能进行低浓度药物(甚至样品中的药物不可检出)情况下的游离ADA检测，即不能克服高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰，也不能检出与药物结合形成复合物的ADA；在检测过程中的洗涤步骤容易洗脱快速解离抗药抗体，从而造成ADA的低估；ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低；ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所倡的总时间一般在2个小时以上，无法满足临床上的快速诊断的需求；ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。
中国专利申请CN 105424682A提供一种Anti-Bevacizumab抗药抗体检测试剂盒，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗体校准品、抗Bevacizumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化Bevacizumab为偶联有生物素的Bevacizumab，所述AP-抗ADA抗体为碱性磷酸酶(AP)标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。中国专利申请CN 105467114A提供一种抗药抗体Anti-Trastuzumab检测试剂盒，包括生物素化Trastuzumab、抗Trastuzumab抗体校准品、抗Trastuzumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化Trastuzumab为偶联有生物素的Trastuzumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。该检测试剂盒基于磁微粒化学发光检测原理来实现ADA的免疫检测，与ELISA方法相比其检测速度快，灵敏度高，但仍无法克服高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰。CN 105424682A和CN 105467114A所描述的方法在原理上与ELISA桥接检测法相同，只是把固相包被的介质由多孔板变为磁微粒，同时把酶促化学反应的底物更换为化学发光底物以适应化学发光免疫检测设备的自动化处理。因此，CN105424682A和CN 105467114A所描述的方法仍然只能进行低浓度药物(甚至样品中的药物不可检出)情况下的游离ADA检测，即不能克服高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰。
本发明通过高密度富集磁珠进行样品的预处理，可以实现对样品中包括以药物-ADA复合体形式存在的总ADA进行检测，得以克服样品中高浓度药物蛋白的影响，提高ADA检测方法的耐药性，同时也具有化学发光免疫检测方法的快速、自动化分析的优点。
发明内容
本发明目的是提供一种灵敏的抗药抗体检测方法，克服现有方法不能在高浓度药物(一般达到1mg/mL以上)存在情况下进行ADA检测的缺陷；并克服桥接免疫检测法只能检测游离形式ADA、而不能检测样品中以药物-ADA复合体形式存在的ADA的缺陷。
一种抗药抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1待测样品预处理；
S2预处理样品检测；
所述步骤S1中采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集，高密度富集磁珠是由蛋白类药
物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的；
所述步骤S2对预处理后的样品进行磁微粒化学发光免疫检测。
所述步骤S2中检测用磁珠为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm-5μm氨基磁珠表面所得到的。
所述步骤S2中用于与蛋白类药物分子结合的化学发光物分子为：N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
一种抗药抗体的检测试剂盒，包括：高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、酸化液、中和液、质控品和激发液。
所述高密度富集磁珠试剂为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的高密度富集磁珠，加入BSA溶液得到的含高密度富集磁珠溶液。
所述检测用磁珠试剂为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm-5μm氨基磁珠表面所得到的检测用磁珠，加入BSA溶液得到的含检测用磁珠溶液。
所述标记发光基团的药物为蛋白类药物分子与ABEI的偶联物。
所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品为单克隆或多克隆抗药抗体，阴性对照品为未给药个体血清或血浆样品。
所述检测样品稀释液为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、牛血清白蛋白l0g/L、硫柳汞1.0g/L的溶液。
所述酸化液为300mM醋酸；所述中和液为pH9.0的Tris溶液；所述激发液为激发液A(含1M氢氧化钠的催化剂)和激发液B(0.03％过氧化氢)。
本发明的有益效果是：高密度富集磁珠和检测用磁珠对药物蛋白分子的载量分别为50-500μg/mg和5-50μg/mg，高密度富集磁珠的载量比检测用磁珠的载量增加5～20倍，高密度富集磁珠可以更好地结合ADA(包括游离ADA和以药物-ADA复合体形式存在的ADA)，使用高密度富集磁珠结合待测样品中的ADA，通过分离结合ADA的高密度富集磁珠对样品中ADA进行富集后，加磁场，沉淀磁珠，洗去游离药物，排除原待测样品中游离药物对后续ADA检测的干扰，可以有效提高ADA的检测效果。
附图说明
图1本发明检测方法的原理图。
具体实施方式
如图1所示，本发明检测方法，包括ADA富集预处理和ADA的化学发光免疫检测。以高密度富集磁珠对待测样品进行预处理，富集包括游离ADA和以ADA-药物复合物形式存在的ADA，收集结合ADA的高密度富集磁珠后，将ADA与高密度富集磁珠分离，获得ADA富集样品。ADA富集样品中加入检测用磁珠和标记发光基团的药物进行免疫检测。
1、高密度富集磁珠的制备方法
按照每毫克氨基磁珠加50-500微克药物的量准确称取粒径0.2-2微米的氨基磁珠和蛋白类药物进行混合，在pH5-6的条件下向混合物中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液，按照每毫克氨基磁珠加20微克EDC计算，在室温下振荡反应30分钟，用0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液洗涤磁珠5次，得到高密度富集磁珠，向高密度富集磁珠中加入1％牛血清白蛋白(BSA)溶液，使磁珠质量浓度为0.5-5％，得到高密度富集磁珠试剂，置4℃冰箱存放。
2、检测用磁珠的制备方法：
按照每毫克氨基磁珠加5-50微克药物的量准确称取粒径1-5微米的氨基磁珠和蛋白类药物进行混合，在pH5-6的条件下往混合物中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液，按照每毫克氨基磁珠加20微克EDC计算，在室温下振荡反应30分钟，用0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液洗涤磁珠5次，得到检测用磁珠，向检测用磁珠中加入1％牛血清白蛋白(BSA)溶液，使磁珠质量浓度为0.5-5％，得到检测用磁珠试剂，置4℃冰箱存放。3、标记发光基团的药物的制备方法
蛋白类药物分子与ABEI的偶联，过程如下：用10mM高碘酸钠将2％葡聚糖dextran(分子量20000至40000)水溶液室温氧化30分钟，然后置4℃放置48小时，48小时后加入待偶联蛋白类药物分子和ABEI，抗体、葡聚糖和ABEI的摩尔比为1：1：30，室温反应2小时，置4℃待用。
4、制备检测样品稀释液：
按照磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞1.0g/L配制稀释液。
5、一种抗药抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1待测样品预处理
S1.1样品酸化：在10μL待测ADA样品(含有ADA和1mg/mL药物)中加入90μL 300mM醋酸溶液，室温孵育1-2小时。
S1.2ADA与高密度磁珠结合：加入20μL高密度富集磁珠(简称高密度磁珠)，并加入25μL pH 9.0的Tris溶液中和，孵育1～2小时。
S1.3收集结合ADA的高密度磁珠：以0.01M pH7.2的PBST洗涤3次后，去除上清，保留结合了ADA的高密度磁珠。
S1.4酸解：加入200μL 300mM醋酸溶液进行酸解，分离磁珠后，保留上清液作为经过预处理的待测样品。
S2预处理样品检测
S2.1在经过预处理的待测样品中加入检测用磁珠、标记发光基团的药物，抽吸混匀后在37℃条件下继续孵育12分钟。
S2.2吸出反应液后，加入洗涤液洗3次，吸出洗涤液后，加入激发液A(含1M氢氧化钠的血红素催化剂)和激发液B(0.03％过氧化氢)各200μL，测定相对发光强度。
6、一种抗药抗体的检测试剂盒，包括：高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、质控品(包括ADA阳性对照品和ADA阴性对照品)。
实施例1
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制药阿达木单抗(Adalimumab)的抗药抗体检测试剂盒
采用上述方法制备阿达木单抗(Adalimumab)的抗药抗体检测试剂盒。试剂盒包括针对Adalimumab ADA检测的高密度富集磁珠、检测用磁珠以及标记发光基团的Adalimumab、样品稀释液、质控品和激发液。
所述高密度富集磁珠试剂为，Adalimumab通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.5μm的氨基磁珠表面(250μg Adalimumab/mg磁珠)，加入1％BSA溶液得到的含高密度富集磁珠溶液。
所述检测用磁珠试剂为，Adalimumab通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm氨基磁珠表面(15μg Adalimumab/mg磁珠)，加入1％BSA溶液得到的含检测用磁珠溶液。
所述标记发光基团的Adalimumab为，Adalimumab分子与ABEI偶联后获得的溶液。
所述样品稀释液为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、牛血清白蛋白l0g/L、硫柳汞1.0g/L的溶液。
所述质控品包括阴性对照品和阳性对照品。其中阴性对照品为未经给药食蟹猴的阴性血清，阳性对照为含有兔抗Adalimumab多克隆抗体(浓度为1mg/mL)的食蟹猴血清。
所述激发液包括激发液A(含1M氢氧化钠的催化剂)和激发液B(0.03％过氧化氢)。
所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现抗药抗体的免疫测定的，其检测原理如图1所示：以高密度富集磁珠对待测样品进行预处理，富集包括游离ADA和以Adalimumab-ADA复合体形式存在的ADA，以检测用磁珠和标记发光基团的Adalimumab及激发液对富集后获得的ADA进行化学发光测定。
实施例2
阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒的加药抑制实验
以实施例1中的试剂盒对食蟹猴血清样品中的抗Adalimumab抗药抗体进行检测。为了评价本发明所述方法对高浓度药物条件下ADA检测的有效性，进行加药抑制实验。以未经给药的食蟹猴血清作为阴性对照，以含有250ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体的食蟹猴血清作为ADA阳性对照，以含有250ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体和0.5mg/mL(样品A)或1mg/mL(样品B)Adalimumab的食蟹猴血清作为待测样品，按照前述方法对进行样品预处理并检测，结果见表1。
表1测定食蟹猴血清中Adalimumab ADA的加药抑制实验的检测结果
实施例3
阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒的性能评估
灵敏度：阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒LOD为5ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。
线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，R2＝0.956。
准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值阳性对照血清(含1000ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体)、一份中值阳性对照血清(含500ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体)、一份低值阳性对照血清(含25ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体)一共三份血清(样本A)，按照1：9体积比分别添加到两份阴性食蟹猴血清中(样本B)，混匀后形成六份新样本，分别检测并计算其浓度。血清加样回收率在85％-115％之间。
精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在15％以内。
稳定性：将阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控品(分别含1000、500、25ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体)，结果表明3种质控品的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒稳定好，符合临床要求。
特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示，添加物质对阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒检测结果没有影响。
实施例4：检测方法对比试验
为了解决高给药浓度条件下对ADA检测中的药物蛋白的干扰问题，常规方法是利用加入高浓度药物蛋白(1mg/mL)对ADA进行饱和结合，进而用PEG(polyethylene glycol)沉淀ADA-药物复合体(J Immunol Methods,2015.426:p.62-9.；WO 2015123315A1.)。然而该方法在实际应用中表现得不够理想，常有漏检或低估ADA水平的现象。本实施例对高浓度Adalimumab样品中的ADA进行检测，以比较本发明方法和传统PEG沉降ELISA法(A值)。
分别以本发明所提供的阿达木单抗(Adalimumab)抗药抗体试剂盒和传统PEG沉降ELISA法对空白血清(未经给药食蟹猴的血清)(样本1)、含有250ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体(ADA)的食蟹猴血清样品(样本2)和含有250ng/mL兔抗Adalimumab多克隆抗体(ADA)+1mg/mL Adalimumab的食蟹猴血清样品(样本3)进行测定，结果见表2。
表2本发明方法与传统PEG沉降ELISA法效果对比
比较两种方法的S2/S1值，可知在测定不含药物分子的待测样本中，本发明方法与传统PEG沉降ELISA法均能有效测出ADA，但本发明方法的信噪比更高，更有优势；比较两种方法的S3/S1值，可知传统PEG沉降ELISA法无法检测到含有高浓度药物分子样本中的ADA，而本发明方法能有效检出。
利用本发明对阿达木单抗(Adalimumab)的抗药抗体进行检测外，还对利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、依那西普(Etanercept)、英夫利昔单抗(Infliximab)以及重组促红细胞生成素(rEPO)和重组生长激素(rGH)等的抗药抗体进行检测，检测结果显示该方法可以在高药物浓度下对相应ADA进行有效检测。

Claims (10)

1.一种抗药抗体的检测方法，其特征是包括以下步骤：
S1 待测样品预处理；
S2 预处理样品检测；
所述步骤S1中采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集，高密度富集磁珠是由蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的；
所述步骤S2对预处理后的样品进行磁微粒化学发光免疫检测。
2.根据权利要求1所述的抗药抗体的检测方法，其特征是所述步骤S2中检测用磁珠为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm-5μm氨基磁珠表面所得到的。
3.根据权利要求1所述的抗药抗体的检测方法，其特征是所述步骤S2中用于与蛋白类药物分子结合的化学发光物分子为：N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
4.一种抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述试剂盒包括高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、酸化液、中和液、质控品和激发液。
5.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述高密度富集磁珠试剂为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的高密度富集磁珠，加入BSA溶液得到的含高密度富集磁珠溶液。
6.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述检测用磁珠试剂为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm-5μm氨基磁珠表面所得到的检测用磁珠，加入BSA溶液得到的含检测用磁珠溶液。
7.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述标记发光基团的药物为蛋白类药物分子与N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)的偶联物。
8.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品为单克隆或多克隆抗药抗体，阴性对照品为未给药个体血清或血浆样品。
9.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述检测样品稀释液为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、牛血清白蛋白l0g/L、硫柳汞1.0g/L的溶液。
10.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述酸化液为300mM醋酸；所述中和液为pH9.0的Tris溶液；所述激发液为激发液A和激发液B，其中激发液A为含1M氢氧化钠的催化剂，激发液B为0.03％过氧化氢。
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