CN114047343B - 双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒及其使用方法和应用。所述试剂盒既能耐受游离药物的干扰又能耐受高浓度靶点干扰，避免使用毒性物质和复杂处理工序，克服了靶点和高浓度药物对检测灵敏度的干扰，耐药水平高，取得了非常好的实施效果，在抗IgE单抗药物的免疫原性分析中具有很好的实用价值和工业价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域，尤其涉及药物免疫原性分析领域，具体涉及一种双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
近年生物医药在全球蓬勃发展，各种类型的生物药百花齐放，成为国内外医药企业追逐的热门领域。单克隆抗体药物（单抗药物）在生物药中占据市场主导地位，目前全球已经有100多个单抗药物上市。单抗药物具有高特异性、靶向性强的特点，被广泛用于肿瘤、传染病、自身免疫性疾病等的治疗。
IgE与变态反应性疾病密切相关。例如，在IgE介导的变态反应性疾病中，变应原与效应细胞如嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE交联，诱导效应细胞活化脱颗粒，合成、释放炎症因子并募集炎症细胞。因此，靶向IgE药物对于精准治疗I型变态反应性疾病具有非常重要的作用。例如，靶向IgE的抗体可以作为治疗变应性哮喘、慢性荨麻疹、变应性鼻炎等疾病的重要药物。此外，自身反应性IgE抗体还与系统性红斑狼疮（SLE）的发病有关。由于IgE与上述系列变态反应性疾病和红斑狼疮等自身免疫性疾病密切相关，靶向结合IgE的抗IgE单抗药物长期为生物医药企业追逐开发的对象，而以IgE为靶点的生物药或类似药也处于不断的发展中。
不同的药物分子通常具有不同的结构，这使得不同单抗药物的研发具有非同质化的特征。免疫原性研究是蛋白质类的大分子药物无法避免的研究环节，而且免疫原性研究贯穿此类药物的整个研发周期。抗肿瘤靶点的单抗药物的肿瘤靶点一般是肿瘤细胞特异性表达，且是跨膜表达蛋白，所以在血浆和血清中基本不存在游离靶点或仅存在低含量的靶点保外区脱落成分。但是IgE在正常的生物个体中基本都存在表达，而且在循环系统中可以呈游离状态分泌，因此生物体的血浆和血清中能够检测到高浓度的IgE，可达到ng甚至mg级的浓度。如何解决此类单抗药物的免疫原性研究中遇到的高浓度靶点的干扰，是本发明所要跨越的重要技术障碍之一。
在临床前或者临床中的免疫原性评价中，生物体给进药物后药物进入血液会产生抗药物抗体（Anti-Drug Antibody，ADA），ADA的检测还会受到血清中存在的高浓度药物的干扰。对于抗IgE单抗药物的ADA检测而言，其不仅需要克服高浓度的药物的干扰、药物-抗药物抗体复合物的干扰，还可能面临血液中高浓度的IgE和可能形成的药物-IgE复合物对ADA检测造成的干扰。上述干扰因素会影响ADA检测的耐药性也会进一步影响检测结果的灵敏度，甚至可能导致阳性样品被检测为假阴性。
总体来说，抗IgE单抗的免疫原性评价需要面临以下几个方面的问题：
1. 在正常状态或者疾病状态的动物或人体内，循环血液中IgE水平较高，正常状态的食蟹猴体内IgE水平也可能达到超高浓度级。因此，以抗IgE单抗药物作为抗原，来检测血液中抗药物抗体会受到体内高浓度IgE结合的干扰。
除了药物靶点本身IgE的干扰外，血液循环中还存在给进的高浓度单抗药物，循环的游离药物与抗药物抗体形成免疫复合物，药物也与IgE形成复合物，这些同样也会干扰血清样品中抗药物抗体的检测。
以上干扰因素会影响耐药性和检测灵敏度，易造成假阴性或弱阳性，不利于实际临床前和临床样品的免疫原性评估。
2. 即使将药物-IgE复合物解离，游离的IgE还可以与用作检测抗原的抗IgE单抗药物结合，这对靶抗原的处理、免疫复合物的处理提出更高的技术要求和挑战。
3. 生物样品基质尤其是血样中包含成千上万种蛋白、各类因子以及游离受体。抗IgE单抗药物的免疫原性检测还面临上述基质成分产生的干扰效应。
技术文献1（EMEA 2005 SCIENTIFIC DISCUSSION）用酸性硫氰酸钾预处理血清样品的方法来选择性聚集IgE并消除IgE的干扰，操作繁杂，且硫氰酸钾毒性强，若操作不当使硫氰酸钾释放至环境中，会对水体造成严重有害污染。技术文献2（103976-Omalizumab-Clinpharm-PREA，https://www.fda.gov/）提及基于ELISA方法对奥马珠单抗（Omalizumab）的ADA检测，耐药程度仅达到耐受10μg/mL。技术文献3（39_103976S5231 omalizumabmultidisciplinary prea，https://www.fda.gov/）同样存在耐药有限的问题。技术文献4（Development and validation of a new IgE-Tolerant ELISA method forquantifying serum concentration of omalizumab）和技术文献5（专利申请号201910660776）也都是针对抗IgE单抗药物本身的检测，并非是免疫原性检测，仅采用酸解的方法耐受游离IgE的干扰，只要克服靶点干扰即可，披露的仅是一种抗IgE单抗的ELISA方法，对样品进行酸解前处理，降低内源性IgE干扰，并利于液相孵育，先形成Biotin-IgE-抗IgE抗体的复合物形式，再与固相载体相结合后利用二抗进行药物本身的检测。综上，目前尚未有针对抗IgE单抗药物的双耐受型即耐受IgE靶点又耐受高浓度单抗药物本身干扰的免疫原性检测试剂盒的报道。
发明内容
如何克服上述干扰，开发一种针对抗IgE单抗药物的免疫原性检测（ADA检测）的试剂盒，使其既能耐受游离药物的干扰又能耐受高浓度靶点干扰，是本发明所要解决的技术问题。针对上述问题，本发明提供一种双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒及其使用方法和应用，避免使用毒性物质和复杂处理工序，克服了靶点和高浓度药物对检测灵敏度的干扰，耐药水平高，取得了非常好的实施效果，在抗IgE单抗药物的免疫原性分析中具有很好的实用价值和工业价值。
第一方面，本发明提供一种双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒。本发明的试剂盒采用了酶标微孔板与电化学发光微孔板的组合运用的方式。具体地，所述试剂盒包括：
组分A：包被作为抗原的抗IgE单抗药物形成固相化抗原的微孔酶标板；
组分B：第一酸化液，使待测样品中的抗IgE单抗药物-抗药物抗体复合物及抗IgE单抗药物-IgE复合物酸化解离；
组分C：中和液，使微孔酶标板上的固相化抗原亲和捕获酸化解离的抗药物抗体和IgE靶点，与抗IgE单抗药物形成“抗IgE单抗药物-抗药物抗体”以及“抗IgE单抗药物-IgE”形式的复合物；
组分D：第二酸化液，将微孔酶标板上抗原亲和捕获的抗药物抗体和IgE靶点酸化解离释放；
组分E：反向包被IgE的电化学发光免疫分析微孔板，具体是将第二次酸化解离释放的抗药物抗体和IgE转移到电化学发光免疫分析微孔板中进行包被，形成固相化抗药物抗体和固相化的IgE；
组分F：对反向包被后的电化学发光免疫分析微孔板进行免疫分析封闭的第一封闭液；
组分G：对免疫分析封闭后的电化学发光免疫分析微孔板进行特异性的靶点阻断封闭的第二封闭液；
组分H：钌标记的抗IgE单抗药物；
组分I：作为阳性对照的抗IgE单抗药物的阳性多抗；
组分J：电化学发光底物。
较佳地，所述双耐受型包括耐受游离抗IgE单抗药物的干扰和耐受待测样品中IgE靶点的干扰。
较佳地，所述试剂盒在未中和的酸性条件下即酸化免中和将第二酸化处理后的样品反向包被至电化学发光免疫分析微孔板形成固相化的抗药物抗体和固相化的IgE。
较佳地，所述第二封闭液包含IgE受体。
较佳地，IgE受体与IgE结合阻断并封闭样品中游离IgE对分析结果的影响。
较佳地，所述IgE受体是人 Fc epsilon RI α（Human Fc epsilon RI alpha）蛋白。
较佳地，所述抗IgE单抗药物包括利格利珠单抗、奥马珠单抗、或者与利格利珠单抗和奥马珠单抗具有相同作用机制的单抗药物。
较佳地，所述酸化液是pH 3.0 ± 0.2的醋酸溶液。
较佳地，所述检测试剂盒还包括稀释液。
较佳地，所述待测样品是免疫原性检测会遇到既要耐受IgE又要耐受高浓度抗IgE单抗药物的人或动物血清样本。
较佳地，所述待测样品是单个血清样品或者混合血清样品。当然，血液样品也可作为本发明所述试剂盒的待测样品。
较佳地，所述检测试剂盒中的IgE替换为在待测样品中具有游离靶点的蛋白分子，抗IgE单抗药物替换为抗相应游离蛋白分子靶点的单抗药物。
第二方面，本发明提供上述任一项所述的双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒的使用方法。所述免疫原性分析试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤S1. 将抗IgE单抗药物作为抗原包被于微孔酶标板上形成固相化抗原；
步骤S2. 对待测样品进行第一酸化处理，使待测样品中的抗IgE单抗药物-抗药物抗体复合物及抗IgE单抗药物-IgE复合物解离；
步骤S3. 向包被有固相化抗原的微孔酶标板中加入第一酸化处理后的样品并进行中和反应形成免疫复合物；
步骤S4. 对形成所述免疫复合物的固相化载体进行第二酸化处理，以酸化解离释放酶标板上抗原亲和捕获的抗体和靶点，形成游离的抗药物抗体和游离的IgE；
步骤S5. 将第二酸化处理后的样品液在酸性条件下反向包被于结合力强于微孔酶标板的电化学发光免疫分析微孔板中，形成固相化的抗药物抗体和固相化的IgE；
步骤S6. 对反向包被后的电化学发光免疫分析微孔进行第一常规封闭处理以防止非特异性吸附；
步骤S7. 对第一常规封闭处理后的电化学发光免疫分析微孔板进行第二封闭处理以完成靶点阻断的特异性封闭；
步骤S8. 向第二封闭结束后的电化学发光免疫分析微孔板中加入钌标记的抗IgE单抗药物进行孵育反应；
步骤S9. 孵育反应结束后，加入电化学发光底物，信号采集读板。
较佳地，电化学发光免疫分析微孔板上检测到的电化学发光信号值与样品中抗药物抗体的含量呈正相关性。
第三方面，本发明提供上述任一项所述的免疫原性分析试剂盒在抗药物抗体的检测中的应用，药物是抗具有游离蛋白分子靶点的单抗药物。
附图说明
图1是本发明所述双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒的原理示意图。
具体实施方式
通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在未作具体说明的情况下，“室温”指的是“20-26℃”，“rpm”指的是“转/分钟”。
如背景技术介绍，抗IgE单抗药物的免疫原性分析过程中，内源性IgE可以游离分布在循环血液中，这导致抗药物抗体的检测会受到样品中高浓度内源性IgE靶点的干扰。而且，多数肿瘤靶点是细胞上跨膜表达，很少有游离肿瘤靶点进入循环血液，所以抗肿瘤靶点的抗体药很少受到游离靶点的干扰。和抗肿瘤靶点的抗体药不同的是，分析抗游离IgE靶点如IgE单抗药物的抗药抗体时，必须考虑克服样品中游离靶点（IgE）的干扰从而提高抗药抗体分析的耐药性。下面结合所述试剂盒的构成来介绍仪器耗材、生物化学试剂和试剂盒的构建（使用）方法。
仪器与耗材：
电化学发光成像仪（Meso-Scale Discovery，S600或等同的可替代品）；
96微孔酶标板（Costar，Cat# 3590或等同的可替代品）；
电化学发光免疫分析微孔板，也可以称为电化学发光微孔板（Meso-ScaleDiscovery，Cat# L15XB-3或等同的可替代品）。
生物和化学试剂：
抗IgE单抗药物：可采用利格利珠单抗(ligelizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、或其它抗IgE单抗的类似物；
抗体药物对应靶点分子的受体，即IgE受体：Human Fc epsilon RI alpha 蛋白,His Tag（ACRO，Cat# FCA-H5228）；
抗IgE单抗的阳性多抗：ADA阳性对照，具体采用抗omalizumab多抗 (美迪西自制)，常规方法制得，为使动物免疫然后纯化免疫血清中的抗体；
三联联吡啶钌标记的抗IgE单抗：Ru-omalizumab（美迪西自制)，常规方法制得，为将三联吡啶钌与omalizumab于PBS单抗共孵育，通过透析去除游离的三联吡啶钌及单抗药物；
第一封闭液：SuperBlock Blocking Buffer in PBS（赛默科技，Cat# 37515，2-8℃保存）；与其功能近似的替代物也可以使用；
第二封闭液（IgE封闭阻断剂）：含10±0.5µg/mL的Human Fc epsilon RI alpha受体蛋白的1×PBS溶液；
电化学发光底物：含Read Buffer（Meso-Scale Discovery，Cat# R92TC-1）；
中和液：pH 8.5 ± 0.5的1M Tris-HCl缓冲液；
稀释液（Assay Buffer）：1×PBS pH 7.4 ± 0.2的磷酸盐缓冲液；
酸化液：300mM的醋酸溶液，pH 3.0 ± 0.2；
洗涤缓冲液(Wash Buffer)：0.05% PBST；
食蟹猴血清（上海美迪西生物医药股份有限公司采集或其它商业来源）。
为了便于试剂盒的快捷使用，试剂盒的微孔酶标板、电化学发光免疫分析微孔板、相关试剂均可以配置为拆开即用型。例如，包被作为抗原的抗IgE单抗药物形成固相化抗原的微孔酶标板可设计为拆开即用型。强结合的电化学发光免疫分析微孔板也可以设计为拆开即用型。
以下结合双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒的组成来说明该试剂盒的构建（使用）方法。所述方法成功克服了IgE抗体免疫原性分析的干扰因素（样品中高浓度的IgE的干扰和给入体内后血液样品中的高浓度药物的干扰），实现了靶点和药物的双耐受。在此指出，下述方法中的数值仅为示例。在试剂盒的实际使用过程中，可以根据需要对体积比、加入量、转速等参数进行适当调整或者改变。但是，体积比优选为同比例调整。
将抗IgE单抗药物作为抗原包被于微孔酶标板上形成固相化抗原。形成固相化抗原的方式为本领域常用手段，包括包被、封闭、洗板。用稀释液将抗IgE单抗药物稀释至9.5-10.5µg/mL (例如10 µg/mL)，混合均匀，以90-110µL/孔(例如100 µL/孔)加入到96微孔酶标板中，置于2-8℃过夜孵育至少15h进行包被。包被结束后，甩掉酶标板中残余液体，使用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。然后以150-250µL/孔(例如200 µL/孔)加入第一封闭液，置于数显型酶标板振荡器以500±50转/分钟室温孵育2 h±15 min。甩掉残余的封闭液，继续用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干，既可以立即使用，也可以用封板膜封装，置于2-8℃内保存并在一周内使用。洗板的次数可为三次。每次洗涤缓冲液的用量可根据实际需要进行调整，例如300 µL/孔。后续洗板的次数和洗涤缓冲液用量不再赘述。
对样品进行第一次酸化处理。第一次酸化处理的目的是使样品中的单抗药物-抗药物抗体复合物及单抗药物-IgE复合物解离。对样品进行酸化处理前可将样品在无外界因素的影响下于室温解冻并且平衡至室温。作为优选，还可以使用稀释液将样品进行最小稀释倍数的稀释并振荡混匀。作为示例，最小稀释倍数为10倍。
对待测样品进行第一酸化处理的具体操作是：用移液器吸取MRD稀释后的样品作为待测样品。将待测样品以40-50µL/孔(例如40 µL/孔)加入到96微孔酶标板中，然后加入酸化液，置于微孔板振荡器以500±50 转/分钟室温振荡孵育1h ± 5 min。作为优选，酸化液和待测样品的体积比可为9：1。所述酸化液可为300mM醋酸溶液，pH 3.0 ± 0.2。
抗原亲和捕获抗体中的靶点及抗药物抗体。向包被有固相化抗原的微孔酶标板中加入中和液，然后加入第一酸化处理后的样品，封闭酶标板后置于微孔板板振荡器以500±50转/分钟室温孵育4 h±30 min。中和液和第一酸化处理后的样品的体积比为1：2。作为示例，中和液在酶标板中的加入量为81 µL/孔，第一酸化处理后的样品在酶标板中的加入量为162 µL/孔。可通过封板膜封闭酶标板。后续的封闭酶标板方式不再赘述。
在该过程中，微孔酶标板上的固相化抗原亲和捕获样品中的抗药物抗体和待测样品中的靶点，从而在固相载体上形成“抗IgE单抗药物-抗IgE单抗药物的抗体”以及“抗IgE单抗药物-IgE”形式的免疫复合物。具体地，微孔酶标板上的固相化抗原（抗IgE单抗药物，Drug）与酸化中和后的样品反应，酶标板上的固相化抗原能够亲和捕获待测样品中的抗药物抗体(后面简称ADA）以及样品中的IgE，从而在固相载体上形成“抗IgE单抗药物-抗药物抗体”（又称“Drug-ADA”）以及“抗IgE单抗药物-IgE”（又称“Drug-IgE”）形式的免疫复合物。也就是说，第一酸化和中和的目的是解离样品中的“抗IgE单抗药物-抗药物抗体”以及“抗IgE单抗药物-IgE”复合物，将液相样品中的两种复合物转变成固相化载体上的复合物。
中和及亲和捕获结束后，甩掉酶标板中的剩余溶液，用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。通过洗涤的方法去除样品中未结合的游离药物（抗IgE单抗）。
对形成所述免疫复合物的固相化载体进行第二酸化处理，以将酶标板上抗原亲和捕获的抗体和靶点酸化解离释放。第二酸化的目的是将固相化载体上的“抗IgE单抗药物-抗药物抗体”以及“抗IgE单抗药物-IgE”复合物尽可能解离成游离的抗药物抗体（ADA）和游离的IgE。向具有所述免疫复合物的微孔酶标板中以90-110µL/孔(例如100 µL/孔)加入酸化液，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育20 ± 5 min。通过第二酸化处理可以释放酶标板上的IgE单抗药物结合的抗药物抗体（ADA）和IgE。
将酸化解离释放的抗药物抗体和IgE转移到电化学发光免疫分析微孔板（ECL 板）中进行包被，形成固相化抗药物抗体和固相化的IgE。具体是：将第二酸化处理后的样品液以90-100µL/孔(例如90 µL/孔)加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于2-8℃过夜孵育至少15h。特别需要注意的是，本发明在第二酸化处理后免中和，即直接在酸性条件下包被，提高信号，改善灵敏度。这打破了常规的“酸化后中和的操作条件有利于Assay灵敏度”的技术认知。
电化学发光免疫分析微孔板的结合能力高于微孔酶标板。本发明将二次酸化解离物转入强结合的电化学发光免疫分析微孔板进行包被，如此抗原亲和捕获的目标分析物和靶点分子能够反向包被到微孔中，这样形成固相化的目标分析物和靶点分子。
对反向包被后的电化学发光免疫分析微孔板进行第一次常规封闭处理。转板反向包被结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。然后以150-200µL/孔(例如200 µL/孔)加入第一封闭液来防止非特异性结合。非特异性结合指的是：封闭液中有封闭蛋白可以把板孔中未吸附蛋白的位置占据，防止后续的检测反应中的抗体非特异性吸附。封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500 ± 50转/分钟室温振荡孵育2 h±15 min。第一封闭结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的剩余封闭液，用洗涤缓冲液洗板多次。第一封闭可以防止板孔其它位点非特异性性吸附结合其它IgE。
对第一封闭处理后的电化学发光免疫分析微孔板进行第二封闭处理以完成靶点阻断封闭。若不阻断靶点可能会造成非特异性信号的增高。将IgE受体用稀释液稀释至10±0.5 µg/mL，然后以100-150µL/孔(例如100 µL/孔)加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1 h ± 5 min。第二封闭使得IgE受体与IgE结合阻断并封闭样品中游离IgE对分析结果的影响。第二封闭结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的剩余封闭液，用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。
采取二次封闭，即常规的免疫分析封闭和特异性的受体阻断封闭相结合的组合方式，可以阻断靶点与作为检测试剂的药物的结合而对抗药物抗体检测的干扰。
向第二封闭结束后的电化学发光免疫分析微孔板中加入钌标记的抗IgE单抗药物进行反应。采用钌标记的药物（抗原），钌可以激发电化学发光，药物可以和对应的ADA结合，作为检测试剂用。以95-105µL/孔(例如100 µL/孔)加入钌标记抗原，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1 h ± 5 min。
孵育反应结束后，加入电化学发光底物，信号采集读板。具体是：钌标记的抗IgE单抗药物孵育结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的剩余液体，用洗涤缓冲液洗板多次。以150-200µL/孔(例如150 µL/孔)加入电化学发光底物，电化学发光底物在电化学发光仪上进行信号采集，读数。电化学发光底物在使用前可以预先平衡至室温。
高亲和力的电化学发光免疫分析微孔板上检测到的电化学发光信号值与样品中抗药物抗体（ADA）的含量呈正相关性。
综上，所述试剂盒利用微孔酶标板（ELISA板）和电化学发光免疫分析微孔板（ECL板）的巧妙组合，采取了抗原亲和捕获目标分析物与目标分析物反向包被到电化学发光免疫微孔板中相结合的方法，提高灵敏度和耐受性。而且，常规的免疫分析封闭和特异性的受体阻断封闭相结合的组合方式，可以阻断靶点与作为检测试剂的药物的结合而对抗药物抗体检测的干扰。
以下的实施例旨在以本发明研发的技术节点性实施例来递进式阐述本发明的形成过程以及本发明的实施效果和技术优势，以便于更好地让相关人员理解本发明的新颖性、创造性、实用性。具体以抗IgE单抗药物奥马珠单抗和食蟹猴血清为对象，旨在提高IgE单抗及其类似药物的免疫原性评价的ADA检测水平，从而构建下述的检测试剂盒及其对应使用方法。具体实施方式中选择使用食蟹猴血清的原因是：猴子是相关种属，抗IgE单抗药物在猴子血清中的临床前免疫原性检测会遇到既要耐受IgE又要耐受高浓度药物的问题。
在下述表格中，NQC表示阴性对照。“NA”指的是“不适用本部分”，或理解为无需参考值。RLU信号值指的是相对发光单位。
实施例1
采用生物素标记的药物与钌标记的药物构建Bridge ECL法。考虑到要克服血清中游离IgE的干扰，利用（另一个）抗IgE的单抗（ligelizumab，里格里单抗）包被在96微孔酶标板（ELISA板）上。先将配制在血清样品中的抗IgE单抗的阳性多抗（ADA，阳性抗药物抗体）以及未添加ADA的血清样品按照表1所述的浓度值与抗IgE单抗（药物Drug，奥马珠单抗）按照最小稀释倍数（MRD，10倍）稀释后进行第一次酸化。酸化液和待酸化的样品液的体积比为1：9。对第一次酸化后的样品液进行中和。中和液和第一次酸化后的样品液的体积比为1：2。中和后的样品液转移入微孔酶标板（ELISA板），用封板膜封好，置于微孔板振荡器以500 ±50转/分钟室温孵育4 h±30 min，通过亲和吸附去除IgE。将ELISA板反应后的样品液转移至非ELISA的稀释板孔中，再次加入酸化液进行第二次酸化，进一步解离药物-抗药物抗体复合物，酸化液和待第二次酸化的样品液的体积比为2:1。取出封闭的预先包被有链霉亲和素（Streptavidin）的高结合力的电化学发光微孔板（ECL板），加入中和液配制的生物素标记的药物（生物素Biotin标记的抗IgE单抗，中和液和生物素标记的药物的体积比为1:10000）和三联联吡啶钌标记的抗IgE单抗（三联联吡啶钌和抗IgE单抗的体积比为1:10000），然后将第二次酸化后的样品液加入ECL微孔板置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1 h±5 min。第二次酸化后的样品液和中和液的体积比为1:1。孵育完成后，加入电化学发光底物读取信号值。
表1 实施例1的检测分析结果
从表1可知，含ADA阳性抗药物抗体的血清样品在同时含有一定浓度药物的情况下，分析检测的耐药性很低。与不含ADA的阴性对照相比，添加了高浓度ADA的血清样品的信号值部分甚至都出现低于阴性对照样品的信号值。含ADA阳性抗药物抗体的血清样品的耐药浓度不超过300μg/mL，其中，含500ng/mL ADA的血清样品无法耐受50μg/mL的药物。不仅如此，实施例1的三联联吡啶钌标记的抗IgE单抗浓度很高，即钌标记抗体使用浓度很高，信号强度低，检测灵敏度差。该实施例采用抗IgE抗体亲和捕获血清样品中的IgE并结合Bridge ECL的方式难以提高检测的耐药水平，因此也很难提高分析灵敏度，应用此技术方案，容易导致含高浓度ADA的血样被检测为假阴性。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅在于：ELISA板中将IgE抗体替换成IgE受体。也就是说，实施例1采用另一个抗IgE的单抗来亲和捕获去除IgE，实施例2则是将IgE受体（配体对抗药物靶标，Human Fc epsilon RI alpha Protein）包被在酶标板（ELISA板）上，其余实施步骤和实施例1相同。
表2实施例2的检测分析结果
实施例2利用IgE受体亲和捕获血样中的IgE，相较于实施例1使用另外的抗IgE抗体捕获IgE，更有利于提高分析方法的药物耐受性。从表2可知，实施例2的信号强度整体提高，尤其含不同浓度ADA的血样几乎均能耐受50μg/mL的药物。与阴性对照样品相比，仍能被检测出阳性结果，而不像实施例1所述的仅仅ADA高于500ng/mL时才能耐受50μg/mL的药物。但实施例2的技术方案仍然难以耐受高浓度的药物，检测灵敏度有限。
根据实施例1和实施例2，无论是用抗IgE的抗体还是用IgE的受体包被酶标板先亲和捕获吸附去除血清样品中的IgE再结合使用Bridge ECL的方法，均难以实现高度的灵敏度和耐药程度。
实施例3
采用双酶标板并结合直接ECL的技术方案以期提高耐药性和灵敏度。具体是：利用（另一个）抗IgE单抗的单克隆抗体包被在酶标板（ELISA板1）上，同时取另一块酶标板（ELISA板2），并在该酶标板上包被抗IgE单抗（药物Drug，奥马珠单抗）。先将配制在血清样品中的抗IgE单抗的阳性多抗（ADA，阳性抗药物抗体）以及未添加ADA的阴性血清样品按照表3所述的浓度值与抗IgE单抗（药物Drug，奥马珠单抗）混合物按照最小稀释倍数（MRD，10倍）稀释后进行第一次酸化。待酸化的样品和酸化液的体积比为1：9。中和第一次酸化后的样品液。第一次酸化后的样品液和中和液的体积比为2：1。将中和后的样品液转移入ELISA板1进行反应，用封板膜封好，置于微孔板板振荡器500±50转/分钟室温孵育4 h ±30min，亲和吸附先去除IgE。将ELISA板1上反应后的微孔中的样品液再转移入包被有抗IgE单抗药物的ELISA板2中，置于微孔板板振荡器500±50转/分钟室温孵育4 h±30 min。洗涤ELISA板2后，直接加入100 µL/孔的酸化液，然后用封板膜封好，置于微孔板振荡器500±50转/分钟室温振荡孵育20±5min，以期解离药物-抗药物抗体复合物。取出高亲和力的电化学发光免疫分析微孔板（ECL板），在每一微孔中预先加入45μL/孔的中和液，然后将ELISA板2中酸化结束后的样品液加入ECL板对应的孔中（90 µL/孔），置于2-8℃过夜孵育至少15h。次日，洗涤ECL板后用第一封闭液（SuperBlock Blocking Buffer in PBS）封闭。封闭结束后，洗涤ECL板，再以100 µL/孔加入1:10000倍稀释的钌标记抗原溶液（三联联吡啶钌标记的抗IgE单抗，Ru-Omalizumab，），用封板膜封好，置于微孔板振荡器500±50 转/分钟室温振荡孵育1h±5 min。孵育完成后，加入电化学发光底物读取信号值。
表3 实施例3的检测分析结果
实施例3仅有非常高浓度的ADA样品（50000ng/mL）才能耐受上述三个药物浓度。与阴性对照样品相比，ADA 500ng/mL的血清样品基本上很难耐受100μg/mL的药物，也就是说实施例3所述检测的耐药水平很难在500ng/mLADA时的临界点继续提升。
实施例4
将抗IgE单抗作为抗原包被于微孔酶标板上形成固相化抗原。对待测样品进行第一酸化处理。将待测样品以40 µL/孔加入到96微孔酶标板中，然后加入酸化液，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1h±5min。向包被有固相化抗原的微孔酶标板中加入中和液，然后加入第一酸化处理后的样品，封闭酶标板后置于微孔板板振荡器以500±50转/分钟室温孵育4 h±30 min。中和液和第一酸化处理后的样品的体积比为1：2。中和及亲和捕获结束后，甩掉酶标板中的剩余溶液，用洗涤缓冲液洗板多次去除样品中未结合的游离抗IgE单抗。洗涤后拍干。向微孔酶标板中以100 µL/孔加入酸化液进行第二酸化处理，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育20 ± 5 min。通过第二酸化处理可以释放酶标板上的IgE单抗药物结合的抗药物抗体（ADA）和IgE。先在电化学发光免疫分析微孔板中预铺45 µL/孔的中和液后，再将第二酸化处理后的样品液以90 µL/孔加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于2-8℃过夜孵育至少15h。对电化学发光免疫分析微孔板进行第一次常规封闭处理，转板包被结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。然后以200 µL/孔加入第一封闭液来防止非特异性结合，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育2h±15min。第一封闭结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的剩余封闭液，用洗涤缓冲液洗板多次。对第一封闭处理后的电化学发光免疫分析微孔板进行第二封闭处理以完成靶点阻断封闭。将IgE的受体用稀释液稀释至10±0.5 µg/mL，然后以100 µL/孔加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1h±5 min。以100 µL/孔加入钌标记抗原，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1h± 5 min。孵育反应结束后，加入电化学发光底物，信号采集读板。
表4实施例4的检测分析结果
从表4可以看出，信号强度相对于表3显著增强。ADA浓度（10000ng/mL）时的信号强度高于实施例3的ADA浓度（50000ng/mL）时的信号强度。ADA浓度（500ng/mL）时能显著耐受100μg/mL的药物。而且，信噪比增大，说明所述免疫原性分析具有更大的优化空间。例如高浓度的ADA对照样品可以尝试更低浓度的情况下考察耐药情况。值得注意的是，实施例4是在中性条件下包被。
实施例5
将抗IgE单抗作为抗原包被于微孔酶标板上形成固相化抗原。对待测样品进行第一酸化处理。将待测样品以40µL/孔加入到96微孔酶标板中，然后加入酸化液，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1h±5min。向包被有固相化抗原的微孔酶标板中加入中和液，然后加入第一酸化处理后的样品，封闭酶标板后置于微孔板板振荡器以500±50转/分钟室温孵育4 h±30 min。中和液和第一酸化处理后的样品的体积比为1：2。中和及亲和捕获结束后，甩掉酶标板中的剩余溶液，用洗涤缓冲液洗板多次去除样品中未结合的游离抗IgE单抗。洗涤后拍干。向微孔酶标板中以100µL/孔加入酸化液，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育20±5min。通过第二酸化处理可以释放酶标板上的IgE单抗药物结合的抗药物抗体（ADA）和IgE。将第二酸化处理后的样品液不中和直接以90 µL/孔加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于2-8℃过夜孵育至少15h。对电化学发光免疫分析微孔板进行第一次常规封闭处理，转板包被结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板多次。洗涤后拍干。然后以200µL/孔加入第一封闭液来防止非特异性结合，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育2 h±15 min。第一封闭结束后，甩掉电化学发光免疫分析微孔板中的剩余封闭液，用洗涤缓冲液洗板多次。对第一封闭处理后的电化学发光免疫分析微孔板进行第二封闭处理以完成靶点阻断封闭。将IgE的受体用稀释液稀释至10±0.5 µg/mL，然后以100 µL/孔加入到电化学发光免疫分析微孔板中，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1 h±5 min。以100 µL/孔加入钌标记抗原，封闭酶标板，置于微孔板振荡器以500±50转/分钟室温振荡孵育1 h ± 5 min。孵育反应结束后，加入电化学发光底物，信号采集读板。
表5实施例5的检测分析结果
从表5可以看出，当混合猴血清中同时存在500ng/mL的ADA和1000μg/mL的抗IgE单抗药物时，仍然能够检测到其信号强度（93.5）高于阴性对照NQC的信号强度（75），即此时呈阳性结果。另外，在含500ng/mL这一临界浓度水平的ADA时，血清样品可以显著耐受200μg/mL、400μg/mL、甚至1000μg/mL的药物浓度水平。如前所述，实施例4采用二次酸化中和后的中性包被的手段，常规的免疫分析方法也多采用中性或偏碱性条件下包被，即一般用PBS（pH7.4）和CBS（碳酸盐缓冲液，PH9.6）进行包被。但是实施例5的技术方案突破传统的中性包被特别是碱性包被，而是采用酸性包被的方式，检测结果相较于比实施例4有显著进步。
实施例6
在食蟹猴混合血清中分别添加2000ng/mL、500ng/mL和30ng/mL的ADA阳性抗药物抗体，同时在上述含有不同浓度阳性抗药物抗体的血清中分别再添加1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL和25μg/mL的IgE，基于实施例5所述的技术方案进行检测分析。
表6实施例6的检测分析结果
从表6可知，所有不同浓度的ADA阳性对照样品均能够在不同浓度的IgE存在下被正常检测出阳性的信号水平。由于食蟹猴血清中还存在高浓度的IgE的干扰，这就表明本发明的检测体系能显著耐受住超过1mg/mL的IgE的干扰。
实施例7
对本发明所述试剂盒的精密度进行验证。在混合食蟹猴血清中添加不同浓度的ADA阳性对照（抗IgE单抗的阳性多抗）建立HPQC（2000 ng/mL）、MPQC（300 ng/mL）、LPQC (30ng/mL)体系。没有加入ADA阳性对照的作为阴性质控（NQC）。在不同的质控批次进行检测以考察所述试剂盒的批内精密度和批间精密度。
表7 批内精密度和批间精密度检测结果表
表8批内精密度和批间精密度检测结果表
实施例8
随机选取10只单个猴的血清，在每个猴血清中添加30 ng/mL的ADA阳性对照（抗IgE单抗的阳性多抗）至达到LPQC的浓度水平。未添加ADA阳性对照的作为NQC。使用用混合血清并添加30 ng/mL的ADA阳性对照以制备 LPQC板，使用未添加ADA阳性对照以制备NQC板。
表9实施例8的检测分析结果
LPQC板指的是低浓度阳性质控样品。LPQC板平均值指的是指单块分析板上的用于随行质控的LPQC的平均值。NQC板同LPQC板。从表9可知，单个基质配制的LPQC与混合基质配制的LPQC板平均信号值差异不超过±25%；单个基质配制的NQC与混合基质配制的 NQC板平均信号值差异不超过±25%。这意味着该发明建立的方法能够克服基质效应，不存在基质效应影响。
最后说明的是，虽然具体实施方式面向奥玛珠单抗，但是应理解，与奥玛珠单抗具有相同靶点和相同作用机制的其它抗IgE单抗药物的ADA的检测也可以使用本发明的试剂盒。
Claims (13)
1.双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
组分A：包被作为抗原的抗IgE单抗药物形成固相化抗原的微孔酶标板；
组分B：第一酸化液，使待测样品中的抗IgE单抗药物-抗药物抗体复合物及抗IgE单抗药物-IgE复合物酸化解离；
组分C：中和液，使微孔酶标板上的固相化抗原亲和捕获酸化解离的抗药物抗体和IgE靶点，与抗IgE单抗药物形成“抗IgE单抗药物-抗药物抗体”以及“抗IgE单抗药物-IgE”形式的复合物；
组分D：第二酸化液，将微孔酶标板上抗原亲和捕获的抗药物抗体和IgE靶点酸化解离释放；
组分E：反向包被IgE的电化学发光免疫分析微孔板，具体是将第二次酸化解离释放的抗药物抗体和IgE转移到电化学发光免疫分析微孔板中进行包被，形成固相化抗药物抗体和固相化的IgE；
组分F：对反向包被后的电化学发光免疫分析微孔板进行免疫分析封闭的第一封闭液；
组分G：对免疫分析封闭后的电化学发光免疫分析微孔板进行特异性的靶点阻断封闭的第二封闭液；
组分H：钌标记的抗IgE单抗药物；
组分I：作为阳性对照的抗IgE单抗药物的阳性多抗；
组分J：电化学发光底物。
2.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述双耐受型包括耐受游离抗IgE单抗药物的干扰和耐受待测样品中IgE靶点的干扰。
3.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在酸化免中和的酸性条件下将第二酸化处理后的样品反向包被至电化学发光免疫分析微孔板形成固相化的抗药物抗体和固相化的IgE。
4.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述第二封闭液包含IgE受体。
5.根据权利要求4所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，IgE受体与IgE结合阻断并封闭样品中游离IgE对分析结果的影响。
6.根据权利要求4所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述IgE受体是人 Fcepsilon RI α 蛋白。
7.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述抗IgE单抗药物包括利格利珠单抗、奥马珠单抗、或者与利格利珠单抗和奥马珠单抗具有相同作用机制的单抗药物。
8.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述酸化液是pH 3.0 ±0.2的醋酸溶液。
9.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述免疫原性分析试剂盒还包括稀释液。
10.根据权利要求1所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述待测样品是免疫原性检测会遇到既要耐受IgE又要耐受高浓度抗IgE单抗药物的人或动物血清样本。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的双耐受型抗IgE单抗药物的免疫原性分析试剂盒的使用方法，其特征在于，所述免疫原性分析试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤S1. 将抗IgE单抗药物作为抗原包被于微孔酶标板上形成固相化抗原；
步骤S2. 对待测样品进行第一酸化处理，使待测样品中的抗IgE单抗药物-抗药物抗体复合物及抗IgE单抗药物-IgE复合物解离；
步骤S3. 向包被有固相化抗原的微孔酶标板中加入第一酸化处理后的样品并进行中和反应形成免疫复合物；
步骤S4. 对形成所述免疫复合物的固相化载体进行第二酸化处理，以酸化解离释放酶标板上抗原亲和捕获的抗体和靶点，形成游离的抗药物抗体和游离的IgE；
步骤S5. 将第二酸化处理后的样品液在酸性条件下反向包被于结合力强于微孔酶标板的电化学发光免疫分析微孔板中，形成固相化的抗药物抗体和固相化的IgE；
步骤S6. 对反向包被后的电化学发光免疫分析微孔进行第一常规封闭处理以防止非特异性吸附；
步骤S7. 对第一常规封闭处理后的电化学发光免疫分析微孔板进行第二封闭处理以完成靶点阻断的特异性封闭；
步骤S8. 向第二封闭结束后的电化学发光免疫分析微孔板中加入钌标记的抗IgE单抗药物进行孵育反应；
步骤S9. 孵育反应结束后，加入电化学发光底物，信号采集读板。
12.根据权利要求11所述的免疫原性分析试剂盒的使用方法，其特征在于，电化学发光免疫分析微孔板上检测到的电化学发光信号值与样品中抗药物抗体的含量呈正相关性。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫原性分析试剂盒在抗药物抗体的检测中的应用，药物是抗具有游离蛋白分子靶点的单抗药物。
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