DE102009034714A1 - Immunoassay zur Bestimmung des freien Targets (Antigen) in Proben, gegen das ein therapeutischer Antikörper gerichtet ist (Free Target Immunoassay) - Google Patents

Immunoassay zur Bestimmung des freien Targets (Antigen) in Proben, gegen das ein therapeutischer Antikörper gerichtet ist (Free Target Immunoassay) Download PDF

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Abstract

Die Erfindung hat das Ziel, das Monitoring von therapeutischen Antikörpern bei der Behandlung schwerer Erkrankungen (Asthma, Rheuma, Tumore) zu verbessern. Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, unabhängig vom Recovery-Immuno-Assay eine Bestimmungsmethode zu finden, mit der man das Freie Target (Antigen) eines therapeutischen Antikörpers bestimmen kann. Es wird ein Sandwich-Immunassay aufgebaut, mit dem man nur das freie Targetprotein bestimmt, das vom therapeutischen Antikörper, der gegen dieses Target gerichtet ist, nicht gebunden wurde (Free Target Immunoassay). Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur Bestimmung des freien Targets (Antigen) in Proben, gegen das ein therapeutischer Antikörper gerichtet ist (Free Target Immunoassay) als Monitoring bei der Anwendung des therapeutischen Antikörpers als Arzneimittel. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.
  • Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:
  • A) Zum Immunoassay
  • Der Immunoassay ist eine sehr verbreitete Technik zur Bestimmung unbekannter Konzentrationen analytisch oder diagnostisch relevanter Stoffe (Analyt) in Probenmaterial wie Serum, Plasma, Gewebsproben, Rückstandspräparationen, Überstände von Zellkulturen und ähnlichem.
  • Die Immunoassays (Radioimmunoassays (RIA), Enzymimmunoassays (EIA), Lumineszenzimmunoassays (LIA) und damit verwandte Assayvarianten) basieren darauf, dass eine Analytkonzentration als Standard vorgeben wird und für diese nach Reaktion mit einem Antikörper unter Einbeziehung einer markierten Verbindung (eines markierten Antigens oder Antikörpers) die Response des gebundenen markierten Antigens oder Antikörpers (Impulsrate, Extinktion, Relative Light Units) bestimmt wird. Der Zusammenhang zwischen Response und Analytkonzentration des Standards wird in Form einer Standardkurve mittels mathematischer Eichfunktion oder graphisch beschrieben.
  • Die Analytkonzentration unbekannter Proben wird unter Verwendung der nach der Analytkonzentration umgeformten Eichfunktion aus der Response der unbekannten Probe errechnet oder wird an der graphisch erstellten Standardkurve abgelesen. Bei der Eichung mit Hilfe einer Standardkurve werden gewöhnlich zur Vermeidung der Beeinflussung der Messung durch Fremdstoffe besondere Vorbehandlungen der Proben (z. B. Extraktionen, Zugabe von Zusatzstoffen) oder der Assaykomponenten (Einbringung der Standards in 0-Seren, Proteinzusätze u. a. m.) vorgenommen. Mit Wiederfindeexperimenten wird die Richtigkeit der Bestimmungen an den so modifizierten Assaykomponenten oder Proben geprüft. Softwarepakete an den Messgeräten (Gamma-Counter, Extinktions-Reader, Lumineszenz-Messgeräte), die die Immunoassay-Auswertung übernehmen, sind Standardausstattung von Immunoassay-Forschungs- und Routinelabors geworden. Darüber hinaus sind Immunoassay-Laborautomaten verschiedenster Hersteller auf dem Markt, die sowohl die Abarbeitung eines Immunoassays als auch seine Messung und Auswertung in einem Automaten vereinen. Allen diesen Auswerte-Software-Paketen und Labor-Automaten liegt o. g. Eichverfahren zugrunde, wenn auch heute, auf Grund der besseren Beherrschung der Assaytechnik, gespeicherte Eichfunktionen für mehrere Assayläufe oder auf zwei Standardkonzentrationen reduzierte Eichgeraden üblich geworden sind (1, 2).
  • B) Therapieantikörper
  • Es sind in den letzten Jahren eine Reihe von Therapieantikörpern entwickelt worden bzw. befinden sich noch in der Entwicklung. Sie sind vorwiegend auf die Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs ausgerichtet. Viele dieser Therapieantikörper sind zwar ursprünglich als monoklonale Antikörper erzeugt, die meisten von ihnen sind jedoch zur Vermeidung der Immunabwehr des Patienten gegen den Therapieantikörper gentechnisch in humane Antikörper umgewandelt worden. Einige von ihnen sind Chimeren von humanen und monoklonalen Antikörpern oder sogar nur monoklonale Antikörper.
  • Tabelle 1 zeigt eine Auswahl von Therapieantikörpern, die bereits als Arzneimittel zugelassen sind. Diese Therapieantikörper sind gegen krankheitsspezifische humane Proteine gerichtet.
  • C) Recovery-Immunoassay
  • Um die Wirkungsweise dieser Therapieantikörper zu überprüfen, wurde das Konzept des Recovery-Immunoassay entwickelt. Der Recovery-Immunoassay geht von einem gewöhnlichen Sandwich-Immunoassay aus. In einem richtig bestimmenden Sandwich-Immunoassay, bei dem der Therapieantikörper in markierter Form als Nachweisantikörper oder Fängerantikörper verwendet wird, bewirkt die Anwesenheit des Therapieantikörpers in Proben eine systematische Verringerung der Wiederfindung des zu bestimmenden Antigen, die mit der Konzentration des Therapieantikörpers korreliert. Diese Korrelation wird zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des Therapieantikörpers und zur Bestimmung der freien und totalen Antigenkonzentration genutzt. Aus diesem Grund kann dieser Immunoassay auch kurz Wiederfinde-Immunoassay oder Recovery-Immunoassay genannt werden (4).
    Handelsname Generischer Name Typ Antigen Anwendung Zulassungsinhaber Zulassungsjahr
    Avastin Bevacizumab humanisiert VEGF Metastasierende Karzinome Roche Registration Ltd. 2005
    Erbitux Cetuximab chimär EGFR Kolorektales Karzinom Merck 2004
    Herceptin Trastuzumab humanisiert Her2 Metastasierender Brustkrebs Roche Registration Ltd. 2000
    Humira Adalimumab human TNFα Inflammatorische Erkrankungen (Autoimmunerkrankungen) Abbott Laboratories, UK Ltd. 2003
    Lucentis Ranibizumab humanisiert VEGF Altersabhängige Makuladegeneration Novartis Europharm Ltd. 2007
    Mab-Campath Alemtuzumab humanisiert CD52 Chronische lymphozytäre Leukämie (CLL) Genzyme Europe BV 2001
    Millenium & ILEX UK Ltd. 2004
    Mabthera Rituximab chimär CD20 Non-Hodgkin Lymphom; Rheumatoide Arthritis Roche Registration Ltd. 1998
    Orthoclone OKT3 Muromonab murin CD3 Gegen Transplantatabstoßung JanssenCilag GmbH 1988
    Raptiva Efalizumab humanisiert CD11a Psoriasis Serono 2004
    Remicade Infliximab chimär TNFα Inflammatorische Erkrankungen (Autoimmunerkrankungen) Centocor B. V., NL 1999
    ReoPro Abciximab chimär Glykoprot ein IIb/IIIa Kardiovaskuläre Erkrankungen Centocor B. V., NL 1995
    MPA Pharma GmbH 2005
    Simulect Basiliximab chimär CD25 Gegen Transplantatabstoßung Novartis 1998
    Soliris Eculizumab humanisiert Komplement C5 PNH Alexion Eurpoe SAS 2007
    Synagis Palivizumab humanisiert F Protein des RS Virus Schwere Atemwegserkrankungen durch RS Virus Abbott Laboratories, UK Ltd. 1999
    Tysabri Natalizumab humanisiert alpha4 – Integrin Multiple Sklerose Elan Pharma International Ltd. 2006
    Vectibix Panitumumab human EGFR Kolorektales Karzinom Amgen Europa B. V. 2007
    Xolair Omalizumab humanisiert IgE Allergie bedingtes Asthma Novartis Europharm Ltd. 2005
    Zenapax Daclizumab humanisiert CD25 Gegen Transplantatabstoßung Roche Registration Ltd. 1999
    Zevalin Ibritumobab Tiuxetan murin CD20 Non-Hodgkin Lymphom Schering AG 2004
    Tabelle 1: Zugelassene therapeutische Antikörper als Arzneimittel in Deutschland [5]
  • Grundprinzip der Erfindung
  • Die Erfindung hat das Ziel, das Monitoring von therapeutischen Antikörpern bei der Behandlung schwerer Erkrankungen (Asthma, Rheuma, Krebs) zu verbessern. Die Erfindung bestand darin, unabhängig vom Recovery-Immuno-Assay eine Bestimmungsmethode zu finden, mit der man das Freie Target (Antigen) eines therapeutischen Antikörpers bestimmen kann.
  • Es wird ein Sandwich-Immunassay aufgebaut, mit dem man nur das freie Targetprotein bestimmt, das vom therapeutischen Antikörper, der gegen dieses Target gerichtet ist, nicht gebunden wurde (Free Target Immunoassay). Da das Ziel der Therapie die Eliminierung des krankheitsverursachenden Targetproteins durch Bindung an den therapeutischen Antikörper ist, resultiert daraus, dass man die Konzentration des ungebunden (freien) Targetproteins im Blut bis zu einem therapeutisch sinnvollem Limit durch Antikörpergabe minimieren möchte. Dieser ungebundene (freie) Rest des Targetproteins wird durch den Free Target Immunoassay bestimmt. Auf diese Weise kann die Wirkung des therapeutischen Antikörpers indirekt kontrolliert werden.
  • Um das zu erreichen, wird erfindungsgemäß für das nachzuweisende Antigen ein Sandwichimmunoassay wie folgt aufgebaut:
    • a) Fängerantikörper ist der therapeutische Antikörper, der an der Mikrotiterplatte oder Biochipoberfläche immobilisiert wird.
    • b) Der Analyt ist das Target (Protein), das als Standard oder Patientenprobe im Immunoassay gemessen wird und gegen das der therapeutische Antikörper gerichtet ist und das mit einem Bindungsepitop am Fängerantikörper (immobilisierter therapeutischer Antikörper) bzw. in der Serumprobe befindlichen therapeutischen Antikörper bindet.
    • c) Der Nachweisantikörper ist ein zweiter Antikörper, der radioaktiv oder nichtradioaktiv markiert ist und den Analyten an einem anderen Bindungsepitop als der therapeutische Antikörper bindet (Signalantikörper). Als nichtradioaktive Markierungen können alle im Immunoassay üblichen Verfahren (mit Peroxydase, mit alkalischer Phosphatase, mit Luminiszenz- oder Fluoreszenzlabeln) benutzt werden.
  • Bezüglich der Standards arbeitet der erfindungsgemäße Assay wie andere gewöhnliche Sandwichassays. Die Besonderheit liegt in der Messung der Proben (Patientenseren). Falls ein Patient im Rahmen einer Behandlung Therapieantikörper erhalten hat, konkurriert im Assay der Therapieantikörper in der Probe (z. B. im Serum) mit dem immobilisierten Therapieantikörper um die Bindung an das Targetprotein. Es ist wesentlich, dass die Inkubationszeit von Probe und Standard möglichst kurz gehalten wird, vorzugsweise 15–30 Minuten. Ferner muss vor der Zugabe des Signalantikörpers aller nicht am Fängerantikörper gebundene Überschuss entfernt werden, vorzugsweise durch waschen. Danach kann das noch verbleibende, zu messende Antigen nur das freie Antigen sein, dass vom Therapieantikörper in der Probe nicht gebunden wurde. Nach Bestimmung dieses Werts kann entschieden werden, ob eine höhere Gabe des Therapieantikörpers an den Patienten zur Bindung des Targetproteins notwendig ist.
  • Hamilton R. G. et al. (3) haben ein alternatives Verfahren zur Bestimmung des freien IgE als Target für den Therapieantikörper Omalizumab beschrieben. Dieser Ansatz ist jedoch auf IgE beschränkt, während der beschriebene erfindungsgemäße Free Target Immunoassay für alle Targetproteine von Therapieantikörpern gilt, die im Patientenserum vorkommen.
  • Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Therapiekontrolle bei allen im Blut vorkommenden Targets beispielsweise bei dem Einsatz von Omalizumab bei allergischem Asthma oder Adalimumab bei Rheuma und anderen Autoimmunerkrankungen sehr einfach durchzuführen.
  • Nachfolgende 2 Beispiele sollen das Verfahren näher erläutern:
  • Beispiel 1:
  • Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten zur Bestimmung des freien IgE in Patientenseren bei Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper Omalizumab
  • Material:
    • 1. Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Standard-Biotin-Bindungskapazität (SC-Beschichtung)
    • 2. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten: biotinylierter humanisierter monoklonaler Therapieantikörper Omalizumab (Xolair) (Lot: B188)
    • 3. IgE-Standard: IgE von OEM (abgeglichen mit WHO-Standard) in 25% FKS (Fötales Kälberserum)
    • 4. Nachweiskonjugat: anti-hIgE-POD (Clone E-411 Lot: PD06)
    • 5. Assaypuffer: 0.05 M PBS, pH = 7.2 + 0.1% RSA + 0.02% Merthiolat
    • 6. Waschlösung: 0.01 M PBS, pH = 7.2/0.1% RSA + 0.1% Tween 20
    • 7. Enzymsubstrat: Tetramethylbenzidin (TMB, Fa. DRG, Lot: HS119)
    • 8. Stopplösung: 5 M Schwefelsäure
  • In Tabelle 2 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte dargestellt und in Tabelle 3 das Ergebnis des Versuchs.
  • Versuchsablauf:
    • 1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Kavitäten der Mikrotiterplatte. Zugabe von 100 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml). Inkubation über Nacht, 4°C
    • 2. Am nächsten Tag 2 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 3. IgE-Standardreihe 0/15,6/31,3/62,5/125/250/500/1000 IU/ml (20 μl Standard + 80 μl 25% FKS in Assaypuffer. Zugabe entsprechend Tabelle 2 (Spalten 1–2 (Duplikat) und Reihen A–H)
    • 4. Patientenproben (20 μl Serum + 80 μl Assaypuffer). Zugabe entsprechend Tabelle 2 (Spalten 3–4 (Duplikat) und Reihen A–H)
    • 5. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
    • 6. 2 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 7. Zugabe des Nachweiskonjugats (PD06, 500 ng/ml, 100 μl) in alle Kavitäten.
    • 8. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur
    • 9. 3 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 10. Enzymnachweis durch Zugabe von 100 μl Tetramethylbenzidin und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 25 μl Stopplösung
    • 11. Messung der Extinktion im Mikrotiterplattenreader
  • Standard IgE [IU/ml] Proben
    1 2 3 4
    A 0 Serum ”K”
    B 15,6 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE
    C 31,3 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:2 verdünnt
    D 62,5 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:4 verdünnt
    E 125 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:5 verdünnt
    F 250 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:10 verdünnt
    G 500 Probe 022
    H 1000 Probe 034
    Tabelle 2: IgE-ELISA: Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte
    Standard Proben
    x = IgE [IU/ml] Y = MW-NSB Bezeichnung Y = MW-NSB
    0 0,000 Serum ”K” 0,022
    15,6 0,091 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE 2,037
    31,3 0,186 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:2 verdünnt 1,350
    62,5 0,310 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:4 verdünnt 0,724
    125 0,620 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:5 verdünnt 0,634
    250 1,109 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:10 verdünnt 0,343
    500 1,890 Probe 022 0,224
    1000 2,868 Probe 034 0,606
    Tabelle 3: IgE-ELISA, Ergebnis des Versuchs
    • MW-NSB: Mittelwerte der Doppelbestimmungen der Extinktionen abzüglich der unspezifischen Bindung (NSB)
  • Die Standardkurve wird mittels nichtlinearer Regression und der Funktion y = ax/(b + x) angepasst, wobei y = Extinktion-NSB und x = IgE-Konzentration in IU/ml,
    a, b: Regressionsparameter Ergebnis: y = 6,014x/(1096,484 + x) (Formel 1) mit einem Bestimmtheitsmaß von 99,999%.
  • Mit der Umkehrfunktion von Formel 1. x = 1096,484y/(6,014 – y) (Formel 2) werden nun die Standards rekalkuliert (aus y berechnet) und die unbekannten Proben aus y bestimmt. Das Auswerteergebnis ist in Tabelle 4 dargestellt.
    Standard Proben
    IgE [IU/ml] Y = MW-NSB IgE, rekalkuliert [IU/ml] Bezeichnung Y = MW-NSB X = IgE [IU/ml]
    0 0,000 0,0 Serum ”K” 0,022 4,0
    15,6 0,091 16,8 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE 2,037 561,6
    31,3 0,186 34,9 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:2 verdünnt 1,350 317,4
    62,5 0,310 59,6 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:4 verdünnt 0,724 149,9
    125 0,620 126,0 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:5 verdünnt 0,634 129,2
    250 1,109 247,8 Serum ”K” + 500 IU/ml IgE, 1:10 verdünnt 0,343 66,3
    500 1,890 502,3 Probe 022 0,224 42,4
    1000 2,868 999,3 Probe 034 0,606 122,8
    Tabelle 4: IgE-ELISA: Auswerteergebnis des Versuchs
  • Erläuterungen:
  • Es wurde das Blutspenderserum „K” getestet, dem außerdem 500 IU IgE/ml zugesetzt wurde, und das unverdünnt und in Verdünnungen von 1:2, 1:4, 1:5 und 1:10 im Assay eingesetzt worden ist. Es enthielt kein Omalizumab. Die Seren 022 und 034 waren von Patienten unter Omalizmab-Therapie.
  • Die Verdünnungsstufen des Serums „K”, aufgestockt mit 500 IU IgE/ml, wurden linear im Assay wiedergefunden.
  • Die Serumproben 022 und 034 unter Omalizumab-Therapie zeigten noch signifikante Reste von freiem IgE (42 und 123 IU IgE/ml).
  • Beispiel 2:
  • Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten zur Bestimmung des freien TNF-α in Patientenseren bei Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper Adalimumab
  • Material:
    • 1. Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Standard-Biotin-Bindungskapazität (SC-Beschichtung)
    • 2. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten: biotinylierter humanisierter monoklonaler Therapieantikörper Adalimumab (Humira) (Lot: B381)
    • 3. TNF-α-Standard: TNF-α von RCMDT Moskau (abgeglichen mit WHO-Standard) in 25% FKS (Fötales Kälberserum)
    • 4. Nachweiskonjugat: anti-TNF-POD (Clone A – 11, Lot: P228)
    • 5. Assaypuffer: 0.05 M PBS, pH = 7.2 + 0.01% Casein + 0.02% Merthiolat
    • 6. Waschlösung: 0.01 M PBS-Puffer, pH = 7.2/0.1% RSA + 0.1% Tween 20
    • 7. Enzymsubstrat: Tetramethylbenzidin (TMB, Fa. DRG, Lot: HS119)
    • 8. Stopplösung: 5 M Schwefelsäure
  • In Tabelle 5 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte dargestellt und in Tabelle 6 das Ergebnis des Versuchs.
  • Versuchsablauf:
    • 1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Kavitäten der Mikrotiterplatte. Zugabe vom 100 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml). Inkubation über Nacht, 4°C
    • 2. Am nächsten Tag 2 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 3. TNFa-Standardreihe 0/7,8/15,6/31,3/62,5/125/250/500 ng/ml (20 μl Standard + 80 μl 25% FKS in Assaypuffer). Zugabe entsprechend Tabelle 5 (Spalten 1–2 (Duplikat) und Reihen A–H)
    • 4. Patientenproben (20 μl Serum + 80 μl Assaypuffer). Zugabe entsprechend Tabelle 5 (Spalten 3–4 (Duplikat) und Reihen A–H)
    • 5. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
    • 6. 2 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 7. Zugabe des Nachweiskonjugat (P228, 25 ng/ml, 100 μl) in alle wells.
    • 8. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
    • 9. 3 × Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
    • 10. Enzymnachweis durch Zugabe von 100 μl Tetramethylbenzidin und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 25 μl Stopplösung
    • 11. Messung der Extinktion im Mikrotiterplattenreader
    • 12.
  • Standard TNF-α [ng/ml] Proben
    1 2 3 4
    A 0 C-1434
    B 7,8 C-1442
    C 15,6 C-1464
    D 31,3 C-1468
    E 62,5 C-1413
    F 125 C-1345
    G 250 C-1421
    H 500 C-1359
    Tabelle 5: TNFα-ELISA, Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte
    Standard Proben
    X = TNF-α [ng/ml] Y = MW Bezeichnung Y = MW
    0 0,028 C-1434 0,380
    7,8 0,190 C-1442 0,413
    15,6 0,367 C-1464 0,171
    31,3 0,663 C-1468 0,132
    62,5 1,056 C-1413 0,388
    125 1,418 C-1345 0,166
    250 1,925 C-1421 0,286
    500 2,375 C-1359 0,189
    Tabelle 6: TNFα-ELISA, Ergebnis des Versuchs
    • MW = Mittelwerte der Doppelbestimmungen der Extinktionen.
  • Die Standardkurve wird mittels nichtlinearer Regression und der Funktion y = ax/(b + x) angepasst, wobei y = Extinktion und x = TNF-α-Konzentration in ng/ml,
    a, b: Regressionsparameter Ergebnis: y = 2,855x/(113,6 + x) (Formel 3) mit einem Bestimmtheitsmaß von 99,7%.
  • Mit der Umkehrfunktion von Formel 3. x = 113,6y/(2,855 – y) (Formel 4) werden nun die unbekannten Proben aus y bestimmt. Das Auswerteergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.
    Standard Proben
    [TNF-α] [ng/ml] Y = MW Bezeichnung Y = MW X = TNF-α [ng/ml]
    0 0,028 C-1434 0,380 17,5
    7,8 0,190 C-1442 0,413 19,2
    15,6 0,367 C-1464 0,171 7,2
    31,3 0,663 C-1468 0,132 5,5
    62,5 1,056 C-1413 0,388 17,9
    125 1,418 C-1345 0,166 7,0
    250 1,925 C-1421 0,286 12,6
    500 2,375 C-1359 0,189 8,1
    Tabelle 7: TNFα-ELISA, Auswerteergebnis des Versuchs
  • Erläuterungen:
  • Die Patienten standen unter Adalimumab-Therapie. Ausnahme sind die Proben C-1464 und C-1468 (Keine Adalimumab-Therapie).
  • In den Seren C-1345 und C-1359 waren die Spiegel an freiem TNF-α deutlich abgesenkt (nahe der Nachweisgrenze). In den Seren C-1434, C-1442, C-1413 und C-1421 wurden noch signifikant leicht erhöhte Spiegel an freiem TNF-α gemessen.
  • Beispiel 3
  • Die Serumprobe eines Patienten mit allergischem Asthma, der mit dem therapeutischen Antikörper Omalizumab behandelt wurde, wird mit dem Assay gemäß Beispiel 1 untersucht. Es ergibt sich ein Wert von 123 IU/ml für das freie IgE.
  • Angestrebt wird ein Wert unter 21 IU/ml. Daraus ist abzuleiten, dass die Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper fortgesetzt werden muss, bis ein Wert unter 21 IU/ml erreicht ist.
  • Literatur
    • (1) Rodbard D., Ratford P. L., Cooper J. and Ross G. T. (1968). Statistical quality control of radioimmunoassays. J. Clin. Endocrinol. Metab. 29, 352.
    • (2) Goldberg M. E. and Djavadi-Ohaniance L. (1993). Methods for measurement of antibody/antigen affinity based an ELISA and RIA. Current Opinion in Immunology 5, 278.
    • (3) Hamilton R. G., Marcotte G. V., Saini S. S.: Immunological methods for quantifying free and total serum Ige levels in allergy patients receiving omalizumab (Xolair) therapy. J. Immunol. Methods. 2005, 303 (1–2): 81–91
    • (4) Strohner, Pavel: Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben (Recovery Immunoassay), WO 2007/06628
    • (5) Paul-Ehrlich-Institut, www.pei.de
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Hamilton R. G. et al. [0013]

Claims (8)

  1. Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung des freien Antigens (Target) im Zusammenhang mit der Anwendung von therapeutischen Antikörpern, bei dem a) als Fängerantikörper der therapeutische Antikörper verwendet wird, immobilisiert an einer Mikrotiterplatte oder Biochipoberfläche, b) der Analyt das Target (Protein) ist, das als Standard oder Probe im Immunoassay gemessen wird und gegen das der therapeutische Antikörper gerichtet ist und das mit einem Bindungsepitop am Fängerantikörper (immobilisierter therapeutischer Antikörper) bzw. in der Serumprobe befindlichen therapeutischen Antikörper bindet, c) der Nachweisantikörper ein zweiter Antikörper ist, der radioaktiv oder nichtradioaktiv markiert ist und an einem anderen Bindungsepitop als der therapeutische Antikörper den Analyten bindet (Signalantikörper).
  2. Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, in dem die nichtradioaktive Markierung mit Peroxydase, mit alkalischer Phosphatase, mit Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabeln erfolgt.
  3. Verfahren zur Verwendung des Sandwich-Immunoassays gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszeit von Probe und Standard kurz gehalten wird, vorzugsweise 15–30 Minuten.
  4. Verfahren zur Verwendung des Sandwich-Immunoassays gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Zugabe des Signalantikörpers der gesamte nicht am Fängerantikörper gebundene Überschuss entfernt wird, vorzugsweise durch Waschen.
  5. Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 1 für therapeutische Antikörper, deren Target im Blut vorkommt und eliminiert werden soll.
  6. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Asthma.
  7. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Rheuma.
  8. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Tumore.
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