CN109425736B - 一种检测pd-1抗体血药浓度的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测PD‑1抗体血药浓度的方法及试剂盒。所述方法包括通过采用生物素标记的PD‑1中和性抗体和待测样品中的PD‑1抗体竞争，采用竞争ELISA方法检测PD‑1抗体浓度。其中生物素标记的PD‑1中和性抗体与血清中的PD‑1抗体竞争结合酶标板固定的抗原，使用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素作为检测抗体，检测生物素标记的PD‑1中和性抗体，从而对血清中的PD‑1抗体进行定量。本发明的方法具有良好的灵敏度、精密度、反复冻融稳定性、室温保存稳定性、特异性等优点，有益于形成商品化的试剂盒。该试剂盒具有低背景，良好的精密度、批间一致性、稳定性等优点。

Description

一种检测PD-1抗体血药浓度的方法及试剂盒

技术领域

本发明是关于一种检测PD-1抗体血药浓度的方法及试剂盒，具体地说，是关于一种测定血清中PD-1抗体浓度的酶联免疫吸附测定法(ELISA)以及所用的试剂盒。

背景技术

近年来，基于免疫检查点蛋白如程序性细胞凋亡蛋白-1(PD-1)及其配体(PD-L1/L2)设计的单抗药物作为抑制肿瘤重要的免疫调控策略被广泛采用。目前FDA批准的针对PD-1靶点的单克隆抗体药物有默沙东Keytruda(pembrolizumab)和百时美施贵宝Opdivo(nivolumab)，但尚未在我国上市。另外，抗PD-1相关单抗药物国内也有多个制药厂在申报，但目前PD-1单抗药物的临床研究由多家申办单位发起，临床资源相对分散，未能形成完善的整合、分享机制；而且PD-1抗体血药浓度检测大多基于科学研究范畴选取一致性病例进行，在实际临床应用时无法对病人的个体化用药予以指导。

其中PD-1抗体序列参考百时美施贵宝Opdivo(nivolumab)相关专利WO2013173223A1和默沙东Keytruda(pembrolizumab)相关专利US2012135408A1。

单抗药物在相关动物中进行的药代动力学试验(吸收、蓄积、分布和消除)能为预测安全范围提供重要信息。靶向性分布是单抗药代动力学研究的关键，以靶组织浓度高于非靶组织浓度表示靶向性。另外，血液和靶点浓度的持续时间，血中抗体浓度与药物作用关系，血中抗体有效浓度、抗抗体的产生与毒性的关系，药物间相互作用等，也是临床前动物药代动力学研究的重点(苗玉发,李波等。单克隆抗体药物临床前安全性评价中的几个问题。《中国药事》，2008；22(6)：454-457)。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法是目前临床上生物标志物(Biomarker)筛选和鉴定的主要方法(Jeffrey R.Whiteaker.Antibody-based enrichment of peptides onmagnetic beads for mass spectrometry-based quantification of serumbiomarkers.Anal Biochem.2007；362(1):44–54)。国内外关于抗PD-1抗体药物代谢动力学(PK)试验大都采用ELISA方法检测(Robert C,Thomas L,Bondarenko I et al.Ipilimumabplus dacarbazine for previouslyuntreated metastatic melanoma.N Engl J Med2011；364:2517–2526；Topalian SL,Hodi FS,Brahmer JR et al.Safety,activity,andimmune correlates ofanti-PD-1antibody in cancer.N Engl J Med 2012；366:2443–2454；Brahmer JR,Tykodi SS,Chow LQ et al.Safety and activity of anti-PD-L1antibodyin patients with advanced cancer.N Engl J Med 2012；366:2455–2465；Brahmer JR,Drake CG,Wollner I et al.Phase I study of single-agentantiprogrammed death-1(MDX-1106)in refractory solid tumors:safety,clinicalactivity,pharmacodynamics,and immunologic correlates.J Clin Oncol 2010；28:3167–3175)，少数采用电化学发光(ECL)方法(Hamid O,Robert C,Daud Aet al.Safetyand tumor responses with lambrolizumab(anti-PD-1)in melanoma.N Engl JMed2013；369:134–144)。

传统的酶联免疫法检测PD-1抗体，临床前及临床的药代动力学研究多数为间接法，众所周知间接法具有一定的弊端，那就是检测背景高，需要将血清500-1000倍的稀释方能解决这一难题。本发明采用生物素标记的抗体与血清中的抗体竞争酶标板中的抗原PD-1，可规避这一弊端。而且该方法是通用型的检测方法，在检测实际病人血药浓度时具有与传统方法等效的检测结果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测PD-1抗体血药浓度的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种检测PD-1抗体血药浓度的ELISA试剂盒。

本发明提供了一种检测PD-1抗体血药浓度的方法，该方法使用竞争ELISA法测定血液例如血清中PD-1抗体浓度，其中生物素(Biotin)标记的中和性抗体与血清中的PD-1抗体竞争，采用辣根过氧化物酶标记的streptavidin检测抗体。本发明的方法具有良好的灵敏度、精密度、反复冻融稳定性、室温保存稳定性、特异性等优点。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，用经过生物素标记的PD-1中和性抗体和待测样品中的PD-1抗体竞争，采用ELISA法检测PD-1抗体浓度。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法还包括：以辣根过氧化酶标记的链酶亲和素用来检测抗体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述ELISA法为竞争ELISA法，例如间接竞争ELISA法。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述待测样品为血清；优选地，所述的血清包括人血清。

本发明的测定法为定量测定法。血药浓度检测范围为5-0.0625μg/ml。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述中和抗体的生物素标记采用化学标记。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述中和抗体的生物素标记方法包括：配制含有中和抗体和生物素的混合溶液，且加入EDC、NHS，经反应得到生物素标记的中和抗体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的生物素标记的PD-1中和抗体，其是按照以下方法制备得到的：

将抗体浓度控制到0.5-1mg/ml之间，分别按照以下比例将下列标记试剂混合，抗体：生物素：EDC:NHS＝1:10～20:100～150:200～300(摩尔比)；25～30℃，反应12～18小时，得到生物素标记的中和抗体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的生物素标记的PD-1中和抗体在制备时，根据需要，加入Tris至终浓度100mM终止反应。

根据本发明的具体实施方案，本发明的生物素标记的PD-1中和抗体在制备时，终止反应后用G-25脱盐柱进行脱盐。

根据本发明的具体实施方案，本发明的生物素标记的PD-1中和抗体在制备时，脱盐后加入0.03％TWEEN 20、Triton X-100或PF-68，最后进行无菌过滤。

根据本发明的具体实施方案，本发明的生物素标记的PD-1中和抗体在制备时，更具体的方法可包括如下步骤：将抗体浓度控制到0.5-1mg/ml之间，分别按照以下比例将下列标记试剂混合，抗体：生物素：EDC:NHS＝1:10～20:100～150:200～300(摩尔比)；25～30℃，反应12～18小时，最终加入Tris至终浓度100mM，中止反应；然后用G-25脱盐柱进行脱盐，进行无菌过滤，得到生物素标记的中和抗体。

另一方面，本发明还提供了一种生物素标记的PD-1中和抗体。在本发明的一些具体实施方式中，生物素标记的PD-1中和抗体中，PD-1中和抗体是经由HEK293细胞表达的抗体。本发明的PD-1中和抗体由ACROBiosystems公司生产，其重链序列如SEQ ID No.2所示，抗体轻链如SEQ ID No.3所示。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述链酶亲和素的标记方法采用化学标记。

本发明还提供了一种检测PD-1抗体血药浓度的ELISA试剂盒。该试剂盒包括标记抗体和/或与待测抗体的竞争结合固相载体。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒中，固相载体包括酶标板和固定在酶标板上的抗体捕捉剂。具体地，所述抗体捕捉剂为PD-1，优选为PD-1蛋白胞外区，经HEK293细胞表达。更具体地，PD-1蛋白胞外区的序列如SEQ ID No.1所示(可参考PD-1蛋白GeneBank编号为NP_005009.2)。该抗体捕捉剂由ACROBiosystems公司生产，货号：PD1-H5221。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒中，所述待测抗体的竞争结合固相载体为经过生物素标记的中和性抗体。抗体有两种：一种是待测抗体，另一种是标记抗体。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒中，所述标记抗体为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

优选地，本发明的试剂盒中各组分为冻干形式。各组分可通过冻干机进行冻干，成品为冻干形式。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒进行了冻干品重构后冻融稳定性试验验证。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒进行了运输稳定性试验验证。

根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒进行了加速稳定性试验验证。

本发明中，采用竞争ELISA法，其中用作筛选的PD-1抗体采取生物素(Biotin)标记，并采用ELISAKit的方法检测血清中抗体含量。本发明中的方法具有良好的灵敏度、精密度、反复冻融稳定性、室温保存稳定性、特异性等优点。

附图说明

图1为本发明的标准品PD-1抗体的标准曲线图。

图2显示不同抗体药使用本发的方法进行血清中药物含量测定结果。

图3显示本发明的方法与传统间接法下产生的背景比较。其中，图片A指间接法不同人不同稀释比例的血清背景，图片B指本发明方法下不同人不同稀释比例的血清背景。

图4显示本发明的方法与传统间接法混合血清的背景比较。

图5显示本发明的方法与间接法进行实际病人血清中抗体检测结果比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例说明本发明技术的实施和应用效果，但这些实施例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1

1.材料

1.1药品与试剂：PD-1，biotinylated anti-PD-1(生物素标记的PD-1抗体)；标准品：PD-1单抗，200mg；包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.5g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6，过滤，分装，4℃保存；PBS：0.2722g KH2PO4，3.58g Na2HPO4.12H2O，8.0063g NaCl，0.2066g KCl，加双蒸水至1L，调pH值至7.4，过滤，分装，4℃保存；洗液(PBST)：PBS中加入0.05％Tween 20。使用前摇匀；封闭液：含2％BSA的PBST溶液；样品稀释液：含0.5％BSA的PBST溶液；抗体稀释液：含0.5％BSA的PBST溶液；抗体：Streptavidin Protein,HRPconjugate(21126)form Thermo，使用比例1:10000；空白血清：购于舜冉(上海)生物科技有限公司。其中，所述biotinylated anti-PD-1采用如下方法制备得到：将抗体浓度控制到0.8mg/ml之间，分别按照以下比例将下列标记试剂混合，抗体：生物素(Sigma)：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,Sigma):NHS(N-羟基丁二酰亚胺,Sigma)＝1:15:12:250(摩尔比)；室温25℃左右，反应16小时，最终加入Tris至终浓度100mM，中止2小时；然后用G-25脱盐柱进行脱盐去除标记试剂，进行无菌过滤，得到生物素标记的中和抗体。-20℃保存备用。经检测，本发明得到的生物素标记的中和抗体中，生物素连接在PD-1抗体的赖氨酸(K)上。

1.2设备与耗材：酶标仪：BMG CLARIOSTAR，S/N:430-0592；恒温培养箱：天津泰斯特/DH4000II，06181；XH-B型旋涡混合器：江苏康健医疗用品有限公司/XH-B型，151207；pH计：赛多利斯PB-10，34691745；冻干机：北京博医康有限公司，Lab-2000c。

1.3标准品及质控样品制备

5×标准品制备

将PD-1单抗用混合血清进行不同浓度的稀释，各浓度为100μg/mL,50μg/mL,25μg/mL,10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL,0.625μg/mL,0.3125μg/mL和0.15625μg/mL，将标准品放于-70℃备用。

5×质控样品的制备

将PD-1单抗用混合血清进行不同浓度的稀释，各浓度为25μg/mL,7.5μg/mL,2.5μg/mL,1μg/mL and 0.3125μg/mL，将质控样品放于-70℃备用。

1.4 ELISA操作步骤：用1μg/ml的抗原PD-1包被酶标板，每孔100μl。4℃放置过夜。封闭后加入标准品、质控样品、待检样品及等体积混匀的biotinylated anti-PD-1(0.002μg/ml，其中血清终浓度为10％，)，孵育1小时后洗板，加入100μlHRP*streptavidin(1:10000)，孵育1小时。显色。用酶标仪测定450nm吸收度。以浓度与对应的百分比建立曲线，采用四参数曲线进行拟合计算。

2.方法学验证

参照FDA及CFDA生物样本检测指导原则，方法学验证包括灵敏度、特异性、标准曲线与线性范围、精密度与准确度、样品稳定性、基质效应等方面。

2.1标准曲线

标准品是采用空白人血清为样品稀释液，将PD-1抗体配制成不同的浓度，通过稀释使标准曲线各浓度的终点分别为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml。其中质控样品的浓度系列分别为5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.0625μg/ml。按照1.4 ELISA操作步骤进行实验，其中，典型的标准曲线图如图1所示。

其中分析方法为四参数拟合方法，其四参数分别为(表1)：

表1分析方法的参数及r²值

分析时间	A	B	C	D	2r
						26/07/17	2.22104	1.6108	0.47102	0.14409	0.99881
01/08/17	2.50561	1.74962	0.76028	0.19767	0.99855
						02/08/17	2.24384	1.58753	0.57407	0.14006	0.99903
04/08/17	1.97996	1.73775	0.43649	0.1218	0.99879
						07/08/17	2.63003	1.66195	0.50744	0.19323	0.99525
11/08/17	2.34886	1.76374	0.56886	0.17182	0.99827

四参数拟合方程:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

*其中包括2个锚定点。

2.2准确度测定

对标准曲线上的各点10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，按照1.4ELISA操作方法进行实验，并对不同天的偏差进行计算，以及真实值与标示值的偏差计算。可接受的标准：STDs：|Diff％|：≤20％(LLOQ&ULOQ≤25％)；CV％：≤20％,(ULOQ&LLOQ≤25％)。最终结果显示，该方法准确度符合要求(表2)。

表2准确度测定

2.3精密度测定

对质控样品(系列浓度为5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.0625μg/ml)根据1.4ELISA操作步骤进行精密度测定。其中同一板内含有六套质控浓度，两套标准浓度。根据同一板上的标准曲线计算质控样品浓度。可接受的要求：每一浓度水平验证样品的精密度(CV％≤20％(LLOQ和ULOQ例外，为25％)；每一浓度水平验证样品的平均值的准确度(|Diff％|≤20％(LLOQ&ULOQ≤25％)；每一浓度水平验证样品的总误差(即％相对偏差绝对值与％变异系数之和)≤30％(LLOQ&ULOQ≤40％)；验证样品各浓度点复孔OD值的CV％≤20％(LLOQ&ULOQ≤25％)。实验结果显示，日内精密度、日间精密度符合要求(表3、表4)。

表3板内精密度

表4板间精密度

2.4分析方法的选择性

收集50例人血清，每例人血清中加入0.0625μg/ml的PD-1抗体，空白血清作为对照。按照1.4ELISA操作步骤进行实验。计算每例血清中的药物浓度，并计算回收率。可接受的要求：验证样品的回收率在80％-120％之间。其中含有80％以上的血清回收率在标准范围内。

表5分析方法的选择性

*bql:below quantifiable limit(＜0.0625μg/ml)。

2.5样品稳定性

将制备的质控样品在室温放置3天以及-70℃冻融三次，按照1.4ELISA操作方法进行实验。可接受的要求：每一浓度水平验证样品的总误差(即％相对偏差绝对值与％变异系数之和)≤20％；验证样品各浓度点复孔OD值的CV％≤20％(表6、表7)。

表6室温放置稳定性

表7冻融稳定性

2.6.稀释线性考察

使用质控样品进行方法的稀释线性考察，即评价样品浓度超过分析方法的定量范围时，空白基质将样品浓度稀释至定量范围内后，是否能准确测定。另外一个目的是考察方法是否存在“前带”或“钩状”效应。即高浓度分析物引起的信号抑制。

方法：将1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml的PD-1抗体，分别稀释1000倍、100倍、10倍，再次进行浓度测定，将测定浓度与标示浓度进行比较，并确定稀释因子。可接受的要求：线形稀释样品经稀释度校正后的浓度应在标示值的|RE％|≤20％范围内(表8)。

表8稀释效应

2.7.平行性考察

选择高浓度(Cmax)样品，用空白基质稀释不同的浓度(n＝3)。实验要求：验证样品在稀释不同倍数后，需在标准曲线浓度范围内，不同稀释倍数下样品浓度与标示浓度的偏差为CV％≤30％(表9)。

表9平行性考察

实施例1中，开发了一种检测血清中PD-1抗体的检测方法，并进行了方法学验证，该方法各项要求符合规定。并且，用两种已上市的PD-1抗体和三种临床试验用的PD-1抗体进行验证(图2)。

实施例2

1.各组分原液质检标准确立

根据1.4ELISA操作步骤，对各组分分别进行质检，各组分质检标准为不同天实验数据偏差(RSD)小于20％，质检合格的原液可作为试剂盒中的组分。实验结果显示，不同天实验IC50值偏差不超过20％(表10)。

表10原液组分不同天偏差

2.试剂盒组分冻干

冻干工艺为：预冻温度为-60℃，持续6个小时，冷阱温度为-70℃，真空度保证10Pa以下，干燥时间为30小时，冻干产品外形饱满。

3.试剂盒质检

冻干后各组分按1.4ELISA操作步骤进行质检。实验数据显示，不同天实验IC50值偏差不超过20％(表11)。说明该试剂盒稳定性较好。

表11冻干品组分不同天实验偏差

4.试剂盒稳定性试验

4.1试剂盒中重构后冻融及加速试验

将各组分用PBS重构后分装，每管10μg，分别进行一下实验：-70℃冻融三次、37℃恒温培养箱中放置2小时，按1.4ELISA操作步骤进行实验。实验结果见表12、13，加速及冻融试验后，活性IC50偏差小于20％，说明该试剂盒稳定性较好。

表12重构后冻融试验

	原液	冻干品0次	重构后冻融一次	重构后冻融二次
					IC50(μg/ml)	0.588	0.544	0.491	0.436
RSD(％)	/	6％	13％	20％

表13重构后加速试验

	原液	冻干品0h	重构后加速1h	重构后加速2h
					IC50(μg/ml)	0.544	0.533	0.702	0.669
RSD(％)	/	1％	18％	15％

4.2试剂盒中加速稳定性试验

将各组分同时置于37℃恒温培养箱中放置15天，按1.4ELISA操作步骤进行实验。实验结果显示，加速后试剂盒活性IC50偏差小于20％，说明试剂盒稳定性较好(表14)。

表14加速稳定性试验

	原液	试剂盒
			IC50(μg/ml)	0.506	0.613
RSD(％)	/	14％

4.3试剂盒运输模拟试验

将各组分同时置于室温放置3天并模拟运输条件，按1.4ELISA操作步骤进行实验。实验结果显示，试剂盒IC50与原液的偏差小于20％，说明试剂盒稳定性较好(表15)。

表15运输模拟试验

	原液	冻干
			IC50(μg/ml)	0.512	0.622
RSD(％)	/	14％

结果：通过稳定性验证，该产品稳定性较好。根据加速时间、条件推算该试剂盒可在-20℃条件下可保存1年，重构后的溶液在-80℃条件下可保存3个月。

实施例3

本实施例中的方法为通用型方法，可检测正在研究以及上市的多种PD-1抗体(由不同厂家提供)。具体实验如下，根据1.4ELISA操作步骤进行各种抗体验证，结果显示(图2)，不同的抗体药可能均使用该方法进行血清中药物含量测定。

实施例4

本实施例中，将本发明的方法与传统间接ELISA方法进行了比较。间接法在检测时往往会出现背景高的问题，需要将血清500-1000倍的稀释方能解决这一难题。本发明采用生物素标记的抗体与血清中的抗体竞争酶标板中的抗原PD-1，可规避这一弊端。而且该方法是通用型的检测方法，在检测实际病人血药浓度时具有与传统方法等效的检测结果。

1.间接法操作步骤

将血清中的PD-1抗体加到包被PD-1抗原(1μg/ml)的板孔中，封闭后，加HRP标记的人IgG进行检测。该方法中血清需稀释100倍，可消除背景。

2.间接法与本发明中方法基质影响比较

选择24例血清，根据两种不同方法进行实验，验证不同方法下产生的背景，根据结果(图3)显示，间接法在稀释1000倍后方可消除背景，而本发明的方法无背景值。而且不同个体间差异较大，因此，本发明中所用到的作为稀释基质的血清为混合血清(图4)。

3.检测实际病人血清中PD-1抗体含量

用两种实验方法进行实际病人血清中抗体(该血清由中科院肿瘤医院提供)验证，结果(图5)显示，本发明中所述方法与间接法所测到的结果无显著性差异。

实施例5

产品用途：本实施例中的试剂盒产品组分包括，PD-1蛋白、PD-1中和性抗体，生物素标记的PD-1中和性抗体以及辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。该试剂盒可用于临床前PD-1抗体药在动物体内不同时间的药物含量，也可对临床病人血清中PD-1抗体药不同时间进行定量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京百普赛斯生物科技有限公司

<120> 一种检测PD-1抗体血药浓度的方法及试剂盒

<130> GAI17CN3114

<150> CN 201710743124.2

<151> 2017-08-25

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe

20 25 30

Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro

35 40 45

Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln

50 55 60

Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu

100 105 110

Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

<210> 2

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> PD-1抗体重链序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> PD-1抗体轻链序列

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (6)

1.一种非诊断目的的定量检测PD-1抗体血药浓度的方法，该方法包括：

用经过生物素标记的PD-1中和性抗体和待测血清样品中的PD-1抗体竞争，采用ELISA法以辣根过氧化酶标记的链霉亲和素为检测抗体检测血清中PD-1抗体浓度；所述的血清为人血清；

其中，所述ELISA操作步骤：

用1μg/ml的抗原PD-1包被酶标板，每孔100μl；4℃放置过夜；

封闭后加入标准品、质控样品、待检样品及等体积混匀的经过生物素标记的PD-1中和性抗体，其中经过生物素标记的PD-1中和性抗体0.002 μg/ml，其中血清终浓度为10%，孵育1小时后洗板，加入100μl 以辣根过氧化酶标记的链霉亲和素，以辣根过氧化酶标记的链霉亲和素使用比例1:10000，孵育1小时；

显色；

用酶标仪测定450nm吸收度；

以浓度与对应的百分比建立曲线，采用四参数曲线进行拟合计算；

其中，经过生物素标记的PD-1中和性抗体是按照以下方法得到的：配制含有PD-1中和抗体和生物素的混合溶液，且加入EDC、NHS，经反应得到生物素标记的中和抗体；其中，将抗体浓度控制到0.5-1 mg/ml之间，分别按照以下摩尔比例将下列标记试剂混合，抗体：生物素：EDC:NHS =1:10~20: 100~150 : 200~300 ；25~30℃，反应12~18小时，得到生物素标记的中和抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ELISA法为竞争ELISA法。

3. 根据权利要求1所述的方法，该方法的血药浓度检测范围为5-0.0625 μg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述中和抗体的生物素标记采用化学标记的方法。

5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述中和抗体的生物素标记方法中，反应结束时，最终加入Tris至终浓度100 mM，终止反应；然后用G-25脱盐柱进行脱盐，进行无菌过滤，得到生物素标记的中和抗体。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述链霉亲和素的标记方法采用化学标记。

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