CN105018569A - Atp硫酸化酶的生物素标记方法 - Google Patents

Atp硫酸化酶的生物素标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及ATP硫酸化酶的生物素标记方法。步骤包括透析ATP硫酸化酶，活化生物素，透析生物素化的ATP硫酸化酶，纯化，测定蛋白和冷藏。在测序反应中，生物素化的ATP硫酸化酶可与焦磷酸酶和荧光素酶协同作用，进行通量高、读长大的测序反应。

Description

ATP硫酸化酶的生物素标记方法
技术领域
    本发明属于生物技术领域，具体涉及ATP硫酸化酶的生物素标记方法。
背景技术
生物素化（biotinylation）是指将生物素共价连接到蛋白质、核酸或其它分子上的过程。由于生物素的分子量不大（分子量为244.31），生物素化反应快速、高效且不易被干扰。生物素化的分子能通过生物素与链霉亲和素、亲和素互作，且不受高热、pH、蛋白酶解的影响。生物素与链霉亲和素、亲和素的结合特异且高效，因此这一互作在生物技术的许多领域有着广泛的应用。另外，多个生物素化分子可以发生交联来形成个科研人员感兴趣的蛋白，同时允许和多个链霉亲和素、亲和素、中性亲和素蛋白结合，增加了对此蛋白的检测灵敏度。此外还有大量的生物素化分子的应用有待开发。
ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase, ATPS）广泛存在于植物、动物及微生物中，但它在各种生物体当中的生物学作用略有不同。在植物和部分微生物中，是催化硫酸盐同化反应第一步的关键酶。在ATPS的催化下，硫酸根离子与ATP反应，产生腺嘌呤-5’-磷酸硫酸ATS和焦磷酸盐PPi。而在一些化学自养菌和化能无机营养菌中，ATPS是催化硫化氢氧化生成无机硫酸盐最后一步的酶，其作用是催化ATS和PPi反应生成ATP和硫酸根离子，即上述反应的逆反应。ATPS已经从产黄青霉菌、鼠肝、卷心菜等生物体中提取并纯化得到，而且编码ATPS的基因也已经从原核生物、真核生物、动物和植物中克隆出来并在适当的宿主中得到表达。不同来源的ATPS结构不同，大肠杆菌来源的ATPS是异源二聚体且需要GTP激活，酵母、真菌以及植物来源的ATPS是单体或是同源寡聚体。在分子生物学方面，目前已通过氨基酸修饰等手段研究其结构和功能的关系，加深了对ATPS作用机制的了解。偶连ATP硫酸化酶可以应用于很多方面，如：PPi定量、RNA测定、DNA测序、DNA聚合酶酶活测定等等。
ATP硫酸化酶被生物素修饰之后就可以同亲和素进行固相亲和作用。生物素与亲和素是一对特异性相当高的亲和配体，并且具有解离速率慢、不易受干扰等特点。目前，生物素化的手段有化学修饰和生物修饰，但修饰后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的ATP硫酸化酶可应用于焦磷酸测序反应中，酶活会直接关系到测序反应的准确度，所以急需找到一种可操作性强，产物活性高的制备方法。
发明内容
本发明的一个目的是一种ATP硫酸化酶的生物素标记方法，包括以下步骤：
（1）使用PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶；
（2）使用PBS缓冲液对ATP硫酸化酶进行透析；
（3）活化生物素；
（4）平衡生物素至10℃以下；
（5）将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶，按照生物素与ATP硫酸化酶摩尔比（22-25）:1的比例混合，搅拌，得到混合溶液；
（6）使用PBS缓冲液对混合溶液进行透析，去除杂质和游离生物素；
（7）采用superdex 200进行分子排阻；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入保护剂，冷藏保存至-80℃—-16℃。
所述步骤（1）-步骤（7）中，PBS缓冲液pH值为8.0。
所述溶解ATP硫酸化酶，使ATP硫酸化酶浓度为1.5-2mg/ml。
所述活化生物素使用EDC/NHS和有机溶剂，生物素、EDC和NHS的摩尔比为4:5:4，有机溶剂为二甲基甲酰胺，纯度为分析纯以上。
所述搅拌温度为4℃，持续5小时以上，优选为8小时。
所述透析过程温度为4℃，持续12小时以上，优选为18小时。
所述透析过程，PBS缓冲液体积为混合溶液的10倍以上，PBS缓冲液更换一次以上。
所述保护剂含有PBS缓冲液；还含有甘氨酸、组氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、叠氮钠和聚乙二醇中的一种或几种。
所述保护剂优选含有PBS缓冲液、甘氨酸、组氨酸、DTT、EDTA和叠氮钠。
加入保护剂后，将保护剂与酶的混合液调节至pH 7.5。
本发明中二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂能够使生物素和ATP硫酸化酶溶解于其中，在其中高效、充分的结合。制备得到的生物素化ATP硫酸化酶，非常适合应用于焦磷酸测序反应中，ATP硫酸化酶的高活性可确保测序反应的准确度。在测序反应中，可与焦磷酸酶和ATP硫化酶协同作用，进行通量高、读长大的测序反应。
具体实施方式
实施例1
（1）    使用pH8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶浓度为1.8mg/ml；
（2）    使用1L PBS缓冲液对100mlATP硫酸化酶溶液进行透析，持续18小时，温度为4℃，PBS缓冲液在6小时更换一次；
（3）    活化生物素：将1mol生物素，1.25mol EDC，1mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
（4）平衡生物素至10℃；
（5）将活化的生物素0.24mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶0.01mol，混合，搅拌8小时，温度为4℃，得到混合溶液；
（6）使用1L PBS缓冲液对100ml混合溶液进行透析，持续18小时，温度为4℃，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在6小时更换一次；
（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，柱平衡和洗脱过程使用pH8.0的PBS缓冲液；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入酶体积2倍的保护剂，保护剂含有10mM PBS缓冲液、20%甘氨酸、30%组氨酸、0.15mM DTT、0.08mM EDTA和0.06mM叠氮钠，调节至pH 7.5，保存至-16℃。
实施例2
（1）使用pH8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶浓度为1.5mg/ml；
（2）使用1LPBS缓冲液对80mlATP硫酸化酶溶液进行透析，持续12小时，温度为4℃，PBS缓冲液在4小时更换一次；
（3）活化生物素：将1mol生物素，1.25mol EDC，1mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
（4）平衡生物素至4℃；
（5）将活化的生物素0.22mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶0.01mol，混合，搅拌5小时，温度为4℃，得到混合溶液；
（6）使用1L PBS缓冲液对80ml混合溶液进行透析，持续12小时，温度为4℃，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在4小时更换一次；
（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，柱平衡和洗脱过程使用pH8.0的PBS缓冲液；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9） 加入酶体积1.5倍的保护剂，保护剂含有10mM PBS缓冲液和0.1mM DTT，调节至pH 7.5，保存至-20℃。
实施例3
（1）使用pH8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶浓度为1.6mg/ml；
（2）使用1L PBS缓冲液对90mlATP硫酸化酶溶液进行透析，持续12小时，温度为4℃，PBS缓冲液在4小时更换一次；
（3）活化生物素：将1mol生物素，1.25mol EDC，1mol NHS加入1L分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
（4）平衡生物素至4℃；
（5）将活化的生物素0.25mol由60ml二甲基甲酰胺和120ml四氢呋喃混合得到的混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶0.01mol，混合，搅拌6小时，温度为4℃，得到混合溶液；
（6）使用1L PBS缓冲液对90ml混合溶液进行透析，持续15小时，温度为4℃，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在4小时和8小时更换；
（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，柱平衡和洗脱过程使用pH8.0的PBS缓冲液；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入酶体积2倍的保护剂，保护剂含有10mM PBS缓冲液、20%甘氨酸、0.2mM甘露醇、0.15mM DTT和0.08mM EDTA，调节至pH 7.5，保存至-70℃。
实施例4
（1）    使用pH8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶浓度为2mg/ml；
（2）    使用1L PBS缓冲液对85ml混合溶液进行透析，持续12小时，温度为4℃，PBS缓冲液在2小时更换一次；
（3）活化生物素：将1mol生物素，1.25mol EDC，1mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
（4）平衡生物素至0℃；
（5）将活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶0.01mol，混合，搅拌7小时，温度为4℃，得到混合溶液；
（6）使用1L PBS缓冲液对85ml混合溶液进行透析，持续13小时，温度为4℃，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在2小时和9小时更换；
（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，柱平衡和洗脱过程使用pH8.0的PBS缓冲液；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入与酶等体积的保护剂，保护剂含有10mM PBS缓冲液、25%甘氨酸、0.15mM DTT和0.2mM 聚乙二醇，调节至pH 7.5，保存至-80℃。
实施例5
（1）    使用pH8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶浓度为1.7mg/ml；
（2）    使用1L PBS缓冲液对85ml混合溶液进行透析，持续12小时，温度为4℃，PBS缓冲液在2小时更换一次；
（3）活化生物素：将1mol生物素，1.25mol EDC，1mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
（4）平衡生物素至0℃；
（5）将活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶0.01mol，混合，搅拌6小时，温度为4℃，得到混合溶液；
（6）使用1L PBS缓冲液对95ml混合溶液进行透析，持续13小时，温度为4℃，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在4小时更换一次；
（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，柱平衡和洗脱过程使用pH8.0的PBS缓冲液；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入与酶等体积的保护剂，保护剂含有10mM PBS缓冲液、0.1mM甘露醇和0.05mM叠氮钠，调节至pH 7.5，保存至-80℃。

Claims (8)

1.一种ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶；
（2）使用PBS缓冲液对ATP硫酸化酶进行透析；
（3）活化生物素；
（4）平衡生物素至10℃以下；
（5）将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶，按照生物素与ATP硫酸化酶摩尔比（22-25）:1的比例混合，搅拌，得到混合溶液；
（6）使用PBS缓冲液对混合溶液进行透析，去除杂质和游离生物素；
（7）采用superdex 200进行分子排阻；
（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
（9）加入保护剂，冷藏保存至-80℃—-16℃。
2.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述步骤（1）-步骤（7）中，PBS缓冲液pH值为8.0。
3.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述溶解ATP硫酸化酶，使ATP硫酸化酶浓度为1.5-2mg/ml。
4.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述活化生物素使用EDC/NHS和有机溶剂，生物素、EDC和NHS的摩尔比为4:5:4，有机溶剂为二甲基甲酰胺，纯度为分析纯以上。
5.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述搅拌温度为4℃，持续5小时以上，优选为8小时。
6.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述透析过程温度为4℃，持续12小时以上，优选为18小时。
7.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述透析过程，PBS缓冲液体积为混合溶液的10倍以上，PBS缓冲液更换一次以上。
8.如权利要求1所述的ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，所述保护剂含有PBS缓冲液；还含有甘氨酸、组氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、叠氮钠和聚乙二醇中的一种或几种。
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