CN101846684A - 检测aib1的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，由包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板、生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液、与生物素标记的单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺组成。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤：(1)制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板；(2)制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液；(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺。
Description
技术领域
本发明属于医用试剂盒领域，特别涉及一种检测甾体激素受体共活化物(amplified inbreast cancer 1，下文中简称AIB1)的试剂盒及其制备方法。
背景技术
AIB1属于细胞核激素受体共激活剂P160家族的成员，最初发现是在乳腺癌中扩增的一种转录辅激活因子，基因定位于人染色体20q12、鼠染色体2H2-4。研究表明，AIB1不仅是正常体细胞生长所必须的物质，而且对于一些肿瘤的发生发展起重要作用，如乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌和卵巢癌等(见Liao L，Kuang SQ，Yuan Y，et al.Molecular structure and biological function of the cancer-amplified nuclear receptor coactivatorSRC-3/AIB1.J Steroid Biochem Mol Biol 2002，83(1-5)：3-14.)。因而，AIB1可作为肿瘤辅助诊断的指标。AIB1的检测，现有方法主要有免疫组织化学法或免疫印迹(western-blot)法。免疫组织化学法通过一种抗体识别AIB1，检测标本为组织切片或细胞爬片，操作步骤包括组织切片脱蜡、一抗孵育、二抗孵育和显色，配套器械和设备包括包埋机、切片机、显微镜及图像分析系统，检测时间为12～24小时。免疫印迹法通过一种抗体识别AIB1，检测标本为组织细胞裂解液或体液或血液，操作步骤包括电泳样品、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育和显色，配套器械和设备包括垂直电泳仪、电转移仪和凝胶分析仪，检测时间为12～24小时。上述两种方法存在的问题是操作过程复杂，检测时间长，配套设备和器械较多，特异性较差(由于只通过一种抗体识别AIB1)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法，以便快速、简便且更特异地检测AIB1。
本发明所述检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，由包被有CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)单克隆抗体的多孔板、生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb(Nitric Monoclonal Antibody)检测液、与生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb结合的亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺组成。所述试剂盒中，包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板、生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液、亲和素-辣根过氧化物酶和3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺分别各自单独存放。
实验表明，上述试剂盒所含包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板，优选每孔包被CmcAb单克隆抗体0.9μg～1μg。
上述试剂盒中，所述生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液主要由生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成；生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb的浓度优选24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度优选1.5g/100ml，甘油的浓度优选50ml/100ml。
所述生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb由生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯和单克隆抗体NmcAb耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与NmcAb的质量比优选0.8～1∶7。
本发明所述检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，工艺步骤如下：
(1)制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板
用pH＝8～10的碳酸盐缓冲液将CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述CmcAb单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4℃包被至少12小时；包被时间届满后，将质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃(一般在4℃冰箱中保存备用)；
(2)制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液为溶剂，NmcAb单克隆抗体为溶质配制浓度为48μg/μl的NmcAb单克隆抗体溶液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获得生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb；反应结束后，将含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液，其保存温度为-20℃；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺，所述亲和素-辣根过氧化物酶和3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺均为市售商品，可直接从市场购买。
上述方法中，制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板时，所述CmcAb单克隆抗体稀释液的加入量为100μl/孔，所述质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液的加入量为120μl/孔。
上述方法中，制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb时，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与NmcAb单克隆抗体的质量比＝1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液形成混合液。
本发明所述试剂盒及其制备方法中，CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)单克隆抗体和NmcAb(Nitric Monoclonal Antibody)单克隆抗体本质上均为蛋白质，能特异识别AIB1。所述CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)的制备方法见：抗AIB1-C单克隆抗体的制备及初步应用，陕西医学杂志2007年36卷3期；所述NmcAb(Nitric MonoclonalAntibody)单克隆抗体的制备方法见：抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定，四川大学学报(医学版)2006年第37卷第02期。
本发明所述检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的检测标本为组织细胞裂解液或体液或血液，所需设备为酶标仪，使用方法如下：
在包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板的孔中加入待检样品，4℃孵育3小时后洗涤去除未反应物；然后向所述多孔板的孔中加入Biotin-NmcAb检测液的稀释液，在37℃反应1h后洗涤去除未反应物；继后向所述多孔板的孔中加入加入亲和素-辣根过氧化物酶稀释液，37℃反应1h后用3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色，用酶标仪测所述多孔板各孔的A450值。
本发明具有以下有益效果：
1、由于本发明所述试剂盒含有两种AIB1识别抗体(CmcAb单克隆抗体和NmcAb单克隆抗体)，因而使用本发明所述试剂盒检测AIB1特异性更好。
2、使用本发明所述试剂盒进行AIB1检测，操作简单，一个样品所需时间仅6小时左右，与免疫组织化学法或免疫印迹(western-blot)法相比，检测时间缩短至少6小时。
3、使用本发明所述试剂盒进行AIB1检测，配套设备仅需酶标仪，与免疫组织化学法或免疫印迹(western-blot)法相比，配套设备和器械大为减少。
附图说明
图1是本发明所述检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒中多孔板的一种形状构造示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法和使用方法作进一步说明。
下述实施例中涉及的材料来源或制备方法如下：
CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)的制备方法见抗AIB1-C单克隆抗体的制备及初步应用，陕西医学杂志 2007年36卷3期；
NmcAb(Nitric Monoclonal Antibody)单克隆抗体的制备方法见抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定，四川大学学报(医学版)2006年第37卷第02期；
碳酸盐缓冲液(CB)，购自美国sigma公司；
磷酸盐缓冲液(PBS)，购自美国sigma公司；
牛血清白蛋白，购自美国sigma公司；
N，N-二甲基甲酰胺，购自美国sigma公司；
酰-N羟基丁二酰亚胺酯，购自美国sigma公司；
甘油的规格是分析醇，购自美国sigma公司；
亲和素-辣根过氧化物酶，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
PBS-Tween20，购自美国sigma公司；
多孔板为96孔的多孔板，其形状和构造如图1所示。
乳腺癌细胞株T47D，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，将其用RIPA蛋白裂解液(购自碧云天生物技术研究所)常规裂解制备成T47D裂解液。
实施例1
本实施例中，采用以下工艺步骤制备检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒：
(1)制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板
用pH＝8、浓度为1mol/l的碳酸盐缓冲液将CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述CmcAb单克隆抗体稀释液按100μl/孔的量加入多孔板(见图1)的各孔内，在4℃包被12小时；包被时间届满后，将质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液按120μl/孔的量加入多孔板的各孔内并在37℃进行封闭反应，反应时间为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板3次，每次3分钟，即获得包被有CmcAb(Carbon Monoclonal Antibody)单克隆抗体的多孔板，然后将其置于4℃冰箱中保存备用；
(2)制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6、浓度为1mol/l的碳酸盐缓冲液为溶剂，NmcAb单克隆抗体为溶质配制浓度为48μg/μl的NmcAb单克隆抗体溶液，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与NmcAb单克隆抗体的质量比＝1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液形成混合液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下(磁力搅拌器，搅拌速度200转/分)于室温反应4小时，即获得生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb；反应结束后，将含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间为12小时，其间更换透析液3次；继后在透析后的反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb和牛血清白蛋白的透析后反应液10000μl与甘油10000μl在室温下混合均匀即形成生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液，其保存温度为-20℃；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶20000μl，配备3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺20000μl。
用本实施例制备的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒对乳腺癌细胞株T47D裂解液和血清进行AIB1检测，操作如下：
将乳腺癌细胞株T47D裂解液和血清用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液稀释成表1中的稀释倍数，将生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液按1∶500稀释，将亲和素-辣根过氧化物酶用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液按1∶1000稀释，对照磷酸盐缓冲液的pH＝7.2、浓度为0.05mol/l。
向包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入不同稀释倍数的乳腺癌细胞株T47D裂解液、血清及对照磷酸盐缓冲液(PBS)，加入量为100μl/孔，在4℃孵育3小时后用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液洗涤5次，然后加入1∶500稀释的生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液，加入量为100μl/孔，在37℃反应1小时后用PBS-Tween20洗涤5次，继后加入1∶1000稀释的亲和素-辣根过氧化物酶稀释液，加入量为100μl/孔，在37℃反应1小时后按100μl/孔加入饱和浓度的3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色，并用酶标仪测所述多孔板各孔的A450值(光密度值)，所测A450值见表1：
表1：检测结果
| 检测标本稀释倍数 | 1 | 1/4 | 1/16 | 1/64 | 1/256 | 1/1024 | PBS对照 |
| 血清A450值 | 2.353 | 1.126 | 0.510 | 0.304 | 0.252 | 0.228 | 0.175 |
| T47D裂解液A450值 | 1.476 | 0.765 | 0.476 | 0.255 | 0.242 | 0.216 | 0.136 |
从上表可以看出，随着检测标本中AIB1抗原量的减低，A450值也随着减低。
实施例2
本实施例中，采用以下工艺步骤制备检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒：
(1)制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板
用pH＝10的碳酸盐缓冲液将CmcAb(Carbon MonoclonalAntibody)单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述CmcAb单克隆抗体稀释液按100μl/孔的量加入多孔板的各孔内，在4℃包被12小时；包被时间届满后，将质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液按120μl/孔的量加入多孔板的各孔内并在37℃进行封闭反应，反应时间为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板3次，每次3分钟即获得包被有CmcAb(CarbonMonoclonal Antibody)单克隆抗体的多孔板，然后将其置于4℃冰箱中保存备用；
(2)制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液
制备方法与实施例1相同。
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶20000μl，配备3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺20000μl。
用本实施例制备的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒对乳腺癌细胞株T47D裂解液和血清进行AIB1检测，操作与实施例1相同。所测A450值见表2：
表2：检测结果
| 检测标本稀释倍数 | 1 | 1/4 | 1/16 | 1/64 | 1/256 | 1/1024 | PBS对照 |
| 血清A450值 | 2.342 | 1.130 | 0.502 | 0.305 | 0.252 | 0.225 | 0.174 |
| T47D裂解液A450值 | 1.483 | 0.771 | 0.472 | 0.254 | 0.244 | 0.218 | 0.135 |
从上表可以看出，随着检测标本中AIB1抗原量的减低，A450值也随着减低，结果与实施例1结果差别微小。
Claims (7)
1.一种检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述试剂盒由包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板、生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液、与生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb结合的亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺组成。
2.根据权利要求1所述的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述多孔板每孔包被CmcAb单克隆抗体0.9μg～1μg。
3.根据权利要求1或2所述的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液主要由生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成，生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb的浓度为24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度为1.5g/100ml，甘油的浓度为50ml/100ml。
4.根据权利要求3所述的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb由生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯和单克隆抗体NmcAb耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与NmcAb的质量比为0.8～1∶7。
5.一种检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
(1)制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板
用pH＝8～10的碳酸盐缓冲液将CmcAb单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述CmcAb单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4℃包被至少12小时；包被时间届满后，将质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃；
(2)制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液为溶剂，NmcAb单克隆抗体为溶质配制浓度为48μg/μl的NmcAb单克隆抗体溶液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获得生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb；反应结束后，将含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb检测液，其保存温度为-20℃；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶和显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺。
6.根据权利要求5所述的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其特征在于制备包被有CmcAb单克隆抗体的多孔板时，所述CmcAb单克隆抗体稀释液的加入量为100μl/孔，所述质量浓度1％的牛血清白蛋白溶液的加入量为120μl/孔。
7.根据权利要求5或6所述的检测AIB1的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其特征在于制备生物素标记的单克隆抗体Biotin-NmcAb时，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与NmcAb单克隆抗体的质量比＝1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述NmcAb单克隆抗体溶液形成混合液。
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