CN103235133B - 一种胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂。本发明还公开了检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂在制备胎儿9号染色体异常筛查试剂中的用途。本发明试剂盒可以对胎儿的9号染色体是否异常进行评估，临床应用前景良好。

Description

一种胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒。
背景技术
人类的9号染色体是23对染色体中的一对，正常情况下每个体细胞拥有两条该染色体，此染色体含有约有800到1200个基因，占细胞内所有DNA的4%到4.5%。9号染色体中有95个基因与疾病有关，其中之一可抑制肿瘤形成，还有一个基因与某种类似亨廷顿氏症的神经退化疾病有关。
9号染色体的异常，如9号染色体三体综合征，主要病理特征是小头畸形、第4脑室扩大，先天心脏、指趾异常，先天性髋关节脱位、马蹄外翻足、隐睾、阴囊阴茎异常、特殊面容、握拳手、手指重叠等，并且患者出生以后早年死亡的可能性大。
因此，在怀孕早期进行检测，确定胎儿的9号染色体是否异常，对妊娠及时干预以及胎儿出生后的及时治疗具有极为重要指导意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒，检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂在制备胎儿9号染色体异常疾病筛查试剂中的用途。
本发明胎儿9号染色体异常疾病的筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂。
其中，所述试剂为ELISA检测用试剂。
所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
本发明还提供了检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂在制备胎儿9号染色体异常疾病筛查试剂中的用途。
其中，所述检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂。
所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
本发明筛查试剂盒和方法能够有效筛查胎儿的9号染色体是否异常，使胎儿可以得到及时的治疗，降低死亡率，并且本发明试剂盒是对孕妇进行血液或尿液进行检查，使用方便，患者依从性高，具有良好的临床应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。
凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1样本采集
1、采集对象：2011年10月-2012年4月在四川大学华西第二医院门诊及成都中医药大学第二附属医院门诊就诊的孕早期孕妇共36例。
2、早期妊娠诊断标准：参考全国高等医学院校教材《妇产科学》第7版记载的方法（包括①停经史；②HCG阳性；③确诊为宫内妊娠（B型超声见到宫腔内有妊娠囊）。
3、纳入标准：①符合上述诊断标准者；②孕周：5周-13+6周；③知情同意，志愿受试。
4、排除标准：有心血管、肝、肾和造血系统等并发症，或其他原发性疾病及精神病患者。
5、脱落标准：①纳入后发现不符合纳入标准或伴有排除标准的病例予以剔除；②因其他原因失访的病例；③患者自行退出；④纳入后发现无法从受试者处获得真实、全面的临床资料。
6、样本人口特征：纳入孕妇年龄范围21岁-43岁，平均年龄31.96±6.1岁。
7、胎儿9号染色异常检测方法：羊水穿刺后G显带分析。检测结果：34例正常，1例为9号染色体三体，1例为9号染色体臂间倒位。
8、样本采集
（1）血液样本：采用含有EDTA的试管采集孕妇静脉血（空腹）4ml,经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
（2）尿液样本：留取受试者中段尿6ml，经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
实施例2PLGF水平的检测方法
1、主要仪器
(1)酶标仪：Molecular Devices公司，Spectra Max5
(2)冷冻离心机：BECKMAN公司，AllegraTM64R
(3)-20℃冰箱：Electrolux公司
(4)超低温冰箱：Thermo公司，SK501
(5)电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司，DRP-9162
2、实验试剂及材料
(1)Capture Antibody：鼠抗人PLGF单克隆抗体Human PLGF Antibody(Monoclonal Mouse IgG1)，购自R&D公司，MAB264；
(2)Detection Antibody：生物素标记的羊抗人PLGF多克隆抗体HumanPLGF Biotinylated Antibody(Ployclonal Goat IgG)，购自R&D公司，BAF264；
(3)PLGF标准品：重组人PLGF Recombinant Human PLGF，购自R&D公司，264-PG-10；
(4)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素Streptavidin-horseradish peroxidase：R&D公司,DY998；
(5)TMB：Sigma公司，TO440-1L；
(6)PBS：自配,pH7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mMKH2PO4,pH7.2-7.4,0.2μm filtered；
(7)Tween-20：上海生工；
(8)包被缓冲液：自配,pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液，Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水至1L；
(9)洗涤液：自配，PBS-T(PBS，含0.02%Tween-20)
(10)终止液：自配，2M H2SO4；
(11)脱脂奶粉：伊利集团；
(12)牛血清白蛋白（BSA）：罗氏公司；
(13)胎牛血清（FBS）：GIBCO公司；
(14)可拆式96孔ELISA板：COSTAR公司。
3、实验方法
（1）将所测样本放在室温下复苏后，再进行检测；
（2）包被Capture Antibody，4μg/ml，100μl/well，4℃放置过夜（约16-20h）；
（3）3%BSA溶液、3%FBS溶液或为5%脱脂奶粉溶液封闭，100μl/well，37℃孵育2h；
（4）PBS-T洗板三次；分别加入8个不同浓度PLGF标准品（浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml）及待测样品，100μl/well，均设置两个复孔，同时设置两个空白孔，37℃孵育2h；
（5）PBS-T洗板三次；分别加入Detection Antibody，1μg/ml，100μl/well，37℃孵育2h；
（6）PBS-T洗板三次；加入streptavidin-horseradish peroxidase，1:200，100μl/well，室温，1h；
（7）PBS-T洗板三次；加入TMB，100μl/well，避光于37℃孵育10min；
（8）直接加终止液，50μl/well；450nm处检测OD值，绘制标准曲线，计算待检样品的PLGF水平。
实施例3PLGF水平与9号染色体异常的相关性
按照实施例2的方法分别检测实施例1采集的血液和尿液样本，统计结果如表1所示：
表1胎儿9号染色体异常与血清PLGF水平的相关性
如表1所示，胎儿正常时，孕妇血清PLGF为228.07pg/ml，胎儿9号染色体异常时，孕妇血清PLGF低至15.6pg/ml，前者比后者高212.47pg/ml，是后者的14.62倍。
表2胎儿9号染色体异常与尿液PLGF水平的相关性
如表2所示，胎儿正常时，孕妇尿液PLGF为164.66pg/ml，胎儿9号染色体异常时，孕妇尿液PLGF为55.55pg/ml，前者比后者高109.11pg/ml，是后者的1.564倍。
同时，两例胎儿9号染色体异常的孕妇均无心血管、肝、肾和造血系统等并发症，无其他原发性疾病及精神病患者，也无既往病史、过敏史，妊娠方式为自然受孕，体重指数正常。
由上述实验结果，可以看出孕妇血清和尿液PLGF水平与胎儿9号染色体异常显著相关。虽然胎儿9号染色体异常的病例比较罕见，但是当孕妇血清PLGF水平低于15.6pg/ml时，或者孕妇尿液PLGF水平低于55.55pg/ml时，可灵敏提示胎儿患9号染色体异常的可能性大。因此，可以通过检测孕妇血清或尿液PLGF水平，筛查胎儿是否有9号染色体疾病。
实施例4本发明筛查试剂盒
1、本发明筛查试剂盒的组分及含量（50人份）：
2、本发明试剂盒的使用方法
血液样本：采用含有EDTA的试管采集孕妇静脉血（空腹）4ml,经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
尿液样本：留取受试者中段尿6ml，经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
使用方法：
（1）将所测样本放在室温下复苏后，进行检测；
（2）包被Capture Antibody，4μg/ml，100μl/well，4℃放置过夜（约16-20h）；
（3）3%BSA封闭，100μl/well，37℃孵育2h；
（4）PBS-T洗板三次；分别加入8个不同浓度的PLGF标准品（浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml）及待测样品，100μl/well，均设置两个复孔，同时设置两个空白孔，37℃孵育2h；
（5）PBS-T洗板三次；分别加入Detection Antibody，1μg/ml，100μl/well，37℃孵育2h；
（6）PBS-T洗板三次；加入streptavidin-horseradish peroxidase，1:200，100μl/well，室温，1h；
（7）PBS-T洗板三次；加入TMB，100μl/well，避光于37℃孵育10min；
（8）直接加终止液，50μl/well；450nm处检测OD值，绘制标准曲线，计算待检样品的PLGF水平。
综上，使用本发明筛查试剂盒检测孕妇进行血液或尿液，可以筛查胎儿的9号染色体是否异常，为异常人群的及时治疗提供依据，临床应用前景良好。

Claims (5)

1.检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂在制备胎儿9号染色体异常筛查试剂中的用途；
所述9号染色体异常是指9号染色体三体或者9号染色体臂间倒位。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
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