CN103235142B - 一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清PLGF水平的试剂。本发明还公开了检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。本发明试剂盒可以对孕妇是否为初次妊娠进行评估，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒。
背景技术
妊娠，即怀孕，是指人和动物母体内有胚胎在发育成长。初次妊娠是指第一次妊娠。
随着我国性观念日渐开放，未婚先孕的情况逐步增加，导致初次妊娠的人工流产的比率逐渐上升。但是，因为第一次妊娠时子宫腔比较狭小，人工流产常使子宫内膜的深层受到损伤，愈合之后易造成子宫腔的粘连，导致月经血排出受阻，引起顽固性的痛经，若粘连面积较大时，会使受精卵无立足之地而造成生育困难。目前，初次妊娠后人工流产导致子宫腔粘连，进而导致不孕症的情况已屡见不鲜。因此，在人工流产时，检查孕妇是否为初次妊娠，对减少不孕症有极大的作用。
另外，初次妊娠孕妇对妊娠的过程，以及妊娠过程中的注意事项都不甚了解，导致很多胎儿患有先天性疾病。因此，在妊娠初期检查孕妇是否为初次妊娠，及时对初次妊娠孕妇进行妊娠相关知识的普及，有利于提高我国人口质量。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒以及检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。
PLGF，即胎盘生长因子(placenta growth factor，PLGF)，是一种二聚体糖蛋白，属于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一员，PLGF通过与特异性受体结合而发生生物学作用。
本发明孕妇初次妊娠筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清PLGF水平的试剂。
其中，所述试剂为ELISA检测用试剂。
所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
本发明还提供了检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。
其中，所述检测孕妇血清PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂。
所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
本发明孕妇初次妊娠筛查试剂盒可以有效筛查孕妇是否为初次妊娠，有利于孕妇身心状况的整体判断，并且操作简单，仅需血液检查，患者依从性高，为孕妇的临床诊疗提供了可靠的依据，具有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。
凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1样本采集
1、采集对象：2011年10月-2012年4月在四川大学华西第二医院门诊及成都中医药大学第二附属医院门诊就诊的孕早期孕妇共34例。
2、早期妊娠诊断标准：参考全国高等医学院校教材《妇产科学》第7版记载的方法（包括①停经史；②HCG阳性；③确诊为宫内妊娠（B型超声见到宫腔内有妊娠囊）。
3、纳入标准：①符合上述诊断标准者；②孕周：5周-13+6周；③知情同意，志愿受试。
4、排除标准：有心血管、肝、肾和造血系统等并发症，或其他原发性疾病及精神病患者。
5、脱落标准：①纳入后发现不符合纳入标准或伴有排除标准的病例予以剔除；②因其他原因失访的病例；③患者自行退出；④纳入后发现无法从受试者处获得真实、全面的临床资料。
6、样本人口特征：纳入孕妇年龄范围21岁-43岁，平均年龄31.96±6.1岁。
7、血液样本：采用含有EDTA的试管采集孕妇静脉血（空腹）4ml,经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
实施例2PLGF水平的检测方法
1、主要仪器
(1)酶标仪：Molecular Devices公司，Spectra Max5
(2)冷冻离心机：BECKMAN公司，AllegraTM64R
(3)-20℃冰箱：Electrolux公司
(4)超低温冰箱：Thermo公司，SK501
(5)电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司，DRP-9162
2、实验试剂及材料
(1)Capture Antibody：鼠抗人PLGF单克隆抗体Human PLGF Antibody(Monoclonal Mouse IgG1)，购自R&D公司，MAB264；
(2)Detection Antibody：生物素标记的羊抗人PLGF多克隆抗体HumanPLGF Biotinylated Antibody(Ployclonal Goat IgG)，购自R&D公司，BAF264；
(3)PLGF标准品：重组人PLGF Recombinant Human PLGF，购自R&D公司，264-PG-10；
(4)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素Streptavidin-horseradish peroxidase：R&D公司,DY998；
(5)TMB：Sigma公司，TO440-1L；
(6)PBS：自配,pH7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mMKH2PO4,pH7.2-7.4,0.2μm filtered；
(7)Tween-20：上海生工；
(8)包被缓冲液：自配,pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液，Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水至1L；
(9)洗涤液：自配，PBS-T(PBS，含0.02%Tween-20)
(10)终止液：自配，2M H2SO4；
(11)脱脂奶粉：伊利集团；
(12)牛血清白蛋白（BSA）：罗氏公司；
(13)胎牛血清（FBS）：GIBCO公司；
(14)可拆式96孔ELISA板：COSTAR公司。
3、实验方法
（1）将所测样本放在室温下复苏后，再进行检测；
（2）包被Capture Antibody，4μg/ml，100μl/well，4℃放置过夜（约16-20h）；
（3）3%BSA溶液、3%FBS溶液或为5%脱脂奶粉溶液封闭，100μl/well，37℃孵育2h；
（4）PBS-T洗板三次；分别加入8个不同浓度PLGF标准品（浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml）及待测样品，100μl/well，均设置两个复孔，同时设置两个空白孔，37℃孵育2h；
（5）PBS-T洗板三次；分别加入Detection Antibody，1μg/ml，100μl/well，37℃孵育2h；
（6）PBS-T洗板三次；加入streptavidin-horseradish peroxidase，1:200，100μl/well，室温，1h；
（7）PBS-T洗板三次；加入TMB，100μl/well，避光于37℃孵育10min；
（8）直接加终止液，50μl/well；450nm处检测OD值，绘制标准曲线，计算待检样品的PLGF水平。
实施例3PLGF水平与孕妇初次妊娠的相关性
按照实施例2的方法分别检测实施例1采集的血液样本，应用SPSS17.0统计软件进行统计分析。计数资料用t检验，P＜0.05认为有统计学意义。
统计结果如表1所示：
表1孕妇初次妊娠与血清PLGF水平的相关性
由表1可以看出，初次妊娠孕妇的PLGF水平平均为158.993pg/ml，多次妊娠孕妇的PLGF水平平均为221.461pg/ml，二者差值达62.468pg/ml，统计结果显示，二者差异显著（P值为0.029<0.05）。
实验结果显示，孕妇的PLGF水平与其是否为初次妊娠显著相关，当PLGF平均水平低于160pg/ml时，孕妇为初次妊娠可能性大。因此，可以通过检测孕妇的PLGF水平，筛查孕妇是否为初次妊娠。
实施例4本发明筛查试剂盒
1、本发明筛查试剂盒的组分及含量（50人份）：
2、本发明试剂盒的使用方法
血液样本：采用含有EDTA的试管采集孕妇静脉血（空腹）4ml,经4℃低温离心（4000rpm,10min）后将其上清液，编号保存于-80℃冰箱冷冻待测。
使用方法：
（1）将所测样本放在室温下复苏后，进行检测；
（2）包被Capture Antibody，4μg/ml，100μl/well，4℃放置过夜（约16-20h）；
（3）3%BSA封闭，100μl/well，37℃孵育2h；
（4）PBS-T洗板三次；分别加入8个不同浓度的PLGF标准品（浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml）及待测样品，100μl/well，均设置两个复孔，同时设置两个空白孔，37℃孵育2h；
（5）PBS-T洗板三次；分别加入Detection Antibody，1μg/ml，100μl/well，37℃孵育2h；
（6）PBS-T洗板三次；加入streptavidin-horseradish peroxidase，1:200，100μl/well，室温，1h；
（7）PBS-T洗板三次；加入TMB，100μl/well，避光于37℃孵育10min；
（8）直接加终止液，50μl/well；450nm处检测OD值，绘制标准曲线，计算待检样品的PLGF水平。
实施例5用本发明筛查试剂盒进行筛查
1、实验方法
（1）使用实施例4所述试剂盒，按照实施例4记载的方法检测两例孕妇。
（2）按照常规方法问诊和检测。
2、实验结果
（1）孕妇a的PLGF值为103.560pg/ml；孕妇b的PLGF值为212.992pg/ml。
根据PLGF水平，可以推断，孕妇a为初次妊娠的可能性较大，孕妇b为多次妊娠的可能性较大。
（2）常规问诊和检测：
孕妇a：初次妊娠，无流产史，初潮年龄14岁，经期天数5天，经期周期28天，身高158cm，体重46kg，体重指数18.43，无手术史，无既往史，无过敏史，妊娠方式为自然受孕，单胎，无家族遗传史。
孕妇b：二次妊娠，无流产史，初潮年龄13岁，经期天数6天，经期周期28天，身高160cm，体重50kg，体重指数19.53，无手术史，无既往史，无过敏史，妊娠方式为自然受孕，单胎，无家族遗传史。
本发明方法的筛查结果跟常规问诊结果一致，说明本发明试剂盒可以有效筛查孕妇是否为初次妊娠。
综上，本发明试剂盒可以筛查孕妇是否为初次妊娠，为医生给孕妇制定合理的保胎和生产方案提供了可靠的依据，临床应用前景良好。
Claims (1)
1.检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途；
所述检测孕妇血清PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂；
所述ELISA检测用试剂为ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂；
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物；
所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB；
所述孕妇血清是孕周5周-13+6周的血清。
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