CN101416060A - 用于确定先兆子痫治疗有效性的方法 - Google Patents

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Abstract

用于测定治疗孕妇先兆子痫有效性的方法，所述孕妇处于先兆子痫的风险之中，所述方法包括：(a)测定来自治疗前的妇女的身体物质中胎盘蛋白13(PP13)的第一浓度。(b)测定来自开始治疗后的妇女的身体物质中PP13的第二浓度。(c)比较第一和第二浓度与各自所对应的PP13的正常水平，基于所述比较，确定所述治疗的有效性。还公开了用于实施本方法的诊断试剂盒。

Description

用于确定先兆子痫治疗有效性的方法
发明领域
本发明涉及一种用于定制药物以治疗或预防先兆子痫并监测其有效性的方法。
发明背景
妊娠障碍，称为先兆子痫(PE)是一种妊娠并发症，其出现率占所有孕妇的5-7％，并且是妊娠期间引起母体死亡的第二常见原因(在美国18％的母体死亡率与妊娠相关)。先兆子痫被定义为先前血压正常的妇女在妊娠20周后形成高血压新发作。世界妊娠期高血压大会已经提供了用于诊断先兆子痫的以下定义：在先前尿中有痕量或没有蛋白的妇女中，妊娠20周后形成高血压新发作，相隔4-6小时(在某些情况下相隔4-72小时)的两次测量≥90/140mm Hg(收缩/舒张，至少一次)，并结合在24小时内收集的尿液中对应于300mg/DL的蛋白表观或经检验片测量为2+。严重的先兆子痫被定义为其中高血压达到160/110mm Hg(收缩/舒张，至少一次)，并结合在24小时内检验片中蛋白尿≥3+或>3gr/d1。子痫是一种紧急状态，其中严重的先兆子痫可恶化为危及母亲生命的痉挛、中风和昏迷。为了避免这种紧急状态，妇女通过分娩取出引起这些作用的婴儿和胎盘。HELLP是先兆子痫的一种严重形式，所述HELLP的主要副作用是溶血、升高的肝酶以及降血小板。
尽管先兆子痫的比例在发展中国家更高，但是在美国的人数仍然很高(5-7％)。所有先兆子痫孕妇中的50％通过剖腹产分娩，而与之相对照的是在整个人群中仅有15-18％的孕妇采用剖腹产。从剖腹产分娩中的恢复延长了恢复时间。与阴道分娩比较，剖腹产分娩不仅过程复杂，而且价格昂贵。在妊娠期间经历先兆子痫失调的妇女最终发展为心血管疾病的风险会增加9倍，而且她们的平均寿命明显缩短。
早期先兆子痫是先兆子痫的一种严重形式，其在早期形成，不得不在妊娠37周前分娩(期限前)。严重的和早期发作的先兆子痫主要危害母亲和胎儿。根据NICHD，早期先兆子痫占所有先兆子痫病例的20-25％，这意味着在经历了应激的待产期后，每100名孕妇中有1-2名将受此并发症的影响，而且婴儿会在极早期分娩。由于婴儿的体重低和内部脏器发育不完全，因此分娩出现越早，婴儿的并发症越严重，所述并发症包括失明、运动和认知障碍以及长期的医学残疾。由于先兆子痫过早地出生的婴儿处于后来形成高血压、心血管疾病和糖尿病的增加的风险中。在妊娠34周前(GW)分娩的早期先兆子痫病例是最严重的，是造成大多数死亡率病例的原因，而且如果婴儿在出生后存活，平均需要在新生儿监护病房看护6-8周。根据NICHD，对于这部分婴儿群体，早期检测对于其生命救助能力和防止早熟是十分必需的。仅有的治疗先兆子痫的现行办法是使母亲分娩，但是当这样的分娩过早发生时，由于体重较低、运动和认知功能障碍，出现各种各样的新生儿病损，且更为严重的情况是生产中或产后死亡。已经开展了许多研究用于早期鉴别形成先兆子痫的风险。
早期的风险检测提供了两个主要优点：
1)它通过密切观察妇女使得控制风险成为可能。按照ACOG指南，对处于高风险中的妇女有效地增加观察，且对处于高风险中病例增加的观察明显改善了结果。由于密切观察和使参与的孕妇接受教育及了解项目相结合，显示妊娠管理计划节约了成本。益处包括：与全国平均值1.96％相比，由于早期先兆子痫(<34周)的出生下降，仅占所有分娩的0.6％；与全国基准2.3％相比，早产减少至所有分娩的0.9％；并且与全国平均值2.9％相比，由于先兆子痫的低出生体重为1.3％。密切观察允许孕妇能在分娩前到达三级医疗中心，所述的分娩在社区诊所和乡村基础健康服务部门是一个非常重大的问题。在那里，密切观察确保某些病例延长分娩持续时间，以降低婴儿后果的严重性，所述婴儿正处于分娩过早的风险之中。其它益处是换取了实施治疗和给予药物例如产前皮质类甾醇的时间，所述药物能促进胎儿器官的成熟。
2)早期检测能够确保在一个更长的周期内通过应用各种认定的药剂形成药物干预策略，所述药剂被认为作用于胎盘以防止/减少所述风险。虽然对于治疗来说没有黄金标准，但是大量的候选药物已经显现出希望，包括低剂量阿司匹林，低分子量肝素，抗氧化剂如维生素C和E以及硫酸镁等。在所有的这些研究中，不是所有处于风险中的妇女都能从治疗干预中获益。而在一些病例中有迹象显示干预开始得太晚，在其它病例中没有明显的证据表明是否应用的药物是不正确的或没有在适当的时间或剂量下应用。目前的研究显示，从目前可得的认定的药物治疗目录(以及在适当的进程中将成为可用的药物)中定制每名妇女的药物干预和继续监测治疗的有效性是有必要的。
目前预防先兆子痫的最主要的药物有：
(1)低剂量水杨酸(阿司匹林)，用以提高血流到达母体动脉以补充氧气和养分到达胎盘；(2)抗凝剂，例如发现低分子量肝素有效防止血栓和其在复发的和严重的先兆子痫中出现的并发症；(3)硫酸镁(MgSO4)，迄今为止已经证实其仅对治疗子痫有效。然而，其治疗先兆子痫的有用性仍旧存在争论。尽管如此，在治疗妇女先兆子痫和HELLP(溶血、肝酶升高和低血小板计数)的许多情况下，MgSO4仍处在一线药剂中。(4)抗氧化剂，如维生素C和E显示能减少在高风险妊娠期中先兆子痫的流行。在许多这些治疗中，可出现副作用如脑出血、神经肌肉阻断和复苏困难，并引起母亲和胎儿出现并发症。
胎盘蛋白13(PP13)是15-16,000Mw的蛋白，所述蛋白如美国专利NO.6,548,306(Admon，et al)中所述，可以从人胎盘组织纯化或通过重组技术制备，所述专利的内容以参考方式引入本文。如美国专利NO.5,198,366(Silberman)中所述，纯化的PP13用来开发某些用于妊娠相关障碍检测的测定，例如子宫内生长限制(IUGR)、先兆子痫和早产，所述专利的内容以参考方式引入本文。通过使用标记的PP13和抗PP13多克隆抗血清，进行放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
PP13的氨基酸组成和序列分析揭示其与半乳凝集素(galectin)家族具有最高度的同源性，所述半乳糖凝集素家族为一组与糖残基具有高度亲和性的蛋白，所述糖残基在连接细胞和胞外基质中(和在分化中)的作用格外重要(Than，N.G，等人(1999))Placenta20：703-710；Than，等人，(2004)Eur.Biochem.271(6)：1065-1078)。实际上，通过免疫组织化学发现，PP13在胎盘形成中很重要。
美国专利NO.6,790,625公开了在妊娠早期阶段，PP13的单克隆抗体和固相免疫试验能测定母体血清PP13，所述专利的内容以参考方式引入本文。
WO 04/021012公开了一种基于许多因素、包括PP13水平的妊娠并发症诊断方法，所述专利的内容以参考方式引入本文。
发明概述
本发明目的在于提供一种简单的体外测定，其将允许主治医生能监测给予孕妇的认定的抗先兆子痫药物的有效性，所述孕妇正处于先兆子痫的高风险之中或正在遭受先兆子痫。
本发明的另一个目的在于应用体外或离体系统，从认定的抗先兆子痫的药物治疗目录中定制用于预防或治疗先兆子痫的药物干预。
在本发明的第一个方面，提供了用于测定治疗孕妇先兆子痫有效性的方法，所述孕妇处于先兆子痫的风险之中，包括：
(a)测定得自治疗前所述妇女身体物质中胎盘蛋白13(PP13)的第一浓度；
(b)测定得自开始治疗后所述妇女身体物质中的PP13的第二浓度；并且
(c)比较所述第一和第二浓度与对应的PP13正常水平，并在所述比较的基础之上，确定治疗的有效性。
有时可参考本发明这方面作为直接方法。
任选地，可持续本发明的方法直到分娩以跟踪所述治疗的有效性。
在本发明说明书中，除非另有特别说明，术语“先兆子痫”(PE)包括所有类型的疾病，包括有轻、重、早发作、晚发作、由子宫内生长限制(IUGR)并发的先兆子痫和HELLP。
术语“先兆子痫的治疗”包括所有类型用于预防先兆子痫、降低其严重性或治疗性处理先兆子痫(例如氧过多，特别是使用药物和食品添加剂的治疗)的药物治疗。用于治疗先兆子痫药物的非限制性实施例包括抗血小板剂如低剂量阿司匹林、抗凝剂如肝素类包括低分子量肝素，抗氧化剂如维生素C和E，硫酸镁以及新的采用生长因子如血管上皮生长因子(VEGF)、用CO处理等试验性治疗。
术语“确定治疗的有效性”可以包括比较一种类型和另一种类型治疗的有效性，比较不同条件下(氧气水平、温度等)同样类型的治疗以及监测某一特定治疗随时间的有效性。
术语“所述妇女身体物质”包括体液(血清、羊水、尿液、唾液)和胎盘组织，所述胎盘组织通过绒毛膜绒毛采样(CVS)、羊膜穿刺术、胎盘活组织检查获得或应用标准化的胎盘绒毛。
术语“PP13的正常水平”指的是来源于正常、健康孕妇的身体物质，所述孕妇没有形成先兆子痫或没有处于形成先兆子痫的风险之中。有时也指由分娩后获得的胎盘外植体释放或由培养的胎盘细胞释放的PP13水平，所述胎盘细胞来自羊膜穿刺术或由来自正常、健康的孕妇绒毛膜绒毛取样后分离的胎盘绒毛，所述孕妇没有形成先兆子痫或没有处在形成先兆子痫的风险之中。
PP13的水平可以作为时间(妊娠周数)的函数、作为所述妇女的遗传和物理特征的函数以及作为测定的身体物质的一致性的函数而变化，所述遗传和物理特征包括身体质量指数、孕妇年龄、种族和产次。因此，当比较来源于患者的PP13测定值和PP13的正常水平时，应该考虑这些参数。有时，将对测定的PP13值标准化使得它能与相对应的PP13的正常水平进行比较。
处于高风险中的妇女是否形成先兆子痫可由以下因素确定：1)风险因素(例如在以前妊娠中的先兆子痫或家族史)；2)血流到达母体子宫动脉受损，由多普勒超声波测定的较高的搏动指数来评价；3)各种血清标记物水平异常，如在前述专利和专利申请中公开的孕妇体液中的PP13。
在一个实施方案中，PP13的第一浓度选自下组：(a)用于多个处于类似先兆子痫风险中的未经治疗的孕妇身体物质的中值PP13浓度的预定范围；或(b)接受所述治疗前该孕妇身体物质的测定的PP13浓度。
根据本发明的方法，对身体物质中PP13变化的检测可用于确定与其初始风险比较，该妇女的风险是否是持续的、是减少的或是增加的，并且与在各自妊娠周的多个正常和处于高风险中的妇女的身体物质中PP13的典型值进行比较。将所述妇女形成先兆子痫的风险的继续重新定义作为一种评价认定的药物疗法有效性的手段，以减少/消除形成先兆子痫的风险。
在本发明的一个实施方案中，在第一浓度和第二浓度的单次测定中进行比较。在另一个具体实施方案中，在第一斜率和第二斜率之间比较，所述第一斜率是由所述妇女妊娠期间两个或更多个连续时间点测定的多个所述第一浓度计算得到的，且所述第二斜率是由所述妇女妊娠期间两个或更多个连续时间点测定的多个所述第二浓度计算得到的。在优选的实施方案中，所述的多个浓度在2-3周的期间内测定。在进一步的实施方案中，多个的每一个浓度与相应的多个的PP13正常水平进行比较。
本发明的一个实施方案涉及胎盘组织。在体内给予治疗后，在组织培养基中培养1-7天的组织中进行测定。本发明的另一个实施方案涉及将组织暴露在认定的药物下，并选择最有效的一个药物。尽管这使妇女免于不必要的药物暴露，但她却暴露在干预过程的风险之中。因此，在本发明方法中应用胎盘组织通常仅适用于那些无论如何都要进行胎盘组织介入取样的妇女。有时候，也可以向有先兆子痫反复发作史以及被认为处于非常高先兆子痫风险之中的妇女提供此方法。
因此，本发明也包括用于确定两种或更多种不同先兆子痫治疗的相对有效性的方法，所述方法包括：
(a)测定得自治疗前所述妇女胎盘组织外植体中PP13的第一浓度；
(b)使外植体与第一种治疗接触；
(c)测定所述治疗后的外植体中PP13的第二浓度；
(d)比较所述第一和第二浓度与对应的PP13正常水平，且在所述比较的基础之上，确定所述第一种治疗的有效性；
(e)用一种或多种另外治疗重复步骤(a)到(d)；并且
(f)比较两种或更多种不同治疗的相对有效性。
在一个实施方案中，在步骤(d)中确定治疗的有效性，如下：
(a)如果第一和第二浓度之间没有显著性差异，所述治疗是无效的；
(b)如果第二浓度与所述PP13正常水平之间的差异明显低于第一浓度与所述正常水平之间的差异，治疗是有效的；
(c)如果第二浓度与所述PP13正常水平之间的差异明显高于第一浓度与所述正常水平之间的差异，所述治疗是有害的。
在一个优选的实施方案中，在胎盘外植体与所述治疗接触后1-4天内测定所述的第二浓度。
本发明的第二方面涉及一种方法，所述方法用于确定两种或更多种不同治疗相对有效性的方法，所述治疗用于处在先兆子痫风险之中的孕妇的先兆子痫，包括：
(a)提供多个标准化的胎盘组织外植体，其用于PP13释放以应答不同的先兆子痫治疗；
(b)使妇女身体物质与第一胎盘组织外植体接触；
(c)使所述外植体与第一种治疗接触，并且在所述第一种治疗之后测定所述外植体的PP13浓度；
(d)用单一或更多种另外的外植体和治疗重复步骤(b)和(c)；并且
(e)测定在所述治疗后PP13的浓度与相应的PP13正常水平的差异，引起最小差异的治疗是最有效的。
有时可参考本发明这方面作为间接方法。
根据本发明这方面内容，可应用胎盘组织外植体评价不同孕妇的身体物质对药物作用于标准组织外植体所产生效果的取代/加强/阻断作用，所述胎盘组织外植体已经就它们在各种药物存在下的应答标准化。在一个优选的实施方案中，标准化胎盘外植体在使用前是冷藏的。
本发明这方面也包括用于实施本发明方法的诊断试剂盒，包括(a)一套抗先兆子痫的药物；和(b)一套标准化胎盘外植体。在一个实施方案中，试剂盒进一步包括计算机软件，所述计算机软件提供计算模型用以基于所测定的PP13值确定所述药物的有效性。本发明还包括试剂盒以测定被调节用于本发明方法的PP13。
如图1所述，在各种认定的抗先兆子痫药物存在下，胎盘外植体(标准的外植体或来源于妇女的外植体)，可以在条件培养基上生长48小时或更长时间。根据本发明的第一方面，就妇女的自身组织而言，比较在有/无药物情况下条件培养基上PP13的释放。根据本发明的第二方面，就其它来源的标准化组织而言，所述组织是成比例的：一部分用于在妇女身体物质不存在的情况下测定药物的影响，而另一部分在妇女身体物质存在的情况下测定。在妇女处于先兆子痫的风险之中的情况下，与没有暴露在患者身体物质下的外植体相比较，她的身体物质影响PP13释放。鉴于包括在所述患者身体物质内的分子，该比较使人们能评价药物治疗的价值。在所有的病例中，收集培养上清液、离心和测定例如体外ELISA测定，以确定从外植体中释放到培养基中PP13的水平。应用释放的PP13水平评价所述药物的影响，所述释放的PP13水平被调节至蛋白水平或组织重量以及培养存活力，并且与对照和标准条件进行比较。
比较分析PP13释放使人们能够鉴别哪种药物治疗能使PP13的释放恢复至其正常水平，正如未受影响的患者的水平，并且这种作用被认为是一种所述治疗性药物作用的指征。基于上文所述，从多个现存方案的药物/药物组合的各种候选物中选择一个是有可能的，所述现存方案将极有可能是有效的。
根据现有发明，在整个妊娠期跟踪确定处于风险之中的妇女，并且评价她的风险以验证不同的治疗如何影响她的风险。在本发明中，使用来自身体物质的PP13评价妇女的风险。因此，分析不是以多个病例和对照为基础，而是根据个体以及她们的特定应答而调节。通过这种方式，评价治疗益处/作用以及对于个体进行她们之间的区分是可能的，从而将试验和误差过程最小化。
根据三个主要妊娠期，所述术语“PP13异常水平”可被定义为与孕龄有关：
(a)妊娠6-13周：高风险与PP13值低相关(PP13处于较低人群的四分位数，或在一个实施方案中所述PP13中值的倍数(MoM)低于约0.45)
(b)妊娠14-25周：与前一个周期的值或与处于正常风险组的孕妇的值相比，PP13值急剧上升。在一个实施方案中，PP13值增加的平均斜率为7。
(c)妊娠26周-分娩：PP13值高于正常(在一个实施方案中，与来源于多个正常孕妇的计算值相比，具有>1.5MoM的最高和较高的四分位数)。
因此，相对于其使各妊娠期的PP13水平恢复到正常水平的能力确定药物益处。于是，在妊娠前期，根据药物提高PP13水平/释放到正常(更高)水平的能力确定药物的益处。在妊娠中期，通过药物降低PP13释放从高(例如7)至正常(例如<3)的斜率变化的陡峭能力进行评价。在妊娠后期，根据使PP13水平降低到正常的能力判断所述益处。
在下列实施例中将说明检测PP13如何有益于评价形成先兆子痫的增加的风险以及人们如何使用PP13风险评价工具来鉴别有益药物或定制药物干预。
附图说明
为了理解本发明和了解本发明在实践中如何实施，现在将仅通过非限制实施例，参考相关附图描述某些实施方案，其中：
图1显示，从绒毛膜绒毛或胎盘合胞体滋养层的顶端膜获得胎盘外植体的步骤。从左至右，显示外植体处于转移(6小时)和培养后36小时。培养物在条件培养基上生长。培养48小时后，收集、离心上清液，用PBS稀释沉淀，通过夹层ELISA并使用PP13标准检查PP13浓度以校正应答OD至PP13浓度。根据所有点的线性回归和外植体的蛋白水平，标化PP13水平至孕龄。
图2是说明PP13(pg/ml)水平随时间变化的纵向评价曲线图，所述PP13水平每2-4周由52名到期分娩正常婴儿的妇女和5名到期左右形成严重先兆子痫的妇女的血液样本测定。通过垂直线表明分娩时间。每条曲线代表多个正常和患病妇女的PP13预期血清水平。
图3是棒图，其显示将250名正常妇女的妊娠前期PP13水平分到四个四分位数，且随后指定50名处于先兆子痫高风险中的妇女到不同的四分位数。根据这种方法，来自较低四分位数的妇女向较高的四分位数的移动是所述药物益处的指征。
图4是棒图，其显示在三个妊娠期妇女的PP13值，包括1179名正常孕妇、20名处于先兆子痫高风险中的妇女、40名接受维生素E给药的正常妇女以及19名接受维生素E给药治疗的处于风险之中的妇女。
图5是棒图，其显示假阳性结果的比率(例如基于PP13检测结果表明妇女将形成先兆子痫，但是实际没有形成的病例)，所述比率基于在妊娠前期期间PP13血清水平的测定(PP13MoM)，基于妊娠中期两个时间点之间斜率的评价(PP13斜率)，基于所述的两次测定的组合(结合的)，以及基于具有低妊娠前期值的妇女中测定的组合(偶然的)；
图6显示在有或没有维生素C和镁治疗的情况下，PP13从得自具有正常妊娠或处于先兆子痫的风险之中的妇女的培养基滋养层中随时间(天)的释放。
图7-11是棒图，其显示PP13水平(pg/ml)的中值结果±95％的置信区间，所述PP13水平用不同的抗先兆子痫方法(如20％氧气-氧过多)和得自处于风险中妇女的标化胎盘外植体中的药物获得(12名处于形成先兆子痫的风险[灰柱]和3名处于形成HELLP风险之中的妇女[点状柱])以及16名正常对照妇女[空白柱]*＝p<0.01；**＝p<0.001。每名妇女的组织分为16个不同部分，每一个部分暴露于不同条件下，并培养48小时；
图7显示6％和20％氧气对PP13释放的作用；
图8显示6％和20％氧气以及0.7和1.4mM Mg对PP13释放的作用；
图9显示6％(图9A)和20％氧气(图9B)，0.7和1.4mM Mg以及维生素C和E对PP13释放的作用。M-带有0.7mM Mg的条件培养基；MC-M+维生素C；ME-M+维生素E；MM-带有1.4mM Mg的条件培养基；MMC-MM+维生素C；MME-MM+维生素E；最佳候选用箭头表示。
图10显示6％(图10A)和20％氧气(图10B)，0.7mM Mg以及抗凝剂肝素和抑酶肽对PP13释放的作用。M-条件培养基；MH-M+肝素；MA-M+抑酶肽；MM-带有0.7mM Mg的条件培养基；MMH-MM+肝素；MMA-MM+抑酶肽；最佳候选用箭头表示。
图11显示进一步的结果，使用条件如图10，图11A-6％氧气±0.7mMMgCl2；图11B-6％氧气±1.4mM MgCl2；图11C-20％氧气±0.7mM MgCl2；图11D-20％氧气±1.4mM MgCl2；M-带有0.7mM Mg条件培养基；MH-M+肝素；MA-M+抑酶肽；MHA-M+肝素+抑酶肽；MM-带有1.4mM Mg的条件培养基。
例举的实施方式的详细说明
方法
除非另有说明，在所有的试验中，通过固相夹层ELISA分析在母体静脉血清中测定PP13(不知道妊娠结果)。根据标准曲线，校正PP13水平，所述标准曲线由重组PP13的校准标准物制备。浓度以pgPP13/ml血清表示。
各种临床研究由医疗中心的内部伦理审查委员会批准，所有参加本研究的妇女都提供了知情同意书，允许少量采集她们的体液以用于测定PP13的水平。患者们不是随机进行任何治疗，治疗决定是基于医院内医疗保健标准的作为最适合每个个体患者的治疗决定。所有其它细节在每一个实施例中单独描述。
实施例
通过PP13评价先兆子痫的风险和评价先兆子痫风险的增加/减少的方法
在临床症状出现很久以前，在评价先兆子痫风险的上下文中，基于PP13测试，可以采用根据本发明的方法测定风险：
(1)通过夹层ELISA用PP13标准物以及一对已知的特异单克隆抗体测定妇女PP13水平，获得以pg/ml表示的数据，而且将该水平与正常中值±95％的置信区间水平进行比较。然后在最佳的敏感性/特异性的平衡处(trade-off)建立截止值(cut off)以确定鉴别妇女处于增加的风险中所需的PP13血清水平。来自预期正常中值妇女的值的明显差异确立了风险。
(2)在根据方法(1)测定PP13后，计算正常的多个中值的倍数(MoM)。通过这种方法建立了正常PP13的中值MoM。将其标准化为正常PP13值的妊娠周(GW)参考中值，并进一步线性调节为母体重量或婴儿体重指数(BMI)。
(3)在实验室内或实验室间使原始PP13值标准化，通过回归在整个妊娠周内每一个妊娠周至少40个原始PP13值的原始值确定用于每一个妊娠周正常结果的参考中值，并从回归线提取参考妊娠周特异性中值。然后如下计算MoM：
Figure A200780008753D00161
 其中：i＝妊娠周数 且 j＝样本
然后以BMI对MoMs进行回归，所述BMI分为BMI四分位数的4个值，并相应地调整，由此标化PP13结果。采用这个步骤使得实验室间能进行合并/比较数据。
(4)正常多个PP13 MoM值定义为1.0。在妊娠前期，MoM＝0.45提供了一个截止值，在该截止值下患者形成先兆子痫的可能性与>80％敏感性和>85％特异性的正常人群相比至少高出4倍。通过理由或受试者工作特征曲线(ROC)定义准确性，所述曲线在曲线下面积(AUC)0.5时不提供预测，曲线下面积>0.75且95％置信区间(CI)为[0.65-0.85]时提供相当的预测，而当曲线下面积>0.8且95％置信区间(CI)为[0.7-0.9]时提供p<0.05或更高的非常好的预测。认为MoM低于0.45的妇女处于增加的风险之中。
在表1中，举例说明MoM的应用。在妊娠前期，在5-10或11-15妊娠周内，那些具有形成先兆子痫风险增加的妇女的PP13MoM分别为0.14和0.17，均以p<0.001显著低于正常值。
在妊娠周16-20和21-25的第二时期，各自的MoMs分别从早期非常低的值增加到0.59和1.08，且相应的P值分别为p<0.05和p<0.39。以上实施例显示了在妊娠前期所述MoM方法的益处，并且如下面(5)中详细所述，在随后的时期基于PP13随时间的变化转换为另一种方法的必要性。
(5)测定相隔几周实施PP13的两次测定的PP13的斜率随时间变化，并且计算PP13斜率＝(PP13GW2-PP13GW1)/(GW2-GW1)，其中1和2分别代表早期和晚期时间点的GW，在两个时间点之间测定斜率。比较多个正常孕妇的斜率提供了额外的风险参数，所述正常孕妇与处于先兆子痫高风险妇女相比较斜率更低。然后，建立截止值用于鉴别在最佳的敏感性/特异性平衡下处于风险增加之中的妇女所需的PP13斜率。
(6)评价妇女似然比(LR)以形成基于模型的病变。在这种方法中，模型涉及考虑到相对于正常结果可能性的所述PP13水平，就妇女形成先兆子痫的可能性评估LR。MoM值的检验显示PP13的分布不适合高斯分布，或者不能转化或经过log转化后不适合高斯分布。因此，为了模拟LRs进行了对数回归，假设PP13水平决定所述风险。对数回归提供了先兆子痫的比值比(odds ratio)。然后，可以进行计算：LRRP13＝ORPP13/P
P是孕妇人群中先兆子痫的百分比。
对于以上任何方法来说，数据应拟合为统计学模型以绘制受试者操作特征曲线(ROC)，从而评价所述测定的截止值，所述截止值用于建立敏感性和特异性以在(先兆子痫的)病例和对照之间加以区分。发现MoM、斜率和LR的使用独立于所检查的人群和进行试验的实验室，而PP13浓度根据上述因素变化。因此，应用后三者测定提供了独立的人群标准，而所述准确的浓度(pg/ml)可能在人群和实验室之间发生变化。
纵向监测
图2描述了正常和先兆子痫孕妇血清中PP13随时间变化的纵向监测结果。相应地，人们可以鉴别几个参数以区分正常未受影响的妇女和患有先兆子痫妇女。对于监测药物有效性来说，有效的药物可以降低在正常人群和高风险患者之间的差异。表1显示了图2的数据，所述数据在获得MoM值后得到。在每个相应的试验周期，进行统计学分析以比较正常和先兆子痫PP13 MoM值。结果表明在妊娠前期和妊娠后期，而不是妊娠中期，在先兆子痫和正常孕妇之间，MoM PP13值有显著性差异(在妊娠前期先兆子痫很少，且在妊娠后期先兆子痫很多，而在妊娠中期恢复正常)。而且，所述表格显示与安慰剂比较，用抗凝剂治疗如何能改善未经治疗而处于风险中妇女的MoM(但不是对照的)。
表1：整个妊娠期的PP13MoM
(*-P<0.05，**P<0.001)
Figure A200780008753D00191
1)妊娠前期
在妊娠前期，可以将PP13作为一个测定标准用于评价以后形成先兆子痫的风险。根据图2和表1，在妊娠前期，大多数将形成先兆子痫的妇女的PP13水平很低，而大多数具有正常结果的妇女的PP13水平较高。在总结在表2和图3的一项试验中，在妊娠第8周，从50个继续形成先兆子痫的病例和290个具有正常结果病例中测定PP13水平。采用妊娠期-特异中值倍数(MoM)的方法，在MoM截止值为0.45时，假阳性率为10％且敏感性为87％。这意味着50例先兆子痫的病例中的43例和290例正常中的29例被鉴定处于高风险中。因此，在总人群中PP13的风险为5％，而在PP13低于0.45的组中，先兆子痫的发生频率是59％(为没有测定的人数中发生频率的10倍以上)。
基于指定的0.45的MoM截止值，通过受试者操作特征(ROC)分析计算敏感性和特异性。在表2中对于10％的假阳性率以百分比的形式提供敏感性值。通过两种计算方法，确定形成病变的比值比：
1)建模，在考虑在人群中病变流行之后，如上面已经描述的计算比值比，和
2)四分位数评价程序，基于比较最低四分位数(25％)和第3四分位数(百分之七十五)的PP13对形成先兆子痫的比值比进行计算。
在表2中提供了这两种方法计算的结果，并且在图3提供了四分位数方法的说明。根据图3，跟踪在妊娠第8周已经进行测试的妇女直到分娩。290名正常分娩。把她们分成四组使得能鉴别PP13的4个四分位数和它们在每个四分位数相对应的PP13浓度，所述相应的PP13浓度分别是0-75pg/ml，76-139pg/ml，140-229pg/ml和229pg/ml以上。然后，根据她们的PP13值，分配先兆子痫的病例到4个四分位数。图3显示，在所有继续形成先兆子痫的妇女中的86％处于较低的四分位数，8％处于第2四分位数，4％处于第3四分位数，而2％处于第4四分位数。
实施例1：评价通过低剂量阿司匹林治疗的有效性
如果在上述指定的周期应用药物治疗，期望相应于妇女降低的形成先兆子痫的可能性，使她的PP13水平恢复到第2和第3甚至第4四分位数。在表2中所描述的实施例中，具有形成先兆子痫风险增加的妇女从妊娠第8周开始进行阿司匹林100mg/kg(低剂量阿司匹林)口服治疗2周或3周。其表明足够早期给予阿司匹林能减少随后形成先兆子痫的风险。因此，接受治疗的妇女期望能降低形成先兆子痫的风险，并且改善她们的结果。
如表2中所示，在试验中，在第8周150名妇女经测试认为处于高风险，50名未经治疗，50名经阿司匹林治疗两周和50名经阿司匹林治疗三周。结果显示，在未经治疗组，大多数妇女仍在低PP13四分位数。在接受治疗2或3周后的小组，与第1四分位数相比，在第2和第3四分位数的患者数量明显增加。因此，她们的预期风险计算值降低。与未经治疗组相比，分娩结果符合风险评价，其中先兆子痫病例的数目在治疗组中明显降低。
相应地，从第1到第2和第3四分位数的频率变化可以作为一种措施用于评价形成先兆子痫风险的降低和治疗的有效性。
表2：分配到PP13四分位数患者
 
参数 未治疗 14天阿司匹林 21天阿司匹林
敏感性(％) 87％(80-94) 40(26-56) 30(14-46)
第1四分位数的频率 43/50 20/50 14/50
第2四分位数的频率 4/50 24/45 30/50
第3四分位数的频率 2/50 5/50 5/50
比值比(通过建模) 77.6 5.9 3.3.
比值比(通过四分位数) 73.7 5.6 3.2
结果 全部50名先兆子痫 24名先兆子痫26名正常 18名先兆子痫33名正常
当特异性固定为90％时(95％CI：86％-93％)，相应于29/292的假阳性病例(10％)，敏感性的百分比值如上所示。
实施例2：评价通过抗凝药物治疗的有效性
认为处于风险增加之中的妇女从妊娠第8周每日给予抗凝剂治疗(低分子量肝素，抑酶肽或其它)，持续2周。发现她们的PP13 MoM分别增加到0.48(妊娠周11-15)(P<0.05)和0.73(妊娠周16-20)，而后者实际上与正常水平难以区别(1±0.29，中值正常MoM±95％置信区间)。正常风险妇女的PP13 MoM不受影响。治疗妇女相应的结果是：在整个周期，没有接受治疗组，所有5名具有风险增加的妇女形成严重先兆子痫，而在治疗组仅一名形成严重先兆子痫，一名轻度先兆子痫和一名未受影响。
实施例3：用胎盘提取物评价药物益处
评价药物益处的一种备用方法是通过使用胎盘绒毛(细胞或外植体)，所述胎盘绒毛通过绒毛膜绒毛取样获自妊娠9-10周的妇女。胎盘细胞/外植体培养48小时，并通过ELISA(以如图1描述同样的方式)在培养基中测定PP13。结果如下表3所示。
表3显示先兆子痫的3个病例(病例#3，4，5)，在6％的氧气(含氧量正常的)的情况下，与正常妇女(病例#1和2)的14,100和15,700相比较，释放量明显减少(3,010，3,500和6,300)。在与抗氧化剂维生素C(其已经显示出在治疗高风险妇女中的希望)培养48小时后，在全部3名高风险妇女中，PP13释放水平恢复几乎至正常水平，分别达到12,030，9,230和15,790(即高3-4倍)。在20％氧气(氧过多)情况下，由于氧气自身(与6％氧气相比3,010，3,500和6,300pg/ml，大约2倍)而没有维生素C额外的作用，PP13释放分别增加到5,000，4,300和7,900。
正如所见，不是对所有用这种方式治疗的个体妇女均显示同样的效果，其表明可进一步利用本发明方法的潜力，以考虑中止治疗、增加药物水平或针对个体患者选择不同的治疗。尽管应用胎盘提取物评价先兆子痫风险使妇女免于接受不必要的药物，但是她却暴露于风险干预过程。因此，这仅适用于那些无论如何都要经历胎盘组织介入取样的妇女。
表3：从妊娠9-10周培养的绒毛膜绒毛的PP13释放
 
病例# 风险 氧气(％) 维生素C PP13(pg/ml) 妊娠结果
1 正常 6 无 14,100 正常
有 14,300
20 无 14,250
有 14,990
2 正常 6 无 15,790 正常
有 15,390
20 无 15,500
有 15,300
3 高风险 6 无 3,010 先兆子痫
有 12,030
20 无 5,000
有 5,100
4 高风险 6 无 3,500 先兆子痫
有 9,230
20 无 4,300
有 4,421
5 高风险 6 无 6,300 先兆子痫
有 15,760
20 无 7,900
有 8,100
2)妊娠前期到妊娠中期的斜率
实施例4：通过妊娠前期-妊娠中期斜率评价药物益处
如图2所述，在妊娠前期到妊娠中期期间，在正常妇女中PP13水平仅适度改变。可以通过以下公式计算斜率：
Slope＝(PP13(妊娠中期))-PP13(妊娠前期)/GW(妊娠中期)-GW(妊娠前期)
正常vs先兆子痫斜率如图4所示，在正常和先兆子痫之间的截止值达到80％敏感性时斜率为3.5。该斜率有助于进一步检验先兆子痫的风险。如图4所示，在6-10周先兆子痫的病例中，PP13水平比正常病例PP13水平低，早期应用维生素E使PP13释放加倍，趋向于正常水平，而不影响正常患者的PP13释放。在16-20周，证明维生素E没有明显作用。在24-28周，当先兆子痫妇女PP13释放高于正常妇女时，维生素E减少PP13释放恢复到正常水平。
图5显示，如何通过使用妊娠前期中PP13MoM水平和妊娠前期到妊娠中期的斜率的结合分析减少固定预测敏感性的假阳性水平。本图表明妊娠前期的MoM和斜率给每一个15％的假阳性率提供了80％的敏感性。结合考虑两个参数，即妊娠前期的MoM和妊娠前期到妊娠中期的斜率，通过结合分析使假阳性率减少到6％而不损失敏感性。在一个偶然方法中(随机性)，仅对妊娠前期MoM值低的妇女再次进行检测，结合分析显示对于同样的敏感性，假阳性率是8％。因此，似乎对于在第一次试验中被认为处于风险中的妇女，妊娠中期的测定是必需的。
如果通过两次测试建立风险后，处于高风险中的该妇女每天通过给予抗氧化剂维生素E接受治疗给药，且所治疗的妇女具有更低的斜率(图4)。从相对大的置信水平，人们能了解不是所有妇女以同样方式受到影响。因此，进一步应用本方法使人们能了解通过药物如何降低斜率以及其与降低形成病变的风险的关联，从而考虑到中断治疗、增加药物水平或针对个体患者选择不同的治疗。结合方法和随机方法表明，仅对于处于风险中的妇女来说，多次测试是必要的，而低风险患者可以避免重复测试。
实施例5：通过滋养层评价药物益处
通过查看得自羊水的滋养层来监测受试者。例如，滋养层可在培养条件下生长2周，所述培养条件带有或不带有1.4mM MgCl2和维生素C的组合。与得自正常妇女(其PP13释放实际上保持不变)的胚胎滋养层相比，来自形成先兆子痫妇女的培养物中的滋养层显示了逐日增加的PP13释放(表明增加的形成先兆子痫风险)(图6)。与未处理的滋养层相比，与Mg和维生素C培养的滋养层对正常培养物没有影响，但却防止了增加的PP13释放，其表明了确定治疗个体病例有效性/无效性的一种方法。再一次地，预期一些病例将没有应答，因此可以通过继续、中止或用其它不同药物替代，采用所述步骤定制治疗。
3)妊娠后期
实施例6：评价氧气的益处
通过胎盘(绒毛)外植体获得下列结果，所述胎盘外植体来源于16例正常妇女，12例先兆子痫以及3例HELLP妇女，其在6％或20％O2下在DMEM/F12中培养48小时。培养结束后，收集条件培养基，测定总蛋白和PP13。PP13释放与总蛋白有关。
由图7可见，在高氧水平(20％)下的培养物中，氧气对来自正常妇女胎盘提取物的PP13释放没有影响，但是明显降低来自先兆子痫妇女的胎盘提取物的PP13释放，甚至在来自HELLP病例的胎盘提取物中更是这样，其表明氧气对胎盘组织有害。
实施例7：通过氧气和Mg组合评价益处
除两个氧气水平之外，使用镁的两个不同水平，即0.7mM和1.4mM对在实施例6中检测的外植体再次进行测定。
由图8可见，在高氧气(20％)和MgCl2(1.4mM)水平下的培养物中，来自正常孕妇的外植体没有受到影响，但是在20％而不是6％氧气的条件下，镁使得先兆子痫外植体恢复到正常水平。通过20％O2使HELLP病例中PP13释放水平降低到正常水平以下。
实施例8：通过氧气、Mg和维生素C和E的组合评价益处
加入维生素C和E，重复在上述实施例6和7中所描述的试验。由图9可见，在6％氧气条件下，特别是在提高镁的条件下，维生素的加入有助于将PP13恢复到正常水平。注意后者的组合也影响HELLP病例。
实施例9：通过氧气、Mg和抗凝素(anticoagulent)组合评价益处加入各种抗凝素，重复上述实施例6和7中描述的试验。由图10可见，加入抗凝素、特别是如果它们与镁组合是有益的。
实施例10：通过氧气、Mg和抗凝剂组合评价益处
在本实施例中，在先前的实施例的所述条件下，在体外测试肝素和抑酶肽对来自正常、先兆子痫和HELLP胎盘的绒毛外植体的PP13释放的影响。结果在图11A-11D中显示。
在图11A中，在正常条件(含氧量正常(6％)和正常Mg(0.7mM))下培养外植体。来源于先兆子痫和HELLP患者外植体的PP13释放明显高于来源于正常对照的PP13释放。在图11B中，在含氧量正常和提高的Mg(1.4mM)情况下导致HELLP患者的PP13释放增加。在图11C中，在(氧过多(20％)和正常Mg)条件下，与含氧量正常相比，来自先兆子痫的外植体中PP13释放明显减少，而对照组保持同样水平。注意到从HELLP患者的PP13释放几乎完全停止。增加镁(图11D)致使HELLP患者的PP13释放增加。
关于抗凝剂，在含氧量正常和高Mg(图11B)条件下，抑酶肽使来源于HELLP患者外植体的PP13释放几乎恢复到正常。在氧过多和正常Mg(图11C)条件下，肝素使PP13几乎恢复到正常。
因此，本发明的方法可用于预测哪一种治疗组合将在克服形成先兆子痫的风险方面是最有效的。
非常重要的是注意到，在上述所有描述的实施例中，并不是以与先兆子痫同样的方式对先兆子痫的严重亚型-HELLP产生影响。因此，通过使用外植体系统体外测试作用，所述外植体系统可以有助于选择适当的治疗，以及针对个体妇女和疾病评价适当的治疗。由于可以通过冷藏储存外植体，有可能使它们标准化而用于进一步评价和定制药物干预。
实施例11：通过给予VEGF评价益处
发现sflt1，血管EGF(VEGF)受体的一种可溶形式，在妊娠后期的妇女血清中具有较高水平，所述妇女在5星期后持续形成先兆子痫。该分子与天然血细胞受体竞争激素VEGF。试验模型已经显示，给予VEGF能防止/减少先兆子痫的严重性。体外跟踪治疗益处的一种途径是检测PP13水平，如果降低至正常水平，其可以用来评价治疗的益处。
4)纵向监测
实施例12
下列是预见性实施例，其描述了在整个妊娠期如何使用本发明方法跟踪妇女先兆子痫风险。
对于多个未受影响(正常)妇女来说，定义PP13水平的MoM为1。如果在第10周(妊娠前期)测试母体血清，并且如在各自妊娠周的统计学的多个孕妇所限定的，妇女的PP13水平对应为0.11MoM，则确定该妇女处于高先兆子痫的风险之中。PP13 MoM＝0.45是80％特异性和85％敏感性的截止值。从这个模型，发现她的似然比(LR)高于正常(5％)9倍，或处于45％的风险之中。如果在两周的治疗后，MoM没有越过截止值-她仍然处在高风险之中。
然后，在4周后(已经妊娠中期，妊娠期＝16周)再次检测她的PP13。她的MoM现在是1.24，在两点之间计算的斜率是7，而斜率截止值是3.0。因此，认定这名妇女处于持续的高风险之中。从这个模型，计算她的LR是高于正常(风险＝42％)8.4倍。因此，她的平均风险是43.5％。现在评价用抗氧化剂的另一项治疗，她的MoM恢复到1.0，表明现在她的风险已经降低。从这个模型来看，她的LR＝2(对应10％风险)。
然后，在第30周(妊娠后期)第三次对她进行检测，发现她的MoM是1.5，而那一周的高风险截止值是1.4MoM。相应地，她的LR＝8.5倍于正常，且她的风险仍然是42.5％。现在，通过抗氧化剂再次对她治疗，并在34周再次检测。然后，发现她的MoM下降到1.2(低于截止值)。她的LR＝2，风险是10％。现在继续治疗，且她到期分娩且血压为85/135和蛋白尿1+(不认为属于先兆子痫)。
实施例13.外植体标准化以测定各种药物的作用(预测性实施例)
通过妊娠前期标记物如PP13或PP13结合多普勒仪，鉴定妇女处于先兆子痫的高风险之中-外植体如何有助于对她定制预防性治疗？
方案1：通过不同药物简单直接定制
●我们已经对用于妊娠前期外植体或来自分娩之后的外植体的培养条件进行标准化。
●外植体可以是由分娩后的患者制成或来自妊娠10-12周通过绒毛膜绒毛取样(CVS)获得的那些样本，或如病例那样的其它胎盘活组织检查。
●标准化指限定的中值存活力指数，外植体中蛋白含量，释放到培养基中的总蛋白，在外植体中PP13含量和从PP13外植体的释放等。
●体外药物作用是从24小时后到7天，应用于培养基的药物对来自胎盘外植体的PP13释放的作用。所述作用与在不加药物情况下所测得的基线释放比较。
●因此，治疗指数是当应用到外植体时，所述药物的体外相对有效性，如上所述，在使存活力，蛋白含量等标准化后，通过带有(PP13D1)和不带有(PP130)药物的PP13释放之间的差异，通过下列方程所测定的：(PP130-PP13D1)/PP130，假设所有其它参数是相同的。
●重要的是注意到，在妊娠前期(妊娠6-13周)，患病的患者中的PP13低于正常人。因此，治疗指数是恢复PP13释放，计算为提高PP13释放的药物。在妊娠后期(妊娠26周和以上)，先兆子痫患者中的PP13高于正常人，于是，治疗指数是降低PP13释放至正常。
●根据体外治疗指数，可以选择一种药物或药物组合来进行体内干预药物治疗。
●随访：在给患者选择服用药物之后，推荐通过测定血中PP13进行每两周一次验血随访，并且进行计算。
PP13斜率＝((PP13GW2-PP13GW1)/(GW2-GW1)，其中GW1和GW2分别代表在PP13检测的第一和第二时期的妊娠周。公式的结果被定义为斜率，计算所述斜率用于每个个体。对于先兆子痫病例与正常病例，将该斜率与典型中值斜率进行比较。如果对于第一时期(妊娠6-13周)正常斜率是3.1，而且先兆子痫的斜率是10，在治疗后每个测试与治疗前比较，斜率是降低的，那么表明治疗是有效的。否则，推荐转换使用那些治疗指数次好的药物。
方案2：定制先兆子痫“类型”
●在妊娠前期，我们测定妇女体液中PP13的水平非常低，表明她处于先兆子痫增加的风险之中。
●我们证实多种其它特征(如低多普勒脉动指数或低PAPP-A)
●基于这些特征-我们表征患者为先兆子痫组A，所谓先兆子痫组A是对应先兆子痫的一种类型(如早期先兆子痫发作)。另一组患者在妊娠前期仅PP13低，但没有其它变化，被指定为B组。
●随后，发现药物1对类型A的体外外植体有作用，而组B的外植体治疗指数表明仅药物2有效。
●相应地，一旦鉴别患者的标志物属于组A，那么选择药物1治疗组1，反之亦然。
●随访：在给患者选择服用药物之后，如上所述，为了确定斜率实施每两周一次PP13验血测试。
评论-现在，我们从先兆子痫多样性中知道了什么，本方法至少使合适的治疗手段的目录明显缩窄到针对一组人的1-2个候选药物。这看上去更适合IVF病例，所述病例中要对每一个妇女实许多试验。因此，可以应用一大套标志物调整“患者类型”(组)。
方案3：间接方法
●我们使用于来自分娩后已知结果的患者A的胎盘外植体的生长条件标准化。
●我们发现药物对这些组的外植体有效。
●测定许多药物后，形成了药物有效性的标准。
●在来自正常人的血清和来自先兆子痫提高风险的患者血清存在下，我们将这些标准化外植体与它们的标准化药物有效性指数暴露于各自药物之下(表1)。
●我们在设定的暴露于药物之下以及设定的与正常患者血清的培养下，发现了最有效的药物，并在来自被鉴定处在先兆子痫风险增加的妇女的血清存在下比较效果。
●我们选择受患者血清损伤最小的药物并在患者体内应用此药物。
●其为受患病患者血清损伤较小的药物，并对该患者定制它。
●这个方案假定处于先兆子痫增加的风险之中，所述患者体液含有各种因子如sflit，estriol，shbg或其它损伤/提高药物有效性以及甚至可能引起先兆子痫的因素。
如果这样，当与患者的样本同时应用时，那些对标准化培养外植体看上去有益的药物可能无效。实际的试验结果在下表4中显示。可以看出，来自处于先兆子痫高风险患者的血清使许多类型的治疗的受到严重抑制。本发明方法允许对治疗进行选择，更有可能证明有效性。
表4 如在胎盘外植体中通过测定PP13向培养基的释放所评价的
患者血清对于抗先兆子痫药物治疗有效性的阻断影响
Figure A200780008753D00301

Claims (16)

1.用于测定治疗孕妇先兆子痫有效性的方法，所述孕妇处于先兆子痫的风险之中，包括：
  (a)测定得自治疗前所述妇女身体物质中胎盘蛋白13(PP13)的第一浓度；
(b)测定得自开始治疗后所述妇女身体物质中的PP13的第二浓度；并且
(c)比较所述第一和第二浓度与对应的PP13正常水平，并在所述比较的基础之上，确定治疗的有效性。
2.权利要求1的方法，其中所述PP13的第一浓度选自：
(a)多个未经治疗的孕妇中所述身体物质的中值PP13浓度的预定范围，所述孕妇处于先兆子痫的类似风险之中；或
(b)接受所述治疗之前的所述孕妇身体物质的测定的PP13浓度。
3.权利要求1的方法，其中所述身体物质选自血清、羊水、尿、唾液、胎盘组织和标准的胎盘绒毛。
4.权利要求1的方法，其中所述比较是在单次测定的所述第一浓度和所述第二浓度之间进行的。
5.权利要求1的方法，其中所述比较是在第一斜率和第二斜率之间进行的，所述第一斜率是由所述妇女妊娠期间两个或更多个连续时间点测定的多个所述第一浓度计算得到的，且所述第二斜率是由所述妇女妊娠期间两个或更多个连续时间点测定的多个所述第二浓度计算得到的。
6.权利要求1的方法，用于测定两种或更多种不同的先兆子痫治疗的相对有效性，所述方法包括：
(a)测定得自治疗前所述妇女胎盘组织外植体中PP13的第一浓度；
(b)使外植体与第一种治疗接触；
(c)测定所述治疗后的外植体中PP13的第二浓度；
(d)比较所述第一和第二浓度与对应的PP13正常水平，且在所述比较的基础之上，确定所述第一种治疗的有效性；
(e)用一种或多种另外治疗重复步骤(a)到(d)；并且
(f)比较两种或更多种不同治疗的相对有效性。
7.权利要求6的方法，其中在胎盘外植体与治疗接触后的1-4天内测定所述第二浓度。
8.权利要求1的方法，其中在步骤(d)中，如下确定治疗的有效性：
(a)如果第一和第二浓度之间没有显著性差异，所述治疗是无效的；
(b)如果第二浓度与所述PP13正常水平之间的差异明显低于第一浓度与所述正常水平之间的差异，治疗是有效的；
(c)如果第二浓度与所述PP13正常水平之间的差异明显高于第一浓度与所述正常水平之间的差异，所述治疗是有害的。
9.权利要求8的方法，其中多个所述浓度的每一个与对应的多个PP13的正常水平比较。
10.权利要求8的方法，其中在2-3周的周期内测定多个浓度。
11.权利要求1的方法，其中所述比较基于中值的倍数(MoM)、斜率和妇女似然比(LR)，受试者操作特征曲线(ROC)用于建立敏感性和特异性的截止值。
12.权利要求1的方法，其中所述比较基于正常和患者群体的孕妇，所述孕妇被分为多个四分位数，而且将PP13浓度分在合适的四分位数内。
13.测定用于孕妇先兆子痫的两种或更多种不同治疗相对有效性的方法，所述孕妇处在先兆子痫的风险之中，包括：
(a)提供多个对于应答不同的先兆子痫治疗释放PP13而标准化的胎盘组织外植体；
(b)使妇女身体物质与第一胎盘组织外植体接触；
(c)使所述外植体与第一种治疗接触，并且在所述第一种治疗之后测定所述外植体的PP13浓度；
(d)用一种或更多种另外的外植体和治疗；重复步骤(b)和(c)并且
(e)测定在所述治疗后PP13的浓度与相应的PP13正常水平之间的差异，引起最小差异的治疗是最有效的。
14.权利要求13的方法，其中所述标准化的胎盘外植体是冷藏的。
15.用于实施权利要求13的方法的诊断试剂盒，包括：
(a)一套抗先兆子痫的药物；和
(b)一套标准化的胎盘外植体。
16.根据权利要求15的试剂盒，进一步包括计算机软件，所述计算机软件提供一种计算模型用以基于所测定的PP13值确定所述药物的有效性。
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