CN103353533B - 人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法，所述的试剂盒包括小鼠抗IL-12p35单克隆抗体(包被抗体)、全长重组蛋白IL-35(标准品)、生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体(检测液A)、底物TMB和终止液。本发明试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA法及质谱法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
白细胞介素35(IL35)，是最新发现的IL-12细胞因子家族成员，由两个亚基组成的异二聚体，即EBI3和IL-12p35。EBI3由EB病毒感染的B淋巴细胞诱导产生，是编码为34kDa的糖蛋白，27％的氨基酸与IL-12p40相同；IL-12p35与其他单链细胞因子如IL-6同源。IL-35从1997年发现，一直到2007年Collison等首次描述了IL-35的组成和功能，发现IL-35是由调节性T细胞(RegulatoryT-cells，Treg)分泌，并对免疫功能发挥调控效应的重要细胞因子。Treg细胞是一种重要的CD4+T细胞亚群，它在维持自我耐受，防止自身免疫病，限制慢性炎症性疾病，调节淋巴细胞的稳态性扩增等方面发挥基本作用。它们同时也在抑制寄生虫和病毒引起的自然免疫应答和疫苗诱导的抗肿瘤免疫效应中发挥重要作用。
根据目前研究表明IL-35可刺激Treg细胞增殖；IL-35抑制Teff细胞增殖；IL-35抑制Th17细胞的分化，Th17细胞是近年来发现的一类独立于Th1和Th2细胞的CD4+效应T细胞，已有研究证明，Th17细胞与炎症性疾病特别是关节炎的发生有密切关系，并且动物试验表明IL-35能缓解小鼠实验性关节炎。研究还证实IL-35与炎症性肠炎，过敏性气道疾病，自身免疫性疾病有关。IL-35的发现具有非常重要的意义，因为对调节型T细胞的调控是免疫治疗的一个重要目标。IL-35是少数的能抑制免疫系统活性的信号分子，因此对IL-35功能的调控可以为免疫治疗提供一个新颖的思路，IL-35是新近治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫病的新靶点。
正因为IL-35是新近发现的细胞因子，目前市场上针对其的检测工具很少。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。ELISA检测的关键问题是得到质量高的抗原和抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括小鼠抗IL-12p35单克隆抗体(包被抗体)、全长重组蛋白IL-35(标准品)、生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体(检测液A)、底物TMB和终止液。
在一个优选的实施方式中，所述的试剂盒以聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，该固定相表面依次有包被层和封闭层，其中包被层中包括小鼠抗IL-12p35单克隆抗体，封闭层包括牛血清蛋白；试剂盒中还包括通过重叠PCR技术制备的全长IL-35标准品蛋白、含有生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体检测液A以及含有亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒通过包括如下步骤在内的方法所制备而成：
使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；
在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的小鼠抗IL-12p35单克隆抗体(此抗体是通过制备的重组蛋白IL12p35免疫小鼠筛选单抗而获得)，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板；
利用重叠PCR制备全长IL35蛋白作为试剂盒的标准品；
配制以生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体(此抗体是通过制备的重组蛋白IL27EBI3免疫小鼠筛选单抗而获得)为活性成分的检测液A；
配制以亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的小鼠抗IL-12p35单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
A.IL-12p35基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_000882.3。根据查到的基因分别设计IL-12p35基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-12p35基因片段：
IL-12p35上游引物：
5’-ACGCGTCGACAAAGAAACCTCCCCGTGGCCACTC-3’
IL-12p35下游引物：
5’-CCGCTCGAGTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCG-3’
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
将上述扩增产物与载体连接，进行表达纯化，纯化得到的蛋白进行单克隆抗体的制备。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
B.IL-27EBI3基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_005755.2。根据查到的基因分别设计IL-27EBI3基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-27EBI3基因片段：
IL-27EBI3上游引物：
5’-CGGAATTCAGGAAAGGGCCCCCAGCAGCTCTGA-3’(EcoRI)
IL-27EBI3下游引物：
5’-CCGCTCGAGTCACTACTTGCCCAGGCTCATTGTGGCA-3’(XhoI)
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；57℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
将上述扩增产物与载体连接，进行表达纯化，纯化得到的蛋白进行单克隆抗体的制备。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的重组全长蛋白IL-35标准品的制备方法包括如下步骤：
C.IL-35全长基因片段的扩增，应用重叠PCR分别设计将IL-27EBI和IL-12p35基因片段通过一个柔性Linker(GGGGS)3连接起来，从而得到完整的人IL-35片段。重叠延伸PCR技术(SOEPCR)采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术不需要内切酶和连接酶处理，引物设计如下：
IL-35Linker互补引物1：
5’-CACAATGAGCCTGGGCAAGtcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggccgatcgAGAAACCTCCCCGTGGCC-3’
IL-35Linker互补引物2：
5’-GGCCACGGGGAGGTTTCTcgatccgccaccgccagagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaCTTGCCCAGGCTCATTGTG-3’
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性55秒；50℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；5个循环。然后接着95℃变性55秒；60℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；72℃终末延伸10分钟；25个循环，冷却至4℃保存。
将上述扩增产物与载体连接，进行表达纯化，纯化得到的蛋白即作为试剂盒中的标准品。
本发明试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA法及质谱法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：
主要技术路线如下：
首先根据NCBI基因库Genebank中的IL-12p35和IL-27EBI3的序列，分别设计扩增对应片段的引物以及链接IL-12p35和IL-27EBI3所需的引物；然后从已有的人全血细胞的cDNA文库中调出对应的基因片段。其中IL-12p35和IL-27EBI3用来免疫动物，分别制备针对两个片段的特异性抗体；
全长的IL-35蛋白用作IL-35ELISA试剂盒中的标准品。
1.重组的IL-12p35蛋白与单克隆抗体的制备：
1)IL-12p35引物设计及基因片段的扩增
IL-12p35基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_000882.3。根据查到的基因分别设计IL-12p35基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-12p35基因片段：
IL-12p35上游引物：
5’-ACGCGTCGACAAAGAAACCTCCCCGTGGCCACTC-3’(SaclI)
IL-12p35下游引物：
5’-CCGCTCGAGTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCG-3’(XhoI)
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
2)IL-12p35基因产物的鉴定与克隆
琼脂糖凝胶电泳检测目的基因：分别取上述PCR扩增产物5-10μl，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行观察、拍摄及分析结果，并用凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。
取IL-12p35的PCR产物和原核表达载体pET28a适量，用SaclI/XhoI进行双酶切，并将酶切产物按2∶1(摩尔比)比例进行连接反应，将连接后的质粒转化至BL21感受态细胞，涂于含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上，培养过夜并于次日挑选阳性克隆，进行PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测序鉴定。
3)IL-12p35蛋白表达及纯化
将鉴定正确的阳性克隆菌活化后，1％接种，37℃，250r/min摇菌2-3小时，使培养液的OD600达到0.4-0.6，加入IPTG终浓度1mmol/L，20℃诱导过夜，离心收集细菌，加入原菌液体积的1/5-1/10体积的超声裂解液【配方：50mMTris-HCl(pH8.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5％TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。】进行冰浴超声，超声5s，间歇10s，总超声时间为10min；然后将超声后的裂解液12，000r/min离心15分钟，取上清液用His标签纯化柱进行纯化分别得到IL-12p35；
4)IL-12p35重组蛋白的SDS-PAGE鉴定分析
20μl纯化后的抗原蛋白加入等体积的2×SDSSampleBuffer，100℃加热10分钟，在质量分数为12％的SDS-PAGE胶上电泳，考马斯亮蓝R250染色检测，并通过Bradford标准蛋白曲线测定法测定蛋白浓度。结果显示IL-12p35蛋白在29kD处出现条带，与理论分子量大小相符。
5)针对IL-12p35的单克隆抗体制备
a.免疫动物，细胞克隆化
选用BALB/C小鼠，将重组抗原IL-12p35蛋白浓度调整为1mg/mL，然后分别取0.4ml蛋白与等量完全弗氏佐剂混合、乳化，每只100ul，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强1次，加强后每隔7d眼眶采血，测定针对IL-12p35的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫。用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞。2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆；每次克隆后扩大培养建库的细胞上清；
b.抗体的纯化
用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗IL-12p35的抗体。采用亲和层析法纯化细胞培养上清中的特异性抗体。将上述重组蛋白偶联到亲和层析柱上，制备成能分离IL-12p35抗体的亲和层析柱。
IL-12p35抗体的纯化具体步骤如下：将200-300ml细胞培养上清样本直接从IL-12p35抗原偶联的层析柱进样口上样，流速为1ml/min。用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液(30-40ml)洗脱杂蛋白后，再用0.01mol/LpH8.0磷酸缓冲液(20-30ml)洗脱，流速为2ml/min。最后用0.1mol/LGly-HCl洗脱缓冲液洗脱，流速为1.5ml/min，收集样本洗脱液，透析浓缩后备用。采用间接ELISA法进行鉴定，抗体效价为1∶1000000-1∶2500000。
2.重组的IL-27EBI3蛋白与单克隆抗体的制备：
1)IL-27EBI3引物设计及基因片段的扩增
IL-27EBI3基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_005755.2。根据查到的基因分别设计IL-27EBI3基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-27EBI3基因片段：
IL-27EBI3上游引物：
5’-CGGAATTCAGGAAAGGGCCCCCAGCAGCTCTGA-3’(EcoRI)
IL-27EBI3下游引物：
5’-CCGCTCGAGTCACTACTTGCCCAGGCTCATTGTGGCA-3’(XhoI)
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；57℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
2)IL-27EBI3基因产物的鉴定与克隆方法参照IL-12p35片段。
3)IL-27EBI3蛋白表达及纯化方法参照IL-12p35片段。
4)IL-27EBI3重组蛋白的SDS-PAGE鉴定分析方法参照IL-12p35片段：结果显示其分子量大小为25kD。
5)IL-27EBI3的单克隆抗体制备及纯化方法参照IL-12p35片段：纯化后IL-27EBI3抗体效价为1∶2000000-1∶4500000。
3.全长IL-35重组蛋白制备步骤如下：
1)全长IL-35引物设计及基因片段的扩增
IL-35全长基因片段的扩增，应用重叠PCR分别设计将IL-27EBI和IL-12p35基因片段通过一个柔性Linker(GGGGS)3连接起来，从而得到完整的人IL-35片段。重叠延伸PCR技术(SOEPCR)采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术不需要内切酶和连接酶处理，引物设计如下：
IL-35Linker互补引物1：
5’-CACAATGAGCCTGGGCAAGtcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggccgatcgAGAAACCTCCCCGTGGCC-3’
IL-35Linker互补引物2：
5’-GGCCACGGGGAGGTTTCTcgatccgccaccgccagagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaCTTGCCCAGGCTCATTGTG-3’
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性55秒；50℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；5个循环。然后接着95℃变性55秒；60℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；72℃终末延伸10分钟；25个循环，冷却至4℃保存。
2)全长IL-35基因产物的鉴定与克隆方法参照IL-12p35片段。
3)全长IL-35蛋白表达及纯化方法参照IL-12p35片段。
4)全长IL-35蛋白的SDS-PAGE鉴定分析方法参照IL-12p35片段：结果显示其分子量大小为55kD。
4.ELISA试剂盒的研制：
本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定人血清样本中IL-35的水平。制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的小鼠抗IL-12p35单克隆抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。由此可见，该酶标板微量孔内主要有2层：1，包被层；2，封闭层。试剂盒的检测抗体，即检测液A，为生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体，并以亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B，与检测抗体特异性结合。其余试剂盒组份包括重组蛋白IL-35制备的标准品、底物TMB和终止液。
5.检测人血清中的IL-35：
检测样本时，加入待测标本及标准品，温育使之充分反应，再加入检测液A，即生物素化的IL-27EBI3单克隆抗体，因此，能同时被包被抗体和检测液A的抗原只有IL-35，而血清中存在的IL-12、IL27等均无法同时被这两个抗体识别，未结合的蛋白可以通过洗涤除去，酶标板上的生物素标记的IL-27EBI3抗体可与后续加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)结合，催化底物5，5′-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色可溶性物质，最后加入硫酸终止后呈黄色，于450nm检测标准品孔及样本孔O.D.值。在试剂盒的检测范围内，待测物浓度越高，样本OD值则越高。
该ELISA试剂盒采用了分别针对IL-12p35和IL27EBI3片段的抗体，有效的避免了与其拥有相同亚基IL-12和IL27片段的交叉反应。且检测系统采用了生物素-亲和素放大系统，使得其检测范围为3.12-200pg/ml，最低检测限为1.26pg/ml，可以达到样本的检测要求。为验证试剂盒的各项性能，分别检测了试剂盒的标准曲线、特异性、精密度、回收率及样本稀释的线性，具体实验结果见下表。
1.标准曲线，表1所示，从检测结果可以看出，标准曲线具有良好的线性关系。
表1：标准曲线
2.特异性检测：
检测该试剂盒能否与IL-35的结构类似物反应，所测值用交叉反应率来表示，即类似物的测定浓度与实际添加值的比值。具体测定方法如下，在阴性血清中添加下述物质，使其终浓度为20ng/ml，使用该试剂盒检测并计算交叉反应率，计算结果见表2。
表2：人IL35ELISA试剂盒交叉反应率测试
| 类似物 | 交叉反应率 |
| 人IL-12p35 | 0.1％ |
| 人IL-27EBI3 | 0.1％ |
| 人IL12 | 1.1％ |
| 人IL27 | 0.1％ |
| IL6 | 0.1％ |
| IL10 | 0.1％ |
2.精密度实验：
用该试剂盒对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，每个样本重复测定20次，表3中结果可见该试剂盒精密度较好。
表3：人IL-35ELISA试剂盒精密度测试
| 批内差CV(％) | 批间差CV(％) | |
| 高值 | 5.6 | 5.6 |
| 中值 | 5.4 | 6.7 |
| 低值 | 5.1 | 7.2 |
3.回收实验：
在定值血清(3.6pg/ml)中分别加入高、中、低浓度的标准品使IL-35终浓度为13.6pg/ml、43.6pg/ml、123.6pg/ml，用该试剂盒检测，并比较测定值和预期值得到回收率(见表4)。
表4：人IL-35ELISA试剂盒回收率测试
| 浓度 | ELISA法 |
| 13.6pg/ml | 92％ |
| 43.6pg/ml | 89％ |
| 123.6pg/ml | 103％ |
结论：
本发明利用基因工程方法获得了IL-12p35、IL-35EBI3和IL-35蛋白，并用IL-35的两个亚基分别免疫动物，进行细胞融合并获得分别针对各自亚基的特异性高及亲和力强的抗体，用来制备IL-35的ELISA试剂盒。填补了市场上检测人IL-35分子的空白。为科研工作者们提供高质量的IL-35检测工具。由于ELISA法采用TMB作为显色底物，所以其试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA法及质谱法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种人白细胞介素35酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
包被抗体：小鼠抗IL-12p35单克隆抗体；
标准品：全长重组蛋白IL-35；
检测液A：生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体；
底物TMB和终止液；
其中，小鼠抗IL-12p35单克隆抗体的制备如下：
IL-12p35基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_000882.3，根据查到的基因分别设计IL-12p35基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-12p35基因片段：
IL-12p35上游引物：5’-ACGCGTCGACAAAGAAACCTCCCCGTGGCCACTC-3’
IL-12p35下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCG-3’；
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
将上述扩增产物与载体连接，进行表达纯化，纯化得到的蛋白进行单克隆抗体的制备；
所述生物素化的小鼠抗IL-27EBI3单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
IL-27EBI3基因片段的扩增，参照的基因序列为Genebank号NM_005755.2；根据查到的基因分别设计IL-27EBI3基因上下游引物，以人cDNA为模板扩增IL-27EBI3基因片段：
IL-27EBI3上游引物：5’-CGGAATTCAGGAAAGGGCCCCCAGCAGCTCTGA-3’
IL-27EBI3下游引物：5’-CCGCTCGAGTCACTACTTGCCCAGGCTCATTGTGGCA-3’；
扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；57℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存；
将上述扩增产物与载体连接，进行表达纯化，纯化得到的蛋白进行单克隆抗体的制备。
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