CN113234135B - 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113234135B
CN113234135B CN202110623526.5A CN202110623526A CN113234135B CN 113234135 B CN113234135 B CN 113234135B CN 202110623526 A CN202110623526 A CN 202110623526A CN 113234135 B CN113234135 B CN 113234135B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
rbp4
binding protein
retinol binding
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110623526.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113234135A (zh
Inventor
王民燕
邱雪妮
褚旭明
夏杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd filed Critical Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110623526.5A priority Critical patent/CN113234135B/zh
Publication of CN113234135A publication Critical patent/CN113234135A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113234135B publication Critical patent/CN113234135B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。针对现有重组表达RBP4蛋白复兴不可控、免疫原性不强、性能不稳定，免疫动物获得的抗体性能不佳等情况，本发明通过对RBP4蛋白氨基酸的替换获得突变重组RBP4蛋白，利用PCR技术得到重组RBP4基因，将重组RBP4基因进行双酶切连接到经过双酶切的载体上获得表达载体，再将表达载体转化大肠杆菌Origamin B感受态细胞得到RBP4表达菌株，纯化后获得重组RBP4。本发明制备的重组RBP4具有天然蛋白的生物活性，其稳定性与免疫原性都优于未突变重组蛋白，并且可应用于RBP4抗原和抗体的制备中。

Description

一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。
背景技术
视黄醇结合蛋白(Retinol-binding Protein，RBP)是在体内负责结合并转运维生素A视黄醇类活性代谢物的一类蛋白质。视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因位于10q，mRNA全长914bp，由181个氨基酸组成，相对分子质量为21kD，是视黄醇结合蛋白家族中的分泌型RBP，是一种单一肽链的运载蛋白，有一个位点特异结合一分子维生素A，可将维生素A从肝脏中转运至靶器官，并可实现维生素A的细胞内转运代谢，RBP4在协助维生素A发挥生理功能中起着重要作用。
目前，用于临床血清RBP4检测的方法主要包括放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)等。这些方法中都需要用到不同或一定浓度的RBP4抗原作为标准品制作标准曲线，从而计算样品中RBP4的含量。国内禁止买卖人血清，从国外购买RBP4成本昂贵且来源有限，发展重组RBP4代替人源RBP4非常有必要。目前重组表达的RBP4蛋白是包涵体表达，存在变性与复兴过程，复兴是不可控的，大大地限制了RBP4的应用，不经突变的RBP4免疫原性不强，免疫动物获得的抗体性能不佳。而重组突变表达的可溶性RBP4不仅具有天然蛋白结构与生物活性，其稳定性与免疫原性都优于天然蛋白，可以应用到体外诊断行业中。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用原核表达系统表达的具有天然蛋白的生物活性且稳定性与免疫原性都优于未突变重组蛋白的可溶重组突变视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。
本发明具体技术方案如下：
一种重组视黄醇结合蛋白4，所述蛋白具有如序列表SEQ ID NO.1、2或3所述的氨基酸序列。
一种上述重组视黄醇结合蛋白4的基因，所述基因具有如序列表SEQ ID NO.5、6或7所示的核苷酸序列。
一种重组载体，所述载体含有上述重组视黄醇结合蛋白4的基因。
一种上述重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：对视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列进行氨基酸的替换，得到突变氨基酸序列；
S20：用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，并通过PCR技术，得到重组视黄醇结合蛋白4基因；
S30：将重组视黄醇结合蛋白4基因进行双酶切，并连接到经过双酶切的载体上，得到表达载体；
S40：将表达载体转化大肠杆菌Origamin B(DE3)感受态细胞，得到视黄醇结合蛋白4表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化，获得所述重组视黄醇结合蛋白4。
进一步地，所述视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述突变氨基酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.1和5、SEQ ID NO.2和6、SEQ ID NO.3和7中的一组或者多组。
进一步地，所述SEQ ID NO.1是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y获得，所述SEQ ID NO.2是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中35位的L替换为G获得，所述SEQ ID NO.3是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y同时将35位的L替换为G获得。
进一步地，所述步骤S30中的双酶切是使用NdeI和XhoI进行双酶切，载体为pET-32a(+)载体，表达载体为pET-32a(+)-RBP4。
一种上述重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗原中的应用。
一种上述重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗体中的应用。
一种上述的重组视黄醇结合蛋白4在视黄醇结合蛋白4检测中作为标准品的应用。
综上所述，本申请上述各个实施例可以具有如下一个或多个优点或有益效果：
1.本发明实现了RBP4蛋白在原核表达系统中的可溶性表达。
2.本发明通过改变RBP4蛋白的氨基酸序列，使突变重组后的RBP4蛋白的稳定性与免疫原性都优于未突变的重组蛋白。
3.本发明得到的可溶性RBP4蛋白在保持了天然蛋白的生物活性的同时还具有优于天然蛋白的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的实施例4中对表达载体pET-32a(+)-RBP4、载体pET-32a(+)和RBP4基因分别进行Xho I和Nde I双酶切鉴定的结果。
图2是本发明的实施例4中对上清进行SDS-PAGE电泳检测的结果。
图3是本发明的的实施例4中对透析样品进行SDS-PAGE电泳检测的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【实施例1】重组RBP4(20)的制备
(1)重组RBP4(20)蛋白设计：
根据NCBI网站公布的RBP4蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，1-18位氨基酸为信号肽，成熟的蛋白序列为19-201位氨基酸，共183个氨基酸，其氨基酸序列如序列表SEQID NO.4所示，将20位的F替换为Y得到如序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
(2)重组RBP4(20)基因序列的优化和获得：
用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.1反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.5，并通过3轮退火延伸PCR反应，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组RBP4(20)基因。
将RBP4(20)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(20)基因。
(3)重组RBP4(20)表达载体的构建：
将上述重组RBP4(20)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)(根据Merck Millipore公司，目录号是69015)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(20)。
(4)重组RBP4(20)表达菌株的构建：
S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅速冰浴化开；
S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(20)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；
S30：迅速冰浴5分钟；
S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；
S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞，命名为pET-32a(+)-RBP4(20)/Origamin B。
(5)重组RBP4(20)的表达纯化：
S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(20)/Origamin B接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；
S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；
S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养16小时，得到第三菌液；
S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；
S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；
S70：透析后分装保存于缓冲液中；
S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。
【实施例2】重组RBP4(35)的制备
(1)重组RBP4(35)蛋白设计：
将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中35位的L替换为G得到如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
(2)重组RBP4(35)基因序列的优化和获得：
用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.2反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.6，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组RBP4(35)基因。
将RBP4(35)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(35)基因。
(3)重组RBP4(35)表达载体的构建：
将上述重组RBP4(35)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(35)。
(4)重组RBP4(35)表达菌株的构建：
S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅速冰浴化开；
S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(35)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；
S30：迅速冰浴5分钟；
S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；
S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞，命名为pET-32a(+)-RBP4(35)/Origamin B。
(5)重组RBP4(35)的表达纯化：
S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(35)/Origamin B接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；
S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；
S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养16小时，得到第三菌液；
S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；
S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；
S70：透析后分装保存于缓冲液中；
S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。
【实施例3】重组RBP4(20-35)的制备
(1)重组RBP4(20-35)蛋白设计：
将将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y同时将35位的L替换为G得到如序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
(2)重组RBP4(20-35)基因序列的优化和获得：
用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.3反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.7，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组RBP4(20-35)基因。
将RBP4(20-35)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(20-35)基因。
(3)重组RBP4(20-35)表达载体的构建：
将上述重组RBP4(20-35)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(20-35)。
(4)重组RBP4(20-35)表达菌株的构建：
S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅速冰浴化开；
S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(20-35)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；
S30：迅速冰浴5分钟；
S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；
S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞，命名为pET-32a(+)-RBP4(20-35)/Origamin B。
(5)重组RBP4(20-35)的表达纯化：
S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(20-35)/Origamin B接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；
S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；
S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养16小时，得到第三菌液；
S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；
S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；
S70：透析后分装保存于缓冲液中；
S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。
【实施例4】重组RBP4(对比)的制备和重组RBP4的检测
(1)重组RBP4(对比)蛋白选择：
根据NCBI网站公布的RBP4蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，1-18位氨基酸为信号肽，成熟的蛋白序列为19-201位氨基酸，共183个氨基酸，其氨基酸序列如序列表SEQID NO.4所示。
(2)重组RBP4(对比)基因序列的优化和获得：
用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.4反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.8，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组RBP4(对比)基因。
将RBP4(对比)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(对比)基因。
(3)重组RBP4(对比)表达载体的构建：
将上述重组RBP4(对比)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(对比)。对上述实施例1、2、3以及本实施例的表达载体pET-32a(+)-RBP4、载体pET-32a(+)和RBP4基因分别进行Xho I和Nde I双酶切鉴定，结果如图1所示，其中1：Marker，2：RBP4(20)酶切载体，3：RBP4(35)酶切载体，4：RBP4(20-35)酶切载体，5：RBP4(对比)酶切载体，6：RBP4(20)PCR条带，7：RBP4(35)PCR条带，8：RBP4(20-35)PCR条带，9：RBP4(对比)PCR条带。由图1可以看出，重组质粒经Xho I和Nhe I双酶切后，电泳均可见到两条与预期分子量大小一致条带，与pET-32a(+)和RBP4基因的大小相符。
(4)重组RBP4(对比)表达菌株的构建：
S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅速冰浴化开；
S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(对比)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；
S30：迅速冰浴5分钟；
S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；
S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞，命名为pET-32a(+)-RBP4(对比)/Origamin B。
(5)重组RBP4(对比)的表达纯化：
S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(对比)/Origamin B接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；
S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；
S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养16小时，得到第三菌液；
S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
S50：对上述实施例1、2、3以及本实施例的上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，其中1：Marker，2：空白菌体，3：RBP4(20)表达菌体，4：RBP4(35)表达菌体，5：RBP4(20-35)表达菌体，6：RBP(对比)表达菌体，可以看出pET-32a(+)-RBP4/Origamin B上清中含有约20KD的目标蛋白RBP4抗原；
S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；
S70：透析后分装保存于缓冲液中；
S80：取上述实施例1、2、3以及本实施例的透析样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，其中1：Marker，2：RBP4(20)，3：RBP4(35)，4：RBP4(20-35)，5：RBP4(对比)，从图3中可知蛋白分子量大小与理论大小一致。
【实施例5】重组视黄醇结合蛋白4性能检测和应用
(1)3种突变重组RBP4抗原性检测
S10：将纯化后的突变重组RBP4与天然RBP4分别使用碳酸盐缓冲液稀释成100ng/mL,100μL/孔，4℃放置过夜；
S20：弃反应液，洗涤拍干，将DAKO抗人视黄醇结合蛋白4多抗稀释为1:40000、1:80000、1:160000、1:320000、1:640000、1:1280000与1:2560000，纵向加入100μL/孔，37℃反应60min；
S30：弃反应液，洗涤拍干，将羊抗兔酶标二抗稀释为1:4000，100μL/孔，37℃反应60min；
S40：弃反应液，洗涤拍干，加TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10min；
S50：加入终止液2mol/l硫酸，50μL/孔，OD450读数。
表1：突变重组RBP4抗原性检测
Figure GDA0003151500160000131
Figure GDA0003151500160000141
从表1可知：突变重组RBP4与抗人视黄醇结合蛋白4多抗具有反应，且反应强度与天然RBP4蛋白接近一致，说明突变重组RBP4具有天然RBP4的抗原性。
(2)突变重组RBP4稳定性测定：
使用RBP4体外诊断试剂盒对上述突变型重组RBP4抗原、未突变重组RBP4抗原和天然RBP4抗原的稳定性进行检测。将以上5种RBP4抗原调整浓度到2mg/mL，分装后放入37℃培养箱中，共7天，采用终点法检测，作为样本在日立7180生化仪上进行检测，2mg/mL浓度稀释至1/10检测，检测结果见表2。
表2：突变重组RBP4稳定性检测
Figure GDA0003151500160000142
Figure GDA0003151500160000151
从表2可知：突变重组RBP4，与0天相比37℃破坏后检测值波动不大且无趋势降低或升高，稳定性好；未突变重组RBP4与天然RBP4检测值有明显的下降趋势，稳定性不理想。
(3)重组RBP4免疫原性测定：
将突变重组的3种RBP4抗原、未突变重组RBP4抗原分别同剂量同时各免疫5只兔子，DAKO公司抗体作为阳性对照(人源抗原免疫获得的抗体)，检测效价，检测结果见表3、4、5、6。
(1)将天然RBP4使用碳酸盐缓冲液稀释成100ng/mL,100μL/孔，4℃放置过夜；
(2)弃反应液，洗涤拍干，将免疫抗血清稀释与阳性对照分别稀释为1:20000、1:40000、1:80000、1:160000、1:320000、1:640000与1:1280000，纵向加入100μL/孔，37℃反应60min；
(3)弃反应液，洗涤拍干，将羊抗兔酶标二抗稀释为1:4000，100μL/孔，37℃反应60min；
(4)弃反应液，洗涤拍干，加TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10min；
(5)加入终止液2mol/l硫酸，50μL/孔，OD450读数。
表3：突变RBP4(20)免疫效价检测
Figure GDA0003151500160000152
Figure GDA0003151500160000161
表4：突变RBP4(35)免疫效价检测
抗体稀释梯度 1号 2号 3号 4号 5号 阳性
1:20000 0.806 1.224 0.783 1.229 0.419 0.76
1:40000 0.533 1.046 0.544 0.919 0.556 0.618
1:80000 0.327 0.634 0.327 0.521 0.423 0.373
1:160000 0.196 0.405 0.198 0.362 0.23 0.233
1:320000 0.127 0.241 0.128 0.27 0.166 0.137
1:640000 0.088 0.14 0.089 0.259 0.111 0.092
1:1280000 0.068 0.1 0.073 0.205 0.088 0.074
阴性 0.060 0.057 0.055 0.054 0.052 0.058
空白 0.054 0.052 0.053 0.051 0.060 0.047
表5：突变RBP4(20-35)免疫效价检测
Figure GDA0003151500160000162
Figure GDA0003151500160000171
表6：未突变重组RBP4免疫效价检测
抗体稀释梯度 1号 2号 3号 4号 5号 阳性
1:20000 0.701 0.716 0.713 0.433 0.12 0.707
1:40000 0.473 0.475 0.496 0.278 0.086 0.474
1:80000 0.326 0.3 0.336 0.198 0.067 0.317
1:160000 0.19 0.203 0.199 0.145 0.063 0.213
1:320000 0.123 0.132 0.126 0.084 0.06 0.127
1:640000 0.082 0.095 0.086 0.059 0.047 0.08
1:1280000 0.075 0.088 0.08 0.06 0.046 0.069
阴性 0.065 0.062 0.058 0.053 0.053 0.058
空白 0.051 0.057 0.059 0.055 0.060 0.056
从表3-表6可知：突变后的抗原免疫原性明显优于未突变抗原，可以更有效的免疫动物获得高效价的抗血清。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波赛珀生物技术有限公司
<120> 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用
<130> 2021-06-04
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp
1 5 10 15
Lys Ala Arg Tyr Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp
35 40 45
Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu
50 55 60
Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr
65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe
85 90 95
Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp
100 105 110
Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr
115 120 125
Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu
130 135 140
Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly
165 170 175
Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu
180
<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp
1 5 10 15
Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Gly Gly Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp
35 40 45
Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu
50 55 60
Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr
65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe
85 90 95
Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp
100 105 110
Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr
115 120 125
Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu
130 135 140
Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly
165 170 175
Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu
180
<210> 3
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp
1 5 10 15
Lys Ala Arg Tyr Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Gly Gly Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp
35 40 45
Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu
50 55 60
Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr
65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe
85 90 95
Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp
100 105 110
Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr
115 120 125
Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu
130 135 140
Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly
165 170 175
Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu
180
<210> 4
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp
1 5 10 15
Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp
35 40 45
Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu
50 55 60
Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr
65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe
85 90 95
Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp
100 105 110
Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr
115 120 125
Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu
130 135 140
Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly
165 170 175
Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu
180
<210> 5
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gaacgtgact gccgtgtttc ttctttccgt gttaaagaaa acttcgacaa agctcgttac 60
tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtctgttcct gcaggacaac 120
atcgttgctg aattctctgt tgacgaaacc ggtcagatgt ctgctaccgc taaaggtcgt 180
gttcgtctgc tgaacaactg ggacgtttgc gctgacatgg ttggtacctt caccgacacc 240
gaagacccgg ctaaattcaa aatgaaatac tggggtgttg cttctttcct gcagaaaggt 300
aacgacgacc actggatcgt tgacaccgac tacgacacct acgctgttca gtactcttgc 360
cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420
ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480
ctggctcgtc agtaccgtct gatcgttcac aacggttact gcgacggtcg ttctgaacgt 540
aacctgctg 549
<210> 6
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gaacgcgatt gccgcgtgag cagctttcgc gtgaaagaaa actttgataa agcgcgcttt 60
agcggcacct ggtatgcgat ggcgaaaaaa gatccggaag gcggctttct gcaggataac 120
attgtggcgg aatttagcgt ggatgaaacc ggccagatga gcgcgaccgc gaaaggccgc 180
gtgcgcctgc tgaacaactg ggatgtgtgc gcggatatgg tgggcacctt taccgatacc 240
gaagatccgg cgaaatttaa aatgaaatat tggggcgtgg cgagctttct gcagaaaggc 300
aacgatgatc attggattgt ggataccgat tatgatacct atgcggtgca gtatagctgc 360
cgcctgctga acctggatgg cacctgcgcg gatagctata gctttgtgtt tagccgcgat 420
ccgaacggcc tgccgccgga agcgcagaaa attgtgcgcc agcgccagga agaactgtgc 480
ctggcgcgcc agtatcgcct gattgtgcat aacggctatt gcgatggccg cagcgaacgc 540
aacctgctg 549
<210> 7
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gaacgtgact gccgtgtttc ttctttccgt gttaaagaaa acttcgacaa agctcgttac 60
tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtggtttcct gcaggacaac 120
atcgttgctg aattctctgt tgacgaaacc ggtcagatgt ctgctaccgc taaaggtcgt 180
gttcgtctgc tgaacaactg ggacgtttgc gctgacatgg ttggtacctt caccgacacc 240
gaagacccgg ctaaattcaa aatgaaatac tggggtgttg cttctttcct gcagaaaggt 300
aacgacgacc actggatcgt tgacaccgac tacgacacct acgctgttca gtactcttgc 360
cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420
ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480
ctggctcgtc agtaccgtct gatcgttcac aacggttact gcgacggtcg ttctgaacgt 540
aacctgctg 549
<210> 8
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gaacgtgact gccgtgtttc ttctttccgt gttaaagaaa acttcgacaa agctcgtttc 60
tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtctgttcct gcaggacaac 120
atcgttgctg aattctctgt tgacgaaacc ggtcagatgt ctgctaccgc taaaggtcgt 180
gttcgtctgc tgaacaactg ggacgtttgc gctgacatgg ttggtacctt caccgacacc 240
gaagacccgg ctaaattcaa aatgaaatac tggggtgttg cttctttcct gcagaaaggt 300
aacgacgacc actggatcgt tgacaccgac tacgacacct acgctgttca gtactcttgc 360
cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420
ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480
ctggctcgtc agtaccgtct gatcgttcac aacggttact gcgacggtcg ttctgaacgt 540
aacctgctg 549

Claims (10)

1.一种重组视黄醇结合蛋白4，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1或3所示。
2.一种权利要求1所述的重组视黄醇结合蛋白4的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5或7所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的重组视黄醇结合蛋白4的基因。
4.一种权利要求1所述的重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：对视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列进行氨基酸的替换，得到突变氨基酸序列；
S20：用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，并通过PCR技术，得到重组视黄醇结合蛋白4基因；
S30：将重组视黄醇结合蛋白4基因进行双酶切，并连接到经过双酶切的载体上，得到表达载体；
S40：将表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到视黄醇结合蛋白4表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化，获得所述重组视黄醇结合蛋白4。
5.根据权利要求4所述的重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，所述突变氨基酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.1和5、SEQ ID NO.3和7中的一组或者多组。
6.根据权利要求5所述的重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，所述SEQ IDNO.1是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y获得，所述SEQ ID NO.3是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y同时将35位的L替换为G获得。
7.根据权利要求4所述的重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，所述步骤S30中的双酶切是使用NdeI和XhoI进行双酶切，载体为pET-32a(+)载体，表达载体为pET-32a(+)-RBP4。
8.一种权利要求1所述的重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗原中的应用。
9.一种权利要求1所述的重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗体中的应用。
10.一种权利要求1所述的重组视黄醇结合蛋白4在视黄醇结合蛋白4检测中作为标准品的应用。
CN202110623526.5A 2021-06-04 2021-06-04 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用 Active CN113234135B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110623526.5A CN113234135B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110623526.5A CN113234135B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113234135A CN113234135A (zh) 2021-08-10
CN113234135B true CN113234135B (zh) 2022-04-29

Family

ID=77136808

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110623526.5A Active CN113234135B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113234135B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118165123B (zh) * 2024-05-11 2024-08-09 北京春雷杰创生物科技有限公司 蛋白复合物及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101165178A (zh) * 2006-10-17 2008-04-23 中国科学院上海生命科学研究院 Rbp4抗体及其制法及用途
CN109679963A (zh) * 2019-02-22 2019-04-26 广西医科大学 一种重组人视黄醇结合蛋白4N端19-201aa的表达与纯化方法及应用
CN109721651A (zh) * 2018-12-28 2019-05-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用
CN110746499A (zh) * 2019-11-28 2020-02-04 宁波赛珀生物技术有限公司 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101165178A (zh) * 2006-10-17 2008-04-23 中国科学院上海生命科学研究院 Rbp4抗体及其制法及用途
CN109721651A (zh) * 2018-12-28 2019-05-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用
CN109679963A (zh) * 2019-02-22 2019-04-26 广西医科大学 一种重组人视黄醇结合蛋白4N端19-201aa的表达与纯化方法及应用
CN110746499A (zh) * 2019-11-28 2020-02-04 宁波赛珀生物技术有限公司 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAH20633.1;佚名;《GenBank》;20060715;1-2 *
Structure of chicken plasma retinol-binding protein;Zanotti G等;《Biochimica et Biophysica Acta》;20011019;第1550卷(第01期);64-69 *
视黄醇结合蛋白L35和Q98位点突变及其对与视黄醇结合的影响;王世春等;《中国生物化学与分子生物学报》;20020410(第02期);213-216 *
视黄醇结合蛋白研究;王世春等;《生命的化学》;20000815(第04期);165-167 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113234135A (zh) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duffort et al. Studies on the biochemical structure of the major cat allergen Felis domesticus I
CN110746499A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法
WO2024087784A1 (zh) 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法
Takakura et al. Tamavidins–novel avidin‐like biotin‐binding proteins from the Tamogitake mushroom
WO2019000267A1 (zh) Gm杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒及其制备方法与应用
CN113234135B (zh) 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用
CN110845582A (zh) 一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN114276445B (zh) 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法
Filipek et al. Interaction of calcyclin and its cyanogen bromide fragments with annexin II and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
Trabucchi et al. Expression and characterization of human proinsulin fused to thioredoxin in Escherichia coli
CN104610443B (zh) 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途
CN109313181B (zh) 蛋变态反应的抗原
CN112345769A (zh) 一种基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备方法
CN110726837A (zh) 用于片形吸虫病诊断的elisa检测试剂盒及其应用
CN107344963B (zh) 体外重折叠波形蛋白的方法及其应用
CN111273030A (zh) 一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争elisa法试剂盒及其应用
CN109810196B (zh) 一种水稻Cu/Zn-SOD多克隆抗体的制备方法和应用
CN113009139B (zh) 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
RU2572343C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК pA4, РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК pQE 30-pA4, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДА A4, ШТАММ Esherichia coli M 15-A4, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pQE 30-pA4 И ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД A4, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД A4, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СЕЛЕКТИВНО СВЯЗЫВАТЬ ЧСА, АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБЫ УДАЛЕНИЯ ЧСА И IgG ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ (ВАРИАНТЫ)
CN112458093A (zh) 一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白tm的编码基因及其应用
CN116082512B (zh) 针对CDKN1A_p21CIP1蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN110964098B (zh) 一种n端脑钠肽变体蛋白及其制备方法和应用
CN116041471B (zh) 一种抗ifitm3n端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体
CN110615846B (zh) 一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒
Iranpoor et al. Expression of recombinant human insulin-like growth factor type 1 (rhIGF-1) in Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant