CN111273030A - 一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争elisa法试剂盒及其应用 - Google Patents

一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争elisa法试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争ELISA试剂盒及其应用，包括重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的微孔酶标板、重组人表皮生长因子标准品、酶标记重组人表皮生长因子抗原、显色液A和B、20×浓缩洗涤液、样品稀释液和终止液。通过抗原‑抗体特异性反应，以酶免疫技术为基础，建立并研制了直接竞争ELISA法定量检测发酵液、半成品、成品等及临床组织细胞样本中重组人表皮生长因子的方法学及可商品化试剂盒，可对相应产品研制及对临床样品样本进行特异性检测；本发明方法最低检测限可达2.0ng/ml，批内差异＜5％，批间差异＜10％；回收率为在90％～110％之间，显示该试剂盒对于生产企业进行产品质量控制及临床标本的检测具有重要的商业开发价值。

Description

一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争ELISA法试剂盒 及其应用
技术领域：
本发明涉及一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争ELISA法试剂盒及其应用，用于检测临床标本中及研发过程、企业生产的发酵液、菌皿、半成品液、冻干品等样品中重组人表皮生长因子的含量。
技术背景：
重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，具有多种生物学活性，其中很重要的作用是修复受损表皮细胞，可用于治疗烧伤、烫伤。近年来的研究发现，rhEGF具有明显的美白抗皱等护肤作用，广泛添加于化妆品中。rhEGF需求量增大。但大多数研究单位或企业目前使用3T3细胞/MTT比色法作为检测rhEGF手段。由于该方法对实验人员操作技能要求高，容易受细胞状态等因素影响，实验信噪比低，且试验周期较长，一般为5天/次以上，无法做到实时质量监测和控制。故一种快速、精确、低成本、高灵敏度的ELISA法检测试剂盒是所有rhEGF研制与使用单位所期盼的。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争ELISA法试剂盒及其应用。
本发明提供的一种定量检测重组人表皮生长的ELISA法试剂盒，包括：重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的微孔酶标板、重组人表皮生长因子标准品、酶标记重组人表皮生长因子抗原、显色液A和B、20×浓缩洗涤液、样品稀释液和终止液。
重组人表皮生长因子抗原的基因如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；重组人表皮生长因子抗原的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。
重组人表皮生长因子多克隆抗体为重组人表皮生长因子完全抗原作为免疫原通过免疫Balb/c小鼠获得的抗血清经多次纯化精制而成。
所述的酶标记重组人表皮生长因子抗原为辣根过氧化物酶标记的重组人表皮生长因子抗原，通过改良高碘酸钠法将辣根过氧化物酶与重组人表皮生长因子抗原偶联制得。
所述的重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的酶标板的制备方法为：用pH9.60.05M碳酸盐缓冲液作为包被稀释液，将重组人表皮生长因子多克隆抗体进行1：100000稀释后，按100μl/孔加入96孔聚苯乙烯ELISA微孔板中，4℃包被过夜后，甩干，按200μl/孔加入pH7.0的内含有10％小牛血清和0.05％Tween-20的1×磷酸盐缓冲液，37℃封闭2小时，洗涤甩干，至室温干燥后装入包装袋中抽真空保存。
所述的20×浓缩洗涤液为20×PBST洗涤缓冲液，即为内含有体积分数为1％Tween-20的0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液；
封闭液为内含有10％小牛血清和0.05％吐温-20pH7.4磷酸盐缓冲液；
样品稀释液为pH7.4的内含有10％小牛血清和0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；
显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B液为加入过氧化氢或过氧化脲溶液；
所述重组人表皮生长因子标准品在使用时，经样品稀释液稀释成3、6、12、24、48ng/ml的重组人表皮生长因子标准品溶液。
同时，本发明还提供了一种定量检测样品中重组人表皮生长因子的方法，包括步骤：
(1)样品前处理将待测样品中的重组人表皮生长因子浓度稀释至3～48ng/ml内，分别将待测样品稀释液和重组人表皮生长因子系列浓度标准液与酶标记重组人表皮生长因子抗原等体积充分混匀，得到混合液。
(2)用权利要求1所述的试剂盒进行检测向包被有重组人表皮生长因子多克隆抗体的微孔酶标板中加入(1)中所得的混合液，按100μl/孔加入微孔酶标板内；于37℃温箱内静置30min；加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；加入显色液B液50μl/孔，再加入显色液A液50μl/孔，轻轻混匀，室温避光反应10min；加入终止液50μl/孔，轻轻混匀，设定酶标仪450nm处测定每孔OD值。
(3)检测结果分析检测板孔内吸光度并绘制标准曲线，相对应每一个样品中重组人表皮生长因子的含量可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样本中重组人表皮生长因子的含量。
利用ELISAClac、EXCLE等数据分析软件更便于大量样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样品中重组人表皮生长因子的含量。
本发明的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，采用直接竞争抑制法以定量检测出样品中重组人表皮生长因子含量；对样品的前处理要求低、处理过程简单，能同时快速检测大批量样品。
本发明中试剂盒采用重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的酶标板，主要试剂以工作液形式提供，试剂盒操作步骤简单，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差。本发明的ELISA法试剂盒具有特异性强、灵敏度和精确度高，对仪器设备要求低、保存时间长、无放射性同位素污染等优点，可在临床检测及企业生产的质量控制环节发挥重要作用。
附图说明
图1是发明创建的板式直接竞争ELISA法定量检测重组人表皮生长因子的操作流程图；
图2是本发明板式直接竞争ELISA法定量检测样品中重组人表皮生长因子的定量标准曲线；
图3为rhEGF蛋白纯化后的SDS-PAGE图，图中泳道M：蛋白Maker26610；泳道1：BL21/PET32a阴性对照；泳道2-5：rhEGF纯化上清液、流穿液、洗杂峰和纯化产物；
图4为rhEGF蛋白Western Blot鉴定图。
具体实施
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而绝不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例1抗原的制备
1.1 pET32a-hEGF重组质粒的构建与转化
本发明使用pET32a载体与人表皮生长因子的编码核酸序列进行连接，该载体中含有TrxA标签序列有助于蛋白的正确折叠避免形成包涵体，含有的His标签可便于蛋白的亲和纯化。人表皮生长因子的基因序列如SEQUENCE LISTING400〈1〉所示，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。
将pET32a-hEGF重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(大连宝生物工程有限公司)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基培养并选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于2mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在恒温培养振荡器37℃培养过夜。用高纯度质粒小提试剂盒(大连宝生物工程有限公司)制备质粒，测序结果证明与理论预期一致，－20℃保存备用。
1.2 rhEGF重组蛋白的表达与纯化
将保存的重组质粒pET32a-hEGF转化至BL21(DE3)感受态细胞(大连宝生物工程有限公司)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于2mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃震荡培养，当OD600达到0.8左右时加入终浓度1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6小时，之后将菌液在7000r/min离心20分钟，收集沉淀。沉淀用20mL结合缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0)重悬后冰水浴600W超声30分钟破碎细胞，4℃12000r/min离心20分钟离心取上清。
上清用His-tag亲和层析柱纯化，使用140mM咪唑进行洗涤去除，再使用500mM咪唑进行洗脱收集目的蛋白，7kDa孔径透析袋透析换液2次，每次4℃透析6小时，12000r/min离心20分钟离心取上清即为rhEGF原液。
1.3 rhEGF原液的鉴定
1.3.1蛋白定量检测
参照《中华人民共和国药典三部》“通则0731第二法”福林酚法(Lowry法)，以中国食品药品生物制品检定院提供的BSA标准蛋白作标准品测定。
1.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳纯度分析
参照《中华人民共和国药典三部》“通则0541第五法”SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测rhEGF原液纯度，rhEGF原液上样量10μg。
1.3.3 Western Blot鉴定
参照《中华人民共和国药典三部》“通则3401”免疫印迹法对rhEGF原液进行Western Blot鉴定，Anti-EGF抗体购自abcam公司，批号ab206423，兔源单抗，工作稀释度为1∶1000。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，工作稀释度为1︰50000。
实施例2抗体的制备及效价检测
1.1多克隆抗体的制备
选取体重20g以上的健康成年Balb/c小鼠，雌雄不限。以重组人表皮生长因子为免疫原与等量弗氏完全佐剂通过分散器混合成油包水的乳浊液，按照0.1mg/只进行首次免疫，采取腹腔注射。每隔两周加强免疫一次，并用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及注射方法同首次。从第三次免疫开始，每次免疫后7天，眼眶静脉丛采血0.1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次免疫，七天后摘除眼球取血，37℃凝固1小时，2000r/min离心10min，将血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物尽可能少的用pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后上亲和层析柱再次纯化收获得到重组人表皮生长因子多克隆抗体精制品。
1.2检测抗体效价
将重组人表皮生长因子稀释成1μg/ml浓度，按照每孔100μl包被酶标板。4℃包被过夜，洗涤5次，拍干，按照每孔200μl封闭液37℃封闭1h，洗涤3次，拍干。按每孔100μl加入1：2000，1：10000，1：50000，1：250000和1：1250000稀释的多克隆抗体精制品，阴性血清及空白对照不加多克隆抗体精制品，只加其稀释液。37℃孵育30min，洗涤5次，拍干。每孔加入已经稀释成最适浓度的酶标记羊抗鼠IgG抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干。每孔先加入50μl显色液B液，再加入50μl显色液A液，室温避光反应10min。每孔加入50μl终止液终止反应，并立即于酶标仪上检测450nm处的吸光度值。以两倍于阴性血清OD值的多克隆抗体OD值所对应的多克隆抗体稀释度作为其效价。检测结果见表1：
表1多克隆抗体效价检测结果
稀释倍数 2000 10000 50000 250000 1250000 阴性血清 空白对照
OD<sub>1</sub>值 1.241 0.963 0.515 0.301 0.281 0.121 0.007
OD<sub>2</sub>值 1.253 0.967 0.517 0.315 0.295 0.183 0.010
OD<sub>3</sub>值 1.250 0.972 0.516 0.318 0.286 0.190 0.007
从表1中显示，该多克隆抗体效价达1:50000。
实施例2酶标记重组人表皮生长因子抗原的制备
改良高碘酸钠法制备抗原是这样实现的：取10mg的辣根过氧化物酶溶于1ml超纯水中，再取12.8mg高碘酸钠溶于1ml超纯水中，配好后将两溶液等体积混合于合适容器中，4℃避光反应30min；用0.05M碳酸盐缓冲液配制0.16mol/L乙二醇溶液，等体积加入上述反应容器中并混匀，于4℃反应30min；将重组人表皮生长因子溶液与辣根过氧化物酶以质量比1:1加入上述反应容器中，立即混匀，并用0.05M碳酸盐缓冲液调节酸碱度至pH 9.0，于4℃避光反应2小时；用纯水新鲜配制1mg/ml硼氢化钠溶液，加入至上述反应容器中(加入量为40μg/1mgHRP)，混匀，于4℃反应2小时；反应结束后透析于20mM PBS中24小时；向透析后的溶液中加入1％BSA，过滤除菌后再加入50％无菌甘油，分装-20℃保存。
实施例3试剂盒的研制
3.1试剂盒的检测原理
采用直接竞争法，将重组人表皮生长因子多克隆抗体包被于酶标微孔板，然后将酶标板封闭，加入待检样本或标准品及酶标记的重组人表皮生长因子完全抗原。待检样品或标准品内的重组人表皮生长因子会与酶标记的重组人表皮生长因子完全抗原竞争性的与包被抗体发生特异性抗原抗体反应；加入显色剂后形成肉眼可见的颜色，颜色的深浅与样本中的重组人表皮生长因子含量成反比，再通过标准曲线即可定量地读出样本中重组人表皮生长因子的含量。
3.2试剂盒的组成
3.2.1重组人表皮生长因子多克隆抗体包被ELISA板的制备方法
用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)作为包被稀释液将重组人表皮生长因子多克隆抗体进行1：100000稀释后，按100μl/孔加入96孔聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按200μl/孔加入封闭液，37℃封闭1小时，洗涤甩干，至室温干燥后装入包装袋中抽真空保存。
3.2.2工作试剂的配制
20×浓缩洗涤液为0.2mol/L磷酸缓冲液：NaCl 160.0g,KH2PO4 4g，Na2HPO4·12H2O58g,KCl 4g用纯水定容至1000mL，酸碱度调至pH7.4，再加10mL吐温-20；
样品稀释液PBST：NaCl 8g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g用纯水定容至1000mL，酸碱度调至pH7.4，再加0.5mL吐温-20和10％小牛血清；
显色液A：TMB 20mg，无水乙醇10mL，加双蒸水至100mL；显色液B：为含Na2HPO41.46g，柠檬酸0.933g，0.75％过氧化氢尿素0.64mL，加纯水至100mL，调至pH 5.0-5.4；
0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液，pH5.0-5.4；
终止液：2mol/L硫酸，即取浓硫酸4mL加入32mL纯净水中混匀；
重组人表皮生长因子系列浓度标准液为：0.2mg/支的重组人表皮生长因子冻干品使用样品稀释液稀释成3、6、12、24和48ng/ml重组人表皮生长因子标准品溶液。
3.2.3重组人表皮生长因子ELISA法定量检测试剂盒的组成
重组人表皮生长因子的ELISA法定量检测试剂盒组成如下。使其包含下述组分：
(1)试剂盒盒体；
(2)包被有重组人表皮生长因子多克隆抗体的酶标板；
(3)重组人表皮生长因子标准品(冻干品)1支，含量为0.2mg，其为直接将实施例1中的rhEGF重组蛋白加入冻干保护剂经冷冻干燥制备；
(4)20×浓缩洗涤液：内含有体积分数为1％Tween-20的0.2mol/L磷酸盐缓冲液；
(5)HRP标记的重组人表皮生长因子抗原；
(6)样品稀释液：pH7.4内含有10％小牛血清和0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；
(7)显色液A含四甲基联苯胺；
(8)显色液B含过氧化氢或过氧化脲；
(9)终止液为2mol/L硫酸溶液；
(10)说明书；
(11)封板膜；
(12)试剂盒支架；
实施例4重组人表皮生长因子ELISA法定量检测试剂盒检测样品中重组人表皮生长因子的操作流程
(1)样品前处理将待测样品中的重组人表皮生长因子浓度稀释至3～48ng/ml内，分别将待测样品稀释液和重组人表皮生长因子系列浓度标准液与酶标抗原等体积充分混匀，得到混合液。
(2)用权利要求1所述的试剂盒进行检测向包被有重组人表皮生长因子多克隆抗体的微孔酶标板中加入(1)中所得的混合液，按100μl/孔加入微孔酶标板内；于37℃温箱内静置30min；加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；加入显色液B液50μl/孔，再加入显色液A液50μl/孔，轻轻混匀，室温避光反应10min；加入终止液50μl/孔，轻轻混匀，设定酶标仪450nm处测定每孔OD值。
(3)检测结果分析检测并记录板孔内吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中重组人表皮生长因子的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样本中重组人表皮生长因子的含量。利用ELISAClac、EXCLE等数据分析软件有助于大量样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，即可判断出样品中重组人表皮生长因子的浓度范围。
实施例5试剂盒精密度试验
按照本试剂盒的操作说明，以测定标准品溶液内人表皮生长因子的浓度作为判定指标显示本试剂盒的精密度；每个标准品溶液重复5孔，以浓度抑制率计算变异系数，结果见表2。
表2本发明试剂盒精密度测定结果
标准溶液(ng/ml) 重复次数 抑制率(％) 变异系数(％)
0 5 100 -
3 5 91 1.4
6 5 78 4.1
12 5 55 3.1
24 5 30 2.7
48 5 13 1.1
结果表明，本发明试剂盒的板内变异系数＜5％，板内测试结果稳定，精密度高。
实施例6试剂盒特异性试验
按照本试剂盒的操作说明，以交叉反应率为指标判定本试剂盒的特异性。即将重组人表皮生长因子与人表皮生长因子、本实验室表达的与重组人表皮生长因子带有相同标签蛋白的重组蛋白溶液(重组人纤连蛋白、重组人碱性细胞生长因子、重组人角质细胞生长因子、重组人成纤维细胞生长因子)等配成不同浓度的溶液，用试剂盒分别测定IC50值，每种重组蛋白溶液重复3孔，计算交叉反应率。结果见表3。
交叉反应率(％)＝50％抑制物浓度(rhEGF)/50％抑制物浓度(其他蛋白)×100％
表3本发明试剂盒特异性检测结果
被分析物名称 交叉反应率
人表皮生长因子 100
重组人碱性细胞生长因子 <0.01
重组人纤连蛋白 <0.01
重组人角质细胞生长因子 <0.01
重组人成纤维细胞生长因子 <0.01
结果发现，本发明试剂盒的板内交叉反应率均为<0.01；测试结果稳定，表明特异性强。
实施例7试剂盒的准确度试验
按照本试剂盒的操作说明进行。但需要先将重组人表皮生长因子母液(1mg/ml)稀释成100ng/ml后，分别添加至5个空载工程菌的菌皿中，使其终浓度分别为1ng/个菌皿、2ng/个菌皿和4ng/个菌皿；按照试剂盒的操作程序，随机选5个批次，每个批次做3个浓度，每个浓度重复3次，测定各批次各菌皿中重组人表皮生长因子浓度，并计算回收率和变异系数。见表4。
表4本发明试剂盒的准确度和重复性检测结果
Figure BDA0002391612710000121
结果显示，回收率在90％～110％，批间变异系数<10％；表明本发明试剂盒数据准确、可靠、重复性好。
实施例8试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2～8℃，经过3月～12月测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制物浓度、重组人表皮生长因子添加实际样品测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置1天，进行加速稳定性试验。结果表明，该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冷冻7天，测定结果也表明，该试剂盒各项指标参数完全正常。从以上结果可得出试剂盒可在2～8℃保存6个月以上。
以上为本发明的最佳实施方式，依据本发明的公开内容，本领域的普通技术人员能够显而易见地想到一些雷同、替代方案，均因落入本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 芜湖天明生物技术有限公司
<120> 一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争ELISA法试剂盒及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 重组人表皮生长因子基因序列
<400> 1
aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggggag 120
cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg gaactgcgc 159
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> 重组人表皮生长因子氨基酸序列
<400> 2
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50

Claims (9)

1.一种定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其中包括：重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的微孔酶标板、重组人表皮生长因子标准品、酶标记重组人表皮生长因子抗原、显色液A和B、20×浓缩洗涤液、样品稀释液和终止液。
2.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：重组人表皮生长因子抗原的基因如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；重组人表皮生长因子抗原的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。
3.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：所述的重组人表皮生长因子多克隆抗体为重组人表皮生长因子完全抗原免疫Balb/c小鼠的抗血清经多次纯化后得到的精制品。
4.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：所述的酶标抗原为辣根过氧化物酶(HRP)标记的重组人表皮生长因子完全抗原。
5.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：所述的重组人表皮生长因子多克隆抗体包被的酶标板的制备方法为：用pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液作为包被稀释液，将重组人表皮生长因子多克隆抗体进行1：100000稀释后，按100μl/孔加入96孔聚苯乙烯ELISA微孔板中，4℃包被过夜后，甩干，按200μl/孔加入pH7.0的内含有10％小牛血清和0.05％Tween-20的1×磷酸盐缓冲液，37℃封闭2小时，洗涤甩干，至室温干燥后装入包装袋中抽真空保存。
6.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：所述的20×浓缩洗涤液为20×PBST洗涤缓冲液，即内含有体积分数为1％Tween-20的0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液；封闭液为pH7.4内含有10％小牛血清和0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；样品稀释液为pH7.4的内含有10％小牛血清和0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B液为加入过氧化氢或过氧化脲溶液。
8.根据权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒，其特征在于：所述重组人表皮生长因子标准品在使用时，经样品稀释液稀释成3、6、12、24、48ng/ml的重组人表皮生长因子标准品溶液。
9.一种检测样品中重组人表皮生长因子含量的方法，包括步骤：
(1)样品前处理将待测样品使用Lowry法测量浓度，并将其蛋白浓度稀释至3～48ng/ml内，分别将待测样品稀释液和重组人表皮生长因子系列浓度标准液与酶标抗原等体积充分混匀，得到混合液；
(2)用权利要求1所述的定量检测重组人表皮生长因子的ELISA法试剂盒进行检测向包被有重组人表皮生长因子多克隆抗体的微孔酶标板中加入(1)中所得的混合液按100μl/孔加入微孔酶标板内；于37℃温箱内静置30min；加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；加入显色液B液50μl/孔，再加入显色液A液50μl/孔，轻轻混匀，室温避光反应10min；加入终止液50μl/孔，轻轻混匀，设定酶标仪450nm处测定每孔OD值；
(3)检测结果分析检测板孔内吸光度并绘制标准曲线，相对应每一个样品中重组人表皮生长因子的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样本中重组人表皮生长因子的含量。
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