CN110618270B - 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次利用将单克隆抗体结合到乳胶增强免疫比浊法中，用于人粪便中幽门螺杆菌抗原尿素酶的检测，用于诊断幽门螺杆菌的感染，与现有技术相比，本申请采用特异性识别幽门螺杆菌抗原尿素酶的单抗，显著提高了检测灵敏度和特异性，具有一定的临床应用前景。

Description

一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法

技术领域

本发明属于医疗检测方法技术领域，涉及一种快速定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原的方法，具体地说涉及一种乳胶免疫比浊法快速定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原的试剂的制备方法。

背景技术

大量研究表明，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎、消化性溃疡的重要病因，且与胃癌、胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤密切相关。目前，临床上已有多种方法评价Hp感染与否，主要分为两大类：侵入性和非侵入性检测方法。

其中，侵入性检测方法是使用内窥镜取得胃活检组织后进行检测，一般包括脲酶试验法、病理学检测法及细菌培养法。快速脲酶试验法依据幽门螺杆菌具有丰富的可分解尿素的尿素酶，尿素酶可分解尿素产生氨气，通过pH的变化测定幽门螺杆菌，该方法简便迅速，但是存在准确度不足的问题，可能因含尿素酶的其它细菌存在而产生假阳性或者检测近期试用过降低胃部细菌量或直接抑制尿素酶活性的药物的样品可产生假阴性。病理学检测法通过对胃粘膜组织切片染色检查，可直接显示幽门螺杆菌菌体而证实，但是不同病理学家观察的差异性对于胃萎缩样品的诊断具有一定的困难性。细菌培养法通过取胃粘膜组织做幽门螺杆菌培养，但是存在培养细菌较少、操作过程复杂、费用昂贵的问题。另外，侵入性检测方法还存在内窥镜侵入待检测者体内导致待检测者痛苦或易产生感染的问题。

非侵入性检测方法指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这类方法包括血清抗体检测、13C/14C呼气试验等。血清抗体检测目前已有的方法包括酶联免疫法、免疫印迹法、胶体金法等，但是由于根除幽门螺杆菌后人体血清中仍然含有对应的抗体，因此通过血清抗体来判定幽门螺杆菌感染存在特异性问题，不能真实反映出胃部是否还有幽门螺杆菌存在。13C/14C呼气试验作为一种检测幽门螺杆菌感染的方法，在临床上广泛应用，但是存在放射性问题，同时需要专门的设备，因此在家庭和社康中心的应用就受到很大限制。

当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射。但是经典的免疫比浊法，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间:如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了现在广泛应用于生化分析仪的乳胶增强免疫比浊法(PETIA)。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。

乳胶增强免疫比浊法(Latex-enhanced tμrbidimetric immμnoassay)是一种体液蛋白均相透射免疫比浊检测方法，原理是在纳米级高分子乳胶微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的透光性能；反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。其具有如下优点：1、省时省力：在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，利用全自动生化分析仪直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，省却酶联免疫法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤；2、稳定准确：操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测人体血液或粪便排泄物中幽门螺杆菌尿素酶抗原的含量；3、应用广泛：乳胶增强免疫比浊法的灵敏度足以检测到幽门螺杆菌尿素酶抗原的下限值，可完全满足临床检测要求，明显优于免疫层析法(胶体金)。

随着检验医学的发展，对于低浓度检测物质的检测越来越多，检测物质的浓度正在从μg/mL级别下降至ng/mL级别，对于诊断试剂的灵敏度要求也越来越高，对于传统的乳胶增强免疫比浊法来说需要进一步的提升检测的灵敏度，以适应检测要求，传统的提升检测灵敏度的方法包括采用亲和力更高的抗体，采用更大颗粒，稳定性更好的乳胶颗粒，选用更好的促进抗原抗体反应的缓冲液体系等，但是这些都会增加试剂的成本，如何提升面对ng/mL级别被分析物的分析灵敏度和精密度，同时不增加成本一直是试剂开发的一大挑战。

现有技术中，目前尚无利用乳胶增强免疫比浊法测定人体粪便中幽门螺杆菌尿素酶的相关试剂盒及检测方法。且目前的乳胶增强免疫比浊法是基于多克隆抗体，并未有记载基于单克隆抗体的检测方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于通过乳胶增强免疫比浊法，快速定量检测粪便中幽门螺杆菌抗原(尿素酶)。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明首先提供幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体的制备。在一个具体的实施例中，所述的单抗是结合文献并应用DNASTAR软件,对幽门螺杆菌尿素酶蛋白两个亚基序列(SEQID NO:1-2)的抗原性、亲水性及表面结构可能性进行分析,选择抗原性高,亲水性强,表面可能性大的16-21个氨基酸左右的肽段作为免疫肽段，其中：A亚基中选取了ELIDIGGNRRIFGFNALC(命名为UreA-AG，SEQ ID NO:3),B 亚基中选取了DTMAAIAGRTMHTVHC(命名为UreB-AG,SEQ ID NO:4)分别对应于A亚基的104-120、B亚基的260-274,末端的半耽氨酸是人为加上的,以提供游离巯基与载体蛋白偶联。委托杭州中肽生化有限公司进行免疫肽段的合成及偶联,并提供完整的质检报告,并与核酸数据库比对以确定其特异性。

本发明提供一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其包括制备试剂2的步骤：

(1)、提取幽门螺杆菌抗原蛋白，将尿素酶基因克隆到质粒中，通过大肠杆菌发酵表达，得到重组幽门螺杆菌抗原；

(2)、制备抗幽门螺杆菌抗原克单隆抗体；

(3)、制备包被抗幽门螺杆菌抗原单克隆抗体的乳胶颗粒；

(4)、将包被抗幽门螺杆菌抗原单克隆抗体的乳胶颗粒与含有0.1％-10％电解质、0.1％-10％稳定剂、0.1％-10％表面活性剂、0.1％-5％防腐剂和1- 1000mmol/L的MES缓冲液混合即得。

在一个具体的实施例中，所述的单克隆抗体制备过程如下：

(1)抗原制备

(2)动物免疫BALB/C小鼠免疫

(3)细胞融合

(4)单克隆抗体筛选

(5)单克隆抗体制备。

在另外的一个具体实施例中，所述步骤抗体报备乳胶颗粒包括如下步骤：

(1)、将乳胶颗粒与缓冲溶液混合并加入表面活性剂，得到乳胶颗粒溶液，所述乳胶颗粒占所述乳胶颗粒溶液的质量百分比为0.01-10％；

(2)、将筛选获得的两株抗幽门螺杆菌抗原单克隆抗体溶解于缓冲溶液得到抗体溶液，所述抗幽门螺杆菌抗原单克隆抗体占抗体溶液的质量百分比为0.01- 10％，两株单抗的摩尔比是1:1；

(3)、将所述乳胶颗粒溶液与所述抗体溶液混合后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐占混合溶液的质量百分比为0.01％-5％，室温下反应2-4小时，得到包被抗幽门螺杆菌抗原单克隆抗体的乳胶颗粒。

在另外一个具体的实施例中，还包括制备试剂1的步骤，所述试剂1包括 0.1％-10％的电解质、0.1％-10％的稳定剂、0.1％-10％的表面活性剂、0.1％-5％的防腐剂，余量为浓度1-1000mmol/L的MES缓冲液。

作为优选，还包括制备校准品的步骤：以重组幽门螺杆菌抗原尿素酶为母液，用牛血清白蛋白溶液梯度稀释所述重组幽门螺杆菌抗原，即得不同浓度的校准品，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为1ng/ml-10g/L。

作为优选，所述试剂1、试剂2中的所述电解质包括但不限于氯化钠，所述稳定剂包括但不限于甘露醇，所述表面活性剂包括但不限于吐温80，防腐剂包括但不限于叠氮钠。作为优选，所述乳胶颗粒的粒径为50-500nm。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原(尿素酶)试剂的制备方法，包括制备试剂2的步骤：S1、提取幽门螺杆菌抗原(尿素酶)蛋白，将尿素酶基因克隆到pGEX-4T-1质粒中，通过大肠杆菌发酵表达，得到重组幽门螺杆菌抗原(尿素酶)；S2、制备抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体；S3、制备包被抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体的乳胶颗粒；S4、将包被抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体的乳胶颗粒与含有0.1％-10％电解质、0.1％-10％稳定剂、0.1％ -10％表面活性剂、0.1％-5％防腐剂和1-1000mmol/L的MES缓冲液混合，即得到试剂2。该方法制得的试剂是一种可直接通过粪便检测幽门螺杆菌的溶液，本发明采用粪便标本进行测试，通过乳胶增强免疫比浊法测定幽门螺杆菌的含量，具有方便快捷并且清洁卫生的特点，可以在家庭和社康中心广泛应用，仅需粪便样品即可完成检测，取样方便，对人体无安全隐患，检测效率高、稳定性好，特异性强，不易受干扰。

附图说明

图1是本发明实施例所述的定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原尿素酶的试剂盒检测试样时吸光度差值曲线图，其中x轴表示反应时间(每个点为22.5秒)，y轴表示吸光度值；

图2是本发明实施例所述的定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒测试幽门螺杆菌抗原标准品的标准曲线图，其中x轴表示幽门螺杆菌抗原的浓度(ng/ml)， y轴表示吸光度的差值。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1单克隆抗体制备

a)由公司合成能够表达上述抗原多肽的原核表达质粒pET-28a(+)，质粒命名为pET-UreA-AG/pET-UreB-AG；

b)将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET-UreA- AG/pET-UreB-AG的工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白—重组质粒pET-UreA-AG/pET-UreB-AG在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：将含有重组质粒pET-UreA-AG/pET-UreB-AG的 E.coli BL21(DE3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中， 37℃下200r/min震荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，1：100扩大培养2h，至OD600约为0.8。向菌液中加入终浓度为0.5mmol/l的IPTG，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，Lysis Buffer重悬，冰浴25min后超声破碎20min，离心收集上清。用Ni- NTA纯化上清液中的重组GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。

(2)动物免疫BALB/C小鼠免疫

第1天经眼静脉采集免疫前小鼠血清作为阴性对照。起始免疫抗原重组蛋白 20μg与等体积的弗氏完全佐剂混合,采用注射器法使抗原和佐剂充分乳化。对小鼠进行腹腔多点皮下注射。第14天加强免疫抗原用量为初始免疫量的,与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化,采用腹腔多点注射。第21天眼静脉取血,间接方法检测抗体滴度。第28天加强免疫直到产生满意的免疫效果。冲击免疫，在融合前三天进行一次免疫。

(3)细胞融合

无菌条件下取免疫后的小鼠脾脏,放入平皿中用不完全培养基冲洗脾脏组织用两只镊子剥离脾脏包膜并将脾脏组织镊碎,使细胞尽可能多地游离加入更多的不完全培养基,以利于过滤用目不锈钢丝网,过滤脾细胞。过滤前先从下面湿润网, 将细胞虑入50mL融合管将生长状态好,处于对数生长期的SP2/0细胞与脾细胞混合，比例为1:10。

以分子量为1500的PEG为介导进行融合,离心后用HAT培养基重悬细胞,并用该含有细胞的HAT培养基铺孔板,每孔2滴。置于37℃,5％CO2培养箱中培养。融合后第3天用HAT培养基半量换液，第五天、第七天分别半量换液一次。两周后换HT培养基。

(4)单克隆抗体筛选

观察杂交瘤细胞的生长情况，当克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时，取上清，用间接方法进行检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，五次后，克隆化细胞抗体阳性率为100％。将阳性克隆细胞进行进一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传代3月以上，反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

(5)单克隆抗体制备

选用12周龄以上的小鼠,腹腔注射液体石蜡,一周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后收集腹水，等体积的腹水与生理盐水混合后，利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去上清后沉淀用生理盐水重悬溶解，再此加入饱和硫酸铵至33％,弃上清，用生理盐水重悬溶解沉淀，装入透析袋，透析，AKTAproteinA层析柱层析纯化获得UreA Mab/UreB Mab，冷冻保藏备用。

实施例2标准品制备

a)由公司合成能够表达上述全长多肽的原核表达质粒pET-28a(+)，质粒命名为pET-Ure(含有编码A B亚基全长的基因序列，SEQ ID NO:5所示)；

b)将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET-Ure的工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白——重组质粒pET-Ure在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：将含有重组质粒pET-Ure的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下180r/min震荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，1：100扩大培养2h，至OD600约为0.8。向菌液中加入终浓度为0.8mmol/l的IPTG，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，Lysis Buffer重悬，冰浴30min后超声破碎25min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重组GroEL蛋白，先用含有20mmol/L咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。

本实施提供一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原的试剂的制备方法，所述试剂包括试剂1和试剂2，其中，以质量百分比计，所述R1试剂包含0.1- 10％的电解质、0.1-10％的稳定剂、0.1-10％的表面活性剂、0.1-5％的防腐剂，余量为1-100mmol/L的MES缓冲液。

实施例3、制备试剂盒

1、制备试剂1

所述试剂1由质量浓度为3％的氯化钠、质量浓度为2.5％的甘露醇、质量浓度为5％的吐温80、质量浓度为0.5％的叠氮钠和摩尔浓度为250mmol/L的MES 缓冲溶液(pH7.4)组成，按比例将上述组分混合均匀即得。

R1、试剂2制备后，分别置于试剂1盒和试剂2盒中。

2、制备试剂2

所述试剂2包括包被抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体的乳胶颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述试剂2通过如下工艺制备：

(1)、将100mg的乳胶颗粒与5ml MES缓冲液(50mM,pH 6.0)或PBS缓冲液中混合后，加入表面活性剂十二烷基磺酸钠(最终浓度0.01％)，得到乳胶颗粒溶液。

(2)、将抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体UreA Mab/UreB Mab(摩尔比为1:1)溶解于5ml MES缓冲液中(50mM,pH 6.0)或PBS缓冲液中，最终浓度达到1～10μmol/ml，得到抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体溶液。

(3)、将乳胶颗粒溶液和抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体溶液充分混合，然后加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于混合液中，室温下反应2～4小时，成功获得包被抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体的乳胶颗粒。

(4)、将4mg/mL的包被抗幽门螺杆菌抗原(尿素酶)单克隆抗体的乳胶颗粒与含有3％氯化钠、2.5％甘露醇、5％吐温80、0.5％叠氮钠和250mmol/L的MES 缓冲液(pH 7.4)混合，即得试剂2。

3、制备校准品

以通过步骤实施例2所述的基因重组技术提纯的幽门螺杆菌抗原(尿素酶) 全长为母液，使用牛血清蛋白梯度稀释母液，制备不同浓度的校准品：S5：40 ng/mL，S4：20ng/mL，S3：10ng/mL，S2：5ng/mL，S1：2.5ng/mL，其中牛血清白蛋白浓度为1ng/ml-10g/L。

4、制备质控品

以通过步骤实施例2中所述的基因重组技术提纯的幽门螺杆菌抗原(尿素酶) 为母液，使用牛血清白蛋白梯度稀释母液，制备两种浓度的质控品：C1： 4.0ng/mL，C2：1.0ng/mL，其中牛血清白蛋白浓度1ng/ml-10g/L。

5、标准曲线的制定

试剂盒测定使用全自动生化分析仪检测主波长：450nm，副波长：800nm。

试剂用量：粪便样本15μl；试剂1：305μl；试剂2：25μl，所述粪便样本通过含有如下成分的裂解液处理后得到：20mM Tris-HCl(pH7.5),1mM DTT, 2mM EDTA,2mM EGTA,25mMNaF,25mMβ-glycerophosphate,0.1mM Na3VO4, 0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.3％Nonidet P-40。

测定方法(两点终点法)：305μl试剂1加入15μl样本，于37℃反应5分钟，然后加入25μl试剂2即开始读点测得吸光度A1，10分钟之后再次读点测得吸光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，如图1所示。

制作标准曲线：采用制得的幽门螺杆菌抗原(尿素酶)校准品，浓度分别为S5：40ng/mL，S4：20ng/mL，S3：10ng/mL，S2：5ng/mL，S1：0ng/mL。按照上述步骤测得本发明幽门螺杆菌抗原(尿素酶)标准品的标准曲线，如图2所示。图 2中曲线上的每个点代表一个含量的标准品，其中x轴表示幽门螺杆菌抗原(尿素酶)的浓度，y轴表示吸光度的差值。

6、线性范围的确定

将接近线性范围上限的幽门螺杆菌抗原(尿素酶)高浓度样本100ng/mL，用生理盐水按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释，共配制成6个不同浓度的溶液，另以不含幽门螺杆菌抗原(尿素酶)的生理盐水作为空白溶液。用制作标准曲线的方法检测各浓度，将测定浓度值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为：y＝1.0552x-0.944，相关系数r＝0.9998，表明本发明试剂盒在0～100ng/mL 线性范围内相关性较好。

7、准确度测定

采用全自动生化分析仪对20例人进行粪便测定，样本来自深圳市大鹏新区葵涌人民医院。参考值：小于0.5ng/mL为阴性标本，大于等于0.5ng/mL为阳性标本，测试结果如表1所示。

表1

上述结果表明，所制得的试剂与临床病症的相关性高。

8、灵敏度测定

灵敏度定义为单位浓度吸光度的变化，用幽门螺杆菌抗原(尿素酶)校准品对幽门螺杆菌抗原(尿素酶)试剂在全自动生化分析仪上定标，记录校准品(浓度为 10ng/mL)时试剂反应的吸光度值变化为0.093，即该试剂在校准浓度为10ng/mL 时的灵敏度为0.093，灵敏度高。

9、批内精密度的测定

按本发明所述的试剂测定同一份样本10次，计算测定均值和批内精密度，测试结果如表2所示。

表2

10、抗干扰分析

干扰物选择配方和测试结果如表3所示。

表3

上述结果表明本发明所述的方法制得的试剂抗干扰能力良好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 深圳市鸿美诊断技术有限公司

<120> 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法

<130> 1

<141> 2019-09-10

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 1

Gly Phe Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val His

1 5 10 15

Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Lys Leu Val Pro Gly Glu Leu Phe Leu

20 25 30

Lys Asn Glu Asp Ile Thr Ile Asn Glu Gly Lys Lys Ala Val Ser Val

35 40 45

Lys Val Lys Asn Val Gly Asp Arg Pro Val Gln Ile Gly Ser His Phe

50 55 60

His Phe Phe Glu Val Asn Arg Cys Leu Asp Phe Asp Arg Glu Lys Thr

65 70 75 80

Phe Gly Lys Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Val Arg Phe Glu

85 90 95

Pro Gly Glu Glu Lys Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg

100 105 110

Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Arg Gln Ala Asp Asn Glu

115 120 125

Ser Lys Lys Ile Ala Leu His Arg Ala Lys Glu Arg Gly Phe His Gly

130 135 140

Ala Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Val Lys Thr Ile Lys Glu

145 150 155

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> helicobacter pylori

<400> 2

Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr

1 5 10 15

Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val

20 25 30

Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly

35 40 45

Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu

50 55 60

Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile

85 90 95

Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Thr Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu

100 105 110

Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val

115 120 125

Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln

130 135 140

Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly

145 150 155 160

Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg

165 170 175

Arg Asn Leu Lys Phe Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

180 185 190

Phe Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala

195 200 205

Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Leu Lys Ile His Glu Asp Trp

210 215 220

Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys

225 230 235 240

Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly

245 250 255

Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr

260 265 270

Val His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile

290 295 300

Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val

305 310 315 320

Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

340 345 350

Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

355 360 365

Val Gly Lys Val Ile Thr

370

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 3

Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala

1 5 10 15

Leu Cys

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 4

Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr Val His Cys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 1599

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 5

ggttttgaag cgatgtttcc tgatgggact aaactcgtaa ccgtgcatac ccctattgag 60

gctaatggaa aattagttcc tggtgagttg ttcttaaaaa atgaagacat cactatcaac 120

gaaggcaaaa aagccgttag cgtgaaagtt aaaaatgttg gcgacagacc ggttcaaatc 180

ggctcacact tccatttctt tgaagtgaat agatgcttag actttgacag agaaaaaact 240

ttcggtaaac gcttagacat tgcgagcggg acagcggtaa ggtttgaacc tggcgaagaa 300

aaatccgtag aattgattga cattggcggt aacagaagaa tctttggatt taacgcgttg 360

gttgataggc aagcagacaa cgaaagcaaa aaaattgctt tacacagagc taaagagcgt 420

ggttttcatg gcgctaaaag cgatgacaac tatgtaaaaa caattaagga gtaagaaatg 480

aaaaagatta gcagaaaaga atatgtttct atgtatggcc ctactacagg cgataaagtg 540

agattgggcg atacagactt gatcgctgaa gtagaacatg actacaccat ttatggcgaa 600

gagcttaaat tcggtggcgg taaaacccta agagaaggca tgagccaatc taacaaccct 660

agcaaagaag aactggatct aatcatcact aacgctttaa tcgtggatta caccggtatt 720

tataaagcgg atattggtat taaagatggc aaaatcgctg gcattggtaa aggcggtaac 780

aaagacacgc aagatggcgt taaaaacaat cttagcgtgg gccctgctac tgaagcctta 840

gccggtgaag gtttgatcgt aacggctggt ggtattgaca cacacatcca cttcatttca 900

ccccaacaaa tccctacggc ttttgcaagc ggtgtaacaa ccatgattgg tggcggaact 960

ggccctgctg atggcactaa cgcaaccact atcactccag gtagaagaaa tttaaaattc 1020

atgctcagag cggctgaaga atattctatg aactttggtt tcttggctaa aggtaacgct 1080

tctaacgatg caagcttagc cgatcaaatt gaagccggtg cgattggcct taaaatccac 1140

gaagactggg gcaccactcc ttctgcaatc aatcatgcgt tagatgttgc ggacaaatac 1200

gatgtgcaag tcgctatcca cacagacact ttgaatgaag ccggttgygt rgaagacact 1260

atggcagcya ttgccggacg cactatgcac acttwccaca ctgaaggcgc tggyggcgga 1320

cacgctcctg atattattaa agtagccggt gaacacaaca tyctkcccgc ttccactaac 1380

cccactatcc ctttcactgt gaatacagaa gcagaacaca tggacatgct tatggtgtgc 1440

caccacttgg ataaaagcat taaagaagat gttcagttcg ctgattcaag gatccgccct 1500

caaaccattg cggctgaaga cactttgcat gacatgggga ttttctccat caccagttct 1560

gactctcagg ctatgggccg tgtgggtaaa gttatcacc 1599

Claims (2)

1.一种用于检测幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒用于定量测定粪便中幽门螺杆菌尿素酶的试剂盒，所述试剂盒包含被抗幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体的乳胶颗粒；

其中所述的乳胶颗粒溶解在溶液2中，所述的溶液2还包括电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、缓冲液；

其中还包括溶液1以及质控品，其中溶液1包括电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；其特征在于，所述抗幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体分别特异性识别UreA的抗原表位ELIDIGGNRRIFGFNALC(命名为UreA-AG，SEQ ID NO:3)和UreB的抗原表位DTMAAIAGRTMHTVHC(命名为UreB-AG，SEQ ID NO:4)；

其中所述的单克隆抗体是通过化学交联偶联于所述乳胶颗粒表面，所述化学交联包括如下步骤：

S1、向交联缓冲溶液中加入乳胶颗粒和交联表面活性剂，得到乳胶颗粒溶液；

S2、将抗UreA的单抗与抗UreB的单抗以摩尔比1:1的比例溶解于交联缓冲溶液中，至浓度为1-10μmol/mL，得到抗幽门螺杆菌尿素酶的单克隆抗体溶液；

S3、将所述乳胶颗粒溶液与所述抗幽门螺杆菌尿素酶的单克隆抗体溶液混合，加入化学交联剂后在室温下反应2-4h，即得包被抗幽门螺杆菌尿素酶的单克隆抗体的乳胶颗粒；

所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的至少一种，在试剂中的浓度为0.1-10％；

所述稳定剂为酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白中的至少一种，在试剂中的浓度为0.1-10％；

所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin防腐剂中的至少一种，所述防腐剂在试剂中的浓度为0.1-10％。

2.一种如权利要求1所述的定量测定粪便中幽门螺杆菌尿素酶的试剂盒在制备检测幽门螺杆菌感染的产品中的应用。

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