CN113563479B

CN113563479B - 包虫病诊断试剂盒

Info

Publication number: CN113563479B
Application number: CN202110782259.6A
Authority: CN
Inventors: 杨先伟; 王文涛; 沈舒; 陈颖
Original assignee: Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture People's Hospital; West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture People's Hospital; West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113563479A

Abstract

本发明公开了一种包虫病诊断试剂盒，属于疾病诊断试剂盒领域。本发明的试剂盒将棘球蚴蛋白Eg95、AgB8/1、Em18去除信号肽后通过连接肽连接得到的融合蛋白作为捕获机体抗棘球蚴抗体的抗原，其不仅具有良好的检测包虫病的性能，还能同时分辨包虫病的两大类型：囊型包虫病(CE)和泡型包虫病(AE)，并能评估病灶大小。

Description

包虫病诊断试剂盒

技术领域

本发明属于疾病诊断试剂盒领域。

背景技术

棘球蚴病又称为包虫病，分为囊型包虫病(CE)和泡型包虫病(AE)，中国是全球高发地区之一，又以四川省患病率最高。包虫病缺乏灵敏、高效的早诊手段，加上疾病初期无明显症状，大部分病人确诊时已处于中晚期，治疗难度极大。

早期筛查、早期诊断是防控包虫病最重要的手段之一。目前的筛查手段仅有超声检查，早期发现率低、客观性差、人力物力要求高且耗时长。现有血清学检测手段特异性和敏感性不足，而新兴液体活检(棘球蚴特异DNA片段)检测条件要求高，短期内无法作为现场快速筛查手段。因此，有必要研发一种简便、快速、灵敏度高的诊断试剂盒来配合超声进行筛查，以提高早诊早治率，同时对高危、可疑的无典型影像结构特征的病例进行辅助诊断、鉴别诊断和高危人群监测、术后随访等。

天然抗原，如囊液粗抗原(EgCF)、头节抗原(EgP)等，提取工艺复杂，需大量养殖动物，产能低下且易污染环境。通过基因信息技术、重组技术等筛查出包虫病高表达的特异抗原基因工程菌种，从而获得重组抗原是目前包虫病诊断试剂盒研究的热点方向，包括rEm18、rAgB等。温浩等曾研发应用包含EgCF、EgP、AgB、Em2四种抗原成分的试剂盒，观察任意一种显示弱阳性即为阳性结果，但操作及结果解读较复杂，特异性为71％，交叉阳性时不易诊断。国外Lorenzo等一项多中心6种诊断试剂(EgCF，AgB，EgMDH等)比对后发现，诊断最高敏感性仅为81.9％。目前利用重组抗原制备的包虫病诊断试剂检测准确度还有待进一步提升。

另外，现有的诊断试剂只能大致做定性检测，难以对AE和CE进行区分，且难以评估包虫病的轻重程度。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种新的包虫病抗原以及对应的诊断试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种重组蛋白，该蛋白是棘球蚴蛋白Eg95、AgB8/1、Em18去除信号肽后通过连接肽连接得到的融合蛋白。

如前述的重组蛋白，所述Eg95、AgB8/1、Em18的连接顺序是：N端-AgB8/1-Em18-EG95-C端；

所述连接肽序列为GGGGSGGGG。

如前述的重组蛋白，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表达前述重组蛋白的DNA。

一种重组质粒，所述重组质粒包括前述的DNA的序列。

一种包虫病诊断试剂盒，所述试剂盒包括抗包虫抗体的抗原，该抗原是前述的重组蛋白。

进一步地，所述试剂盒是间接ELISA诊断试剂盒，包括所述抗原、缓冲液、连接HRP(辣根过氧化物酶)的抗人IgG抗体、TMB(四甲基联苯胺)和酶标板。

前述的重组蛋白在制备包虫病诊断试剂盒中的用途。

如前述的用途，所述包虫病诊断试剂盒是区分囊型包虫病和泡型包虫病的试剂盒。

如前述的用途，所述包虫病诊断试剂盒是评估包虫病病灶大小的试剂盒。

本发明的有益效果为：

1)本发明试剂盒用与检测包虫病的检测准确度高，其灵敏度高达93.75％，特异度为83.33％；达到了市售试剂盒的水平。

2)依据本发明试剂盒检测所得OD值，能鉴别AE或CE，诊断更为精准。

3)依据本发明试剂盒检测所得OD值，可预测病灶直径大小，为进一步的用药提供准确的依据。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：T3透析及浓缩SDS-PAGE验证。(A).T3重组蛋白透析图；(B).上清纯化浓缩图(NTA-60)。

图2：新型重组抗原T3及商用H试剂ELISA诊断试剂盒ROC曲线。红色为T3曲线，曲线下面积(AUC)为0.927；蓝色为H试剂，AUC为0.944，两者AUC无统计学差异。

图3：新型重组抗原T3及商用H试剂ELISA测定OD450nm结果。横坐标为诊断试剂，纵坐标为OD值，p＜0.0001(***)，AE的OD值显著高于CE，而在H试剂测定的AE与CE的OD值差异无统计学差异(ns)，图小标为95％置信区间。

图4：诊断试剂相关性分析及T3 OD值预测病灶直径回归模型建立。(A).T3组病灶直径和OD值具有线性关系，r＝0.707；(B).商用H试剂无线性关系；(C).以T3 OD值预测病灶直径的回归模型。

具体实施方式

实施例1重组抗原的制备

从GenBank数据库获取棘球蚴特异的Eg95(GenBank ID号：LN901900.1)、AgB8/1(GenBank登录号：AF143813.1)及四川株Em18基因序列(GenBank登录号：AY513264.1)，将基因序列特点分析后，去除信号肽和跨膜区，并在不同蛋白之间通过连接肽(linker)GGGGSGGGG连接，构建重组顺序及序列，基因表达的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

注：单实线标注的序列为AgB8/1蛋白，双实线标注的为Em18蛋白，虚线标注的为EG95蛋白。

利用软件(ExpOptimizer tool)将上述氨基酸序列对应的DNA序列按大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化，得到如下核酸序列(SEQ ID NO.2)的重组基因片段：

将前述重组基因片段构建到载体pET-22b(+)的NdeI-XhoI位点间，C端或N端融合组氨酸标签(His-tag)以便易于蛋白检测和纯化，载体上插入耐氨苄青霉素(Amp)基因序列便于筛选。然后将载体转入大肠杆菌中培养，再用IPTG诱导目的蛋白表达。目的蛋白命名为T3。

将培养系统进行离心收菌，重悬菌体，超声破碎；再离心，取上清进行NiSepharose Fast Flow亲和层析纯化，中空纤维柱浓缩离心后的上清液，板式滤器过滤，再将洗脱的目的蛋白用生物半透膜透析48h以充分脱盐和去咪唑(透析液pH7.4PBS)，最后纯化出的目的蛋白取少量进行SDS-PAGE验证、考马斯亮蓝染色和WB检测(抗体HRP-Conjugated His-Tag AntibodV：Proteintech)，以及BCA蛋白定量标准曲线法获取T3吸光值，在标曲图像上查寻及根据稀释倍数计算对应的蛋白浓度(mg/mL)。其他剩余纯化后的蛋白保存于-20℃备用。

经反复实验验证，SDS-PAGE染色、T3目的蛋白表达明显，分子量接近89kDa(图1)。最后BCA测定蛋白浓度1.5mg/mL，每管按2m分装于冻存管放于-20℃备用。

实施例2一种包虫病诊断试剂盒

本试剂盒是间接ELISA诊断试剂盒，以实施例1的T3为抗原(蛋白浓度1.5mg/mL)。

试剂盒包括如下组分：

抗原、PBST缓冲液、二抗(羊抗人IgG-HRP)、底物TMB、酶标板。

试剂盒的使用方法如下：

1)新型重组抗原T3按0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL等浓度包被酶标板，4摄氏度过夜，PBST洗板，采用5％脱脂奶粉浸板2h封闭制作96T测试板备用；

2)棋盘滴定法确定最适抗原稀释浓度和酶反应工作浓度(二抗：常规羊抗人IgG-HRP稀释1∶4000)；

3)待测血清以1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600等稀释备用；

4)室温内加100μL稀释后血清样本于测试板，放于37℃ 1h孵育后，PBST洗板3次，每次浸泡1min，280μL/孔，甩干；

5)每孔加二抗工作液100μL(使用前10min现配)，放于密闭箱37℃ 0.5h，后PBST洗涤，方法如上。

6)添加底物TMB 90μL，放于温箱37℃显色10min，注意避免出现大量沉淀形成，加入终止液50μL后，5min内在酶标仪采集A450nm OD值；

7)将两个不同病人阴性血清混匀后作为阴性对照组，测定2个OD值求平均值X及标准差SD，按截断值(Cut-off)值＝2×SD+X作为阴性对照，大于Cut-off认为阳性，否则为阴性结果。

实验例1与rEm18-Eg95(T2)抗原和市售ELISA检测试剂盒的临床检测效果比较

一、材料和方法

1.材料

1.1rEm18-Eg95抗原

在实施例1的基础上，省略T3中的rAgB8/1抗原，仅融合表达包虫的rEm18和Eg95蛋白，得rEm18-Eg95抗原，简称T2。

1.2市售ELISA检测试剂盒

购买自珠海海泰生物有限公司，商品名为包虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)，抗原以囊液粗抗原为主(AGB)，简称商用H试剂。

1.3T3抗原

即实施例1的T3。

2.血清

本研究方案经过四川大学华西医院伦理委员会、甘孜州人民医院伦理委员审批及通过，并接受四川省包虫病临床医学研究中心指导，伦理审批号为(2018-02)。所有被采集血清的患者均知情同意。包虫阳性、阴性血清来自华西医院(WCH-Hosp)、甘孜州人民医院(GZZ-Hosp)，且经过手术、影像学、穿刺、病理等确诊。对照组血清肝血吸虫、囊虫病、日本血吸虫来自华西医院及四川大学寄生虫教研室。肝良恶性肿瘤、正常健康人血清(活体肝移植自愿捐肝者提供)来自华西医院肝脏外科。血清来源及病理诊断情况如表1所示。以上血清均分装后放于-80摄氏度备用。

表1重组抗原试剂盒制备过程所需血清来源及病理诊断

3.诊断试剂盒效能评价方法及公式

如表2所示。

表2诊断实验评价方法及计算公式

4.T2、T3试剂盒间接ELISA法诊断效能评估

随机从包虫病筛查诊断血清中(表1)中抽取4个阴性血清样本，4个阳性血清样本，根据诊断试剂盒常规参数设定：空白对照OD450＜0.1，阴性样本≤0.35，阳性样本≤5.00，能将阴阳性血清较明显分开，且不易形成沉淀。根据T2或T3整体符合率较高者进行后续诊断实验及试剂盒制备。

5.新型重组蛋白T2和T3的间接FLISA法测定基本流程

同实施例2。

6.新型诊断试剂盒制备品控要求、参考标准

(1)热稳定实验

确定最佳诊断抗原包埋浓度及血清稀释比例等参数后，进行热稳定性测试，将包被好的板条放置于37度0天、4天和7天，分别检测待测样本，评估试剂盒的稳定性；

(2)重复性实验

批内批间差即同批包被不同板条/不同批包被不同板条做复孔，平均偏差需≤10％；

(3)参考标准

参考R&D.rndsystems、质检总局SN/T 4818-2017等标准。

7.商用H试剂ELISA法操作流程

(1)使用前检查试剂盒包装有效期及合格证。预先按1∶10配置洗涤液，并将血清样本按1∶100加入样品稀释液稀释。标准孔及空白孔等设置及加样根据说明书执行。

(2)加样后置于37℃±1℃温箱温育30min。

(3)弃净孔内液体，用排枪将每孔加入280μL洗涤液，摇晃洗板30min，甩净拍干，反复洗涤3次。除空白对照孔外，加IgG酶标记物50μL/孔，再放于温箱37℃±1℃温育30min。

(4)弃孔内液体，同上洗板5次，拍干后每个孔依次加显色液A、显色液B各50μL，置于温箱37℃±1℃避光反应15min。每孔加入终止液50μL，上机读数机内轻微摇晃1次。

(5)酶标仪读取450nm的OD值，临界OD值0.2～0.8(取3个孔平均值)，阳性结果大于1.1倍临界值。

8.统计学数据分析

8.1一般统计学资料

使用Excel 2016、SPSS 26.0、Graph Pad 6.0对临床回顾性数据、实验数据进行整理和分析。不同抗原检测血清计数资料的统计学比较用配对卡方检验(X2)和Kappa一致性检验。当X2检验某一表格期望值＜1时或n＜40，用Fisher卡方；当n≥40且存在任意一个1≤期望值＜5，使用Yates校正卡方。Kappa值判断标准：Kappa≥0.75，说明两种方法诊断结果一致性较好；0.4≤Kappa<0.75，说明两种方法诊断结果一致性一般；Kappa＜0.4，说明两种方法诊断结果一致性较差。不同血清与抗原反应的平均吸光度的差异比较用t检验分析。最后用ROC曲线及曲线下面积AUC来评估诊断效能。

8.2大样本量计算方法

根据T2，T3小样本诊断效能验证后，选取灵敏度、特异度较高的新型诊断抗原与现有商用试剂盒对比。

①根据商品化H试剂说明书注释，该试剂检测共计1080例包虫病流行区和非流行区人群样本，与影像学诊断比较，其灵敏度为91.0％，特异度为94.7％。

②根据如下公式：

从公式可以看出，需要灵敏度(Sensitivity，S_N)、特异度(Specificity，S_P)、患病率(Prevalance)，α，和L(容许误差)值。Z_1-α/2一般取为1.96，α取0.01时，Z_1-α/2为2.58。L即我们容许的灵敏度或特异度95％区间的宽度，是研究者人为指定，一般定在0.03～0.1。

③假定本研究新型试剂能达到商用H试剂诊断效能，根据灵敏度0.910及特异度0.947，包虫病患病率取最大值0.1209，制定容许误差为0.1，α取0.05，根据公式得出：

N1._灵敏度＝(1.96×1.96×0.91×(1-0.910))/(0.1×0.1×0.1209)＝260.24

N2._特异度＝(1.96×1.96×0.947×(1-0.947))/(0.1×0.1×(1-0.1209))＝21.93

结果显示N1＞N2，以样本量大的原则，建议本项目至少需收集260份待诊血清。以上统计量经过PASS 15软件重复验证后，结果基本一致。

8.3血清抗体水平OD值与病灶直径的相关性分析

采用Pearson检验，检验水准为双侧α＝0.05。相关系数r值0.8～1.0为极强相关，0.6～0.8为强相关，低于0.2为极弱相关或无相关。以OD值为自变量，病灶直径为因变量，建立线性回归预测模型，Durbin Watson检验模型效率。

二、结果

1.T2或T3包板条件及血清稀释浓度探索结果

1.1T2或T3抗原性检测

随机选取临床病理确诊且已行商用试剂盒(H)的验证的血清，分为阳性血清4例(26，HX49，7，HX73)和阴性血清4例(G12，20，HX6，25)。根据诊断试剂盒常规参数设定标准：空白对照OD₄₅₀＜0.1，阴性样本≤0.35，阳性样本≤5.00，能将阴阳性血清较明显分开，且不易形成沉淀。

当蛋白浓度1μg/mL及血清1∶10稀释时，T2抗原OD₄₅₀均值3.2418，T3均值2.3810，均较高，故需进一步降低浓度及稀释比例。最后，测定结果见表3。由此可见，T3整体符合率更好，T2无法区分阴阳性标本。

表3 T2或T3抗原不同血清稀释浓度及蛋白浓度测定24个阳性标本阳性率情况

1.2T3棋盘法滴定血清稀释浓度及蛋白包被浓度结果

选取T3行进一步包板条件摸索。将G12、HX6阴性血清混匀后作为阴性对照组，测定2个0D值求平均值X及标准差SD，按Cut-off值＝2×SD+X，分别对24个阳性样本检测。测定结果阳性率见表4。由于血清稀释1∶1600后Cut-off值较低，不进行阳性率检测。从阳性率结果看，0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL包被时，1∶200-1∶800均可，但是结合阴性背景的话，后续应选择0.5μg/mL或1μg/mL包被制备间接ELISA试剂盒，血清应按1∶400或1∶800稀释。

表4 T3诊断抗原不同血清稀释浓度及蛋白浓度测定24个阳性标本阳性率情况

1.3 T3重组抗原试剂盒热稳定实验及批内批间差异测试

将T3重组抗原分别按0.5μg/mL和1μg/mL包被制备间接FLISA试剂盒，随机抽取阳性血清2例(编号HX102、12)及阴性血清(G12和HX6混合阴性血清)，分别按1∶200、1∶400、1∶800稀释后测定0天、7天、14天的0D值。在1μg/mL组第7天平均下降率为22％、19％、17％，在0.5μg/mL组第7天平均下降率20％、17％、22％。两个包被浓度的热稳均符合预期，若选用0.5μg/mL的板子，血清样本推荐1∶400；若选用1μg/mL抗原包埋，血清样本推荐1∶800优先。

重复性测试显示，对HX102、12、正常人血清三组分别测试24次、12次、12次，批间差测试变异系数(Coefficient of Variation，CV)分别为1.075％、2.549％、4.125％，均低于10％，诊断试剂盒7天内诊断性能较稳定，重复性测定数据变异较小。

2.同商用H诊断试剂盒检测效能对比及大样本血清学验证

2.1包虫病新型T3抗原诊断定性检测及效能评价

采用T3抗原1.0μg/mL包板，Cut-off值为0.5271(＞0.35)，血清稀释比例为1∶400方案构建T3 ELISA 96T试剂盒8-10个备测，同时保证批间差和批内差＜5％。同时采用商用H试剂检测，用于对比效果。

人血清有AE 116例、CE 76例、肝脏非包虫病(HCC 28例、肝囊肿8例、肝血管瘤12例、肝腺瘤2例、局灶结节性增生2例)、健康人8例、非包虫寄生虫(肝吸虫8例、日本血吸虫8例、囊虫4例)。共计272例，其中包虫合计192例，非包虫病患者60例，其他寄生虫20例。

对上述272例样本血清检测后，T3的灵敏度为93.75％，特异度为83.33％，约登系数77.08％，寄生虫交叉反应30％，分别为囊虫(2/4)、血吸虫(4/8)。商用H试剂的灵敏度为88.89％，特异度为93.33％，约登系数82.22％，寄生虫交叉反应20％，分别为囊虫(2/4)、血吸虫(2/8)。两种试剂的敏感性、特异性无统计学差异，Kappa系数＜0.4，一致性差，但在交叉反应一致性尚可。值得注意的是特异性Kappa系数差异性接近0.05，可能特异性的一致性较接近。具体相关指数如下表5及统计学差异见表6。

表5新型T3诊断抗原及商用H试剂配对大样本血清验证结果

表6新型T3诊断抗原及商用H试剂诊断效能统计值

根据病理及影像确诊的272例患者，将两种诊断试剂OD值导入SPSS软件后，绘制ROC曲线。可以看到，T3曲线下面积(AUC)为0.927(95％CI：0.893-0.960)，H试剂为0.944(95％CI：0.916-0.971)，两者Z检验双侧p＝0.434，曲线下面积无差异，两者的诊断性能均较强，无显著差异(图2)。

2.2包虫病新型T3抗原检测OD值定量分析

对T3诊断试剂OD450nm值进行分析，AE的OD值为1.9414±0.6976，CE为1.1816±0.6236，两者p＜0.0001。H试剂里，AE的OD值为1.0978±0.6485，CE为1.2036±0.9198，两者采用非参数检验时p＝0.642，无统计学差异，如图3。其余吸光度差异见表7。

表7新型T3诊断抗原及商用H试剂诊断效能统计值

*p＜0.0001，OD450nm值用均数±标准差表示

上述结果表明，对于是否患有包虫病的诊断，T3抗原和H试剂的诊断性能均较强，无显著差异；但T3抗原可根据OD450nm值的大小来鉴别AE与CE，H试剂则无该性能。

2.3包虫病新型T3抗原诊断试剂盒AE/CE鉴别诊断价值

纳入192例AE/CE OD值后，根据ROC曲线求得最佳Cut-Off值为0.7821，大于0.7821认定为AE可能性大。在AE组高于Cut-Off值有114例，CE组有51例。此时，灵敏度为98.28％，特异度67.11％，约登指数65.3％，准确度85.94％，阳性预测值82.01％，阴性预测值96.23％。AUC为0.791(95％CI：0.725-0.857)。

可见，当T3抗原包板浓度为1.0μg/mL，血清稀释比例为1∶400，临界值＞0.7821有助于AE诊断，诊断价值评估为中等。

2.4 T3 OD_4s0nm测量值与包虫病灶直径相关性分析

将192例病人临床标本测量的最大直径作为病灶直径(Diameter)，同病灶直径Pearson相关分析后，重组抗原T3的Pearson相关系数(r)为0.707(95％CI：0.628～0.771)，为强相关(p＜0.0001)。而H试剂的Pearson相关系数为0.073，极弱相关或无相关(p＝0.315)。用直径作为X轴，OD值为Y轴，绘制散点图所图4所示。可见，病灶直径约在10cm常具有较高OD值，在20cm值较低。对T3重组抗原采用以0D值为自变量，直径因变量，建立回归预测模型，T3线性函数方程式如下：

Y_预测直径＝4.27×X_0D值+3.32

回归方程式Durbin Watson检验值为1.848，方差分析F值189.48，p＜0.01。方程式回归系数和常量的t检验均有统计学意义(p＜0.0001)。

此结果表明，市售H试剂无法评估包虫病灶直径，但可借助T3抗原评估包虫病病灶的大小。

综上，本发明的重组蛋白不仅能准确诊断包虫病，还能通过检测的0D450nm值对囊型包虫病(CE)和泡型包虫病(AE)进行区分，并评估包虫病病灶的大小。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

甘孜藏族自治州人民医院

<120> 包虫病诊断试剂盒

<130> GYKH1921-2021P0113088CCR4

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 766

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Met Asp Asp Gly Leu Thr Ser Thr Ser Arg Ser Val Met Lys Met Phe

1 5 10 15

Gly Glu Val Lys Tyr Phe Phe Glu Arg Asp Pro Leu Gly Gln Lys Val

20 25 30

Val Asp Leu Leu Lys Glu Leu Glu Glu Val Phe Gln Leu Leu Arg Lys

35 40 45

Lys Leu Arg Met Ala Leu Arg Ser His Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu

50 55 60

Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Leu Lys Arg Ser

65 70 75 80

Lys Asn Lys Thr Asn Lys Val Arg Val Thr Thr Ala Glu Ser Gln Leu

85 90 95

Glu Phe Glu Met Gln Lys Gly Ser Leu Gly Gln Asp Leu Phe Asp Gln

100 105 110

Val Val Arg Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Tyr Phe Gly Ile Gln

115 120 125

Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asn Pro Thr Phe Leu Arg Leu Asp Lys Lys

130 135 140

Ile Ser Ser Asn Asp Phe Ala Pro Gly Ser Glu Tyr Asp Phe Lys Phe

145 150 155 160

Met Val Lys Phe Tyr Pro Glu Asn Val Glu Glu Glu Leu Ile Gln Thr

165 170 175

Cys Thr Ile Thr His Phe Tyr Leu Gln Val Lys Ser Asp Ile Met Ser

180 185 190

Gly Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Asp Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr

195 200 205

Ala Cys Val Ala Lys Tyr Gly Pro Tyr Asp Pro Gln Ser Cys Pro Lys

210 215 220

Ser Leu Pro Ile Asp Arg Leu Ile Thr Ser Lys Glu Gln Tyr Asp Gln

225 230 235 240

Thr Asp Glu Gln Trp Tyr Glu Arg Ile Ile Ala Tyr Tyr Lys Asp His

245 250 255

His Asp Met Ser Arg Glu Asp Ala Met Val Gln Tyr Leu Gln Ile Ala

260 265 270

Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Glu Thr Phe Asn Ile Lys Asn Lys

275 280 285

Lys Gly Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly Leu Ser Ile

290 295 300

Tyr Glu Pro Gly Asn Leu Leu Asp Pro Lys Ile Gly Phe Pro Trp Ser

305 310 315 320

Glu Ile Arg Asn Leu Ser Phe His Asp Lys Lys Phe Ile Ile Lys Pro

325 330 335

Ala Asp Lys Ser Ala Lys Glu Phe Phe Phe Leu Val Glu Lys Ser Lys

340 345 350

Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Thr Gly Asn His Glu Leu Tyr

355 360 365

Met Arg Arg Arg Lys Ser Asp Ser Ile Glu Val Gln Gln Met Lys Ile

370 375 380

Gln Ala Lys Glu Glu Arg Glu Leu Lys Glu Ala Glu Arg Gln Arg Leu

385 390 395 400

Lys Glu Glu Arg Leu Gln Arg Met Glu Asn Glu Gln Lys Leu Arg Glu

405 410 415

Leu Arg Ala Gln Met Val Glu Lys Glu Ser Asp Leu Ala Asp Met Lys

420 425 430

Asn Lys Ala Ser Ala Tyr Glu Ser Lys Ile Ala Glu Leu Glu Met Leu

435 440 445

Leu Gln Gln Glu Arg His Ala Arg Glu Ser Leu Gln Lys Ser Gln Asp

450 455 460

Lys Leu Ala Glu Met Asn Arg Lys Leu Lys Glu Glu Thr Ala Ala Ser

465 470 475 480

Ala Glu Glu Arg Asp Arg Leu Met Ala Gln Arg Asp Glu Val Gln Arg

485 490 495

Glu Val Glu Ala Gln Lys Val Ala Met Ala Lys Lys Glu Ala Glu Lys

500 505 510

Ala Gln Ala Glu Ala Glu Leu Arg Arg Met Arg Glu Lys His Asp Ala

515 520 525

Lys His Lys Ser Gln Val Asn Gly Ser Gly Asp Ala Ala Ser Gln Asp

530 535 540

Asp Glu Ser Glu Ala Lys Glu Leu Glu Val Ile Pro Asn Val Arg Arg

545 550 555 560

Thr Glu Glu Ser Arg Val Thr Ala Val Ser Lys Asn Glu Thr Leu Gln

565 570 575

Thr Lys Leu Ala Asn Leu Lys Met Glu Leu Ser Ser Thr Arg Asp Gln

580 585 590

Ser Lys Met Arg Asp Ile Asp Arg Arg His Glu Tyr Asn Val Arg Glu

595 600 605

Gly Asn Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Asn Ile Arg Lys Gly Asn Thr

610 615 620

Met Cys Arg Val Glu Gln Phe Glu Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly

625 630 635 640

Gly Gly Gly Gln Glu Tyr Arg Gly Arg Gly Ile Glu Ile Lys Thr Thr

645 650 655

Glu Ser Pro Leu Arg Lys His Phe Ser Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln

660 665 670

Gly Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Pro Asp Leu Arg Gly

675 680 685

Thr Asn Ile Ser Leu Lys Ala Leu Asp Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr

690 695 700

Lys Arg Gln Thr Ala Gln Phe Ser Asp Gly Gln Leu Ala Ile Gly Arg

705 710 715 720

Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Gln Met Thr Val Glu Ala Val Arg Gly

725 730 735

Lys Asn Thr Thr Leu Lys Phe Thr Glu Asp Ile Lys Thr Leu Arg Ile

740 745 750

Gly Glu Lys Glu Ser Thr Leu Glu His His His His His His

755 760 765

<210> 2

<211> 2400

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

catatgcttc tcgctctggc tctcgtctca ttcgtggtgg ttactcaggc tgatgatggc 60

ctcacctcga cgtcgaggag tgtgatgaaa atgtttggcg aagtgaagta cttcttcgaa 120

cgtgatccgt tgggtcagaa agtggttgac ctcttaaagg aactggaaga agtgttccag 180

ttgttgagga agaagctacg catggcactc aggtcccacc tcagagggtt gattgctgaa 240

ggtgaaatgt tgaagaggag taagaataag acgaataagg tcagggtgac tacagctgag 300

tcacagttag agtttgagat gcagaagggc tctttgggcc aggatctctt cgatcaagtg 360

gtccgcacca taggtcttcg tgaagtctgg tacttcggaa tccagtacat cgacaaagac 420

ggcaatccaa cctttctaag actggataag aaaatttcga gtaacgattt tgcacctggt 480

tctgaatacg acttcaagtt catggtcaag ttctaccccg agaatgtcga ggaggaactc 540

attcaaactt gcacaatcac tcatttctac cttcaggtca agagcgacat aatgtctggc 600

aaaatctact gcccaactga cactgctgtc ctgctggcgt cgtatgcctg tgttgccaag 660

tatggtccgt acgacccaca gtcgtgccct aagagtttgc ctatcgatcg actgattacc 720

agcaaggaac agtacgatca aaccgacgag caatggtacg agcggatcat agcatactac 780

aaggaccacc atgacatgtc tcgcgaagat gcaatggttc agtatctaca aattgcacag 840

gatctggaga tgtatggtgt ggagaccttt aacatcaaga ataagaaggg aacatctctc 900

gttcttggtg ttgatgctct cggtttgagc atatacgaac ctggtaattt attggaccct 960

aaaattggtt ttccttggtc ggaaattcga aatctctctt ttcacgacaa gaagttcatc 1020

atcaaaccgg cagacaagtc cgcaaaggag tttttcttct tggtggaaaa atccaagatt 1080

aacaagcgca ttttggcatt gtgtactggc aaccatgagc tctacatgcg tagaagaaag 1140

tcagactcta ttgaggtgca acagatgaag attcaggcca aggaggaacg tgaattgaag 1200

gaggctgaga gacaacgcct gaaggaggaa cgattgcaac gtatggaaaa tgaacagaaa 1260

ctgcgggagc ttcgtgctca aatggtcgaa aaggagtctg acttagcgga tatgaagaat 1320

aaggcatctg cctatgagag taagattgcg gagctggaga tgctgctaca gcaggagcga 1380

catgcgcgtg agagtcttca gaagagccaa gacaaactgg cggagatgaa cagaaagctg 1440

aaggaggaga ctgcggcatc agccgaagag cgcgaccgtc tgatggccca gcgtgacgaa 1500

gtgcaacgcg aagttgaggc tcagaaggtc gccatggcca agaaggaagc tgaaaaggct 1560

caggctgaag ctgagcttcg cagaatgcgt gagaaacacg atgcaaagca caagtcccag 1620

gtcaatggca gtggtgacgc tgcttcgcag gatgatgaaa gtgaagccaa ggaacttgag 1680

gtgataccaa atgtgaggcg gacggaggaa tcgagggtga cggccgtctc taagaatgag 1740

acgctccaga cgaagctggc caacctcaaa atggagttga gctcgacacg cgatcagtcg 1800

aaaatgcgcg acattgatcg tcgtcatgag tacaatgtgc gggagggtaa tgacaagtac 1860

aagacactgc gcaacattcg caagggcaac accatgtgtc gtgttgaaca gtttgagtcg 1920

atgatggcat tgcagttatg tctcattttg tttgcgactt caattttggc tcaggaatac 1980

agaggaaggg gcattgagat aaagacaaca gagagtccac tccgtaaaca cttcagtttg 2040

actcttgtgg gttctcaggg cattcgctta agttgggatg tccagcactt gcctgacctc 2100

agaggaacaa atatttccct aaaagcgttg gatccttctg accccctagt ctacaagaga 2160

caaactgcac agttctcgga tggacaactc gccatcggca gactgaagcc ttccacatta 2220

taccaaatga ctgtagaagc agtgagaggg aaaaatacca ctttgaaatt caccgaagac 2280

ataaaaacac ttcgcattgg cgagaaagaa agcaccgtaa tgactagtgg atccgcctta 2340

acatccgcaa tcgccggttt tgtgttcagc tgcatagtaa ttgtccttac ttgactcgag 2400

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于：该蛋白是棘球蚴蛋白 Eg95、AgB8/1、 Em18 去除信号肽后通过连接肽连接得到的融合蛋白；所述 Eg95、AgB8/1、Em18 的连接顺序是：N端-AgB8/1-Em18-EG95-C端；所述连接肽序列为GGGGSGGGG；所述重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1 所示。

2. 一种 DNA，其特征在于：所述 DNA 的序列如 SEQ ID NO.2 所示。

3. 一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包括如权利要求2所述的 DNA 的序列。

4.一种包虫病诊断试剂盒，所述试剂盒包括抗包虫抗体的抗原，其特征在于：所述抗原是权利要求1所述的重组蛋白。

5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是间接 ELISA 诊断试剂盒，包括所述抗原、缓冲液、连接 HRP 的抗人IgG 抗体、TMB和酶标板。

6.权利要求1所述的重组蛋白在制备包虫病诊断试剂盒中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述包虫病诊断试剂盒是区分囊型包虫病和泡型包虫病的试剂盒。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述包虫病诊断试剂盒是评估包虫病病灶大小的试剂盒。