KR102466369B1

KR102466369B1 - 자가면역 뇌염의 진단 방법

Info

Publication number: KR102466369B1
Application number: KR1020200097184A
Authority: KR
Inventors: 이순태; 배지연; 이상건; 주건
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2022-11-14
Also published as: KR20220017101A; WO2022030944A1

Abstract

본 발명은 자가면역 뇌염의 진단을 위한 신규 표적, 이를 이용한 자가면역 뇌염의 진단 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규의 진단 표적을 이용하여 자가면역 뇌염을 감별함으로써 보다 정확하고, 빠르게 자가면역 뇌염 질환 관련 정보를 제공할 수 있고, 이에 따라 원인에 따른 뇌염 치료를 신속하게 진행할 수 있어 보다 효과적인 치료가 가능한 효과가 있다.

Description

자가면역 뇌염의 진단 방법 {DIAGNOSIS METHOD FOR AUTOIMMUNE ENCEPHALITIS}

본 발명은 자가면역 뇌염에서 확인되는 신규의 항체를 이용한 자가면역 뇌염의 진단 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.

자가면역 뇌염은 주로 항체-매개 뉴런 또는 시냅스 기능 장애에 의해 유발되는 급격한 질환 스펙트럼이다. 2007년에 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NMDAR) 뇌염이 발견된 이후, 여러 다른 시냅스 자가 항체가 확인되었다. 그러나, 현재의 진단은 자가면역 뇌염의 절반의 경우에만 질병 항체를 검출할 수 있는 문제가 있고, 여전히 숨겨진 항체가 발견되지 않은 경우가 많다. 이러한 항체 검출 없이, 자가면역 뇌염의 진단은 바이러스 및 다른 병인의 배제에 기초하여야 하는 문제가 있기 때문에 치료가 지연될 수밖에 없는 문제가 존재한다. 조기 면역 요법은 자가면역 뇌염의 치료에 가장 바람직하고, 이를 위해서는 항체의 조기 검출이 필요하다. 시냅스 항체가 공격적인 뉴런 손실 없이 더 가역적이기 때문에 항체의 검출은 정확한 면역 요법 및 예후 예측을 가능하게 한다.

Voltage-gated ion channels은 자가면역 뇌염의 주요 대상이다. LGI1, Caspr2 및 DPPX에 대한 항체는 전압-게이트 K⁺ 채널 복합체의 인접 단백질 또는 조절 서브 유닛을 표적으로 한다. 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 관점에서, P/ Q^- 타입 또는 N^- 타입 VGCC에 대한 항체는 여러 경우의 자가면역 뇌염에서 발견되었지만, 항체가 질병-병원성인지 확실하지 않다. 그러나, VGCC의 조절 서브 유닛과 관련된 자가면역 항체는 아직 확인되지 않았다.

이러한 배경 하에, 현재 국내외에서 관련 환자가 지속적으로 증가하고 있으며 이에 대한 추가적인 진단 방법이 필요함을 고려할 때, 관련 기술 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0019927호 대한민국 등록특허 제10-1875788호

이에 본 발명자들은 자가면역 뇌염 환자에서 확인되는 신규 자가 항체를 확인하고, 이를 통해 자가면역 뇌염의 진단이 가능함을 확인하였다. 특히, 해당 자가면역 항체는 이 분야에서 보고되지 않은 시냅스 전 VGCC의 보조 서브 유닛을 표적으로 하고 있으며 질환의 진단에 우수한 효과를 나타낸다는 점에서 기술 차별성이 존재한다.

본원은 VGCC 알파2델타1 서브유닛(α2δsubunit of VGCC (voltage-gated calcium channel)) 즉, CaVα2δ를 항원으로 이용한다.

이에 본 발명은 CaVα2δ 자가 항체를 특이적으로 검출할 수 있는 에피토프 및 이의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명은 VGCC 알파2델타1 서브유닛(α2δsubunit of VGCC (voltage-gated calcium channel))의 에피토프로 표시되는, CaVα2δ 자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 상기 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵세포를 포함하는 형질전환세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 에피토프를 포함하는 CaVα2δ에 대한 자가항체 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 에피토프를 이용한 자가 면역 뇌염의 진단 방법을 제공한다.

이를 위해 본원에 따른 하나 이상의 에피토프를 제공하는 단계; 상기 에피토프와 시료를 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 에피토프-항체 복합체가 형성되고; 그리고 상기 에피토프-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 에피토프-항체 복합체 검출결과가 대조군의 결과와 비교하여 양성인 경우 상기 시료를 자가면역 뇌염으로 진단하는 CaVα2δ 자가 항체 검출 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 다양한 시료, 예를 들면 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 눈물 또는 타액 중 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 에피토프 및 검출 항체를 포함하며, 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 칼라 라텍스입자를 포함하는 칼라 입자를 포함하는 물질로 표지된 것인, 자가면역 뇌염 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트에서 에피토프는 고상지지체 예를 들면 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인에 결합된 형태로 제공될 수 있다.

본원은 자가 면역 뇌염 환자에서 발견되는 신규한 CaVα2δ 자가항체를 확인하였다. 또한, 이를 인식할 수 있는 CaVα2δ에 존재하는 기능적 서열들을 분석하여 해당 서열을 기초로 CaVα2δ 자가항체를 검출하여 자가 면역 뇌염의 진단의 우수한 효과를 확인하였다.

이에 한 양태에서 본원은 VGCC 알파2델타1 서브유닛(α2δsubunit of VGCC (voltage-gated calcium channel))의 에피토프로 표시되는, CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 제공한다.

본원에서 사용된 용어, "에피토프(epitope)"는 특정 항체에 의해 인식될 수 있는 항원의 한 부분으로 본원에서는 펩타이드로 제작되었다. 본원의 전반에 걸쳐 에피토프 및 펩타이드는 서로 교환적으로 사용될 수 있다.

또한, 본원의 에피토프 보다 큰, 본원의 에피토프를 포함하는 단리 또는 정제된 단백질 또는 펩타이드 분자가 여전히 본원의 범위에 포함된다.

구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ의 폴리펩타이드에 관한 것일 수 있다.

"전압 개폐 칼슘 채널" (VGCC)은, 칼슘 이온 Ca²⁺의 투과성이 막 전위와 관련된, 흥분된 세포의 막에 존재하는 전압 개폐 이온 채널, 바람직하게는 인간 전압 개폐 칼슘 채널의 그룹을 지칭한다. 전압 개폐 칼슘 채널은 수개의 상이한 서브유니트의 복합체로 형성된다. 공지된 서브유니트에는 기공-형성 Cavα1, 세포내 Cavβ막관통 Cavγ이황화-연결 이량체 Cavα2δ가 있다. α1 서브유니트는 VGCC에서 채널 기능에 필요한 기본 서브유니트이고, 각각 이온 전도 기공을 형성하는 6개의 막관통 α-나선을 함유하는 특징적인 4개의 상동 I-IV 도메인으로 이루어지며, 결합된 서브유니트는 개폐의 조절을 포함하여, 여러 가지 기능을 갖는다. 전압 개폐 칼슘 채널은, 전체 채널의 활성화 임계값을 설정하는 그의 α1 서브유니트에 의해 기능화된다. α1 서브유니트의 비제한적인 예에는 Cav1.1, Cav1.2, Cav1.3, Cav1.4, Cav2.1, Cav2.2, Cav2.3, Cav3.1, Cav3.2 및 Cav3.3이 있다. 본원에 따른 에피토프는 CaVα2δ의 특정 영역에 위치한다. 이러한 에피토프는 CaVα2δ항체에 의해 인식될 수 있는 항원의 한 부분을 포함한다. 본원 발명은 위 항체를 인식할 수 있는 항원 영역을 본 발명 내 포함할 수 있다.

본원에서는 에피토프가 상술한 바와 같이 특정 영역 유래의 서열로 특징되는 것은 물론 구조에 따른 차별적 특징을 또한 가질 수 있다. 예를 들어, 본원의 에피토프가 CaVα2δ에서 위치하는 영역에 따라 선형 및/또는 원형 구조의 에피토프가 작용할 수 있다.

따라서 본원에 따른 에피토프 펩타이드는 선형의 펩타이드로 사용될 수 있거나, 또는 구조적 변형을 만들기 위해 상기 에피토프 펩타이드의 서열의 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 추가할 수 있거나, 추가 없이 그 자체로 양 말단 또는 양 말단 부근 아미노산 잔기 사이의 결합을 통해 원형 구조를 형성할 수도 있다.

본원의 펩타이드는 본원에 기재된 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체에 대한 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다.

따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본원의 에피토프 또는 이를 코딩하는 핵산은 본원에 개시된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본원의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 얼라인먼트의 다양한 방법 및 알고리즘은 공지되어 있으며 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch,. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and harp, Gene (1988) 73:237-44 에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et l., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, blastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다.

본원 발명에서는 CaVα2δ자가 면역 항체에 대한 전반적 검출을 위하여, 서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ의 폴리펩타이드을 사용하였다. 이러한 폴리펩타이드 서열들을 위 언급한 에피토프 영역을 포함하며, 이에 따라 상기 언급한 자가 면역 항체에 대한 항원으로서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 에피토프를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵세포 또는 형질전환체에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어, "핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본원의 핵산분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 본원의 핵산분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본원의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명에 따른 에피토프를 코딩하는 핵산은 VGCC 알파2델타1 서브유닛(α2δsubunit of VGCC (voltage-gated calcium channel))의 에피토프, 항원 또는 펩타이드를 코딩하는 것으로서, CaVα2δ자가 항체 검출을 할 수 있는 에피토프, 항원 또는 펩타이드를 코딩하는 것이라면 어떠한 것이라도 본 발명에 포함된다.

본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드 서열을 항원 서열로 사용하였다.

이에 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본원에 따른 핵산을 포함하는 재조합벡터는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 이러한 벡터에서 핵산분자는 발현을 위해 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이와 같은 조절서열의 영향아래 조절되어 발현될 수 있도록 동작가능하게 결합되어 있다. 본원의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본원에 따른 재조합벡터를 포함하는 형질전환체, 또는 원핵 또는 진핵세포는 본원에 따른 벡터로 형질전환 또는 전달 이입된 세포이다. 본 명세서에서, 숙주세포로의 "형질전환" 및/또는 "형질감염"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포좀을 이용한 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 상기 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하여 수득한 에프토프는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.

본원에 따른 펩타이드는, 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation) 또는/및 C-말단을 아미드화(amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본원의 상기 펩타이드는 또한 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여, 융합 파트너 및 본원의 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 이를 숙주 세포에 형질전환시킨 후, 융합 단백질 형태로 발현하고, 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본원의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다.

본원에 따른 에피토프 펩타이드는 항-CaVα2δ 자가항체 (또는 CaVα2δ 자가항체로도 칭함)를 특이적으로 인식한다.

자가면역 뇌염은 최근 새롭게 밝혀지게 된 병으로, 전체 뇌염 환자의 약 절반이 자가면역 뇌염에 해당된다. 자가면역 뇌염의 경우, 통상적으로 자가항체 검출을 통해 진단하게 되나, 원인 항체의 종류가 다양하고, 계속해서 새로운 항체가 발굴되고 있어, 기존의 항체 검사 키트만으로는 정확한 진단이 어려운 측면이 존재한다. 즉, 명세서에 사용되는 바와 같은 "자가면역 뇌염"은 하나 또는 하나 이상의 자가항체의 발생과 관련된 뇌염을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 자가항체로는 현재까지 예를 들어 NMDAR (EP2057466 B1), GABA(A) (EP2863231 A1), GABA(B) (EP2483417 B1), DPPX (US9719993 BB), LgI1 또는 CASPR2 (US9250250 BB), IGLON5 (EP2905622 A1), SNARE (EP17001205), NBC1 (EP3026434 A1), flotillin (EP3101424 A1), DAGLA (EP18196867), 및 ITPR (EP3018478 A1) 등 정도만이 알려져 있고, 아직 알려지지 않은 다수의 자가 항체가 존재한다.

이에 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 하나 이상의 에피토프를 포함하는 CaVα2δ에 대한 자가항체 검출용 조성물 또는 키트, 또는 본원에 따른 에피토프, 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용한 CaVα2δ 자가항체 검출 방법에 관한 것이다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 에프토프에 의한 자가항체의 검출 특징은 특히 자가 면역 뇌염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 진행 단계 결정 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

이에 본원은 다른 양태에서 본원에 따른 하나 이상의 에피토프를 제공하는 단계; 상기 에피토프가 시료와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 에피토프-항체 복합체가 형성되고; 그리고 상기 에피토프-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 에피토프-항체 복합체 검출결과가 대조군의 결과와 비교하여 양성인 경우 CaVα2δ의 존재를 확인하는, CaVα2δ 자가항체 검출 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 시료는 자가면역 뇌염이 의심되는 사람 또는 자가면역 뇌염에 걸린 사람 또는 자가면역 뇌염으로 진단 후 치료를 받고 있는 사람 유래의 시료다.

이러한 시료는 CaVα2δ 자가항체를 검출할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 혈장, 뇌척수액 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 혈액, 특히 혈청이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 항원-항체 복합체는 공지된 다양한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들면 항원-항 체 복합체는 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역침전분석, RIA (Radioimmunoassay), 경쟁적 간접면역현광법 (competition indirect immunofluorescent assay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 검출될 수 있다. 이런 방식의 검출은 특히 항원이 가용성단백질로 제공되는 경우에 유리하며, 일 구현예에서는 CaVα2δ의 세포외영역 단백질 부분이 항원으로 제공될 수 있다. 본원에 따른 일구현예에서는 ELISA 방법, 특히 샌드위치 방식의 ELISA가 사용되며, 이 경우 후술하는 검출항체가 또한 사용된다.

다른 구현예에서 항원이 세포의 형태로 제공되는 경우에는 세포기반 분석 방법 예를 들면 FACS (Fluorescenceactivated cell sorting) 분석법, 항체를 이용한 세포면역염색방법 예를 들면 본원 실시예에 기재된 바와 같은 면역형광세포염색 (immunofluorescence cell staining)이 사용될 수 있다.

항원-항체 복합체 검출 과정을 통해 시료의 최종적인 시그널의 세기를 분석하고 이를 정상 대조군(자가 면역 뇌염이 걸리지 않은 대조군)의 시료의 시그널과 비교하여, 이보다 높은 경우 자가 면역 뇌염으로 진단하거나, 치료 경과에 대한 판단을 할 수 있다.

본원에 따른 일 구현 예에서, 항원-항체 복합체의 검출을 위해, 항원 에피토프가 후술하는 표지물질로 표지되거나 또는 항원에 결합한 인간 Ig를 검출하는 검출항체가 표지될 수도 있다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 검출 항체는, 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제 (catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제 (malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 그리고 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있는 효소로 표지될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예에서, 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 광의 조사에 의해 조사된 광과 상이한 파장의 광을 방출하는 바이로루미네슨스, 케미루미네슨스, 일렉트로루미네슨스, 일렉트로케미루미네슨스 및 포토루미네슨스에 사용되는 발색단으로 예를 들면 단백질로서 그린형광단백질; 유기화합물로서 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), 그리고 플루오르카민(fluorecamine)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구현예에서, 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 다양한 방사선 동위원소 물질로 표지될 수 있다. 본원에서 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다. 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있다. 또한, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 예를 들면 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자 등과 같은 나노입자를 포함하는 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 상기한 본원에 따른 방법에 사용되는, 이로 제한하는 것은 아니나 에피토프가 결합된 고상지지체 및 검출항체를 포함하며, 상기 항원 또는 검출 항체는 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자를 포함하는 나노입자를 포함하는 물질로 표지되는 것인 자가 면역 뇌염 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.

본원에 따른 키트에 포함되는 구성 중 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다.

본원에 따른 키트에서 본원에 따른 항원은 96웰 마이크로웰플레이트와 같은 마이크로웰플레이트, 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법 또는 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석방식으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 항원에 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 상술한 바와 같은 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 또한 면역분석 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 등과 같은 상술한 물질로 표지된 2차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 본원에 따른 방법 또는 키트는 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 사용될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 지지체의 표면에 항원이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에 서 입수할 수 있다.

또한 본원의 키트는 본원에 따른 바이오 마커의 사용법에 관한 안내서를 포함할 수 있다. 또한 대조군에 특이적인 항체 또는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 등을 추가로 포함할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 자가 면역 뇌염 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원은 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 CaVα2δ1에 대한 자가 항체 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일시양태에 따르면, 환자 시료를 이용하여 신규의 자가 항체로 항-CaVα2δ 항체를 확인하고, 이를 면역 조직 화학 염색을 통해 확인함으로써 자가 면역 뇌염의 진단이 가능함을 확인하였다. 또한, 위 CaVα2δ1에 대한 자가 항체 검출이 가능함을 확인하였다.

본원에 따른 조성물은 자가 면역 뇌염의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드 항원은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. CaVα2δ를 발현하지 않는 세포의 경우 CaVα2δ를 발현하는 플라스미드를 해당 세포에 전달이입하여, 이를 발현시켜 사용할 수 있다.

본원에 따른 시료는 자가 면역 뇌염이 의심되는 사람 또는 자가 면역 뇌염에 걸린 사람 또는 자가 면역 뇌염으로 진단 후 치료를 받고 있는 사람 유래의 시료다.

이러한 시료는 CaVα2δ 자가항체를 검출할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 혈액, 특히 혈청이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 항원-항체 복합체는 공지된 다양한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들면 항원-항체 복합체는 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역 침전분석, RIA (Radioimmunoassay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 검출될 수 있다. 이런방식의 검출은 특히 항원이 가용성 단백질로 제공되는 경우에 유리하며, 일 구현예에서는 CaVα2δ의 세포외영역 단백질 부분이 항원으로 제공될 수 있다. 본원에 따른 일구현예에서는 ELISA 방법, 특히 샌드위치 방식의 ELISA가 사용되며, 이 경우 후술하는 검출항체가 또한 사용된다.

항원-항체 복합체 검출 과정을 통해 시료의 최종적인 시그널의 세기를 분석하고 이를 정상 대조군의 시료의 시그널과 비교하여, 이보다 높은 경우 자가 면역 뇌염으로 진단하거나, 치료 경과에 대한 판단을 할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 항원-항체 복합체의 검출을 위해, 항원이 후술하는 표지물질로 표지되거나 또는 검출항체 또는 2차 항체가 사용된다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphatedehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 그리고 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있

는 효소로 표지될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구현예에서, 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 다양한 방사선 동위원소 물질로 표지될 수 있다.

본원에서 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다. 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있다. 또한, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 자가 면역 뇌염 진단용 키트에 관한 것으로, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드 항원이 흡착된 고상지지체 및 검출항체를 포함하며, 상기 항원 또는 검출 항체는 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자를 포함하는 나노입자를 포함하는 물질로 표지되는 것인 자가 면역 뇌염 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.

본원에 따른 키트에 포함되는 구성 중 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다. 본원에 따른 키트에서 본원에 따른 항원은 96웰 마이크로웰플레이트와 같은 마이크로웰플레이트, 콜로이드성 금 입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법 또는 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석방식으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 항원에 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 상술한 바와 같은 ³H 또는¹²⁵I와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 또한 면역분석 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 등과 같은 상술한 물질로 표지된 2차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 본원에 따른 방법 또는 키트는 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 사용될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 지지체의 표면에 항원이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 자가 면역 뇌염을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 상기 항원을 시료와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 항원-항체 복합체가 형성되고; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 검출결과 항원-항체 복합체 검출결과가 양성인 경우 자가 면역 뇌염으로 진단하는, 자가 면역 뇌염의 진단 방법에 관한 것이다.

상기 본원의 방법에 사용되는 펩타이드, 항원-항체 복합체 검출 등에 관하여 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다.

본 발명에 따른 신규의 진단 표적을 이용하여 자가면역 뇌염을 감별함으로써 보다 정확하고, 빠르게 자가면역 뇌염 질환 관련 정보를 제공할 수 있고, 이에 따라 원인에 따른 뇌염 치료를 신속하게 진행할 수 있어 보다 효과적인 치료가 가능한 효과가 있다.

도 1은 알려지지 않은 항체의 검출 및 항원으로 확인 결과를 나타낸다.
구체적으로, 대조군 CSF(a, b)는 음성 염색을 가지는 반면, 두 환자 시료로부터 CSF 시료(case #1= c, d, case #2= e, f)는 hippocampal layers, basal ganglia, and cortex에 결합하는 랫트 뇌 섹션을 염색하였다 (b, d, f = a, c, e의 inlet에서 확대도). 환자 시료는 또한 1 차 배양된 랫트 뉴런의 뉴런 수상 돌기 (g = 대조 혈청, h = 환자 혈청)를 염색하였다. CaVα2δ과발현 293T 세포는 293T 세포 (i)에 기초하여 제조되었고 CaVα2δ에 대한 상업적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다. 상업적인 항체는 CaVα2δ과발현 세포 (j)를 염색하였고, 대조군 혈청은 세포 (k)의 면역 염색을 나타내지 않았다. case # 1 (l) 및 case # 2 (m)의 혈청 샘플은 세포의 면역 염색에 양성이었다. CaVα2δ과발현 세포 및 정상 293T 세포를 50:50 비로 혼합하여 위-양성 백그라운드 염색 (j-m)을 배제하였다. 스케일 바 = 50 μm.
도 2는 환자의 MRI 이미지를 나타낸다.
구체적으로, case # 1의 환자는 수막염 단계, 뇌염 단계 및 회복 단계 (a-h)에서 뇌 MRI를 나타낸다. case # 2의 환자는 뇌염 단계에서만 MRI를 받았다 (i). case # 1 환자가 수막염 단계에서 뇌량팽대 병변을 보인 반면, 두 환자 모두 심각한 뇌 기능 장애에도 불구하고 뇌 MRI에 이상이 없었으며, 이는 시냅스 항체 관련 자가면역 뇌염을 시사한다. 각 환자의 윗줄과 아랫 줄은 다른 수준에서 다른 섹션을 보여준다. a, d=diffusion-weighted images; b, e, h, i= fluid-attenuated inversion recovery images; c, f=T1-enhanced images; g=T2-weighted images.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

환자 및 항체 스크리닝

2016 년 6 월 1 일부터 2019 년 2 월 28 일까지 혈청 및/또는 CSF 샘플은 자가면역 뇌염에 대한 항체 검사를 위해 서울대학교병원 기관에 위탁되었다. 이전에 알려진 방법에 따라 뇌 조직에 자가 항체가 있는지 확인하기 위해 면역 조직 화학 염색법으로 시료를 처음으로 쥐 뇌 부분에 반응시켰다. 이어서, 공지된 항체에 대해 통상적인 항체 분석 키트 (Euroimmune Ag, Germany)로 시료를 스크리닝하였다. 세포-기반 분석을 위한 항원은 NMDAR, LGI1, Caspr2, AMPA 및 GABA-B 수용체를 포함하였다. 면역 블롯팅 분석 항원은 amphiphysin, CV2 / CRMP5, PNMA / Ma2 / Ta, Ri, Yo, Hu, Recoverin 및 Sox1을 포함하였다. 시료가 랫트 뇌 섹션에 대한 양성 면역 조직 화학 염색 및 통상적인 항체 분석 키트에 대한 음성 반응성을 생성하는 경우, "알 수 없는 항체"를 갖는 시료로서 정의하였다. 이 연구는 서울 대학교 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받았으며, 환자들로부터 서면 동의서를 얻었다.

면역 침강 및 LC-MS/MS 분석

가능한 항원 후보를 확인하기 위해, 전반적으로 일차 랫트 해마 뉴런 세포 배양, 면역 침강 및 LC-MS/MS는 이전에 공개된 방법을 따랐다. 간략하게, 세포를 환자 혈청과 함께 배양하고 (1: 200으로 희석) 단백질 A/G 아가로스 비드 (Thermo Fisher Scientific)로 처리하였다. 표적 세포 표면 항원에 결합된 환자 항체를 갖는 A/G 비드를 digestion시키고 LC-MS/MS 분석을 위해 후속 절차를 진행하였다. Proteome Discoverer 1.4 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 가능한 표적 항원을 나열하였다. LC-MS/MS에서 파생된 수많은 단백질 목록 중에서, 환자가 대뇌 변연계 뇌염을 가지고 있었기 때문에 시냅스 수용체를 중심으로 검토를 하였다. 해마는 쥐 뇌에서 양성 면역 염색의 주요 영역이었다. 여러 시행 착오 실험 후, CaVα2δ가 다음 후보 목표로 선택되었다.

렌티바이러스 벡터 및 과발현 세포주 구축

CACNA2D1 유전자의 전장 코딩 서열을 인간 정상 조직으로부터의 cDNA를 사용하여 증폭시키고 다음 프라이머로 클로닝하였다 : CACNA2D1_ EcoRI 정방향, 5'-CTCAAGCTTCGAATTC ATGGCTGCTGGCTGCCTG -3' (서열번호 3) 및 역, 5'-GGGTTCTTTGGCTGAAGATTTG -3' (서열번호 4) 및 CACNA2D1_ RamHI 정방향, 5'-CAAATCTTCAGCCAAAGAACCC-3 ' (서열번호 5) 및 역방향, 5'-TAGAGTCGCGGGATCC TCATAACAGGCGGTGTGTG-3' (서열번호 6). 렌티 바이러스 벡터 플라스미드 pLVX- 푸로 (Clontech, Takara) 및 CACNA2D1 유전자 서열은 EcoRI 및 RamHI 제한 효소 (Clontech, Takara)에 의해 분해되었다. 재조합 렌티 바이러스 벡터는 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다.

HEK 293T 세포 (ATCC)를 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 D10 배지 (10 % FBS, 100 U / ml 페니실린 및 100 μg / ml 스트렙토마이신, L- 글루타민 및 1 M HEPES를 함유하는 DMEM)에서 배양하고, 3 ~ 3.5x10⁶ 293T 세포를 플레이트 당 8ml D10 배지를 사용하여 100mm 플레이트에 시딩하였다. 24 시간 후, 세포를 인산 칼슘 침전법에 의해 pLVX- puro CACNA2D1, psPAX2 (Addgene) 및 pMD2G (Addgene) 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 6 ~ 8 시간 후, 배지를 새로운 배지로 교체하고, 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 수거하고 0.45-μm 필터 유닛 (Macherey-Nagel, Germany)을 통해 여과하였다. 바이러스의 역가는 희석 및 계수 방법에 의해 결정되었다. HEK 293T 세포를 대략 1 x 10⁵/mL (100 μL/웰)의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 배양하였다. 바이러스 용액을 3 배 희석하고, 각 희석액 10 μL를 293T 세포에 첨가하였다. 감염 후 3 일에, 형광의 백분율이 10 내지 30 % 인 세포를 함유하는 웰을 사용하여 다음 식을 사용하여 바이러스 역가를 계산 하였다 :

역가 (TU / mL) = cell number×fluorescence ratio×multiplicity of infection (MOI; 1)×virus dilution factor×10³

293T 세포에서 CaVα2δ의 과발현의 경우, lentiviral 벡터 pLVX-puro-CANCNA2D1 (CaVα2δ- 과발현 293T 세포의 경우) 또는 pLVX-puro (대조군 293T 세포의 경우)를 바이러스 상청액을 사용하여 HEK 293T 세포로 감염시켰다. 형질 감염된 세포를 분석 전 48 ~ 72 시간 동안 5 % CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다.

면역세포화학

랫트 일차 뉴런 또는 293T 세포 (1 × 10⁵, 50:50 혼합된 정상 HEK 293 세포 및 CaVα2δ- 과발현 293T 세포)를 6-웰 플레이트에서 18 mm × 18 mm 커버 슬립에 플레이팅하였다. 시료를 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4) 중 4 % 파라포름 알데히드에 15 분 동안 고정시키고, PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 중 1 % BSA / 0.2 % Triton X-100, pH 7.5)와 함께 1 시간 동안 배양하였다. CSF (1:20) 또는 항 -CaVα2δ1 항체 (Thermo Fisher, # MA3-921)와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양하고 3 회 세척하였다. 이어서, 세포를 플루오레세인 염소 항-인간 IgG 2 차 항체 (Cat # FI-3000; VECTOR Laboratories Inc., Burlingame, CA, 94010)와 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다.

통계 분석

도면의 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차로 표현되며, 여기서 n은 연구된 세포의 수를 나타낸다. 통계 분석은 IgorPro (버전 6.1, WaveMetrics, Lake Oswego, USA, USA) 및 OriginPro (버전 9.0, OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 실험군 간의 유의미한 차이는 독립적이거나 짝을 이루는 스튜던트 t- 검정을 사용하여 분석되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

[실험 결과]

항체 스크리닝 및 신규 항체 확인

4,735명의 환자로부터 스크리닝된 시료 중, 62명의 환자로부터 시료를 “알려지지 않은” 항체(즉, 알려진 종래의 항체가 없는 랫트 뇌 섹션에 대한 면역 반응성)로 정의하였다. 이들 중, 알려지지 않은 항체를 가진 31명의 환자 시료, 혈청 및 CSF 평가 후 비-신경성 질환으로 진단된 3개의 음성 대조군, 및 3개의 양성대조군 (항-GABA-B 수용체, 항-LGI1 및 항-AMPA-수용체 뇌염)를 1차 뉴런 면역염색, 면역 침강 및 LC-MS / MS 분석을 위해 처리하였다. 시료들 간의 결과를 비교함으로써, 목표와 시료를 좁히고 마침내 두 환자 시료에 초점을 두었다.

두 환자 (Case #1 및 #2)로부터 혈청 및 CSF 시료는 랫트 뇌 섹션에서 전형적인 시냅스 면역 조직 화학적 패턴을 가졌으며 (도 1A-F), 해마 층, 기저핵 및 피질에서 신경필 유사 염색을 나타내었다. 일차 배양된 랫트 뉴런에 반응할 때, 환자로부터의 혈청은 세포체 및 수상 돌기에 결합하였다 (도 1G 및 H). 두 시료의 LC-MS / MS 분석 결과는 가능한 항원 표적으로서 CaVα2δ 단백질을 포함하였고, CaVα2δ 단백질을 과발현하는 293T 세포를 생성하였다 (도 1I). 가능한 비특이적 백그라운드 염색을 배제하고 진정한 면역 반응성을 확인하기 위해, CaVα2δ-과발현 293T 세포를 대조군 293T 세포와 50:50 비율로 혼합하고, 혼합된 세포를 상업적으로 판매하는 항-CaVα2δ1 항체, 대조군 CSF 샘플 및 2 명의 환자 CSF 시료로 염색하였다.

예상한 바와 같이, 상업적으로 판매하는 항체는 혼합 세포의 절반을 인식하였고 (도 1J), 대조군 CSF는 세포를 염색하지 않았다 (도 1K). 마지막으로, 사례 # 1 (도 1L) 및 사례 # 2 (도 1M)로부터의 CSF 시료는 혼합 세포의 절반을 염색하여, 두 시료가 항-CaVα2δ 항체를 가짐을 나타낸다. 또한, 2 개의 환자 시료가 CaVα2δ- 과발현 293T 세포로부터의 단백질 추출물에 반응할 때, 웨스턴 블롯 상에 반응성 밴드가 없었으며, 이는 수용체 단백질의 변성된 3 차원 입체 구조가 환자 항체 결합에 필요하다는 것을 나타낸다. 알려지지 않은 항체로 62 개 시료에서 개발된 세포-기반 분석을 사용하여 항-CaVα2δ 항체를 스크리닝하면 항-CaVα2δ 항체와 다른 경우는 확인되지 않았다.

인덱스 환자의 임상 증상

인덱스 환자의 임상 증상을 아래 표와 같이 정리하고, 구체적 case에 대한 설명을 정리한다.

[표 1] 임상적 특징, 치료 및 결과

Case #1: 16 세의 여성은 수막염이 개선된 후 기억 상실, 정신병, 발작 및 정신력이 발달하였다(표 1). 그녀는 건강했고 처음에는 일주일 동안 지속된 열과 두통 (1 일)에 이어 양측 외전 신경 마비로 인한 디플로피아(diplopia)로 발전했다(10 일). 12 일째의 초기 CSF 연구는 증가된 개방 압력 (26.5 cmH₂O), 다형성 (70 세포/ mm³, 림프구 60 %), 높은 단백질 수준 (186 mg / dL) 및 정상 포도당 수준 (43 mg/dL, 혈청 107 mg /dL)을 갖는 수막염 패턴을 보여 주었다. 12 일째의 초기 MRI는 확산 제한을 갖는 뇌량 판상근(corpus callosum splenial) 병변을 보여 주었다 (도 2). 바이러스 병인은 발견되지 않았지만, 바이러스성 수막염 진단이었다. 디플로피아와 두통은 일주일에 걸쳐 개선되었다.

그러나 18 일째에 그녀는 기억력 저하, 비정상적인 행동 및 정신과적 증상을 보였다. 18 일 째 CSF 연구는 20 cmH₂O의 개방 압력, 악화된 다핵 세포증 (120 세포/ mm³, 림프구 92 %), 높은 단백질 수준 (138 mg/dL) 및 정상 포도당 수준을 보여 주었다. 20 일째에, 그녀는 구강 안면 자동발작으로 재발성 비경련 발작을 보였다. 뇌 MRI는 정상이었다 (도 2). 그녀는 정맥 면역 글로불린 (21 ~ 25 일)과 스테로이드 (20 ~ 24 일)로 치료를 받았지만 정신 상태가 악화되었고 24 일에 이송되었다. 전정 안구 반사, 뇌신경 기능, 사지 강도, 감각 검사 및 반사가 정상이었다. 24 일 째 CSF 연구는 정상 개방 압력 (13 cmH₂O), 감소된 다핵 생성 (13 cell/mm³), 개선된 단백질 수준 (48 mg/dL) 및 정상 포도당 수준을 보여 주었다. CSF 바이러스 PCR 및 통상적인 자가면역 항체 시험은 모두 음성이었다. 29 일에, 리툭시맙을 매주 주입하는 것을 시작하였다. 재발성 발작은 레베티라 세탐 (일일 2g) 및 토피라메이트 (일일 600mg)에 의해 조절되지 않았지만, 프레가발린 (일일 600mg)을 추가하여 완전히 조절되었다. 면역 요법 후, 신경학적 결손없이 4 개월에 걸쳐 천천히 그리고 완전히 개선되었다.

Case # 2 : 75 세의 남성은 4 주 동안 진행되는 기억 상실, 정신병 및 졸음 상태를 나타냈다 (표 1). 처음에 일주일 동안 진행된 recent memory loss [MMSE (mini-mental status exam score) = 27]을 나타내었고, 다음 2 주 동안 혼란, 동요 및 정신병이 진행되었다. 그런 다음, 4 주째에 환자는 종합 병원에 입원하였다. 입원시의 신경학적 검사는 최근의 완전한 기억 상실 및 감소된 주의력을 보여주었다 (MMSE = 6). 두개골 신경 기능, 사지 강도, 감각 검사 및 반사가 정상이었다. 5 주차 CSF 분석은 pleocytosis (1 세포/ mm³)을 나타내지 않고, 정상 단백질 수준 (25.7 mg / dL) 및 정상 포도당 수준 (70 mg / dL, 혈청 109 mg / dL)을 나타내었다. CSF 바이러스 PCR 및 통상적인 자가면역 항체 시험은 모두 음성이었고, 뇌 MRI는 정상이었다 (그림 2). 그는 6 주차에 전신성 강직성 발작을 보였으며 정맥 면역 글로불린과 스테로이드를 투여받았다. 환자는 주입 후 개선된 MMSE 점수를 나타냈다 (MMSE = 16). 암 스크리닝은 종격동 종괴를 검출하였고, 이는 7 주에 비디오 보조 흉강경 수술에 의해 제거되었다. 불행하게도 9 주차에 환자는 수술 후 관리 중 패 혈성 쇼크로 사망했다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> DIAGNOSIS METHOD FOR AUTOIMMUNE ENCEPHALITIS <130> Pol_Seoul <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CaVa2d <400> 1 Met Ala Ala Gly Cys Leu Leu Ala Leu Thr Leu Thr Leu Phe Gln Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ile Gly Pro Ser Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Ala Val Thr 20 25 30 Ile Lys Ser Trp Val Asp Lys Met Gln Glu Asp Leu Val Thr Leu Ala 35 40 45 Lys Thr Ala Ser Gly Val Asn Gln Leu Val Asp Ile Tyr Glu Lys Tyr 50 55 60 Gln Asp Leu Tyr Thr Val Glu Pro Asn Asn Ala Arg Gln Leu Val Glu 65 70 75 80 Ile Ala Ala Arg Asp Ile Glu Lys Leu Leu Ser Asn Arg Ser Lys Ala 85 90 95 Leu Val Arg Leu Ala Leu Glu Ala Glu Lys Val Gln Ala Ala His Gln 100 105 110 Trp Arg Glu Asp Phe Ala Ser Asn Glu Val Val Tyr Tyr Asn Ala Lys 115 120 125 Asp Asp Leu Asp Pro Glu Lys Asn Asp Ser Glu Pro Gly Ser Gln Arg 130 135 140 Ile Lys Pro Val Phe Ile Glu Asp Ala Asn Phe Gly Arg Gln Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Gln His Ala Ala Val His Ile 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Claims

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서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 포함하는 CaVα2δ1에 대한 자가 항체 검출용 조성물로서 상기 조성물은 자가 면역 뇌염 진단을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 자가 항체 검출용 조성물.
서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 및
상기 항체와 결합하는 에피토프가 시료와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 에피토프-항체 복합체가 형성되고; 그리고 상기 에피토프-항체 복합체를 검출하는 단계; 를 포함하며,
상기 에피토프-항체 복합체 검출결과가 대조군의 결과와 비교하여 양성인 경우 CaVα2δ의 존재를 확인하는, CaVα2δ 자가항체 검출 방법으로서 상기 자가항체 검출 방법은 자가 면역 뇌염 진단을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 CaVα2δ 자가항체 검출 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 눈물 또는 타액인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 에피토프-항체 복합체 검출은 FACS (Fluorescence-activated cell sorting), 세포면역염색방법, 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역침전분석, RIA(Radioimmunoassay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 수행되는 것인, 방법.
서열번호 1로 표시되는 CaVα2δ자가 항체 검출용 폴리펩타이드를 포함하는 자가 면역 뇌염 진단용 조성물.
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