KR102415209B1

KR102415209B1 - Kras 자가항체를 이용한 쇼그렌 증후군 진단방법

Info

Publication number: KR102415209B1
Application number: KR1020200176378A
Authority: KR
Inventors: 서창희; 강호철; 김현아; 정주양; 박상욱; 손인옥; 윤정현
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-06-29
Also published as: KR20220086173A

Abstract

본원은 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

KRAS 자가항체를 이용한 쇼그렌 증후군 진단방법{DIAGNOSIS OF SJOGREN'S SYNDROME USING KRAS AUTOANTIBODIES}

본원은 KRAS 자가항체를 이용한 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 진단방법에 관한 것이다.

쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)은 염증성 자가면역질환으로 주로 외분비샘에 영향을 주어 그 기능을 저하시키는 병이다. 주로 30 대 또는 40 대 여성에서 발생한다고 알려져 있으며, T 세포 및 B 세포의 조절장애에 의해 생긴 샘기능의 저하로 인하여 건성 각결막염, 구강 건조증 및 귀밑샘 부종 등이 주 증상으로 알려져 있다.

현재 쇼그렌 증후군을 완치할 수 있는 방법은 없으며, 쇼그렌 증후군의 치료는 주로 대증요법으로서 건조 증상 치료, 국소적인 증상에 대한 치료, 전신적인 콜린성 약물, 전신적인 항염증 약물 및 전신적인 면역억제 약물을 사용하고 있다.

이와 같이 쇼그렌 증후군은 완치할 수 있는 방법이 없으며, 환자에 따라 매우 다양한 임상 소견과 경과를 보이므로 질병의 활동성을 판정하고 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무를 정확히 파악하여 각 환자의 질병 상태에 합당한 치료 방침을 결정해야 한다.

이와 관련하여, 현재 쇼그렌 증후군의 진단은 2002 년 미국-유럽 공동제안에 의해 개정된 분류 기준을 주로 사용하고 있으며, 구체적으로, 혈액검사를 통해 적혈구침강속도, 항Ro(SS-A) 항체, 항Ra(SS-B) 항체, 류마티스인자 및 항핵항체 등의 확인, 눈물샘 분비능을 평가하는 Schirmer tear 검사법, 침샘 분비능의 측정, 침샘 조영술 및 작은 침샘 생검 등을 시행하여 이를 종합하여 진단하고 있다. 그러나, 아직까지 질병 활성도와 연관된 진단지표 및 쇼그렌 증후군에 특이적인 바이오마커가 없는 실정이다.

쇼그렌 증후군과 같은 자가면역질환은 현재까지 특이적 치료제가 없고, 특정 약제로 제거할 수 있는 다른 질병과 달리 활성화된 자가면역세포를 완벽하게 억제할 수만은 없기 때문에 치료에 많은 어려움이 있다. 따라서, 초기 진단, 중증도 판별, 약제의 효용성 확인 및 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무를 정확히 파악하기 위한 쇼그렌 증후군 바이오마커에 대한 연구가 매우 중요한 의미를 가진다. 이에, 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 초기에 간편하게 쇼그렌 증후군을 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

바이오마커란 DNA, RNA, 대사물질, 단백질 및 단백질 조각 등에서 유래된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서 체내에서 유전적 또는 후생 유전적 변화의 영향으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표를 의미한다. 단백질체 및 자가항체들은 단백질 바이오마커들로써 환자의 혈청 내에 존재하며 검출이 용이한 장점으로 인해 바이오마커로의 중요한 가치를 나타낸다.

그러나, 자가항체의 발굴에 주로 사용되는 종래의 단백질 칩은 집적된 항원의 숫자의 제한 등으로 다양한 자가항체들의 발굴이 용이하지 않으며, 혈청 내 소량이 존재할 경우 검출 시 민감도가 매우 낮아 진단의 정확성이 떨어진다는 문제점이 있다.

따라서, 특이도 및 민감도를 높여 쇼그렌 증후군의 조기 진단에 유용하게 활용될 수 있는 바이오마커에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

본원의 배경이 되는 기술인 한국 등록특허공보 제 10-1794403 호는 쇼그렌 증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌 증후군 진단방법에 관한 것으로서, 구체적으로, 아쿠아포린 5에 대한 검체의 특이적 반응을 이용하여 쇼그렌 증후군을 검출 또는 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 그러나, KRAS 자가항체를 이용하여 간편하게 쇼그렌 증후군을 진단하는 방법, 진단용 조성물 및 키트에 대해서는 언급하지 않고 있다.

본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본원은 상기 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본원은 상기 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본원은 상기 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 단백질은 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 항원 단백질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 2 측면은 본원의 제 1 측면에 따른 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 키트를 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 시료 내 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출하여 쇼그렌 증후군을 진단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 자가항체를 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 3 측면은 본원의 제 1 측면에 따른 조성물을 이용하여 쇼그렌 증후군이 의심되는 개체의 시료에서 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계, 상기 측정된 자가항체 수준을 정상 대조군 시료의 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준과 비교하는 단계 및 상기 대조군에 비하여 상기 쇼그렌 증후군이 의심되는 개체의 시료에서 상기 자가항체의 수준이 증가한 경우 쇼그렌 증후군으로 진단하는 단계를 포함하는 쇼그렌 증후군 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 자가항체의 수준을 측정하는 단계는 항원-항체 결합반응을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 자가항체의 수준을 측정하는 단계는 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 4 측면은 본원의 제 1 측면에 따른 조성물을 이용하여 쇼그렌 증후군이 의심되는 개체의 시료에서 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계, 상기 개체에 쇼그렌 증후군 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 및 상기 쇼그렌 증후군 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계를 포함하는 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면 상기 치료 효과를 측정하는 단계는 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계, 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 자가항체의 수준을 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 자가항체의 수준과 비교하는 단계 및 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 자가항체의 수준에 비하여 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 자가항체의 수준이 감소한 경우 상기 치료제 후보 물질을 쇼그렌 증후군 치료제로 고려하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 진단이 어려운 쇼그렌 증후군을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다.

또한, 자가항체의 발굴에 주로 사용되는 종래의 단백질 칩은 집적된 항원의 숫자의 제한 등으로 다양한 자가항체들의 발굴이 용이하지 않으며, 혈청 내 소량이 존재할 경우 검출 시 민감도가 매우 낮아 진단의 정확성이 떨어진다는 문제점이 있었으나, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 특이도 및 민감도가 높아 쇼그렌 증후군의 조기 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 간편하게 쇼그렌 증후군을 진단할 수 있으므로, 편의성 및 경제성이 우수할 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 벡터를 이용한 재조합 단백질을 생산하는 간단한 공정으로 제조할 수 있기 때문에, 제작 공정이 단순화될 수 있고, 적은 비용으로도 제작될 수 있으며, 대량 생산이 용이하고, 경제성이 우수할 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 질병의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 및 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있으므로, 질병의 병인을 설명하고 질병의 활성을 반영하는 쇼그렌 증후군 특이적 바이오마커를 제공할 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 초기 진단, 중증도 판별, 질병의 활성도 반영, 치료 효용 평가, 약제의 효용성 확인 및 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무 파악 등에 유용하게 활용할 수 있으므로, 쇼그렌 증후군 치료의 치료 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 환자 개인별 질환 활성도를 판별함으로써 초기 치료 방향 설정 및 실시간 치료 효용 평가를 통한 개인별 맞춤형 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법은 다양한 후보 물질의 쇼그렌 증후군 치료 효과를 간이하고 신속하게 스크리닝 할 수 있으므로, 쇼그렌 증후군 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법은 환자 개인별 질환 활성도를 판별할 수 있는 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용함으로써, 환자 맞춤형 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법은 벡터를 이용한 재조합 단백질을 생산하는 간단한 공정으로 제조되어 대량 생산이 용이한 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 사용함으로써, 비용을 절감할 수 있고, 간단한 방법으로 다양한 후보 물질을 신속하게 스크리닝 할 수 있어 경제성이 우수할 수 있다.

다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.

도 1 은 22K 단백질 마이크로어레이를 활용하여 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 특이적 자가항체를 동정한 것이다.
도 2 는 KRAS 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-KRAS 벡터를 나타낸 것이다.
도 3 은 KRAS 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-KRAS 벡터의 클로닝 결과를 나타낸 것이다.
도 4 는 KRAS 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-KRAS 벡터를 나타낸 것이다.
도 5 는 KRAS 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-KRAS 벡터의 클로닝 결과를 나타낸 것이다.
도 6 은 GST-KRAS 재조합 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 은 정제된 GST-KRAS 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 KRAS 재조합 단백질 및 쇼그렌 증후군 임상시료를 이용하여 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 특이적 자가항체를 검증한 결과를 나타낸 것이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 합성 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

이하에서는 본원의 KRAS 자가항체를 이용한 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 진단방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본원에 따른 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 진단용 조성물은 쇼그렌 증후군 환자의 혈액 내에 특이적으로 존재하는 KRAS 자가항체에 주목하고, 이를 발굴하고 검증한 것이다. 이에, 22,000(22K) 개의 인간 단백질들이 (인간 단백질의 90% 이상을 포함함) 집적되어 있는 단백질 칩 및 임상 샘플을 활용하여 쇼그렌 증후군 환자 특이적인 자가항체들을 동정하였으며, 이중 KRAS 자가항체와 특이적으로 결합할 수 있는 KRAS 단백질 항원을 제조하여 쇼그렌 증후군을 진단하는 조성물을 제공하였다.

RAS 는 세포의 분화, 증식 및 생존과 관련된 신호전달체계에서 중요한 역할을 하는 small GTPases protein 이다. RAS family 는 HRAS, NRAS 및 KRAS 세개의 isoforms 이 있다. KRAS(Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 는 상기 RAS family 의 하나로서, 다양한 암종에서 변이가 발견되는 oncogene 으로 잘 알려져 있다.

상기 자가항체(autoantibodies, AAb)는 체내에서 발현되어 생체내 성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미하는 것이다.

예를 들어, 상기 자가항체는 쇼그렌 증후군 발병 시에 생성되는 KRAS 항원 단백질에 대한 자가항체가 될 수 있다.

상기 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 진행 단계 결정 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

예를 들어, 상기 진단은 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항원은 항체와 항원-항체 결합을 수행할 수 있는 단백질성 면역원을 의미한다. 이러한 항원은 통상적인 방법에 의해 유전자 재조합 방법을 통해 합성 분리 및 정제될 수 있다.

상기 항원은 포유류, 특히 인간 유래의 서열로, 예를 들면, GenBank Accession No. NM_004985.5 에 기재된 서열로 표시되는 것, 이의 전장 또는 단편일 수 있으며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 GenBank Accession No. NM_004985.5 항원은 상기 서열번호 1 로 표시된다.

예를 들어, 상기 항원은 상기 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물은 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 간편하게 쇼그렌 증후군을 진단할 수 있으므로, 편의성 및 경제성이 우수할 수 있다.

본원의 제 2 측면의 상기 쇼그렌 증후군 진단용 키트에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 쇼그렌 증후군이 발병된 개체에서 유래된 시료로부터 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하여 쇼그렌 증후군의 발병여부를 진단하는데 사용될 수 있다.

상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 항원-항체 복합체 검출 과정을 통해 시료의 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 정상 대조군의 시료의 시그널보다 높은 경우 쇼그렌 증후군으로 진단하거나, 치료 경과에 대한 판단을 할 수 있다.

상기 키트는 상기 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위한 항원, 항체, 앱타머, 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 장치 및 이들의 조합들로부터 선택되는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 키트는 상기 항원-항체 복합체의 검출을 위해, 항원이 후술하는 표지물질로 표지되거나 검출항체 또는 2차 항체를 사용할 수 있으며, 완충용액, 발색 기질액 등을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA 에 특이적으로 결합하며, 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있는 효소로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 광의 조사에 의해 조사된 광과 상이한 파장의 광을 방출하는 바이로루미네슨스, 케미루미네슨스, 일렉트로루미네슨스, 일렉트로케미루미네슨스 또는 포토루미네슨스에 사용되는 발색단으로, 예를 들어, 단백질로서 그린형광단백질 또는 유기화합물로서 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin) 또는 플루오르카민(fluorecamine)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 다양한 방사선 동위원소 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있고, 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있으며, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민) 또는 TMB(테트라메틸 벤지딘) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본원에 따른 키트에서 상기 항원은 96 웰 마이크로웰플레이트와 같은 마이크로웰플레이트, 콜로이드성 금 입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다

상기 개체는 쇼그렌 증후군이 의심되는 사람 또는 쇼그렌 증후군에 걸린 사람 또는 쇼그렌 증후군으로 진단 후 치료를 받고 있는 사람을 의미하는 것이다.

구체적으로, 상기 시료는 상기 개체에서 분리되어 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미한다. 이러한 시료는 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출 할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 시료는 쇼그렌 증후군이 발병된 환자의 혈액, 혈청, 혈장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검출은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로서 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

예를 들어, 상기 자가항체를 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA) 또는 닷 블랏 분석(dot blot assay)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 방법은 고상의 기질 예를 들어, 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 항원에 검체를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들어, 3H 또는 125I 와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

예를 들어, 상기 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들어, 발색단(chromophores), 효소 등과 같은 물질로 표지된 2 차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본원에 따른 키트는 사용법에 관한 안내서를 추가로 포함할 수 있으며, 대조군에 특이적인 항체 또는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 3 측면의 상기 쇼그렌 증후군 진단을 위한 정보제공 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어, 상기 쇼그렌 증후군이 의심되는 개체의 시료에서 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준이 정상 대조군 시료의 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준과 비교하여 약 1.5 배 이상 유의하게 증가한 경우 쇼그렌 증후군이 발병한 것으로 판단할 수 있으며, 유의하게 증가하지 않는 경우에는 상기 쇼그렌 증후군이 의심되는 개체에서 쇼그렌 증후군이 발병하지 않았다고 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 4 측면의 상기 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면에 기재된 내용은 본원의 제 4 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

본원에 따른 쇼그렌 증후군 진단용 조성물을 이용한 쇼그렌 증후군 치료제의 스크리닝 방법은 다양한 후보 물질의 쇼그렌 증후군 치료 효과를 간이하고 신속하게 스크리닝 할 수 있으므로, 쇼그렌 증후군 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 22K 단백질 마이크로어레이를 활용한 쇼그렌 증후군 자가항체 동정

도 1 은 22K 단백질 마이크로어레이를 활용하여 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 특이적 자가항체를 동정한 것이다.

구체적으로, 쇼그렌 증후군 특이적 자가항체를 검출하기 위하여 22,000(22K) 개의 인간 항원이 집적된 단백질 칩을 활용하여 5 명의 정상군과 9 명의 쇼그렌 환자의 혈청샘플에 대하여 마이크로어레이를 활용하여 실험하였다.

이를 통하여, 정상군과 비교하여 쇼그렌 증후군 환자의 혈액으로부터 KRAS 자가항체가 특이적으로 동정되었음을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] 쇼그렌 증후군 바이오마커 단백질 발현 벡터 제작

도 2 는 KRAS 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-KRAS 벡터를 나타낸 것이고, 도 3 은 KRAS 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-KRAS 벡터의 클로닝 결과를 나타낸 것이다. 도 4 는 KRAS 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-KRAS 벡터를 나타낸 것이고, 도 5 는 KRAS 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-KRAS 벡터의 클로닝 결과를 나타낸 것이다.

구체적으로, 쇼그렌 증후군 바이오마커의 후보물질 KRAS 의 전체 도메인을 포함하여 ENTRY 벡터를 제작하고 이를 pCR8GW-KRAS(도 2) 로 명명하였다.

이어서, pCR8GW-KRAS 컨스트럭트를 제작하기 위해 Full-length KRAS DNA 서열(567 bp)을 바탕으로 프라이머(primer)를 디자인한 후, 제작하였다.

Full-length KRAS 의 아미노산 서열은 서열번호 1 로 나타냈으며, 하기 표 1 의 KRAS WT forward 프라이머는 서열번호 2, KRAS WT reverse 프라이머는 서열번호 3으로 나타내었다.

No	Primer	Sequence(5' → 3')
1	KRAS WT forward primer	ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT
2	KRAS WT reverse primer	TTA CAT AAT TAC ACA CTT TGT CTT TGA

이어서, Human cDNA 를 템플레이트(Template)로 하고 상기 제작된 프라이머를 활용하여 PCR 을 수행하였다.이어서, 합성된 PCR product 를 pCR8GW 벡터에 클로닝 하였다(도 2 및 도 3).

이어서, KRAS N-말단에 GST-Tag 을 접합하기 위하여 상기 제작된 벡터와 gateway cloning 을 통해 pDEST20-KRAS 컨스트럭트를 제작하였다(도 4 및 도 5).

이어서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 제작된 벡터를 이용하여 insect 세포에서 재조합 단백질 발현이 가능한 KRAS-Bacmid 를 제작하였다.

[실시예 3] Insect 세포에서 쇼그렌 증후군 바이오마커 재조합 단백질의 발현

도 6 은 GST-KRAS 재조합 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

구체적으로, 실시예 2 에서 제작한 쇼그렌 증후군 바이오마커 KRAS 의 재조합 단백질의 발현을 위해 제작된 KRAS-Bacmid 를 SF9 insect 세포에 형질주입하였다.

이어서, 형질주입된 세포에서 KRAS 재조합 단백질의 발현을 유도하는 Baculovirus 를 생산하였다.

이어서, 세포내 재조합 단백질의 발현을 웨스턴블랏으로 확인하였다(도 6).

이를 통하여, 상기 쇼그렌 증후군 바이오마커 KRAS 의 발현이 잘 유도된 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 쇼그렌 증후군 바이오마커의 정제

도 7 은 정제된 GST-KRAS 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.

구체적으로, 쇼그렌 증후군 바이오마커 단백질의 대규모 정제를 위해 제작된 KRAS Baculovirus 를 SF9 insect 숙주세포에 2 차 감염시켰다. 상기 제작된 bacmid 에 포함되어 있는 GST-tag 을 이용하여 정제할 수 있도록 KRAS 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.

이어서, Baculovirus 에 의해 2차 감염된 SF9 insect 세포를 3 일간 28℃ 에서 배양하였다. 이어서, 바이러스가 포함된 배지를 1500 rpm 으로 원심분리하여 4℃ 에 보관하고, 재조합 단백질이 과발현된 세포는 잔여배지를 제거하기 위하여 PBS 로 1 회 세척하였다.

이어서, 1500 rpm 에서 1 분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 세포에 75T flask 1 개당 5 ml 의 세포 용해 버퍼(25 mM Tris-Cl(pH7.4), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% NP-40, 0.1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1X protease inhibitor cocktail)를 넣어 혼합한 후, 4℃ 에서 30 분간 반응시켰다.

이어서, 용해물을 14000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다.

이어서, 수용액으로부터 GST-KRAS 만을 정제하기 위하여 glutathione Sepharose 4B(GEHealthcare Life Science, USA) 와 반응시킨 후, 크로마토그래피 방법을 이용하여 재조합 단백질과 결합한 glutathione Sepharose 4B 를 분리하였다.

이어서, 비특이적으로 결합한 단백질들의 제거를 위해 세포 용해버퍼로 3 회 세척하였다. pH 7.5 의 50 mM HEPES, 100 mM NaCL, 30% Glycerol 과 40 mM GSH 가 포함된 용액을 사용하여 재조합 단백질들을 glutathione Sepharose 4B 로부터 용리하였다.

이어서, SDS-PAGE 로 분석하였다(도 7).

이를 통하여, 약 48 kDa 의 GST-KRAS 쇼그렌 증후군 재조합 단백질이 정제되었음을 확인할 수 있었다.

[실험예 1] 쇼그렌 증후군 루푸스 특이적 자가항체의 검증

도 8 은 KRAS 재조합 단백질 및 쇼그렌 증후군 임상시료를 이용하여 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 특이적 자가항체를 검증한 결과를 나타낸 것이다.

구체적으로, 쇼그렌 증후군 환자의 혈청 내에 단백질 마이크로어레이 기법을 통하여 신규 발굴된 KRAS 자가항체가 다량 존재하는지 검증하기 위하여 실시예 4 에서 정제된 GST-KRAS 재조합 단백질을 활용하여 ELISA(효소 연결 면역 흡착제 분석) 를 수행하였다.

더욱 구체적으로, 1 ㎍ 의 GST-KRAS 단백질을 96 well plate 에 코팅한 후, 35 명의 정상인 및 62 명의 쇼그렌 증후군 환자의 혈청과 반응시켜 ELISA 를 수행하였다.

이를 통하여, 정상군에 비해 쇼그렌 증후군 환자에서 자가항원을 인지하는 KRAS 자가항체가 정상군에 비해 1.5 배 이상 과발현 되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 단백질 마이크로어레이 결과와 동일한 결과로서, KRAS 자가항체가 정상군에 비해 쇼그렌 환자의 혈청에 특이적으로 다량 존재하고 있음을 검증한 것을 시사하는 것이다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> DIAGNOSIS OF SJOGREN'S SYNDROME USING KRAS AUTOANTIBODIES <130> DP20200652 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS <400> 1 Met Glu Thr Thr His Arg Gly Leu Ala Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Glu Ala Val Ala Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu 20 25 30 Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser 35 40 45 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Leu Glu Ala Thr His Arg Ile Leu Glu Gly 50 55 60 Leu Asn Leu Glu Ala Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Ser Asn His Ile 65 70 75 80 Ser Pro His Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ala Thr Tyr Arg 85 90 95 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr His Arg Ile Leu Glu Gly Leu Ala Ala 100 105 110 Ser Pro Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Gly Leu 115 120 125 Asn Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr 130 135 140 Gly Leu Ala Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Leu Glu Ala Ala 145 150 155 160 Ser Pro Ile Leu Glu Leu Glu Ala Ala Ser Pro Thr His Arg Ala Leu 165 170 175 Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Ala Gly Leu Ala Thr Tyr Arg 180 185 190 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Met Glu Thr Ala Arg Gly Ala Ser Pro Gly 195 200 205 Leu Asn Thr Tyr Arg Met Glu Thr Ala Arg Gly Thr His Arg Gly Leu 210 215 220 Tyr Gly Leu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Leu Glu Ala Cys Tyr Ser 225 230 235 240 Val Ala Leu Pro His Glu Ala Leu Ala Ile Leu Glu Ala Ser Asn Ala 245 250 255 Ser Asn Thr His Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Pro His Glu Gly Leu 260 265 270 Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu His Ile Ser His Ile Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Ala Arg Gly Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Ala 290 295 300 Arg Gly Val Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ser Glu Arg Gly Leu 305 310 315 320 Ala Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro Arg Ala Met Glu Thr Val Ala Leu 325 330 335 Leu Glu Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Cys 340 345 350 Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Ala Pro Arg Ala Ser Glu Arg Ala Arg 355 360 365 Gly Thr His Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Thr His Arg Leu Tyr Ser 370 375 380 Gly Leu Asn Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ala Ser Pro Leu Glu Ala Ala 385 390 395 400 Leu Ala Ala Arg Gly Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ile Leu 405 410 415 Glu Pro Arg Ala Pro His Glu Ile Leu Glu Gly Leu Ala Thr His Arg 420 425 430 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Ala Arg Gly Gly 435 440 445 Leu Asn Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ala Leu 450 455 460 Ala Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Val Ala Leu 465 470 475 480 Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ile Leu Glu Ala Arg Gly Leu Tyr Ser His 485 490 495 Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Met Glu Thr Ser Glu 500 505 510 Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser 515 520 525 Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu 530 535 540 Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ile Leu 545 550 555 560 Glu Met Glu Thr <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS WT forward <400> 2 atgactgaat ataaacttgt ggtagtt 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS WT reverse <400> 3 ttacataatt acacactttg tctttga 27

Claims

KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 항원 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 조성물.
삭제
제 1 항의 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 시료 내 KRAS 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출하여 쇼그렌 증후군을 진단하는 것인, 쇼그렌 증후군 진단용 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 쇼그렌 증후군 진단용 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 자가항체의 검출은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것인, 쇼그렌 증후군 진단용 키트.
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