KR101438530B1

KR101438530B1 - 위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법

Info

Publication number: KR101438530B1
Application number: KR1020120056977A
Authority: KR
Inventors: 강민정; 하피자 아크테르; 권오승; 박원상; 정병화
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20130133593A; US9222946B2; US20130323760A1

Abstract

본 발명은 위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법에 따르면, 위암이 의심되는 환자로부터 위암을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법{Biomarker composition for diagnosing stomach cancer and method for diagnosis using the same}

본 발명은 위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법에 관한 것이다.

위암은 한국과 일본에 가장 많이 발병되는 질환으로, 한국인에게 두 번째로 흔한 질병이다. 위암의 위험 인자로는 위암 가족력, 헬리코박터균 감염, 흡연, 짠음식, 가공된 단백질, 상한 음식 등이 있으며, 주로 위장관 조영술을 통해 진단할 수 있다. 정기적인 위내시경으로 위암의 경도를 판단할 수 있으나, 초기 발견은 어려운 수준이다. 따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 진단 마커를 발굴하고 이를 검출할 수 있는 단일 클론 항체를 이용하면, 위암의 조기진단 및 병의 진행 정도를 미리 예측할 수 있는 키트의 개발을 도모할 수 있다.

혈액에서 펩티드 마커를 측정하는데는 혈액 내에 풍부하게 존재하는 여러 단백질(알부민, 면역글로불린)등에 의한 방해 신호가 있으므로, 혈액으로부터 펩티드 마커를 추출하는 것은 분자 컷-오프 필터를 사용하여 회수율을 높게 할 필요가 있다,

일반적으로 뉴로텐신(neurotensin)과 콜레시스토키닌(cholecystokinin)은 소화에 관여하는 펩티드인데, 뇌에서 식욕을 조절하는데도 작용하므로, 주로 뇌에서의 작용과 기능에 대해서 연구가 많이 진행되어 왔다. ELISA 방법으로 뉴로펩티드로서의 마우스의 뇌조직에서 측정한 결과가 발표된 이후로 파킨슨병 환자 혈액 시료에서 뉴로텐신의 농도가 증가되었다는 결과가 보고되었고, 프로콜레시스토키닌(procholecystokinin)의 경우, 인간 유잉 육종(human ewing sarcoma) 환자의 진단 마커로 제안되었다. 또한, 뉴로텐신과 콜레시스토키닌이 비만 여성에게서 높은 농도로 검출되었다는 보고가 있으나, 위암과 관련하여서는 뉴로텐신과 콜레시스토키닌이 바이오 마커로서 사용되었다는 보고는 아직까지 없다.

이를 바탕으로, 본 발명자들은 위암 환자 혈액 내의 뉴로텐신과 콜레시스토키닌의 농도를 측정하여 정상 환자와 비교 분석함으로써 뉴로텐신과 콜레시스토키닌이 위암을 진단할 수 있는 바이오 마커 및 이를 이용한 위암 진단 방법을 확립하였다.

일 구체예는 위암 진단용 바이오 마커 조성물, 이에 대한 항체를 포함하는 위암 진단 키트 및 이를 이용한 위암 진단 방법을 제공한다.

일 양상은 정상인의 체액에서 보다 위암 환자의 체액에서 농도가 증가하는 것으로서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 뉴로텐신(neurotensin)을 포함하는 위암 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

다른 양상은 정상인의 체액에서 보다 위암 환자의 체액에서 농도가 감소하는 것으로서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 콜레시스토키닌(cholecystokinin)을 포함하는 위암 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 체액은 위액, 타액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 상기 체액은 혈액일 수 있다.

또 다른 양상은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 뉴로텐신 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체; 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 콜레시스토키닌 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

상기 단백질의 단편은 예를 들어, 면역원성 단편일 수 있으며, 이는 상기 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오 마커 단백질의 단편을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으나, 단일클론 항체를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 적당량(약 10㎍)을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다.

일 구체예에 따른 위암 진단 키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 전형적으로 동결 건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorophore), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

한편, 일 구체예에 따른 단일클론 항체는 면역분석 키트(예를 들어, ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 위암 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에도 이용될 수 있다.

상기 키트는 예를 들어, 면역분석에 사용될 수 있으며, 상기 뉴로텐신 및/또는 콜레시스토키닌 검출 방법은 면역분석에 기초한 방법을 설명한 것이다. 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 표지된 항체가 뉴로텐신 및/또는 콜레시스토키닌을 검출하는 데 이용될 수 있다.

상기 키트가 예를 들어, ELISA 방법을 이용하도록 제작되는 경우, 상기 키트를 이용한 특정 실시예는 (i) 정상인 개체와 위암이 의심되는 개체의 혈액 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 뉴로텐신 또는 콜레시스토키닌 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 혈액 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

다른 양상은 정상 환자의 체액에 비해 위암이 의심되는 환자의 체액 내의 뉴로텐신의 농도가 상대적으로 증가하거나, 또는, 콜레시스토키닌의 농도가 상대적으로 감소하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 검출 결과로부터 상기 위암이 의심되는 환자의 위암 여부를 판단하는 단계를 포함하는 위암 진단 방법을 제공한다.

상기 체액은 예를 들어, 위액, 타액 및 혈액을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 체액은 혈액일 수 있다.

상기 진단 방법에서, 상기 검출 단계는 위암이 의심되는 환자의 체액으로부터 효소면역측정법(ELISA, Coated tube), 항체가 결합된 자성 입자를 이용한 방법, 항체가 결합된 라텍스 입자를 이용한 방법 등을 통해 뉴로텐신 및/또는 콜레시스토키닌의 농도를 측정함으로써 수행할 수 있다.

일 구체예에 따른 위암 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법에 따르면, 위암이 의심되는 환자로부터 위암을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 뉴로텐신과 콜레시스토키닌에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 ELISA 어세이 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 정상인과 위암 환자의 혈액 시료로부터 뉴로텐신과 콜레시스토키닌의 농도를 분석한 결과를 나타낸다. 위암환자의 경우 정상인 (control)에 비해 유의미하게 (p<0.005)높거나 (NT), 낮은 (CCK) 농도를 보였다. Cut-off 값은 38 pg/ml (CCK), 237 pg/ml (NT)로 결정하였다 (confidence interval 95 %).
도 3은 정상인과 위암환자의 Receiver operating chracteristic(ROC) 곡선을 나타낸다. (A)는 콜레시스토키닌, (B)는 뉴로텐신을 의미한다.
도 4는 환자별 뉴로텐신(원)과 콜레시스토키닌(사각형)의 농도의 상관관계를 비교한 그래프로, x축은 환자를, y축은 혈중 농도를 의미한다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 실험 방법

(1) 시료 준비

카톨릭의대로부터 얻은 정상인의 혈액 시료 및 위암 환자의 혈액 시료 500 ul를 10 % formic acid buffer로 2배 희석한 다음, Oasisㄾ HLB 1cc (30mg) Extraction Cartridges Solid phase Extraction Kit로 펩티드를 추출하였다 (Waters, Ireland). 다른 한편으로는 10 kDa Molecular cut-off filter(Millipore, USA)를 사용하여, 혈청 및 플라즈마 내의 내인성 펩티드를 단백질로부터 분리하여 추출하였다. 상기 추출된 펩티드가 포함된 용액은 N₂ Evaporator, Freeze-Dryer를 사용하여 말린 후, 면역학적 분석을 위해서는 50 ul의 어세이 버퍼(Phoenix Pharmaceuticals Inc., USA)에 용해하여 분석하거나, 또는 25 ul의 혈청 및 플라즈마를 PBS buffer에 2배 희석하여 직접 분석하였고, LC-MS/MS 분석을 위하여서는 100 ul의 0.2 % formic acid in 50 % methanol에 용해하여 분석하였다.

(2) ELISA 어세이

먼저, 0.2-0.5 ㎍/㎖ 농도의 뉴로텐신, 콜레시스토키닌의 항체(1차 항체, Phoenix Pharmaceuticals Inc., USA)를 Microplate(SPL, Korea)에 코팅하였다. 이후, 1 mg/㎖ 농도의 BSA (bovine serum albumin)가 포함된 PBS를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 비특이적 반응을 방해한 후, 상기 준비된 펩티드 용액, 또는 희석된 혈액을 상기 플레이트와 반응시켰다. 이후, 1 %의 Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 세척하여 상기 항체에 결합하지 않은 항원들을 제거하고, 2차 항체를 1%의 BSA가 포함된 PBS로 1:3,000의 비율로 희석하여 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 플레이트에 1%의 BSA가 포함된 PBS로 1:5,000비율로 희석시킨 100 ㎕의 고트 항-휴먼-IgG-HRP (Pierce)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 1 %의 트윈-20이 포함된 PBS로 세척하였다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100 ㎕의 트리메틸벤지딘(trimethylbenzidine, TMB) 기질(Sigma)을 첨가하여 발색 반응을 유도시켰으며, 이후, 2 N의 H₂SO₄용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD₄₅₀ 값을 플레이트 리더(Bio-Rad)로 측정하였다. 이때, 아는 농도의 스탠다드(0.01, 0.1, 1, 10, 100 ng/ml)를 함께 측정하여, 조정 곡선(calibration curve)를 그리고 농도를 계산하였다. 한편, 도 1에 상기 ELISA 어세이 방법에 대한 개략도를 나타내었다.

(3) 뉴로텐신 , 콜레시스토키닌의 농도 계산 방법

정상인의 혈액 시료 또는 위암 환자의 혈액 시료와 형광 물질(FITC)이 표지된 항원 스탠다드(뉴로텐신, 콜레시스토키닌)를 항체(Phoenix Pharmaceuticals Inc., USA)가 코팅된 마그네틱 비드를 넣어 경쟁적으로 반응 시킨 후, 침전시키고 붙지 않은 혈액 내 펩티드와 항원 스탠다드를 1% 트윈 20이 섞인 PBS로 깨끗하게 세척한 후, 유동세포 분석기(Beckmann Coulter Inc., USA)로 분석하여, 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌의 농도를 계산하였다. 유동세포분석법의 경우에는 조정곡선을 통한 정확한 농도의 계산은 어려워, 스탠다드(cut-off value 농도)를 이용하여 분석한 결과를 레퍼런스로 하여, 양성과 음성을 판별하는 방법으로 사용하였다.

또는, 상기 준비된 혈액으로부터 추출하여 농축한 펩티드를 아는 농도의 펩티드 스탠다드(0.01, 0.1, 1, 10 100 ng/ml)와 함께 LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific)의 multi reaction mornitoing (MRM) 방법으로 분석하여 표준용액으로 구한 크로마토그램의 면적으로 조정곡선을 그리고, 이를 이용하여, 혈액 중의 뉴로텐신, 콜레시스토키닌의 농도를 계산하였다. 사용된 LC의 분리 조건은 아래와 같다.

- Mobile phase:

A 10 % Acetonitrile in dH₂O with 0.2 % formic acid

B 10 % dH₂O in Acetonitrile with 0.2% formic acid

- Flow rate: 0.2 mL/min

- Gradient: B 0 % → 0 % (2 min), 0 % → 20 % (23 min), 20 % → 35 % (5 min), 35 % → 40 % (8 min), 40 % → 70 % (10 min), 70 % → 100 % (5 min, hold 5 min), 100 % → 100 % (2 min)

한편, 펩티드를 검출하는데 사용한 MRM 조건은 하기 표 1과 같다.

Compound	Parent ion	Monitoring fragment ion
Neurotensin	837.9	780.6
CCK	1064.0	1047.0

2. 실험 결과

ELISA 어세이 방법을 통해 정상인과 위암 환자의 혈액 시료로부터 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌의 농도를 분석한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 정상인에 비해 위암 환자의 혈액시료에서 뉴로텐신의 농도가 유의미하게 높게 검출이 되었으며, 콜레시스토키닌의 농도는 유의미하게 낮게 검출됨을 확인할 수 있었다.

또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 위암 환자와 정상인의 혈액 시료로부터 측정된 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌의 농도를 바탕으로 ROC 곡선을 그려본 결과, 뉴로텐신의 경우, 특이성(specificity)은 83 %, 민감도(sensitivity)는 72 %를 나타내었으며, 이때, 판단기준은 237 pg/ml이었다. 콜레시스토키닌의 경우, 94 %의 특이성, 95 %의 민감도를 보였으며, 판단기준은 38 pg/ml 이었다. ROC곡선의 각각의 Area under curve (AUC)는 0.95(콜레시스토키닌)와 0.81(뉴로텐신)이었다(표 2 참조). 상기 결과로 볼 때, 두 마커는 질환 특이적이고, 위암진단 마커로 아주 유용함을 알 수 있었다.

Parameters	CCK	NT
Cutoff value (pg/ml)	38	237
AUC	0.95ㅁ0.018^a,b	0.81ㅁ0.05^a,b
Specificity	94.4 %	83.3 %
Sensitivity ( 95% CI)	94.7 % (86-98)	71.6 % (53-85)

AUC, area under the curve; CI, confidence interval;

^aAUC ± standard error

^bAll p < 0.0001 when comparing AUC for CCK and NT

Sensitivity and specificity of each assay were calculated using a cutoff value of CCK, NT, respectively.

또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 환자별로 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌 농도의 상관관계를 비교한 결과, 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌의 농도가 대체로 반비례하는 결과를 보였다. 이러한 결과로 볼때, 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌의 두 가지 마커를 결합하여 진단에 사용한다면, 더욱 정확한 진단을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Biomarker composition for diagnosing stomach cancer and method for diagnosis using the same <130> PN096753 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> pyrrolidone carboxylic acid <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> hydroxylation <400> 1 Glu Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> sulfatation <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> amidation <400> 2 Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe 1 5

Claims

삭제
정상인의 체액에서 보다 위암 환자의 체액에서 농도가 감소하는 것으로서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 콜레시스토키닌(cholecystokinin)을 포함하는 위암 진단용 바이오 마커 조성물.
제2항에 있어서, 상기 체액은 위액, 타액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 뉴로텐신에 특이적으로 결합하는 항체; 및
서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 콜레시스토키닌에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 위암 진단 키트.
제4항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인 위암 진단 키트.
위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
정상 환자의 체액에 비해 위암이 의심되는 환자의 체액 내의 뉴로텐신의 농도가 상대적으로 증가하거나, 또는, 콜레시스토키닌의 농도가 상대적으로 감소하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 뉴로텐신 또는 콜레시스토키닌을 검출하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 체액은 위액, 타액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.