KR20170093141A - 데옥시하이푸신·신타제 유전자를 지표로서 사용하는 동맥 경화 및 암의 검출 방법 - Google Patents

데옥시하이푸신·신타제 유전자를 지표로서 사용하는 동맥 경화 및 암의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명자는, 종래는 전립선암과 자궁경부암의 관계가 보고되어 있는 데옥시하이푸신·신타제(DHPS) 유전자가, 놀랍게도 동맥 경화 및 소화기계 암과 매우 잘 연관되고, 원하는 동맥 경화 및 소화기계 암의 마커로서 사용하는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 구체적으로는, 본 발명은 피험 시료, 바람직하게는 혈액 검체에서의 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현을 당해 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 동맥 경화 및 소화기계 암을 검출하는, 동맥 경화 및 소화기계 암의 검출 방법을 제공하는 것이다.

Description

데옥시하이푸신·신타제 유전자를 지표로서 사용하는 동맥 경화 및 암의 검출 방법{ARTERIOSCLEROSIS AND CANCER DETECTION METHOD USING DEOXYHYPUSINE SYNTHASE GENE AS INDICATOR}
[A] 동맥 경화 마커에 대하여
본 발명은 질병의 검출 방법에 관한 발명이고, 더 구체적으로는, 데옥시하이푸신·신타제 유전자를 지표로서 사용하는 동맥 경화 및 암의 검출 방법에 관한 발명이다.
동맥 경화는 뇌졸중이나 심근경색 등의 순환기계 질환의 기초적인 요인이 되는 것임은 이미 명확한 것이고, 노화에 따라 저절로 리스크가 증대하는 것이지만, 유전적인 소인(素因)이나 생활 습관의 혼란 등에 의해서도 발생 리스크는 변동하고, 증대한다.
동맥 경화를 기초로 하여 일어나는 순환기계 질환은 환자 본인이나 그 가족에게 있어서 부담이 큰 것이지만, 사회적으로도 의료비의 증대로 이어지고, 그 발생의 예방이나, 적절한 치료 수단의 확립은 여전히 중요한 과제이다.
특히 유전적인 소인의 특정은 이를 특정함으로써, 빠른 생활 지도나, 동맥 경화의 예방약이나 치료약의 투약 등 예방적인 조치를 적절한 때에 실시하는 것을 가능하게 하기 위해서, 최근 점점 중요시되고 있다.
[B] 암 마커에 대하여
암은 노화에 따라 저절로 리스크가 증대하는 것이지만, 유전적인 소인이나 생활 습관의 혼란 등에 의해서도 발생 리스크는 변동하고, 증대한다.
고령화 사회에 따른 암 환자의 증가는 환자 본인이나 가족에게 있어서 부담이 무거운 것이지만, 사회적으로도 의료비의 증대로 이어지고, 그 발생의 예방이나, 적절한 치료 수단의 확립은 여전히 중요한 과제이다.
특히 유전적인 소인의 특정은 이를 특정함으로써, 빠른 생활 지도 등의 예방적인 조치를 적절한 때에 실시하는 것을 가능하게 하기 위해서, 최근 점점 중요시되고 있다.
일본 공개특허공보 특개2007-14277호 일본 공개특허공보 특표2006-507816호
Cracchiolo BM, Heller DS, Clement PM, Wolff EC, Park MH, Hanauske-Abel HM,"Eukaryotic initiation factor 5A-1(eIF5A-1) as a diagnostic marker for aberrant proliferation in intraepithelial neoplasia of the vulva."Gynecol Oncol. 2004 94: 217-22
[A] 동맥 경화 마커에 대하여
동맥 경화의 유전적 소인은 다종 다양하고, 동맥 경화를 예견하여 필요 충분한 검출력을 수반한, 이른바 「만능 마커」로서의 특정한 유전자 마커의 상정은 곤란하다.
그래서 빠짐없이 동맥 경화의 유전자 검사를 실현하기 위해서, 뛰어난 판별력을 수반한 유전자 마커를 더욱 찾아낼 필요가 있다.
[B] 암 마커에 대하여
식도암, 대장암 등의 소화기계의 암의 일부는 다른 종류의 암과 비교하여 이환율(罹患率)이 여전히 높은 것이고, 빠짐없이 소화기계 암의 유전자 검사를 실현하기 위해서, 뛰어난 판별력을 수반한 유전자 마커를 더욱 찾아낼 필요가 있다.
[A] 동맥 경화 마커에 대하여
이번에 본 발명자는, 종래는 전립선암과 자궁경부암의 관계가 보고되어 있는 유전자 「데옥시하이푸신·신타제(deoxyhypusine synthase) 유전자」가 놀랍게도 동맥 경화와 매우 잘 연관되고, 원하는 동맥 경화의 마커로서 사용하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 피험(被驗) 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제(이하, DHPS라고도 함) 유전자의 발현을 당해 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 동맥 경화를 검출하는 동맥 경화의 검출 방법(이하, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법이라고도 함)을 제공하는 발명이다. 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서 사용하는 피험 시료는 혈액 검체인 것이 적합하다. 본 발명의 동맥 경화 검출 방법은 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 발현 데이터를 취득하고, 당해 유전자 발현의 항진이 인정되는 경우에, 동맥 경화의 존재 데이터로 하는 것을 특징으로 하는 데이터 취득 방법이라고 할 수도 있다.
본 발명의 동맥 경화 검출 방법은 하기의 3종류의 형태(동맥 경화 검출 방법1 내지 3)로 대별된다. 그리고, 이들 방법을 키트를 사용하여 실시하는 것도 가능하다.
(1) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 1
본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 DHPS 단백질의 전부 또는 일부를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 특히, 당해 DHPS 단백질의 전부 또는 일부의 검출을 이것과 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용하여 실시하는 것이 적합하다.
(2) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 2
본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)를 검출함으로써 실시할 수 있다. 당해 자기 항체의 검출은, 예를 들면, DHPS의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 상기의 고정화물에 포함되는 DHPS의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수는 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상, 즉 184개 아미노산 이상으로 하는 것이 가능하고, 적합하게는 186개 아미노산 이상, 더욱 적합하게는 187개 아미노산 이상이다. 폴리펩티드의 항원성이 확보되어 있는 것이 전제이지만, 폴리펩티드 길이가 짧은 것이 펩티드 자체의 안정성이 뛰어나고, 또한 고정화물의 단위량당 고정화 펩티드수가 커져 감도가 향상되는 경향이 있다.
(3) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3
본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 당해 표적 핵산의 검출은, 예를 들면, 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을, PCR법 등의 유전자 증폭법에 의해 증폭시켜 이루어지는 유전자 증폭산물을, 표적 핵산으로서 검출할 수 있다.
(4) 동맥 경화 검출용 키트
또한 본 발명의 동맥 경화 검출 방법은 이를 실시하는 요소를 구비한 동맥 경화 검출용 키트에 의해 실시하는 것이 가능하다.
(5) 고정화 플레이트
본 발명은 또한 이하의 스텝(a) 내지 (d)를 포함하는 고정화 플레이트의 사용 방법을 제공한다. 당해 고정화 플레이트는 동맥 경화 검출 방법 2를 실시할 때에 「DHPS의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물」로서 사용되는 것이다.
(a) 인공적으로 조제한 DHPS의 전부 또는 일부를 고정화한 플레이트를, 혈액 검체와 접촉시켜서, 당해 혈액 검체 중의 DHPS에 대한 자기 항체와 당해 플레이트 위의 DHPS의 전부 또는 일부가 결합한 항원 항체 결합체의 형성을, 플레이트 위에서 실시하는 스텝;
(b) 표지(標識)가 인공적으로 부가된 항체 결합성의 2차 항체를, 플레이트 위의 상기 항원 항체 결합체의 자기 항체에 결합시키는 스텝;
(c) 자기 항체에 결합한 상기 2차 항체의 표지를 플레이트 위에서 현재화(顯在化)시켜서, 당해 현재화 시그널을 검출하기 위해서 플레이트를 사용하는 스텝;
(d) 플레이트에서 얻어진 당해 현재화 시그널의 검출값을 DHPS에 대한 자기 항체의 정량값으로서 카운트하여, 통계적으로 얻어진 동맥 경화에 대한 임계값보다도 큰 경우의 당해 정량값을, 상기 혈액 검체에서의 동맥 경화의 지표로 하는 스텝.
상기 플레이트에 고정화된 DHPS의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수는, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것이 적합한 것은 상기의 동맥 경화 검출 방법 2에서의 기재와 같다.
DHPS의 전부 또는 일부를 고정화하는 플레이트(기판)로서는 유리 슬라이드, 다공질 겔, 마이크로타이터 플레이트 등을 들 수 있다. 기판으로의 DHPS의 전부 또는 일부의 고정화법으로서는 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하고, 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법, 생화학적 특이 결합법 등 항체 결합법 등을 실시할 수 있다. 또한, 사용하는 고정화법에 적합한 기판을 선택하는 것도 가능하다. 예를 들면, 기판의 표면에서의 단백질의 결합을 촉진시키기 위해서, 그 표면에 아미노기를 도입한 것을 사용하는 것이 가능하다. 이 경우, 당해 기판 표면의 아미노기에 글루타르알데히드를 결합시키고, 이 결합시킨 글루타르알데히드에, DHPS의 전부 또는 일부의 말단 아미노기 등을 결합시키는 방법; 당해 기판 표면의 아미노기에 정전 상호 작용에 의해 DHPS의 전부 또는 일부를 고정화하는 방법 등을 실시할 수 있다. 또한, 단백질의 고정화에 적합한 기판의 각종 시판품을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 동맥 경화 검출 방법의 표적 요소인 「데옥시하이푸신·신타제(DHPS)」는, 전립선암과 자궁경부암(특허문헌 1, 비특허문헌 1)이나 아폽토시스(특허문헌 2)에 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 공지된 효소 단백질이고, 그 사람에서의 아미노산 서열은 서열번호 1인 것으로 알려져 있고(특허문헌 1), 이를 코드하는 DHPS 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, 서열번호 2로서 알려져 있다. 또한, DHPS에 대한 항체(모노클로날 항체와 폴리클로날 항체)도 공지되어 있고, 통상적인 방법에 의해 제조하는 것이 가능하며, 이미 시판도 되고 있다. 본 발명에서의 DHPS(DHPS 단백질이라고도 함)란, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 DHPS의 아미노산 서열과 상동성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 당해 아미노산 서열의 일부에 치환, 결손, 삽입, 부가 부분이 포함되는 단백질이다. 그리고, 본 발명에서의 DHPS 유전자는 상기의 DHPS를 코드하는 염기 서열을 갖는 유전자이다.
특허문헌 1에 개시되어 있는 바와 같이, DHPS는 스페르미딘 존재하에서, eIF5A(eukaryotic translation Initiation Factor 5A)를 하이푸신화(활성화)하는 효소이고, 입체 구조 중에 효소 활성 부위(본체 구조), 쇄상 구조, 구상 구조를 갖고, 효소 활성 부위와 구상 구조는 쇄상 구조를 통하여 연결되어 있다. 입체 구조 해석 등에 의해, 효소 활성 부위와 구상 구조는 상호 작용하는 것으로 알려져 있고, 구상 구조는 효소 활성 부위의 위기질(僞基質)이라고 추측되고 있다. 하이푸신화는 세포 증식을 포함하는 세포 기능에 필수적인 것으로 알려져 있다. 즉, 하이푸신화는 스페르미딘의 부틸아민 부분을 특이적 리신 잔기의 ε-아미노기에 NAD 의존적으로 전이 후, 수산화된다는 eIF5A에 고유의 번역 후 수식(修飾)이며, 효모에서부터 사람까지 보존된 생육에 필수적인 것이다.
상기한 바와 같이 DHPS는 특히 전립선암이나 자궁경부암의 마커로서의 응용 가능성이 인식되어 있지만, 동맥 경화의 마커로서의 개시는 시사도 포함하여 이루어지고 있지 않다.
[B] 암 마커에 대하여
이번에 본 발명자는, 종래는 전립선암이나 자궁경부암과의 관계가 보고되어 있는 유전자 「데옥시하이푸신·신타제(deoxyhypusine synthase) 유전자」가 놀랍게도 소화기계 암과 매우 잘 연관되고, 원하는 암 마커로서 사용하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제(이하, DHPS라고도 함) 유전자의 발현을 당해 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 소화기계 암을 검출하는 암의 검출 방법(이하, 본 발명의 암 검출 방법이라고도 함)을 제공하는 발명이다. 본 발명의 암 검출 방법에 있어서 사용하는 피험 시료는 혈액 검체인 것이 적합하다. 본 발명의 암 검출 방법은 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 발현 데이터를 취득하고, 당해 유전자 발현의 항진이 인정되는 경우에, 소화기계 암의 존재 데이터로 하는 것을 특징으로 하는 데이터의 취득 방법이라고 할 수도 있다.
본 발명의 암 검출 방법은 하기의 3종류의 형태(암 검출 방법 1 내지 3)로 대별된다. 그리고, 이들 방법을 키트를 사용하여 실시하는 것도 가능하다.
(1) 본 발명의 암 검출 방법 1
본 발명의 암 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 DHPS 단백질의 전부 또는 일부를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 특히, 당해 DHPS 단백질의 전부 또는 일부의 검출을, 이것과 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용하여 실시하는 것이 적합하다.
(2) 본 발명의 암 검출 방법 2
본 발명의 암 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)를 검출함으로써 실시할 수 있다. 당해 자기 항체의 검출은, 예를 들면, DHPS의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 상기의 고정화물에 포함되는 DHPS의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수는 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상, 즉 184 아미노산 이상으로 하는 것이 가능하고, 적합하게는 186 아미노산 이상, 더욱 적합하게는 187 아미노산 이상이다. 폴리펩티드의 항원성이 확보되어 있는 것이 전제이지만, 폴리펩티드 길이가 짧은 것이 펩티드 자체의 안정성이 뛰어나고, 또한 고정화물의 단위량당 고정화 펩티드수가 커져 감도가 향상되는 경향이 있다.
(3) 본 발명의 암 검출 방법 3
본 발명의 암 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 당해 표적 핵산의 검출은, 예를 들면, 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을, PCR법 등의 유전자 증폭법에 의해 증폭시켜 이루어지는 유전자 증폭산물을 표적 핵산으로서 검출할 수 있다.
(4) 암 검출용 키트
또한 본 발명의 암 검출 방법은 이를 실시하는 요소를 구비한 암 검출용 키트에 의해 실시하는 것이 가능하다.
(5) 고정화 플레이트
본 발명은 또한 이하의 스텝(a) 내지 (d)를 포함하는 고정화 플레이트의 사용 방법을 제공한다. 당해 고정화 플레이트는 암 검출 방법 2를 실시할 때에 「DHPS의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물」로서 사용되는 것이다.
(a) 인공적으로 조제한 DHPS의 전부 또는 일부를 고정화한 플레이트를, 혈액 검체와 접촉시켜서, 당해 혈액 검체 중의 DHPS에 대한 자기 항체와 당해 플레이트 위의 DHPS의 전부 또는 일부가 결합한 항원 항체 결합체의 형성을, 플레이트 위에서 실시하는 스텝;
(b) 표지가 인공적으로 부가된 항체 결합성의 2차 항체를, 플레이트 위의 상기 항원 항체 결합체의 자기 항체에 결합시키는 스텝;
(c) 자기 항체에 결합한 상기 2차 항체의 표지를 플레이트 위에서 현재화시켜서, 당해 현재화 시그널을 검출하기 위해서 플레이트를 사용하는 스텝;
(d) 플레이트에서 얻어진 당해 현재화 시그널의 검출값을 DHPS에 대한 자기 항체의 정량값으로서 카운트하여, 통계적으로 얻어진 소화기계 암에 대한 임계값보다도 큰 경우의 당해 정량값을, 상기 혈액 검체에서의 소화기계 암의 지표로 하는 스텝.
상기 플레이트에 고정화된 DHPS의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수는, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것이 적합한 것은 상기의 암 검출 방법 2에서의 기재와 같다.
DHPS의 전부 또는 일부를 고정화하는 플레이트(기판)로서는 유리 슬라이드, 다공질 겔, 마이크로타이터 플레이트 등을 들 수 있다. 기판으로의 DHPS의 전부 또는 일부의 고정화법으로서는 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하고, 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법, 생화학적 특이 결합법 등 항체 결합법 등을 실시할 수 있다. 또한, 사용하는 고정화법에 적합한 기판을 선택하는 것도 가능하다. 예를 들면, 기판의 표면에서의 단백질의 결합을 촉진시키기 위해서, 그 표면에 아미노기를 도입한 것을 사용하는 것이 가능하다. 이 경우, 당해 기판 표면의 아미노기에 글루타르알데히드를 결합시키고, 이 결합시킨 글루타르알데히드에, DHPS의 전부 또는 일부의 말단 아미노기 등을 결합시키는 방법; 당해 기판 표면의 아미노기에 정전 상호 작용에 의해 DHPS의 전부 또는 일부를 고정화하는 방법 등을 실시할 수 있다. 또한, 단백질의 고정화에 적합한 기판의 각종 시판품을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 암 검출 방법의 표적 요소인 「데옥시하이푸신·신타제(DHPS)」는, 전립선암과 자궁경부암(특허문헌 1, 비특허문헌 1)이나 아폽토시스(특허문헌 2)에 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 공지된 효소 단백질이고, 그 사람에서의 아미노산 서열은 서열번호 1인 것으로 알려져 있고(특허문헌 1), 이를 코드하는 DHPS 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, 서열번호 2로서 알려져 있다. 또한, DHPS에 대한 항체(모노클로날 항체와 폴리클로날 항체)도 공지되어 있고, 통상적인 방법에 의해 제조하는 것이 가능하며, 이미 시판도 되고 있다. 본 발명에서의 DHPS(DHPS 단백질이라고도 함)란, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 DHPS의 아미노산 서열과 상동성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 당해 아미노산 서열의 일부에 치환, 결손, 삽입, 부가 부분이 포함되는 단백질이다. 그리고, 본 발명에서의 DHPS 유전자는 상기의 DHPS를 코드하는 염기 서열을 갖는 유전자이다.
특허문헌 1에 개시되어 있는 바와 같이, DHPS는 스페르미딘 존재하에서, eIF5A(eukaryotic translation Initiation Factor 5A)를 하이푸신화(활성화)하는 효소이고, 입체 구조 중에 효소 활성 부위(본체 구조), 쇄상 구조, 구상 구조를 갖고, 효소 활성 부위와 구상 구조는 쇄상 구조를 통하여 연결되어 있다. 입체 구조 해석 등에 의해, 효소 활성 부위와 구상 구조는 상호 작용하는 것으로 알려져 있고, 구상 구조는 효소 활성 부위의 위기질이라고 추측되고 있다. 하이푸신화는 세포 증식을 포함하는 세포 기능에 필수적인 것으로 알려져 있다. 즉, 하이푸신화는 스페르미딘의 부틸아민 부분을 특이적 리신 잔기의 ε-아미노기에 NAD 의존적으로 전이 후, 수산화된다는 eIF5A에 고유의 번역 후 수식이며, 효모에서부터 사람까지 보존된 생육에 필수적인 것이다.
상기한 바와 같이 DHPS는 특히 전립선암이나 자궁경부암의 마커로서의 응용 가능성이 인식되어 있지만, 소화기계 암 마커로서의 개시는 시사도 포함하여 이루어지고 있지 않다.
소화기계 암으로서는 식도암, 위암, 십이지장암, 대장암(직장암 및 결장암을 포함함), 소장암, 담낭암, 췌장암, 및 간장암을 들 수 있지만, 특히 식도암 및 대장암의 마커로서 DHPS는 유용하다.
본 발명에 의해, 피험 시료 중의 데옥시하이푸신·신타제(DHPS) 유전자의 발현에 관한 요소를 기초로 한 동맥 경화의 검출 수단, 및 소화기계 암의 검출 수단이 제공된다.
도 1은 의료 시설 유래의 혈청 검체에 있어서, 급성기 뇌경색 환자와 정상인 사이에서 ELISA법을 사용하여 검토한 DHPS의 자기 항체가(抗體價) 분포의 첫 번째 결과를, 컷오프 값과 함께 나타낸 도면이다.
도 2는 도 1의 DHPS의 자기 항체가의 분포에 관한 ROC 곡선이다.
도 3은 의료 시설 유래의 혈청 검체에 있어서, 급성기 뇌경색 환자와 정상인 사이에서 ELISA법을 사용하여 검토한 DHPS의 자기 항체가 분포의 두 번째 결과를, 컷오프 값과 함께 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3의 DHPS의 자기 항체가의 분포에 관한 ROC 곡선이다.
도 5는 의료 시설 유래의 혈청 검체에 있어서, 기존의 동맥 경화 마커인 CRP값의 음성군과 양성군으로 나누고, 또한 이들 군 중의 급성기 뇌경색 환자군과 정상인군 사이에서의 ELISA법에 의한 DHPS의 자기 항체가의 분포를, 세 번째 검토 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 도 5의 DHPS의 자기 항체가 중 CRP값의 음성군에서의 ROC 곡선이다.
도 7은 급성기 뇌경색 환자의 혈청 검체 중 DHPS의 자기 항체에 대하여, 웨스턴 블롯법에 의해 검토한 결과를 나타낸 전기영동도이다.
도 8은 급성기 뇌경색 환자의 혈청 검체 중 내재성의 DHPS에 대하여, 웨스턴 블롯법으로 검출한 결과를 나타낸 전기영동도이다.
도 9는 의료 시설 유래의 혈청 검체에 있어서, 암 환자와 정상인 사이에서 ELISA법을 사용하여 검토한 DHPS의 자기 항체가의 분포 결과를, 컷오프 값과 함께 나타낸 도면이다.
도 10은 도 9의 DHPS의 자기 항체가의 분포에 관한 ROC 곡선이다.
[A] 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 대하여
(1) 데옥시하이푸신·신타제(DHPS) 유전자에 관한 재료의 입수
상기한 바와 같이, 사람들에게 DHPS의 존재는 공지되어 있고, 이미 그 아미노산 서열(사람에 대하여, 서열번호 1)과 이를 코드하는 염기 서열(예를 들면, 서열번호 2)은 공지되어 있다.
이에 기초하여 재조합 DHPS를 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 염기 서열에 기초하여, 당해 염기 서열의 전부 또는 일부를 갖는 2중쇄 DNA를 증폭하기 위한 핵산 증폭용 프라이머를 설계하고, 당해 증폭용 프라이머를 사용한 PCR법 등에 의한 유전자 증폭산물을 DHPS 유전자의 전부 또는 일부로서 수득하고, 이를 사용하여 적절한 벡터에 내장하고, 당해 벡터가 내장되어 형질 전환한 형질 전환체를 선택하여 클로닝하고, 또한 목적으로 하는 DHPS의 전부 또는 일부를 당해 형질 전환체, 또는 당해 형질 전환체로부터 수득된 DHPS 유전자를 유전자 발현에 적합한 벡터와 숙주에 대하여 적용한 형질 전환체에 있어서 DHPS 유전자의 발현을 실시함으로써 재조합 DHPS를 수득할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 PCR법 등의 유전자 증폭법을 사용하지 않고, 유전자 라이브러리의 제작을 거쳐서 DHPS 유전자의 클로닝을 실시할 수도 있다. 또한, 재조합 DHPS는, 필요에 따라, 점 돌연변이 도입법, 랜덤 돌연변이 도입법, 단계적 결실 유전자 제작법 등의 유전자 개변법을 대상으로 이루어지는 DHPS를 코드하는 핵산에서 실시함으로써, 그 아미노산 서열을 천연형으로부터 개변하는 것이 가능하다.
또한 DHPS의 전부 또는 일부는 공지된 펩티드의 화학 합성법에 따라 제조하는 것이 가능하다. 펩티드 합성에 관해서는, 이미 통상적인 방법으로 확립되어 있는 액상 펩티드 합성법, 또는 고상 펩티드 합성법을 사용하여 제조하는 것이 가능하다. 그리고, 일반적으로 적합한 화학 합성법으로서 인식되어 있는 고상 펩티드 합성법으로서, Boc 고상법 또는 Fmoc 고상법을 사용하는 것이 가능하다. 특히, 장쇄를 합성하는 경우에는 라이게이션법을 사용할 수 있다.
상기에서 수득되는 DHPS 유전자의 다른 용도로서, 예를 들면, DHPS에 대한 항체를 유전자 면역법에 의해 제조할 때에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서 사용되는 핵산 프로브로서 이용하는 것이 가능하다.
또한 상기에서 수득되는 DHPS는 DHPS에 대한 항체를 제조할 때의 면역원, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법을 자기 항체의 검출에 의해 실시할 때의 자기 항체의 결합장(結合場), 또한 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에서의 표준 물질 등으로서 사용할 수 있다.
DHPS에 대한 항체는 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 즉, 면역 동물에 대하여, 면역원인 DHPS, 또는 DHPS 유전자를 부여하여, 이에 의해 면역 동물체 내에 생성하는 항혈청을 폴리클로날 항체로서 수득할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 상기 면역 동물로부터 B세포를 수득하여, 이를 기초로 한 하이브리도마를 제작하고, 이를 다시 숙주 동물에게 부여함으로써 당해 숙주 동물에 의해 수득할 수 있다.
상기에서 수득되는 DHPS 유전자, DHPS 및 DHPS에 대한 항체에서는, 필요에 따라 적절한 수식이나 처리를 실시하는 것도 가능하다. 수식으로서는, 예를 들면, 형광 물질, 색소, 효소, 방사성 물질 등의 표지 물질의 부가 등, 처리로서는, 예를 들면, 항체의 프래그먼트화 등을 들 수 있다.
상기의 DHPS 유전자에 관한 요소는 시판품을 사용하는 것도 가능하다. 시판품으로는 기제품은 물론, 주문에 따라 제조되는 외주품도 포함된다.
(2) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 1에 대하여
본 발명의 동맥 경화 검출 방법 1은 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 동맥 경화를 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 DHPS의 전부 또는 일부(이하, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서 DHPSes로 총칭하는 경우도 있음)를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 한다.
즉 피험 시료 중의 DHPSes를 정량하고, 그 정량값이 적어도 동맥 경화가 인정되지 않는 자(이하, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 있어서 동맥 경화 정상인이라고도 함)의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPS 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료 제공자의 동맥 경화를 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또한 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료에서의 DHPSes량의 동맥 경화 정상인의 표준값은 일반적인 검사에 의해 동맥 경화가 인정되지 않는 것으로 추정되는 자의 표본 집단을 설정하고, 당해 표본 집단에서의 당해 피험 시료의 DHPSes의 정량값을 구하고, 이것에 통계 처리를 하여, 평균, 표준 편차 등을 구함으로써 컷오프 값을 포함하여 도출할 수 있다.
피험 시료에서의 DHPSes의 정량 수단은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, DHPSes와 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용하여 실시하는 정량 수단, 구체적으로는 면역 침강법, 웨스턴 블로팅법, 면역 염색법, EIA법, RIA법, 비탁법, 비롱법(比朧法), 라텍스 응집 비탁법, CLEIA법 등을 들 수 있다. 또한, TOF-MASS를 사용하여 DHPSes를 직접 정량하는 것도 가능하다. EIA법에서는, 특히 고정화 항체를 사용하는 ELISA법이 적합하다. 어느 정량 수단도, 정량 표적 물질을 피험 시료 중의 DHPSes로 한 경우의, 확립된 수단을 사용하여 실시할 수 있다. 이하, 이들 중 몇 가지에 대하여 간단하게 설명한다.
정량 수단이 ELISA법인 경우에는, 예를 들면, 마이크로플레이트에 고정화한 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서 피험 시료 중의 DHPSes를 고정화 항체에 결합시키고, 이 고정화 항체에 결합한 DHPSes를, 효소 표지한 별도의 DHPS에 대한 항체 등을 사용하여 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 또한, 고정화 항체와, 피험 시료 및 효소 표지 항체를 동시에 반응시켜서, 피험 시료 중의 DHPSes를 정량하는 것도 가능하다.
정량 수단이 면역 침강법인 경우에는, 예를 들면, 비즈에 고정화한 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서 DHPSes를 고정화 항체에 결합시키고, 이 고정화 항체에 결합한 DHPSes를 분리하여, 그 분리물로부터 DHPSes를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 이 DHPSes의 면역 침강법에 의한 정량은, 예를 들면, 상기의 분리물에 대하여 전기영동을 실시하여, 이 전기영동 패턴의 전사물에, DHPS에 대한 표지 항체를 작용시켜서, DHPSes의 밴드를 검출하는 웨스턴 블롯법을 사용하여 실시할 수 있다.
또한 정량 수단을, 웨스턴 블롯법을 주체로 한 방법으로 하는 것도 가능하다. 예를 들면, 피험 시료로부터 세포를 제외한 세포 제외 피험 시료를 직접 전기영동에 의해 분리하고, 그 전사물에, DHPS에 대한 표지 항체를 작용시켜서 밴드를 검출함으로써, 피험 시료 중의 DHPSes를 정량할 수 있다.
정량 수단이 라텍스 응집 비탁법인 경우에는, 예를 들면, 라텍스 입자에 결합시킨 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서, 액상 중에서 항원 항체 반응에 의한 면역 복합체의 응집덩어리를 형성시켜 그 탁도의 변화를 측정함으로써 정량을 실시할 수 있다.
(3) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 2에 대하여
본 발명의 동맥 경화 검출 방법 2는 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 동맥 경화를 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)를 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는 검출 방법이다.
즉 피험 시료 중의 DHPS에 대한 자기 항체를 정량하고, 그 정량값이 동맥 경화 정상인의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPS 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료 제공자의 동맥 경화를 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또는 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료에서의 DHPS 자기 항체량의 동맥 경화 정상인의 표준값은 일반적인 검사에 의해 동맥 경화가 인정되지 않는 것으로 추정되는 자의 표본 집단을 설정하고, 당해 표본 집단에서의 당해 피험 시료의 DHPS 자기 항체의 정량값을 구하고, 이것에 통계 처리를 하여, 평균, 표준 편차 등을 구함으로써 컷오프 값을 포함하여 도출할 수 있다.
당해 자기 항체의 정량은, 예를 들면, DHPSes를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는, 간접형광 항체법, ELISA법, 웨스턴 블롯법(면역 블롯법), 비탁법, 비롱법, 라텍스 응집 비탁법, CLEIA법 등의 수단을 사용하여 정량을 실시할 수 있다. 어느 정량 수단도, 정량 표적 물질을 피험 시료 중의 DHPS 자기 항체로 한 경우의, 확립된 수단을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 간접형광 항체법(FANA)에서는, DHPSes를 고정화한 단백질 어레이에 피험 시료를 접촉시켜서, 고정화 DHPSes와, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체를 결합시켜서, 형성된 고정화 DHPSes-항DHPS 항체 복합체에 대하여, 또는 형광 표지를 실행한 2차 항체를 접촉시켜서, DHPS에 대한 자기 항체를 정량할 수 있다. ELISA법에서는, 간접형광 항체법에서 사용하는 2차 항체의 표지를 효소 표지로서 정량을 실시하는 것이다. 2차 항체의 표지는 다양하게 선택 가능하다. 웨스턴 블롯법에서는, DHPSes를 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후에, 겔로부터 니트로셀룰로스 막 등의 담체에 전사시키고, 당해 전사 담체에 피험 시료를 접촉시켜서, 당해 전사 담체 위의 DHPSes와 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체의 복합체를 형성시켜서, 당해 복합체를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 비탁법이나 비롱법에서는, 피험 시료와 DHPSes를 접촉시킴으로써 형성된 DHPSes-항DHPS 항체 복합체를 탁도(비탁법)나, 산란광 강도의 변화(비롱법)로 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 라텍스 응집 비탁법에서는, DHPSes를 결합시킨 라텍스 입자와 피험 시료를 접촉시킴으로써, 당해 라텍스 입자의 응집체를, 라텍스 입자에 결합한 자기 항체끼리의 상호 작용에 의해 형성시켜서, 이를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. CLEIA법에서는, DHPSes 결합 자성 입자와 피험 시료를 접촉시켜서, 자성 입자 위에 DHPSes-항DHPS 항체 복합체를 형성시켜서 집자(集磁)를 실시하고, 미반응물을 제거하여, 적절한 형광화 처리 등을 실행하여 당해 복합체를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다.
(4) 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3에 대하여
본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3은 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 동맥 경화를 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는 검출 방법이다.
예를 들면, 피험 시료 중의 DHPSes를 코드하는 mRNA량을 정량하고, 그 정량값이 동맥 경화 정상인의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPSes 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료 제공자의 동맥 경화를 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또는 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료 중의 DHPSes를 코드하는 mRNA량 검출의 기초가 되는 핵산은 피험 시료에서의 RNA를 통상적인 방법에 의해 추출하고, 이를 DNA로의 역전사를 실시함으로써 cDNA로서 수득할 수 있다. 당해 cDNA에 대하여, DHPSes 유전자를 증폭하기 위한 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 PCR법 등의 유전자 증폭 방법을 실시하고(RT-PCR법), 그 기초가 되는 mRNA량을 나타내는 정도, 예를 들면, 특정한 사이클수의 유전자 증폭 수단에서의 DHPSes 유전자의 카피수나, DHPSes 유전자의 카피수의 증가 스피드 등을 파악함으로써, 피험 시료 중의 DHPSes 유전자의 발현량을 파악할 수 있다.
당해 표적 핵산의 검출은, 예를 들면, 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 유전자 증폭산물로서 수득된 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시할 수 있다.
당해 시그널의 검출은, 예를 들면, 서던 블롯법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3의 일련의 공정을 RT-PCR법을 사용한 리얼타임 분석 등에 의해 실시할 수 있다.
(5) 본 발명의 동맥 경화 검출용 키트
본 발명의 동맥 경화 검출용 키트는 상기한 바와 같이 본 발명의 동맥 경화 검출 방법을 실시하기 위한 요소를 구비한 키트이다. 당해 동맥 경화 검출용 키트의 내용은 본 발명의 동맥 경화 검출 방법의 형태나, 목적, 어느 정도를 키트화할지에 관한 의도 등에 따라 다르다.
예를 들면, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 1을 실시하기 위한 동맥 경화 검출용 키트에 있어서는, DHPS에 대한 항체를 1차 항체로서 고정화한 플레이트, 표지되어 있는 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, ELISA법을 실시하기 위한 키트의 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPS에 대한 항체를 결합시킨 라텍스 입자를, 라텍스 응집 비탁법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPS에 대한 항체를 결합시킨 자성 입자와, 표지되어 있는 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, CLEIA법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 1의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 동맥 경화 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 2를 실시하기 위한 동맥 경화 검출용 키트에 있어서는, 예를 들면, DHPSes를 고정화한 플레이트, 표지되어 있는 자기 항체에 대한 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, FANA법이나 ELISA법을 실시하기 위한 키트의 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPSes를 결합시킨 라텍스 입자를, 라텍스 응집 비탁법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPSes를 결합시킨 자성 입자와, 표지되어 있는 자기 항체에 대한 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, CLEIA법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 2의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 동맥 경화 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3을 실시하기 위한 동맥 경화 검출용 키트에 있어서는, 예를 들면, mRNA를 역전사하기 위한 역전사 효소와 역전사용 프라이머, DHPSes를 코드하는 cDNA를 증폭하기 위한 유전자 증폭용 프라이머, 유전자 증폭산물을 검출하기 위한 핵산 프로브, 당해 핵산 프로브의 시그널을 현재화시키기 위한 시약 등을 키트의 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 동맥 경화 검출 방법 3의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 동맥 경화 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
[B] 본 발명의 암 검출 방법에 대하여
(1) 데옥시하이푸신·신타제(DHPS) 유전자에 관한 재료의 입수
상기한 바와 같이, 사람들에게 DHPS의 존재는 공지되어 있고, 이미 그 아미노산 서열(사람에 대하여, 서열번호 1)과 이를 코드하는 염기 서열(예를 들면, 서열번호 2)은 공지되어 있다.
이에 기초하여 재조합 DHPS를 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 염기 서열에 기초하여, 당해 염기 서열의 전부 또는 일부를 갖는 2중쇄 DNA를 증폭하기 위한 핵산 증폭용 프라이머를 설계하고, 당해 증폭용 프라이머를 사용한 PCR법 등에 의한 유전자 증폭산물을 DHPS 유전자의 전부 또는 일부로서 수득하고, 이를 사용하여 적절한 벡터에 내장하고, 당해 벡터가 내장되어 형질 전환한 형질 전환체를 선택하여 클로닝하고, 또한 목적으로 하는 DHPS의 전부 또는 일부를 당해 형질 전환체, 또는 당해 형질 전환체로부터 수득된 DHPS 유전자를 유전자 발현에 적합한 벡터와 숙주에 대하여 적용한 형질 전환체에 있어서 DHPS 유전자의 발현을 실시함으로써 재조합 DHPS를 수득할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 PCR법 등의 유전자 증폭법을 사용하지 않고, 유전자 라이브러리의 제작을 거쳐서 DHPS 유전자의 클로닝을 실시할 수도 있다. 또한, 재조합 DHPS는, 필요에 따라, 점 돌연변이 도입법, 랜덤 돌연변이 도입법, 단계적 결실 유전자 제작법 등의 유전자 개변법을 대상으로 이루어지는 DHPS를 코드하는 핵산에서 실시함으로써, 그 아미노산 서열을 천연형으로부터 개변하는 것이 가능하다.
또한 DHPS의 전부 또는 일부는 공지된 펩티드의 화학 합성법에 따라 제조하는 것이 가능하다. 펩티드 합성에 관해서는, 이미 통상적인 방법으로 확립되어 있는 액상 펩티드 합성법, 또는 고상 펩티드 합성법을 사용하여 제조하는 것이 가능하다. 그리고, 일반적으로 적합한 화학 합성법으로서 인식되어 있는 고상 펩티드 합성법으로서, Boc 고상법 또는 Fmoc 고상법을 사용하는 것이 가능하다. 특히, 장쇄를 합성하는 경우에는 라이게이션법을 사용할 수 있다.
상기에서 수득되는 DHPS 유전자의 다른 용도로서, 예를 들면, DHPS에 대한 항체를 유전자 면역법에 의해 제조할 때에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 암 검출 방법에 있어서 사용되는 핵산 프로브로서 이용하는 것이 가능하다.
또한 상기에서 수득되는 DHPS는 DHPS에 대한 항체를 제조할 때의 면역원, 본 발명의 암 검출 방법을 자기 항체의 검출에 의해 실시할 때의 자기 항체의 결합장, 또한 본 발명의 암 검출 방법에서의 표준 물질 등으로서 사용할 수 있다.
DHPS에 대한 항체는 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 즉, 면역 동물에 대하여, 면역원인 DHPS, 또는 DHPS 유전자를 부여하여, 이에 의해 면역 동물체 내에 생성하는 항혈청을 폴리클로날 항체로서 수득할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 상기 면역 동물로부터 B세포를 수득하여, 이를 기초로 한 하이브리도마를 제작하고, 이를 다시 숙주 동물에게 부여함으로써 당해 숙주 동물에 의해 수득할 수 있다.
상기에서 수득되는 DHPS 유전자, DHPS 및 DHPS에 대한 항체에서는, 필요에 따라 적절한 수식이나 처리를 실시하는 것도 가능하다. 수식으로서는, 예를 들면, 형광 물질, 색소, 효소, 방사성 물질 등의 표지 물질의 부가 등, 처리로서는, 예를 들면, 항체의 프래그먼트화 등을 들 수 있다.
상기의 DHPS 유전자에 관한 요소는 시판품을 사용하는 것도 가능하다. 시판품으로는 기제품은 물론, 주문에 따라 제조되는 외주품도 포함된다.
(2) 본 발명의 암 검출 방법 1에 대하여
본 발명의 암 검출 방법 1은 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 소화기계 암을 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 DHPS의 전부 또는 일부(이하, 본 발명의 암 검출 방법에 있어서 DHPSes로 총칭하는 경우도 있음)를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 한다.
즉 피험 시료 중의 DHPSes를 정량하고, 그 정량값이 적어도 소화기계 암이 인정되지 않는 자(이하, 본 발명의 암 검출 방법에 있어서 소화기계 암 정상인이라고도 함)의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPS 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료 제공자의 소화기계 암을 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또는 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료에서의 DHPSes량의 소화기계 암 정상인의 표준값은 일반적인 검사에 의해 소화기계 암이 인정되지 않는 것으로 추정되는 자의 표본 집단을 설정하고, 당해 표본 집단에서의 당해 피험 시료의 DHPSes의 정량값을 구하고, 이것에 통계 처리를 하여, 평균, 표준 편차 등을 구함으로써 컷오프 값을 포함하여 도출할 수 있다.
피험 시료에서의 DHPSes의 정량 수단은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, DHPSes와 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용하여 실시하는 정량 수단, 구체적으로는 면역 침강법, 웨스턴 블로팅법, 면역 염색법, EIA법, RIA법, 비탁법, 비롱법, 라텍스 응집 비탁법, CLEIA법 등을 들 수 있다. 또한, TOF-MASS를 사용하여 DHPSes를 직접 정량하는 것도 가능하다. EIA법에서는 특히 고정화 항체를 사용하는 ELISA법이 적합하다. 어느 정량 수단도, 정량 표적 물질을 피험 시료 중의 DHPSes로 한 경우의, 확립된 수단을 사용하여 실시할 수 있다. 이하, 이들 중 몇 가지에 대하여 간단하게 설명한다.
정량 수단이 ELISA법인 경우에는, 예를 들면, 마이크로플레이트에 고정화한 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서 피험 시료 중의 DHPSes를 고정화 항체에 결합시키고, 이 고정화 항체에 결합한 DHPSes를, 효소 표지한 별도의 DHPS에 대한 항체 등을 사용하여 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 또한, 고정화 항체와, 피험 시료 및 효소 표지 항체를 동시에 반응시켜서, 피험 시료 중의 DHPSes를 정량하는 것도 가능하다.
정량 수단이 면역 침강법인 경우에는, 예를 들면, 비즈에 고정화한 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서 DHPSes를 고정화 항체에 결합시키고, 이 고정화 항체에 결합한 DHPSes를 분리하여, 그 분리물로부터 DHPSes를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 이 DHPSes의 면역 침강법에 의한 정량은, 예를 들면, 상기의 분리물에 대하여 전기영동을 실시하여, 이 전기영동 패턴의 전사물에, DHPS에 대한 표지 항체를 작용시켜서, DHPSes의 밴드를 검출하는 웨스턴 블롯법을 사용하여 실시할 수 있다.
또한 정량 수단을, 웨스턴 블롯법을 주체로 한 방법으로 하는 것도 가능하다. 예를 들면, 피험 시료로부터 세포를 제외한 세포 제외 피험 시료를 직접 전기영동에 의해 분리하고, 그 전사물에, DHPS에 대한 표지 항체를 작용시켜서 밴드를 검출함으로써, 피험 시료 중의 DHPSes를 정량할 수 있다.
정량 수단이 라텍스 응집 비탁법인 경우에는, 예를 들면, 라텍스 입자에 결합시킨 DHPS에 대한 항체에, 피험 시료를 접촉시켜서, 액상 중에서 항원 항체 반응에 의한 면역 복합체의 응집덩어리를 형성시켜 그 탁도의 변화를 측정함으로써 정량을 실시할 수 있다.
(3) 본 발명의 암 검출 방법 2에 대하여
본 발명의 암 검출 방법 2는 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 소화기계 암을 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)를 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는 검출 방법이다.
즉 피험 시료 중의 DHPS에 대한 자기 항체를 정량하고, 그 정량값이 소화기계 암 정상인의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPS 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료 제공자의 소화기계 암을 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또는 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료에서의 DHPS 자기 항체량의 소화기계 암 정상인의 표준값은 일반적인 검사에 의해 소화기계 암이 인정되지 않는 것으로 추정되는 자의 표본 집단을 설정하고, 당해 표본 집단에서의 당해 피험 시료의 DHPS 자기 항체의 정량값을 구하고, 이것에 통계 처리를 하여, 평균, 표준 편차 등을 구함으로써 컷오프 값을 포함하여 도출할 수 있다.
당해 자기 항체의 정량은, 예를 들면, DHPSes를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 DHPS에 대한 항체(자기 항체)의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는, 간접형광 항체법, ELISA법, 웨스턴 블롯법(면역 블롯법), 비탁법, 비롱법, 라텍스 응집 비탁법, CLEIA법 등의 수단을 사용하여 정량을 실시할 수 있다. 어느 정량 수단도, 정량 표적 물질을 피험 시료 중의 DHPS 자기 항체로 한 경우의, 확립된 수단을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 간접형광 항체법(FANA)에서는, DHPSes를 고정화한 단백질 어레이에 피험 시료를 접촉시켜서, 고정화 DHPSes와, 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체를 결합시켜서, 형성된 고정화 DHPSes-항DHPS 항체 복합체에 대하여, 또는 형광 표지를 실행한 2차 항체를 접촉시켜서, DHPS에 대한 자기 항체를 정량할 수 있다. ELISA법에서는, 간접형광 항체법에서 사용하는 2차 항체의 표지를 효소 표지로서 정량을 실시하는 것이다. 2차 항체의 표지는 다양하게 선택 가능하다. 웨스턴 블롯법에서는, DHPSes를 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후에, 겔로부터 니트로셀룰로스 막 등의 담체에 전사시키고, 당해 전사 담체에 피험 시료를 접촉시켜서, 당해 전사 담체 위의 DHPSes와 피험 시료 중의 DHPS에 대한 항체의 복합체를 형성시켜서, 당해 복합체를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 비탁법이나 비롱법에서는, 피험 시료와 DHPSes를 접촉시킴으로써 형성된 DHPSes-항DHPS 항체 복합체를 탁도(비탁법)나, 산란광 강도의 변화(비롱법)로 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. 라텍스 응집 비탁법에서는, DHPSes를 결합시킨 라텍스 입자와 피험 시료를 접촉시킴으로써, 당해 라텍스 입자의 응집체를, 라텍스 입자에 결합한 자기 항체끼리의 상호 작용에 의해 형성시켜서, 이를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다. CLEIA법에서는, DHPSes 결합 자성 입자와 피험 시료를 접촉시켜서, 자성 입자 위에 DHPSes-항DHPS 항체 복합체를 형성시켜서 집자를 실시하고, 미반응물을 제거하고, 적절한 형광화 처리 등을 실행하여 당해 복합체를 검출함으로써 정량을 실시할 수 있다.
(4) 본 발명의 암 검출 방법 3에 대하여
본 발명의 암 검출 방법 3은 DHPS 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 피험자의 소화기계 암을 검출할 때에, 표적 유전자인 DHPS 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 DHPS 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는 검출 방법이다.
예를 들면, 피험 시료 중의 DHPSes를 코드하는 mRNA량을 정량하고, 그 정량값이 소화기계 암 정상인의 표준값보다도 큰 경우에, 피험 시료 제공자에서의 DHPSes 유전자의 발현 항진을 인정하고, 이를 지표로서 당해 피험 시료의 제공자의 소화기계 암을 검출하는 것이 가능하다. 피험 시료로서는 혈청 검체, 혈장 검체, 전혈 검체 등의 혈액 검체, 또는 소변 검체 등을 사용할 수 있지만, 혈액 검체가 적합하다. 또한, 혈액 검체는 적절히 적절한 처리, 예를 들면, 헤파린 처리 등이 이루어져 있어도 좋다.
피험 시료 중의 DHPSes를 코드하는 mRNA량 검출의 기초가 되는 핵산은 피험 시료에서의 RNA를 통상적인 방법에 의해 추출하고, 이를 DNA로의 역전사를 실시함으로써 cDNA로서 수득할 수 있다. 당해 cDNA에 대하여, DHPSes 유전자를 증폭하기 위한 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 PCR법 등의 유전자 증폭 방법을 실시하고(RT-PCR법), 그 기초가 되는 mRNA량을 나타내는 정도, 예를 들면, 특정 사이클수의 유전자 증폭 수단에서의 DHPSes 유전자의 카피수나, DHPSes 유전자의 카피수의 증가 스스피드 등을 파악함으로써, 피험 시료 중의 DHPSes 유전자의 발현량을 파악할 수 있다.
당해 표적 핵산의 검출은, 예를 들면, 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 유전자 증폭산물로서 수득된 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시할 수 있다.
당해 시그널의 검출은, 예를 들면, 서던 블롯법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 암 검출 방법 3의 일련의 공정을 RT-PCR법을 사용한 리얼타임 분석 등에 의해 실시할 수 있다.
(5) 본 발명의 암 검출용 키트
본 발명의 암 검출용 키트는 상기한 바와 같이 본 발명의 암 검출 방법을 실시하기 위한 요소를 구비한 키트이다. 당해 암 검출용 키트의 내용은 본 발명의 암 검출 방법의 형태나, 목적, 어느 정도를 키트화할지에 관한 의도 등에 따라 다르다.
예를 들면, 본 발명의 암 검출 방법 1을 실시하기 위한 암 검출용 키트에 있어서는, DHPS에 대한 항체를 1차 항체로서 고정화한 플레이트, 표지되어 있는 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, ELISA법을 실시하기 위한 키트의 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPS에 대한 항체를 결합시킨 라텍스 입자를, 라텍스 응집 비탁법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPS에 대한 항체를 결합시킨 자성 입자와, 표지되어 있는 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, CLEIA법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 암 검출 방법 1의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 암 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 암 검출 방법 2를 실시하기 위한 암 검출용 키트에 있어서는, 예를 들면, DHPSes를 고정화한 플레이트, 표지되어 있는 자기 항체에 대한 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, FANA법이나 ELISA법을 실시하기 위한 키트의 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPSes를 결합시킨 라텍스 입자를, 라텍스 응집 비탁법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 또한, DHPSes를 결합시킨 자성 입자와, 표지되어 있는 자기 항체에 대한 2차 항체, 2차 항체의 표지를 현재화시키기 위한 시약을 구비한 형태를, CLEIA법을 실시하기 위한 키트 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 암 검출 방법 2의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 암 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 암 검출 방법 3을 실시하기 위한 암 검출용 키트에 있어서는, 예를 들면, mRNA를 역전사하기 위한 역전사 효소와 역전사용 프라이머, DHPSes를 코드하는 cDNA를 증폭하기 위한 유전자 증폭용 프라이머, 유전자 증폭산물을 검출하기 위한 핵산 프로브, 당해 핵산 프로브의 시그널을 현재화시키기 위한 시약 등을 키트의 구성으로서 들 수 있다. 여기에 든 이들 구성은 어디까지나 예시이며, 본 발명의 암 검출 방법 3의 다른 형태를 실시하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 여기에 예시된 상기의 요소의 구성을 더욱 적게 하여, 검사의 외주 또는 자기 조달의 정도를 늘리도록 설정하는 것도 가능하고, 반대로, 희석액이나 시약용의 튜브 등을 구성으로서 늘려서, 암 검출용 키트의 즉시 사용을 설정하는 것도 가능하다. 또한, 구체적인 검사 형태에 따른 다른 요소를 가미하는 것도 가능하다.
실시예
이하, 본 발명의 실시예를 개시한다.
[A] 본 발명의 동맥 경화 검출 방법에 대하여
[참고예] DHPS의 동맥 경화 마커로서의 스크리닝
(1) 약 8000종류의 단백질이 고정화된 단백질 어레이와, 동맥 경화 환자와 정상인의 혈청 검체를 접촉시켜서, 당해 검체 중에 존재하는 동맥 경화 환자 특유의 자기 항체를 간접형광 항체법에 의해 검출하였다. 그 결과, 약 150종의 후보 자기 항체를 특정하고, 이들 후보 자기 항체의 하나가 DHPS에 대한 혈청 중의 자기 항체이다. 여기에서 사용한 동맥 경화 환자의 혈청 검체는 병원 및 연구 협력 시설을 수진(受診)한 경동맥 협착증 환자에게서 수득한 것이다.
또한, 상기 환자의 평가에서는 외래 수진자 중에서 성별·연령(±5세)을 동맥 경화 환자와 일치시킨 거의 같은 수의 정상 피험자를 기준(컨트롤)으로 하여 선택하였다. 외래 수진시 또는 입원시에, 1) 연구 목적이나 연구 협력의 임의성 등을 본인, 가족에게 설명하고, 인폼드·콘센트를 얻은 후에, 2) 가족력·과거병력·음주나 흡연 등의 라이프스타일, 작업 형태에 관한 문진을 실시하고, 3) 채혈하여 혈청과 혈구 성분을 분리 동결 보존하였다. 또한, 4) 의사의 진료록을 기초로, 임상적 중증도, 치료 경과, 혈액 검사 소견 등을 기록하였다. 해석 대상의 환자 혈액은 혈청 분리 후 마이너스 80도로 연구 개시까지 동결 보존하였다. 이 피험자에 관한 취급은 기본적으로 후술하는 예에 있어서도 같다.
(2) 다음에, 상기의 약 150종의 후보 자기 항체에 대하여 ELISA법에 의한 스크리닝을 실시하였다. 이들 개개의 후보 자기 항체에 대한 ELISA법의 실시에 앞서, DHPS를 포함하는 약 150종의 항원 단백질은 하기의 공정을 거쳐 재조합 단백질로서 수득하였다.
우선 PCR법에 의해 인서트를 제작하였다. 즉, 미리 발현 벡터 pET28 또는 pGEX-4T로의 재조합에 적합한 제한 효소 인식 부위를 갖는 프라이머를 제작하고, 골육종 세포주 U2-OS에서 추출한 RNA를 주형으로서 역전사 PCR을 실시하여 cDNA를 제작하고, 또한 PCR을 실시하여 전장(全長)의 인서트를 수득하였다. 이 인서트 및 발현 벡터를 제한 효소 처리하고, Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE사)를 사용하여, 인서트와 발현 벡터를 라이게이션하고, 인서트를 포함한 플러스미드를 제작하였다. 또한, 대장균 컴피턴트 세포 BL21(NIPPON GENE사)을 사용하여 재조합체로 형질 전환하였다. 이 형질 전환체를 항생 물질 주입의 LB 배지에서 배양하고, IPTG로 인서트 DNA 유래 단백질의 발현을 유도하였다. 이 상태의 형질 전환된 대장균을 원심분리 회수 후, 가용분획과 불용분획으로 분리하고, 또한 요소를 사용하여 불용분획의 가용화를 실시하였다. 단백질은 ProBond Resin(Invitrogen사) 및 Glutathione-Sepharose(GE Healthcare사)를 사용하여 정제하였다.
이렇게 하여 수득된 각종의 정제 재조합 단백질을, 96웰 ELISA 플레이트에 5㎍/ml의 농도로 주입하고, 밤새 4℃로 보존하고, 고정화시킴으로써, ELISA법에 사용하는 재조합 단백질을 고정화한 96웰 플레이트를 수득하였다.
ELISA법에서는 이 재조합 단백질 고정화 플레이트를 PBS 세정, 20% 당, 20% 합성 중합체(니혼유지사) 배합 용액으로 블로킹 후, 환자 혈청, 및 대조 혈청(정상인의 혈청)을 200배 희석하고, 고정화한 단백질과 반응시키고, 이어서, PBS 세정 후, HRP 표지 염소 항사람 IgG 항체를 가하였다. 마지막으로 효소 발색 기질을 가하여 발색시켜, 플레이트 리더로 OD 450nm의 흡수를 측정하였다.
이 ELISA법에 의한 스크리닝에 의해, 약 150종 있었던 후보 자기 항체(항원 단백질)는 약 40종으로 압축되고, 이들 중에 본 발명의 주제인 DHPS가 포함되어 있었다. 이하, 실제로는 DHPS 이외의 자기 항체에 대한 검토도 병행하여 실시하였지만, 여기에서는 DHPS에 관해서만 개시한다.
[실시예 A-1] ELISA법에 의한 자기 항체의 검토
ELISA법에 의한 검토는 3회에 걸쳐 실시하였다.
(a) ELISA법에 의한 자기 항체의 검토(1)
의료 시설 A에 있어서, 급성기 뇌경색 환자 78예와, 정상인 51예의 혈청 검체를 사용하였다. 그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 도 1은 환자군(환자)과 정상인군(정상)에서의 DHPS의 자기 항체의 항체가의 분포를 나타내고, 도 2는 본 검토에서의 ROC 곡선(수신자 동작 특성 곡선)을 나타내고 있다.
도 1 및 도 2에 기초하여 검정에 의해 유도된 결과를 표 1에 기재하였다. 표 1에 기재된 바와 같이, 컷오프 값은 약 0.69이고, 도 1에서 점선으로 나타내었다.
[표 1]
Figure pct00001
P값은 0.05(0.01)보다도 작고, 「DHPS의 혈청 항체가는 동맥 경화 환자군에 있어서 정상인군보다도 큰」 것에 대한 유의차가 확인되었다.
또한 상기 컷오프 값에서의 양성율은 약 69%였다.
(b) ELISA법에 의한 자기 항체의 검토(2)
의료 시설 B의 급성기 뇌경색 환자 111예와 의료 시설 C의 급성기 뇌경색 환자 46예(총 157예)와, 의료 시설 A의 정상인 51예의 혈청 검체를 사용하였다. 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 도 3은 환자군(환자)과 정상인군(정상)에서의 DHPS의 자기 항체의 항체가의 분포를 나타내고, 도 4는 본 검토에서의 ROC 곡선(수신자 동작 특성 곡선)을 나타내고 있다.
도 3 및 도 4에 기초하여 검정에 의해 유도된 결과를 표 2에 기재하였다. 표 2에 기재된 바와 같이, 컷오프 값은 약 0.69이고, 도 3에서 점선으로 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00002
P값은 0.05(0.01)보다도 훨씬 작고, 「DHPS의 혈청 항체가는 동맥 경화 환자군에 있어서 정상인군보다도 큰」 것에 대한 유의차가 확인되었다.
또한 상기 컷오프 값에서의 양성율은 약 73%였다.
(c) ELISA법에 의한 자기 항체의 검토(3)
본 예에서는 기존의 동맥 경화 마커의 양성군과 음성군에서의, DHPS 자기 항체 마커의 동향에 관한 검토를 실시하였다. 기존의 동맥 경화 마커로서는 CRP를 사용하였다. CRP(C-reactive protein)는 급성기 단백질(acute phase reactant: APR)의 1종이며, 1930년에 Tillet들에 의해 발견된 폐렴 쌍구균으로부터 추출된 C다당체와 침강 반응을 일으키는 혈청 단백질이다. 최근, 동맥 경화에 따른 혈관 조직의 염증으로, 동맥 경화소에 침윤한 염증성 세포에서 분비되는 염증성 사이트카인에 의해, CRP가 간장에서 생산되어 증가하는 것이 알려져 있고, 또한 그 농도는 혈관내피의 기능 장해의 정도와 상관하고, 그 증가가 협심증이나 심근경색을 일으키는 위험 인자가 되고 있다(Ridker PM: Circulation 103: 1813, 2002).
본 예에서의 CRP 측정의 검체는 의료 시설 A로부터 수득된 83예(급성기 뇌경색 환자 65예와 정상인 18예)의 혈청 검체를 사용하였다. 이들의 모든 혈청 검체에 대하여, C 반응성 단백 키트(나노피아 세키스이메디컬사 제조)를 사용하여 라텍스 응집 비탁법에 의한 CRP의 측정을 실시하고, CRP의 컷오프 값을 0.2mg/dL로서 분류하였다. 즉, CRP값이 0.2mg/dL을 초과하는 군은 「CRP 동맥 경화 리스크군」으로, 0.2mg/dL 이하의 군은 「CRP 동맥 경화 비(非)리스크군」으로 분류하였다. 이들의 CRP에 의한 분류별로 상기 환자군과 정상인군을 나누고, 이들의 혈청 검체 중의 DHPS에 대한 자기 항체가를 ELISA법에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내고, 또한 0.2mg/dL 이하의 「CRP 동맥 경화 비리스크군」의 ROC 곡선을 도 6에 나타내었다.
P값은 0.003이고, 0.05(0.01)보다도 명백하게 작았다.
또한, 양성율은 46%였다. 따라서, CRP값에 있어서는 동맥 경화의 리스크는 적다고 취급되는 군에서도, DHPS에 의한 동맥 경화의 테스트를 실시함으로써, 유의차를 수반하여 동맥 경화를 검출하는 것이 가능하다는 것이 인정되었다.
「CRP 동맥 경화 리스크군」에서는 정상군의 검체수가 적기 때문에 유의차 검정은 실시하지 않았지만, 도 5로부터 이 군에서도 DHPS의 자기 항체의 정량이 동맥 경화의 검출에 유효한 것은 일목요연하다.
[실시예 A-2] 웨스턴 블롯법에 의한 자기 항체의 검토
상기 참고예(2)에 개시한 방법으로 인서트를 제작하고, 그에 기초한 정제 단백질을 수득하였다. 즉, 미리 발현 벡터 pET28 또는 pGEX-4T로의 재조합에 적합한 제한 효소 인식 부위를 갖는 프라이머를 제작하고, 골육종 세포주 U2-OS에서 추출한 RNA를 주형으로 역전사 PCR을 실시하여 cDNA를 제작하고, 또한 PCR을 실시하여 전장의 인서트를 수득하였다. 이 인서트 및 발현 벡터를 제한 효소 처리하고, Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE사)를 사용하여, 인서트와 발현 벡터를 라이게이션하고, 인서트를 포함한 플러스미드를 제작하였다. 그리고, 대장균 컴피턴트 세포 BL21(NIPPON GENE사)을 사용하여 재조합체로 형질 전환하였다. 이 형질 전환체를 항생 물질 주입의 LB 배지에서 배양하고, IPTG로 인서트 DNA 유래 단백질의 발현을 유도하였다. 이 상태의 형질 전환된 대장균을 원심분리 회수 후, 가용분획과 불용분획으로 분리하고, 또한 요소를 사용하여 불용분획의 가용화를 실시하였다. 단백질은 ProBond Resin(Invitrogen사) 및 Glutathione-Sepharose(GE Healthcare사)를 사용하여 정제하였다.
이 정제한 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 변성시켜 웨스턴법의 샘플로 하였다. 12% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 상기 샘플을 전기영동 후, 전사 장치로 니트로셀룰로스 막에 단백질을 전사하였다. 5% 탈지유로 블로킹 후, 500배 희석한 환자 혈청(검체 1 내지 4)을 1차 항체로서 가하여, 하룻밤 인큐베이트하였다. PBST로 세정 후, 20000배 희석 HRP 표지 염소 항사람 IgG 항체(ab98633, Abcam회사)를 가하여, 30분간 반응시켰다. PBST로 세정 후, 발광 시약 Immobilon Western(MILLIPORE사)을 사용하여 발광시키고, 필름에 노광시켜 현상하였다.
결과를 도 7의 전기영동도에 나타내었다. 도 7에서, 검체 1, 2, 3, 4는 의료 시설 A로부터 제공된 급성기 뇌경색 환자의 혈청 검체이고, 단백질 His-DHPS(a. a. 184-369)의 ELISA 측정값(자기 항체)은 검체 1이 3.61, 검체 2가 3.82, 검체 3이 3.61, 검체 4가 3.47이었다. 또한, 단백질 GST-DHPS(a. a. 183-369)의 ELISA 측정값(자기 항체)은 검체 1이 3.60, 검체 2가 2.64, 검체 3이 2.33, 검체 4가 2.46이었다.
하기 표 3-1 내지 표 3-4는 각 멤브레인 마커 75kDa의 밴드 강도를 「1」로 한 경우의 검출 밴드 강도의 비율을 나타내고 있다. 표 3-1은 검체 1에 관한 결과이고, 표 3-2는 검체 2에 관한 결과이고, 표 3-3은 검체 3에 관한 결과이고, 표 3-4는 검체 4에 관한 결과이다. 또한, 표 중에서, 단백질 His-DHPS(a. a. 184-369)를 His-36C로, 단백질 GST-DHPS(a. a. 183-369)를 GST-36C로 표기하였다.
[표 3-1]
Figure pct00003
[표 3-2]
Figure pct00004
[표 3-3]
Figure pct00005
[표 3-4]
Figure pct00006
상기의 결과로, 급성기 뇌경색 환자 검체 혈청인 검체 1, 검체 2, 검체 3, 및 검체 4 중 자기 항체는 단백질 His-DHPS(a. a. 184-369)로 강한 반응성을 나타내는 것을 알 수 있다. 웨스턴 블롯의 결과, 목적 밴드가 자기 항체와 반응하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 이때의 밴드의 강도로부터, ELISA법에서 높은 측정값를 나타내는 검체 정도 단백질 His-DHPS(a. a. 184-369)로 높은 반응성을 나타내고 있는 것을 확인하였다.
다음에, 이들 검체에서 내재성(endogenos)의 DHPS의 존재에 관한 검토를, 항DHPS 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검토하였다. 구체적으로는, His-DHPS(서열번호 1의 a. a. 1-369) 단백질(포지티브 컨트롤), 및 환자의 혈청 검체(검체 1 내지 4)를 SDS 샘플 버퍼로 변성시켜 웨스턴법의 샘플로 하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 상기 샘플을 전기영동 후, 전사 장치로 니트로셀룰로스 막에 단백질을 전사하였다. 5% 탈지유로 블로킹 후, 500배 희석한 항DHPS 항체(H00001725-B02P, Abnova사)를 1차 항체로서 가하여, 하룻밤 인큐베이트하였다. PBST로 세정 후, 7500배 희석 HRP 표지 양 항마우스 IgG 항체(NA931, GE Healthcare사)를 가하여, 30분간 반응시켰다. PBST로 세정 후, 발광 시약 Immobilon Western(MILLIPORE사)을 사용하여 발광시키고, 필름에 노광시켜 현상하였다.
결과를 도 8의 전기영동도에 나타내었다. 이에 의해 모든 검체에 대하여 내재성의 DHPS의 존재를 시사하는 밴드가 인정되고, 혈중에서의 내재성의 DHPS의 존재가 강하게 시사되었다.
[B] 본 발명의 암 검출 방법에 대하여
[실시예 B-1] ELISA법에 의한 자기 항체의 검토
(1) 검토 수법
DHPS의 자기 항체의 항원 단백질은 하기의 공정을 거쳐 재조합 단백질로서 수득하였다.
우선 PCR법에 의해 인서트를 제작하였다. 즉, 미리 발현 벡터 pET28 또는 pGEX-4T로의 재조합에 적합한 제한 효소 인식 부위를 갖는 프라이머를 제작하고, 골육종 세포주 U2-OS에서 추출한 RNA를 주형으로 역전사 PCR을 실시하여 cDNA를 제작하고, 또한 PCR을 실시하여 전장의 인서트를 수득하였다. 이 인서트 및 발현 벡터를 제한 효소 처리하고, Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE사)를 사용하여, 인서트와 발현 벡터를 라이게이션하고, 인서트를 포함한 플러스미드를 제작하였다. 또한, 대장균 컴피턴트 세포 BL21(NIPPON GENE사)을 사용하여 재조합체로 형질 전환하였다. 이 형질 전환체를 항생 물질 주입의 LB 배지에서 배양하고, IPTG로 인서트 DNA 유래 단백질의 발현을 유도하였다. 이 상태의 형질 전환된 대장균을 원심분리 회수 후, 가용분획과 불용분획으로 분리하고, 또한 요소를 사용하여 불용분획의 가용화를 실시하였다. 단백질은 ProBond Resin(Invitrogen사) 및 Glutathione-Sepharose(GE Healthcare사)를 사용하여 정제하였다.
이렇게 하여 수득된 각종의 정제 재조합 단백질을, 96웰 ELISA 플레이트에 10㎍/ml의 농도로 주입하고, 밤새 4℃로 보존하고, 고정화시킴으로써, ELISA법에 사용하는 재조합 단백질을 고정화한 96웰 플레이트를 수득하였다.
ELISA법에서는 이 재조합 단백질 고정화 플레이트를 PBS 세정, 10% 소 태아혈청 PBS 용액으로 블로킹 후, 환자 혈청, 및 대조 혈청(정상인의 혈청)을 2000배 희석하고, 고정화한 단백질과 반응시키고, 이어서, PBS 세정 후, HRP 표지 염소 항사람 IgG 항체를 가하였다. 마지막으로 효소 발색 기질을 가하여 발색시켜, 플레이트 리더로 OD450nm의 흡수를 측정하였다.
(2) ELISA법에 의한 자기 항체의 검토
의료 시설 D에서의 식도암 환자 61예와, 대장암 환자 19예(암 환자 총 80예), 게다가, 의료 시설 A의 정상인 51예의 혈청 검체를 사용하였다. 그 결과를 도 9와 도 10에 나타내었다. 도 9는 환자군(환자)과 정상인군(정상)에서의 DHPS의 자기 항체의 항체가의 분포를 나타내고, 도 10은 본 검토에서의 ROC 곡선(수신자 동작 특성 곡선)을 나타내고 있다.
상기 도 9와 도 10에 기초하여 검정에 의해 유도된 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 컷오프 값은 약 0.69이고, 도 9에서 점선으로 나타내었다.
[표 4]
Figure pct00007
P값은 0.05보다도 작고, 「DHPS의 혈청 항체가는 대장암과 식도암의 환자군에 있어서 정상인군보다도 큰」 것에 대한 유의차가 확인되었다.
또한 상기 컷오프 값에서의 양성율은 80% 정도였다.
<110> Fujikura Kasei Co., Ltd. National University Corporation Chiba University <120> ARTERIOSCLEROSIS AND CANCER DETECTION METHOD USING DEOXYHYPUSINE SYNTHASE GENE AS INDICATOR <130> PFKK3PCT <150> JP 2014-226847 <151> 2014-11-07 <160> 2 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Gly Ser Leu Glu Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Val Leu Lys His Ser Ser Thr Leu Pro Pro Glu Ser Thr Gln Val Arg 20 25 30 Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asn Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Ala 35 40 45 Phe Gly Thr Thr Gly Phe Gln Ala Thr Asn Phe Gly Arg Ala Val Gln 50 55 60 Gln Val Asn Ala Met Ile Glu Lys Lys Leu Glu Pro Leu Ser Gln Asp 65 70 75 80 Glu Asp Gln His Ala Asp Leu Thr Gln Ser Arg Arg Pro Leu Thr Ser 85 90 95 Cys Thr Ile Phe Leu Gly Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Ile 100 105 110 Arg Glu Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His Asn Met Val Asp Val Leu 115 120 125 Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala 130 135 140 Pro Thr Tyr Leu Gly Glu Phe Ser Leu Arg Gly Lys Glu Leu Arg Glu 145 150 155 160 Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Lys Phe Glu Asp Trp Leu Met Pro Ile Leu Asp Gln Met Val Met 180 185 190 Glu Gln Asn Thr Glu Gly Val Lys Trp Thr Pro Ser Lys Met Ile Ala 195 200 205 Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Pro Glu Ser Val Tyr Tyr Trp Ala 210 215 220 Gln Lys Asn His Ile Pro Val Phe Ser Pro Ala Leu Thr Asp Gly Ser 225 230 235 240 Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr Lys Asn Pro Gly Leu Val 245 250 255 Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile Asn Thr Gln Ala Ile Phe 260 265 270 Ala Lys Cys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Val Val Lys His 275 280 285 His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val 290 295 300 Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg 305 310 315 320 Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Val Asp Ala Gln Pro 325 330 335 Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val Phe Pro Leu Leu Val Ala 340 345 350 Glu Thr Phe Ala Gln Lys Met Asp Ala Phe Met His Glu Lys Asn Glu 355 360 365 Asp <210> 2 <211> 1110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggaaggtt ccctggaacg ggaggcgcca gcgggggcgc tggccgccgt gctaaagcac 60 agctcgacgt tgccgcccga aagcacccag gtccggggct acgacttcaa ccgcggtgtg 120 aattaccgcg cactgctgga ggccttcggc accaccggct tccaagcaac caacttcggg 180 cgcgctgtac agcaagtcaa tgccatgatc gagaagaagc tggaaccact gtcacaggat 240 gaagaccagc acgcggacct gacccagagc cgccgcccac ttaccagctg caccattttc 300 ctgggatata catccaacct catcagttca ggcatccgtg agaccattcg ctaccttgtg 360 cagcacaaca tggtggacgt attggtgacc acagctggcg gcgtggagga agacctcatc 420 aagtgcctgg cgcccacata cttgggcgag tttagcctca gggggaagga gctccgggag 480 aacgggatca ataggatcgg aaacctgctg gtgcccaatg agaattactg caagtttgag 540 gactggctga tgcccattct ggaccagatg gtgatggagc agaacacaga gggtgtaaag 600 tggacgcctt ctaagatgat cgcccggctg ggcaaggaga tcaacaaccc agagtccgtg 660 tattactggg cccagaagaa ccacatccct gtgtttagtc ccgcacttac agacggctcg 720 ctgggcgaca tgatcttctt ccattcctac aagaacccgg gcctggtcct ggacatcgtt 780 gaggacctga ggctcatcaa cacacaggcc atctttgcca agtgcactgg gatgatcatt 840 ctgggcgggg gcgtggtcaa gcaccacatt gccaatgcca acctcatgcg gaacggggcc 900 gactacgctg tttacatcaa cacagcccag gagtttgatg gctctgactc aggtgcccga 960 ccagacgagg ctgtctcctg gggcaagatc cgggtggatg cacagcccgt caaggtctat 1020 gctgacgcct ccctggtctt ccccctgctt gtggctgaaa cctttgccca gaagatggat 1080 gccttcatgc atgagaagaa cgaggactga 1110

Claims (29)

  1. 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제(deoxyhypusine synthase) 유전자의 발현을 당해 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 동맥 경화를 검출하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 표적 폴리펩티드인 데옥시하이푸신·신타제의 검출을, 당해 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체를 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써, 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 고정화물에 포함되는 데옥시하이푸신·신타제의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수가, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, 표적 핵산의 검출은 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을, 유전자 증폭법에 의해 증폭시켜 이루어지는 유전자 증폭산물을, 표적 핵산으로서 검출하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피험 시료는 혈액 검체인 것을 특징으로 하는, 동맥 경화의 검출 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 동맥 경화의 검출 방법을 실시하기 위한, 동맥 경화 검출용 키트.
  13. 이하의 스텝(a) 내지 (d)를 포함하는 고정화 플레이트의 사용 방법.
    (a) 인공적으로 조제한 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 고정화한 플레이트를, 혈액 검체와 접촉시켜서, 당해 혈액 검체 중의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 자기 항체와 당해 플레이트 위의 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부가 결합한 항원 항체 결합체의 형성을, 플레이트 위에서 실시하는 스텝;
    (b) 표지가 인공적으로 부가된 항체 결합성의 2차 항체를, 플레이트 위의 상기 항원 항체 결합체의 자기 항체에 결합시키는 스텝;
    (c) 자기 항체에 결합한 상기 2차 항체의 표지를 플레이트 위에서 현재화(顯在化)시켜서, 당해 현재화 시그널을 검출하기 위해서 플레이트를 사용하는 스텝;
    (d) 플레이트에서 얻어진 당해 현재화 시그널의 검출값을 데옥시하이푸신·신타제에 대한 자기 항체의 정량값으로서 카운트하여, 통계적으로 얻어진 동맥 경화에 대한 임계값보다도 큰 경우의 당해 정량값을, 상기 혈액 검체에서의 동맥 경화의 지표로 하는 스텝.
  14. 제13항에 있어서, 플레이트에 고정화된 데옥시하이푸신·신타제의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수가, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것을 특징으로 하는, 고정화 플레이트의 사용 방법.
  15. 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제(deoxyhypusine synthase) 유전자의 발현을 피험 시료에서 확인하고, 당해 유전자 발현의 항진을 지표로 하여 소화기계 암을 검출하는, 암의 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 당해 유전자가 코드하는 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 표적 폴리펩티드로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 표적 폴리펩티드인 데옥시하이푸신·신타제의 검출을, 당해 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 피험 시료 중의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체를 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서, 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드의 고정화물에 피험 시료를 접촉시키고, 피험 시료 내의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체의 당해 고정화 폴리펩티드와의 결합을 시그널로서 검출함으로써, 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  21. 제20항에 있어서, 고정화물에 포함되는 데옥시하이푸신·신타제의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수가, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 검출 방법에 있어서, 표적 유전자인 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 발현 확인을, 피험 시료에서의 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 표적 핵산으로서 검출함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표적 핵산의 검출은, 당해 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 서열의 핵산을 갖는 핵산 프로브를, 고정화된 또는 고정화되어 있지 않은 표적 핵산과 하이브리다이즈시켜서, 당해 하이브리다이즈에 의해 생기는 시그널을 검출함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 데옥시하이푸신·신타제 유전자의 전부 또는 일부, 또는 당해 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을, 유전자 증폭법에 의해 증폭시켜 이루어지는 유전자 증폭산물을, 표적 핵산으로서 검출하는, 암의 검출 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 피험 시료는 혈액 검체인 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 소화기계 암은 식도암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는, 암의 검출 방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 암의 검출 방법을 실시하기 위한, 암 검출용 키트.
  28. 이하의 스텝(a) 내지 (d)를 포함하는 고정화 플레이트의 사용 방법.
    (a) 인공적으로 조제한 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부를 고정화한 플레이트를, 혈액 검체와 접촉시켜서, 당해 혈액 검체 중의 데옥시하이푸신·신타제에 대한 자기 항체와 당해 플레이트 위의 데옥시하이푸신·신타제의 전부 또는 일부가 결합한 항원 항체 결합체의 형성을, 플레이트 위에서 실시하는 스텝;
    (b) 표지가 인공적으로 부가된 항체 결합성의 2차 항체를, 플레이트 위의 상기 항원 항체 결합체의 자기 항체에 결합시키는 스텝;
    (c) 자기 항체에 결합한 상기 2차 항체의 표지를 플레이트 위에서 현재화시켜서, 당해 현재화 시그널을 검출하기 위해서 플레이트를 사용하는 스텝;
    (d) 플레이트에서 얻어진 당해 현재화 시그널의 검출값을 데옥시하이푸신·신타제에 대한 자기 항체의 정량값으로서 카운트하고, 통계적으로 얻어진 소화기계 암에 대한 임계값보다도 큰 경우의 당해 정량값을, 상기 혈액 검체에서의 소화기계 암의 지표로 하는 스텝.
  29. 제28항에 있어서, 플레이트에 고정화된 데옥시하이푸신·신타제의 일부의 폴리펩티드의 아미노산 수가, 당해 전부의 폴리펩티드의 아미노산 수의 1/2 이상인 것을 특징으로 하는, 고정화 플레이트의 사용 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6942036B2 (ja) * 2017-11-30 2021-09-29 藤倉化成株式会社 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー
KR102247913B1 (ko) * 2018-11-14 2021-05-06 이화여자대학교 산학협력단 동맥경화 중증도 진단 마커 및 이를 이용한 진단 방법
JP7280640B2 (ja) * 2018-11-14 2023-05-24 イファ ユニバーシティ－インダストリー コラボレーション ファウンデーション 動脈硬化重症度診断マーカーおよびこれを利用した診断方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006507816A (ja) 2002-10-23 2006-03-09 セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド アポトーシスを調節するための核酸、ポリペプチド、及びアポトーシスを調節する方法
JP2007014277A (ja) 2005-07-08 2007-01-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology タンパク質相互作用と、抗がん剤、並びに抗がん剤のスクリーニング方法
US20110287955A1 (en) * 2008-08-15 2011-11-24 National University Corporation Chiba University Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis
US20120283115A1 (en) * 2009-08-31 2012-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Seromic analysis of ovarian cancer

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002230997A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-24 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for diagnosing and treating rheumatoid arthritis
US9575070B2 (en) * 2001-12-04 2017-02-21 Wayne State University Neoepitope detection of disease using protein arrays
WO2003072126A2 (de) * 2002-02-28 2003-09-04 Switch Biotech Ag Verwendung eines fibroblastenwachstumsfaktor-bindeproteins zur behandlung und diagnose von diabetischen wundheilungsstörungen
US20040248323A1 (en) * 2003-06-09 2004-12-09 Protometrix, Inc. Methods for conducting assays for enzyme activity on protein microarrays
AU2013206284A1 (en) * 2005-12-13 2013-07-04 Senesco Technologies, Inc. Use of eif-5a to kill multiple myeloma cells
US20090022731A1 (en) * 2006-08-25 2009-01-22 Wyeth Arthritis-associated B cell gene expression
WO2009020645A2 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Oxford Genome Sciences (Uk) Ltd. Matriptase protein and uses thereof
NZ562237A (en) * 2007-10-05 2011-02-25 Pacific Edge Biotechnology Ltd Proliferation signature and prognosis for gastrointestinal cancer
WO2009144933A1 (ja) * 2008-05-27 2009-12-03 国立大学法人東京大学 アポトーシス誘導薬
US8445638B2 (en) 2008-09-03 2013-05-21 Senesco Technologies, Inc. Use of a truncated eIF-5A1 polynucleotide to induce apoptosis in cancer cells
WO2010028093A2 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Senesco Technologies, Inc. Use of a truncated elf-5a1 polynucleotide to induce apoptosis in cancer cells
EP2370813A4 (en) * 2008-12-04 2012-05-23 Univ California MATERIALS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF PROSTATE CANCER
US20110195848A1 (en) * 2010-01-08 2011-08-11 Roopra Avtar S Gene expression and breast cancer
WO2013098419A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006507816A (ja) 2002-10-23 2006-03-09 セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド アポトーシスを調節するための核酸、ポリペプチド、及びアポトーシスを調節する方法
JP2007014277A (ja) 2005-07-08 2007-01-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology タンパク質相互作用と、抗がん剤、並びに抗がん剤のスクリーニング方法
US20110287955A1 (en) * 2008-08-15 2011-11-24 National University Corporation Chiba University Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis
US20120283115A1 (en) * 2009-08-31 2012-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Seromic analysis of ovarian cancer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cracchiolo BM, Heller DS, Clement PM, Wolff EC, Park MH, Hanauske-Abel HM,"Eukaryotic initiation factor 5A-1(eIF5A-1) as a diagnostic marker for aberrant proliferation in intraepithelial neoplasia of the vulva."Gynecol Oncol. 2004 94: 217-22

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