WO2003072126A2 - Verwendung eines fibroblastenwachstumsfaktor-bindeproteins zur behandlung und diagnose von diabetischen wundheilungsstörungen - Google Patents

Verwendung eines fibroblastenwachstumsfaktor-bindeproteins zur behandlung und diagnose von diabetischen wundheilungsstörungen Download PDF

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fgf
polypeptide
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wound healing
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Definitions

  • the present invention relates to the use of fibroblast growth factor binding protein (FGF-BP) polypeptides or functional variants of these polypeptides or nucleic acids encoding them or functional variants thereof and / or a cell expressing a FGF-BP polypeptide or functional variants thereof for the treatment, diagnosis and / or prevention of wound healing disorders which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, in particular of diabetes-associated wounds, and on the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3 and / or at least one nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No. 2 and SEQ LD No.
  • FGF-BP fibroblast growth factor binding protein
  • Various cell types migrate into the wound and release mediators of the inflammatory reaction.
  • the proliferation phase serves to regenerate the injured tissue and to restructure the newly formed tissue.
  • the processes involved primarily include neovascularization, fibroblast proliferation and re-epithelialization through proliferation and differentiation of a wide variety of skin cells and are controlled by a wide variety of growth factors and / or combinations thereof.
  • vascularization is supported by the growth factors bFGF, VEGF and TGF-beta 1 and 2, which are released by destroyed endothelial cells or macrophages.
  • ECM extracellular matrix
  • Interleukin 1 TNF-beta and interferon-gamma influence the secretion of the ECM components.
  • TGF-beta, PDGF, VEGF and FGF are also essential for the reorganization.
  • This precisely coordinated, complex interplay of the physiological processes occurring during wound healing makes it clear that a wide variety of disorders can lead to impairments in the wound healing process. Some of these factors include age, immune disorders, nutritional deficiencies, zinc deficiency, innervation disorders, alcohol abuse or genetic defects. Severe impairments to the wound healing process can then lead to chronic wounds and ultimately to ulcers. So far, however, little satisfactory therapies have been developed to intervene in chronic wound healing disorders. Established forms of therapy are limited to physical support for wound healing (eg bandages, compresses, gels), scraping of necrotic tissue and transplantation of skin tissues, cultured skin cells and / or matrix proteins.
  • venous ulcers are usually examined on a molecular basis and considered representative of chronic and / or poorly healing wounds. Under chroni see skin wounds, however, very different diseases with un- different pathogenic background summarized.
  • the most common types of chronic skin wounds are diabetic ulcers, venous ulcers, neuropathic ulcers, arterial ulcers and decubitus ulcers. Ulcer pressure ulcers are very deep wounds due to long-term pressure, which are associated with necrosis, infection and maceration of the tissue.
  • venous ulcers caused by venous stasis are rather superficial.
  • Arterial ulcers are often caused by arterial occlusive diseases.
  • Diabetic ulcers are ulcers that are common in diabetic patients.
  • the late complications of diabetes include not only a variety of diseases, but also characteristic skin changes such as frequent infections, trophic disorders and necrobiosis lipoidica. These changes can develop into poorly healing ulcers.
  • 25% of patients with type U diabetes often suffer from chronic ulcers (eg "diabetic foot"), about half of which require extensive inpatient treatment and ultimately heal poorly.
  • the diabetic foot alone causes more hospital stays than any other complication associated with diabetes.
  • the number of these cases in type I and JJ diabetes is increasing and represents approx. 2.5% of all hospital admissions.
  • Biopsies from human diabetic ulcers showed the mRNA coding for FGF-BP in a significantly lower concentration than biopsies of venous ulcers or biopsies of wounds that healed normally. This proves that, in particular, diabetes-associated wound healing disorders are characterized by a reduced level of expression of the FGF-BP specifically for these diseases.
  • the protein encoding nucleic acid (s) it is possible to counter FGF-BP, the protein encoding nucleic acid (s) to use an inventive polypeptide or functionally variant thereof directed antibodies and / or cells expressing the protein for a successful and effective therapy and diagnosis of diabetes-associated wounds.
  • the object is therefore achieved according to the invention by using one or more FGF-BP polypeptides or nucleic acids encoding them.
  • the present invention therefore relates to the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ No. 1 and SEQ No. 3 or functional variants thereof or the nucleic acid (s) coding for it according to SEQ No. 2 and SEQ No. 4 or functional variants thereof or against a polypeptide which can be used according to the invention or functional variants thereof or antibodies or antibody fragments or an FGF-BP-expressing cell for the treatment, diagnosis and / or prevention of wound healing disorders which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, in particular of diabetes-associated wounds.
  • a preferred diabetes-associated poorly healing wound is the diabetic ulcer.
  • Another object of the present invention is the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 and 3 or functional variants thereof and / or at least one nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No. 2 and 4 or more functional Variants thereof or against an FGF-BP polypeptide which can be used according to the invention or functional variants thereof directed antibodies or antibody fragments and / or at least one FGF-BP polypeptide expressing cell for the identification of pharmacologically active substances which increase the function and / or the expression of the FGF-BP polypeptide and / or a nucleic acid coding for FGF-BP polypeptide Treatment and / or prevention of skin diseases characterized by a reduced amount of FGF-BP, in particular diabetic wound healing disorders.
  • a preferred use of the substances and cells mentioned is the production of a test for the detection of pharmacologically active substances in connection with skin diseases which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, in particular diabetic wound healing disorders.
  • the human FGF-BP is a polypeptide with a molecular weight of 17 kD which can be present as a monomer or as a homodimer. It was originally isolated from culture medium which had been conditioned by human epidermoid carcinoma cells (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 5: 16778-16785). Furthermore, there was a strong increase in the expression of FGF-BP, especially in the early stages of spongy carcinomas, in normal and immortalized human keratinocytes, and in kidney tubules in renal diseases such as e.g. FflV-associated nephropathy or hemolytic uremic syndrome (HUS) was observed (Liu et al. (2001) Kidney Int., 59: 1717-1728).
  • FflV-associated nephropathy or hemolytic uremic syndrome HUS
  • FGF-BP is known to non-covalently and reversibly bind FGF-1 (aFGF) and FGF-2 (bFGF) (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 5: 16778-16785).
  • FGF-1 and -2 belong to the family of FGF proteins, to which over 20 different proteins belong and which are expressed in various tissues.
  • FGFs are so-called translocating proteins that are secreted independently of the normal secretion pathway and bind to the extracellular matrix, thereby protecting them from degradation on the one hand and forming a local reservoir of inactive protein on the other hand, which ensures strict spatial regulation of the FGF Signal path allowed.
  • the release of FGF from the extracellular matrix enables FGF to bind to its receptor.
  • bFGF is secreted by a wide variety of cell types, such as keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells and macrophages, and in turn exerts, either autocrine or paracrine, chemotactic and itogenic influences (Powers et al. (2000) Endocr. Relat. Cancer 7: 165-197) ,
  • the first mechanism involves enzymatic cleavage by plasmin or heparanase, the second the binding to FGF-BP as a carrier protein.
  • FGF-BP can thus help to increase the activity of the FGFs.
  • Such a stimulating effect has so far been demonstrated exclusively for angiogenesis and proliferation in connection with tumor formation and growth.
  • recombinant FGF-BP can bind directly to bFGF without cofactors, at the same time reduce the affinity of bFGF for heparin and stimulate the proliferation of 3T3 fibroblasts and endothelial cells.
  • the FGF-BP is heavily involved in the development and progression of tumors and was only discussed in this context.
  • FGF-BP transcripts were down-regulated by factors that control differentiation, such as retinic acid (Liaudet-Coopman et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21303-21308).
  • FGF-BP transcripts were up-regulated by factors that promote tumor growth, such as 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), serum and the so-called epidermal growth factor (EGF) (see, for example, Harris et al. (1998) J Biol. Chem. 273: 19130-19139).
  • TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF-BP stimulates the function of FGFs during embryogenesis in the skin and is apparently down-regulated in adult skin. Only in the early stages of carcinogenesis is a strong reexpression of FGF-BP in vivo and in vitro in the skin observed (Kurtz et al. (1997) Oncogene 14: 2671-2681). Interestingly, however, no connection between FGF-BP and the release of FGFs from the extracellular matrix to mediate proliferation and angiogenesis during impaired wound healing processes has been demonstrated or suggested, although a wound healing promoting effect of aFGF and bFGF has been shown in various animal models (Quirinia & Viidik et al. (1998) Scand. J. Plast. Reconstr.
  • the poorer wound healing of diabetic patients is related to the insufficient local release of the available reserves of FGF.
  • the present invention thus helps to overcome this technical prejudice that poorer wound healing in diabetic patients is due to the reduced availability of FGF and opens up the possibility of the activity of FGFs Increase wound healing disorders, especially diabetes-associated wounds, by local administration of FGF-BP.
  • Wound healing and its pathological disorders in the sense of the invention are to be differentiated from skin diseases which are associated with degenerate cell development and cell differentiation, in particular skin cancer.
  • skin cancer In the latter disease, individual cells are transformed, which then begins to proliferate uncontrolled, autonomously, ie isolated from interactions with other cell types, and thereby pass on the pathological changes to the daughter cells. It is therefore a disease that is associated with a loss of interactions, for example Zeil-Zeil adhesion and typical cell properties.
  • wound healing disorders in the sense of the invention are based on disorders of skin cells in their physiological context. The course of wound healing can be modulated by various endogenous and exogenous factors.
  • cancer can be treated surgically. This physical treatment option is possible since there are no interactions between tumor cells and the surrounding cells and tissues, so that the patient can be cured by simple excision of the tumor, whereas this is not possible in the case of wound healing disorders in the sense of the invention. Cell and / or tissue-tissue interactions cannot be eliminated by cutting out affected skin areas. That the compared diseases are diseases that are based on a fundamentally different mechanism becomes clear when one compares the therapeutic approaches. In cancer and diseases associated with degenerate cell proliferation, the therapy is aimed at killing rapidly growing cells, for example using cytostatics.
  • the treatment of wound healing disorders in the sense of the invention aims at modulating the interactions between the different cell types, such as by influencing the migration, proliferation and differentiation of individual cell types.
  • Wound healing disorders in the sense of the invention cannot be cured by general inactivation of proliferating cells.
  • the methodological approach to identifying the invention The nucleic acids used, which are involved in wound healing and their disorders in the sense of the invention, differ significantly from methods which are suitable for identifying nucleic acids which are involved in cancer processes. The latter can be identified by analyzing differentially expressed genes of the cancer-affected cell type. Rather, the aim of the assay of the present invention is to identify genes which are involved in the complex processes of wound healing and their pathological disorders by comparing the expression in sick and healthy tissue biopsies. This method would be unsuitable for identifying cancer-relevant genes.
  • “Wound healing” in the sense of the present invention is to be understood as the healing process of a mechanical injury to the skin, such as cuts, abrasions, or the rubbing of the skin, for example, by constant stress, for example pressure ulcers or necrotic processes, for example necrobiosis lipoidica.
  • wound healing disorders in the context of the present invention are wounds of diabetic patients and alcoholics, wounds infected with organisms or viruses, ischemic wounds, wounds of patients with arterial occlusive diseases or venous insufficiency, and scars, preferably excessive scars, in particular keloids.
  • Particularly preferred bad healing wounds are diabetic, neuropathic, venous and arterial ulcers, especially diabetes-associated wounds.
  • Diabetes-associated wounds in the context of the present invention are skin wounds of non-human mammals and people with diabetes mellitus. Examples of such skin wounds are caused by diabetes. causes ulcers, for example ulcus cruris arteriosum or the necrobiosis lipoidica.
  • “Activity” in the sense of the present invention is the interaction between FGF-BP polypeptides themselves (homodimers) but also between FGF-BP polypeptides and various other molecules, such as, for example, Perlecan (a heparan sulfate proteoglycan), heparin and FGF-Farnilien members such as FGF-1 or FGF-2, as well as the physiological, functional, proliferation and differentiation changes of cells and / or cell assemblies caused by them, examples of such activities can be found in Mongiat et al. (2001), J. Biol. Chem. 276: 10263-10271 and Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 40247-53.
  • Amount of FGF-BP means both FGF-BP polypeptides and FGF-BP encoding nucleic acids, both of which are included together or individually.
  • a “reduced amount of FGF-BP” in the sense of the present invention means both a reduced expression of FGF-BP polypeptides and FGF-BP encoding nucleic acids and a reduced activity of FGF-BP polypeptides.
  • the term also includes FGF- Polypeptides and nucleic acids coding for FGF-BP together and each individually.
  • polypeptides in the sense of the present invention encompasses polypeptides which, for example, like the polypeptides used according to the invention, are regulated during skin diseases which are associated with reduced levels of FGF-BP. 2122
  • “Functional variants” in the sense of the present invention are also polypeptides that have a sequence homology, in particular a sequence identity, of approximately at least 70%, preferably approximately at least 80%, in particular approximately at least 90%, especially approximately at least 95% have the polypeptide with the amino acid sequence according to one of SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3.
  • Examples of such functional variants are accordingly the polypeptides homologous to a polypeptide which can be used according to the invention and which originate from organisms other than humans or the mouse, preferably from non-human mammals such as Monkeys, pigs and rats come from.
  • Other examples of functional variants are polypeptides which are encoded by different alleles of the gene in different individuals or in different organs of an organism.
  • Further examples of functional variants are, for example, polypeptides which are encoded by a FGF-BP-encoding nucleic acid which is derived from non-skin-specific tissue, e.g. Embryonic tissues are isolated, but after expression in a cell involved in wound healing have the designated functions.
  • the activity of the polypeptide to be tested can be compared with the activity of a polypeptide which can be used according to the invention by means of functional tests.
  • the polypeptide to be tested fulfills the requirements for a functional variant on the level of sequence identity, the polypeptide to be tested is a functional variant if its activity T EP03 / 02122
  • These functional tests include, for example, the application of an expression vector which contains a nucleic acid encoding the polypeptide to be tested or the application of the polypeptide to be tested itself (Example 4) or an antibody directed against the polypeptide to be tested or an antisense oligonucleotide on wounds. After incubation, for example of an expression vector, the progress of wound healing upon administration of the different expression vectors containing either a nucleic acid coding for the polypeptide to be tested or a nucleic acid coding for the polypeptide which can be used according to the invention or an expression vector without an insert is compared.
  • Functional variants of the polypeptide can also be parts of the polypeptide used according to the invention with a length of at least 6 amino acids, preferably with a length of at least 8 amino acids, in particular with a length of at least 12 amino acids. Also included are N- and / or C-terminal and / or internal deletions of the polypeptide used according to the invention in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids.
  • the first amino acid, methionine may be absent without significantly changing the function of the polypeptide.
  • the polypeptides which can be used according to the invention can furthermore be characterized in that they are produced synthetically.
  • polypeptide can be synthesized using classic synthesis (Merrifield technique).
  • Parts of the polypeptides according to the invention are particularly suitable for obtaining antisera by means of which suitable gene expression banks can be searched in order to arrive at further functional variants of the polypeptide according to the invention.
  • Polypeptides which can be used according to the invention can be produced by generally known recombinant processes.
  • the polypeptide is produced, for example, by expression of the nucleic acids according to SEQ ID Nos. 2 and 4 or functional variants thereof in a suitable expression system using methods which are generally known to the person skilled in the art. These expression systems are explained below.
  • Suitable cells are, for example, the E. coli strains DHS, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, the insect cell line Lepidopteran, e.g. from Spodoptera frugiperda, or the animal cells COS, Vero, 293, HaCaT, and HeLa, all of which are commonly available.
  • the FGF-BP according to the invention has already been successfully expressed in Sf-9 insect cells ((Example 4) Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 40247-53).
  • polypeptides which can be used according to the invention can be isolated from an organism or from tissue or cells and used according to the invention. For example, it is possible to purify polypeptides which can be used according to the invention from mammalian tissue, for example from skin or from body fluids, for example blood, serum, saliva, synovial fluid or wound fluid.
  • cell lines which express polypeptides which can be used according to the invention can be produced from cells which can then be used to isolate polypeptides which can be used according to the invention. For example, expression vectors containing those according to the invention PT / EP03 / 02122
  • usable nucleic acids are transformed into skin cells, for example HaCaT cells.
  • the expression can be constitutive or inducible, for example.
  • the FGF-BP protein according to the invention has already been successfully purified from medium conditioned by cell lines or from bovine mammary tissue (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 16-778-85; Wang et al. (1998 ) Biochem. Mol. Biol. Int. 46: 81-87; Lametsch et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 19469-19474).
  • a further embodiment relates to the use of the FGF-BP polypeptides according to the invention, the variants of SEQ ID No. 1 and / or 3 or SEQ ID No. 2 and / or 4 being fusion proteins or nucleic acids coding for fusion proteins.
  • Fusion proteins which can be used according to the invention can be produced, for example, by expressing nucleic acids which can be used according to the invention in a suitable cell.
  • fusion proteins themselves already function as a polypeptide of the invention or are functional only after the fusion portion has been split off. Above all, this includes fusion proteins with a proportion of approx. 1-300, preferably approx. 1-200, in particular approx. 1-100, especially approx. 1-50 foreign amino acids.
  • peptide sequences are prokaryotic peptide sequences, e.g. may be derived from the E. coli galactosidase.
  • viral peptide sequences such as, for example, from bacteriophage M13, can also be used in order to generate fusion proteins for the "phage display" method known to the person skilled in the art.
  • peptide sequences for fusion proteins which can be used according to the invention are peptides which facilitate the detection of the fusion proteins. These include, for example, “green fluorescent protein” (WO 95/07463) or functional variants thereof.
  • a further polypeptide (“tag”) can be added to purify the proteins described above. Protein tags according to the invention allow, for example, high-affinity adsorption onto a matrix, stringent washing with suitable buffers without eluting the complex to any appreciable extent, and then targeted elution of the adsorbed complex.
  • protein tags known to the person skilled in the art are a (His) 6 tag, a Myc tag, a FLAG tag, a hemagglutinin tag, glutathione transferase (GST) tag, intein with an affinity chitin binding tag tag or maltose binding protein (MBP) tag.
  • His His 6 tag
  • Myc FLAG tag
  • FLAG hemagglutinin tag
  • GST glutathione transferase
  • MBP maltose binding protein
  • coding nucleic acid refers to a DNA sequence according to SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4, which is for an isolatable functional polypeptide according to the invention or a precursor, e.g. encoded with a signal sequence.
  • the polypeptide can be encoded by a full-length sequence or any part of the coding sequence, as long as the specific, for example enzymatic, activity is retained.
  • “Variants” of the nucleic acids are understood to mean all DNA sequences that are complementary to a DNA sequence that are under stringent conditions hybridize with the reference sequence and have essentially the same activity as the polypeptide encoded by the reference sequence.
  • “Stringent hybridization conditions” are understood to mean those conditions in which hybridization takes place, for example, at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C. in a lower buffer concentration, and remains stable.
  • Variants of the nucleic acid can also be parts of the nucleic acid used according to the invention with at least 8 nucleotides in length, preferably with at least 18 nucleotides in length, in particular with at least 24 nucleotides in length, particularly preferably with at least 30 nucleotides, preferably with at least 42 nucleotides.
  • the nucleic acids which can be used according to the invention are preferably DNA or RNA, preferably a DNA, particularly preferably a double-stranded DNA. Furthermore, the sequence of the nucleic acids can be characterized in that it has at least one intron and / or a polyA sequence. The nucleic acids used according to the invention can also be in the form of their antisense sequence.
  • nucleic acid which has been prepared synthetically can be used to carry out the invention.
  • the nucleic acid used according to the invention can be synthesized chemically using the DNA sequences described in Table 1 and / or using the protein sequences also described in Table 1 using the genetic code, for example using the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews 90: 543-584). “Expression” in the sense of the present invention is to be understood as the amount of FGF-BP polypeptides and / or FGF-BP encoding nucleic acids present in a certain cell type.
  • regulation is understood to mean, for example, the increase or decrease in the amount of polypeptide or the nucleic acid encoding it, this change being able to take place, for example, at the transcriptional, translational, post-transcriptional and post-translation level.
  • a double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question, the DNA region coding for the polypeptide being particularly preferred.
  • this area begins with the first start codon (ATG) lying in a Kozak sequence (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) until the next stop codon (TAG, TGA or TAA), which is in the same reading frame as the ATG.
  • this region begins with a conserved sequence of 6 nucleotides a few nucleotides above the start codon, the so-called Shine-Dalgarno sequence (Shine & Dalgarno, 1975, Eur. J. Biochem. 57: 221-30).
  • Expression vectors can be prokaryotic or eukaryotic expression vectors.
  • prokaryotic expression vectors for expression in E. coli are, for example, the vectors pGEM or pUC derivatives and for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae, for example the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res.
  • the expression vectors also contain promoters suitable for the respective cell, such as, for example, the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the Met 25, GAL 1 or ADH2 promoter for Expression in yeast (Rüssel et al. (1983) J. Biol. Chem.
  • promoters are suitable for expression in mammalian cells, which allow a constitutive, regulatable, tissue-specific, cell cycle-specific or metabolism-specific expression in eukaryotic cells.
  • Regulable elements according to the present invention are promoters, activator sequences, enhancers, silencers and or repressor sequences.
  • Suitable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by the RNA polymerase HI or viral promoters, CMV enhancers, CMV promoters, SV40 promoters or LTR promoters e.g. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214: 228-232) and further viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV or HTV.
  • promoters which are recognized by the RNA polymerase HI or viral promoters CMV enhancers, CMV promoters, SV40 promoters or LTR promoters e.g. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214: 228-232) and further viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HT
  • tissue-specific promoters skin-specific promoters such as the human K10 promoter (Bailleul et al. (1990) Cell 62: 697-708) and the human K14 promoter (Vassar et al. (1989 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) or the bovine cytokeratin IV promoter (Fuchs et al. (1988) The biology of wool and hair (ed .: GE Rogers, et al.), S. 287-309 Chapman and Hall, London / New York) are particularly preferred.
  • tissue-specific promoters skin-specific promoters
  • skin-specific promoters such as the human K10 promoter (Bailleul et al. (1990) Cell 62: 697-708) and the human K14 promoter (Vassar et al. (1989 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) or the bovine cytokeratin
  • Examples of elements which enable regulatable expression in eukaryotes are the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 516-20).
  • controllable elements which enable cell cycle-specific expression in eukaryotes are promoters of the following genes: cdc25A, cdc25B, cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F-1 to E2F-5, B-myb or DHFR (Zwicker J. and Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
  • the use of cell cycle-regulated promoters is particularly preferred in cases in which the expression of the polypeptides or nucleic acids used according to the invention is to be restricted to proliferating cells.
  • regulatable elements which simultaneously allow spatially and temporally limited expression are nucleic acids which code for a fusion between the sequence for the site-specific recombinase Cre and a modified estrogen receptor under the control of a tissue-specific promoter.
  • the resulting tissue-specific cytoplasmic fusion protein can translocate into the cell nucleus by administration of the estrogen analog tamoxifen and generate recombinations which lead to altered gene expression (Feil et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10887-90).
  • the nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No. 2 and 4 or functional Variants thereof are used in the form of an expression vector, in particular a vector which is active in gene therapy.
  • the nucleic acid coding for FGF-BP can be present in a “shuttle” vector, phage id, cosmid, plasmid or as part of a viral or non-viral vector.
  • viral vectors baculoviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, Adeno-associated viruses and herpes viruses:
  • non-viral vectors virosomes, liposomes, cationic lipids, or poly-lysine-conjugated DNA.
  • a gene-therapeutic vector contains wound- or skin-specific regulatory sequences which are functionally linked to the nucleic acid described above.
  • the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide contains one or more non-coding sequences including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the polypeptide, and / or one contains polyA sequence, in particular the naturally occurring polyA sequence or an SV40 virus polyA sequence, especially at the 3 'end of the gene, since this can stabilize the mRNA (Example 3; Palmiter et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482; Jackson (1993) Cell 74: 9-14).
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  • a “gene therapeutic vector” in the sense of the present invention is to be understood as a nucleic acid into which a nucleic acid which can be used according to the invention can be integrated and which is subsequently introduced into a cell and in which the missing or defective expression of the nucleic acid according to the invention is supplemented or replaced.
  • vectors which are active in gene therapy are virus vectors, for example adenovirus vectors or retroviral vectors (Lindemann et al. (1997), Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2: 549-58).
  • virus vectors for example adenovirus vectors or retroviral vectors
  • eukaryotic expression vectors are suitable for gene therapy use, since naked DNA can penetrate skin cells when applied topically (Hengge et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al. (1999 J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).
  • Gene therapy-effective vectors can also be obtained by complexing the nucleic acids described above with liposomes, since this enables a very high transfection efficiency, in particular of skin cells, to be achieved (Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279- 85).
  • lipofection small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is bound ionically on the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes.
  • Examples of the new lipid formulations are DOTAP N- [l- (2,3- Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium ethyl sulfate or DOGS (TRANSFECTAM; dioctadecylamidoglycyl spermine).
  • Excipients that increase the transfer of nucleic acids into the cell can be, for example, proteins or peptides that are bound to DNA or synthetic peptide-DNA molecules that enable the transport of the nucleic acid into the nucleus of the cell (Schwanz et al. ( 1999) Gene Therapy 6: 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17: 784).
  • Excipients also include molecules that enable the release of nucleic acids into the cytoplasm of the cell (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8: 213) or for example liposomes (Uhlmann and Peymann (1990) supra).
  • gene therapy vectors can be obtained by applying the nucleic acid described above to gold particles and using the so-called “gene gun” to shoot them into tissue, preferably into the skin, or cells (Wang et al . (1999) J. Invest. Dermatol. 112: 775-81, Tuting et al. (1998) J. invest. Dermatol. 111: 183-8).
  • a further embodiment of a gene therapy-effective vector which can be used according to the invention can be produced by introducing "bare" expression vectors into a biocompatible matrix, for example a collagen matrix.
  • This matrix can be introduced into wounds in order to transfect the immigrating cells with the expression vector and to express the polypeptides according to the invention in the cells (Goldstein and Banadio, US Pat. No. 5,962,427).
  • Wound healing disorders in particular wounds associated with diabetes, can be treated in a conventional manner, for example by dressings, plasters, compresses or gels, which contain the medicaments according to the invention. It is thus possible to use suitable additives or auxiliary substances such as physiological cooking Saline, demineralized water, stabilizers, proteinase inhibitors, gel formulations, such as white petroleum jelly, low-viscosity paraffin and / or yellow wax, etc., to be administered topically and locally in order to immediately and immediately influence wound healing.
  • suitable additives or auxiliary substances such as physiological cooking Saline, demineralized water, stabilizers, proteinase inhibitors, gel formulations, such as white petroleum jelly, low-viscosity paraffin and / or yellow wax, etc.
  • the medicaments according to the invention can also be administered topically and locally in the area of the wound, optionally in the form of liposome complexes or gold particle complexes.
  • the treatment can be carried out by means of a transdermal therapeutic system (TTS), which enables a time-controlled delivery of the medicinal products which can be used according to the invention.
  • TTS transdermal therapeutic system
  • Treatment by means of the medicaments which can be used according to the invention can, however, also take place via oral dosage forms, such as tablets or capsules, via the mucous membranes, for example the nose or the oral cavity, or in the form of disposers implanted under the skin.
  • TTS are known for example from EP 0 944398, EP 0916336, EP 0889723 or EP 0852493.
  • a drug is particularly suitable which contains the nucleic acids described in the naked form or in the form of one of the gene therapy vectors described above or in a form complexed with liposomes or gold particles.
  • the pharmaceutical carrier is, for example, a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0-8.0, preferably approximately 6.8-7.8, in particular approximately 7.4 and / or osmolarity from about 200-400 milliosmol / liter, preferably from about 290-310 milliosmol / liter.
  • the pharmaceutical carrier can contain suitable stabilizers, e.g. Nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
  • a preferred embodiment of a medicament according to the present invention is to polypeptide itself with suitable additives or auxiliaries, such as, for example, physiological saline, demineralized water, stabilizers, proteinase inhibitors, gel formulations, such as, for example, white petroleum jelly, low-viscosity paraffin and / or yellow wax, etc. . to administer, in order to influence the wound healing immediately and immediately (Example 4).
  • suitable additives or auxiliaries such as, for example, physiological saline, demineralized water, stabilizers, proteinase inhibitors, gel formulations, such as, for example, white petroleum jelly, low-viscosity paraffin and / or yellow wax, etc. .
  • a further preferred embodiment of a medicament according to the present invention consists in the use of an antibody directed against a polypeptide which can be used according to the invention and which increases or supports the activity of the FGF-BP.
  • an antibody directed against a polypeptide which can be used according to the invention and which increases or supports the activity of the FGF-BP.
  • such an antibody could positively influence the release of FGF and contribute to the treatment and prevention of wound healing disorders, which are characterized by a reduced amount of FGF-BP.
  • a pharmaceutical according to the present invention consists in the transplantation of autologous or allogeneic cells which express and secrete the FGF-BP polypeptide according to the invention with the aid of a suitable carrier material, e.g. so-called microcarriers, which consist of biocompatible materials, such as a dextran matrix (US 5,980,888).
  • a suitable carrier material e.g. so-called microcarriers, which consist of biocompatible materials, such as a dextran matrix (US 5,980,888).
  • a further preferred embodiment of the present invention is the use of a cell which, with a vector or knock-out gene construct which can be used according to the invention, for the diagnosis and / or treatment and / or prevention of wound healing disorders, in particular diabetes-associated wounds, and transformed to identify pharmacologically active substances.
  • Cells can be both prokaryotic and eukaryotic cells, examples of prokaryotic cells are E. coli and Saccharomyces cerevisiae or insect cells for eukaryotic cells.
  • Cells which express an FGF-BP polypeptide according to the invention or functional variants thereof or antibodies or antibody fragments directed against FGF-BP polypeptides according to the invention or functional variants thereof are e.g. human, non-embryonic, autologous or allogeneic cells.
  • the cells mentioned are preferably skin cells, in particular keratinocytes, fibroblasts or endothelial cells.
  • a particularly preferred transformed cell which can be used according to the invention is a transgenic embryonic non-human stem cell which is characterized in that it contains at least one knock-out gene construct which can be used according to the invention and or at least one expression cassette which can be used according to the invention, as described above.
  • Methods for transforming cells and / or stem cells are well known to those skilled in the art and include, for example, electroporation or microinjection.
  • a further preferred embodiment according to the present invention relates to the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 and 3 or functional variants thereof and / or at least one nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No.
  • the pharmacologically active substances mentioned can be organic and inorganic substances which modulate, in particular activate, the activity and / or the expression of the FGF-BP protein and / or DNA. These organic or inorganic pharmacologically active substances can be used as medicaments by application as described above. Examples of such activating substances can be found in Harris et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 10802-10811.
  • the present invention further relates to the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 and 3 or a functional variant thereof and / or at least one nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No. 2 and 4 or functional variants thereof or against an FGF-BP polypeptide which can be used according to the invention or functional variants thereof, antibodies or antibody fragments and / or at least one cell expressing FGF-BP polypeptide, optionally combined or together with suitable additives and auxiliaries, for the preparation of a test for the detection of pharmacologically active substances Substances related to skin disorders that are characterized by a reduced amount of FGF-BP, especially diabetes-associated wounds.
  • pharmacologically active substances within the meaning of the present invention is to be understood as all those molecules, compounds and / or compositions and mixtures of substances which contain the nucleic acids, polypeptides, antibodies or antibody fragments described above, optionally together with suitable additives and Excipients can interact under suitable conditions.
  • Possible pharmacologically active substances are simple chemical organic or inorganic molecules or compounds, but can also include nucleic acids, peptides, proteins or complexes thereof.
  • the pharmacologically active substances can influence the function (s) of the nucleic acids, polypeptides or antibodies in vivo or in vitro or can only bind to the previously described nucleic acids, polypeptides, antibodies or antibody fragments or other interactions with them covalently or non-covalently Wise.
  • examples of pharmacologically active substances are also organic molecules that come from substance libraries that have been checked for their pharmacological activity.
  • Preferred pharmacologically active substances according to the present invention are those which have an activating effect.
  • the tests for the detection of pharmacologically active substances of the FGF-BP assay according to the invention include those which influence the expression of genes and are generally known to the person skilled in the art (see, for example, Sivaraja et al. (2001) US 6,183,956).
  • cells that express FGF-BP for example skin cells
  • a possible test system is the human keratinocyte cell line HaCaT, which is generally available.
  • Gene expression is analyzed, for example, at the mRNA or protein level.
  • the amount of FGF-BP mRNA and / or protein is measured after adding one or more substances to the cell culture and compared with the corresponding amount in a control culture. This is done, for example, with the help of hybridization of an antisense probe with the mRNA of an FGF-BP according to the invention contained in the lysate of the cells.
  • the hybridization can be quantified, for example, by binding a specific antibody to the mRNA probe complex (see Stuart & Frank, 1998, US 4,732,847). It is possible to carry out the analysis using the high-throughput method. and to analyze a large number of substances for their suitability as a modulator of the expression of FGF-BP (Sivaraja et al. (2001) US 6,183,956).
  • the substances to be analyzed can be found in substance libraries (see for example DE 19816414, DE 19619373), which can contain several thousand, often very heterogeneous substances.
  • the total RNA or mRNA can first be isolated from cells and then the absolute amount or the relative proportion of the mRNA of FGF-BP, for example with the aid of quantitative RT-PCR (see EP 0 200 362; Wittwer, 1997, Bio Techniques 22: 130-138; Morrison et al. (1998) Bio Techniques 24: 954-62) or the RNase Protection Assay (see e.g. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Chapter 7; EP 0 063 879).
  • Another possibility is to analyze the amount of protein in the cell lysate with antibodies that specifically recognize FGF-BP.
  • the quantification can be carried out here, for example, using an ELISA or a Western blot, which are generally known.
  • the influence of the substances on the expression of the FGF-BP can be compared with the influence on the expression of other genes, such as genes of metabolism such as GAPDH or cyclophilin.
  • Assays which are suitable for identifying substances which have as little influence as possible on the expression of one or more control genes, such as, for example, GAPDH or cyclophilin, are particularly preferred (see, for example, WO 00/05416).
  • Another embodiment of the present invention relates to the use of FGF-BP polypeptides for the identification of pharmacologically active substances which increase the activity of FGF-BP with the aid of screening methods.
  • FGF-BP polypeptides for the identification of pharmacologically active substances which increase the activity of FGF-BP with the aid of screening methods.
  • two-hybrid system Fields and Sternglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas and Brent, 1998 TB3TECH, 16, 355-363.
  • cells are transformed with expression vectors, the fusion proteins from the polypeptide according to the invention and one Express the DNA binding domain of a transcription factor such as Gal4 or LexA.
  • the transformed cells also contain a reporter gene, the promoter of which contains binding sites for the corresponding DNA binding domain.
  • the expression of the reporter gene can be greatly increased if the second fusion protein interacts with the polypeptide according to the invention. acts.
  • This increase in expression can be used to identify new pharmacologically active substances, for example by producing a cDNA library from regenerating tissue for the construction of the second fusion protein.
  • this test system can be used for the raster examination of substances that inhibit an interaction between the polypeptide according to the invention and an interactor.
  • a nucleic acid encoding FGF-BP can be integrated into the expression vectors both in sense and in antisense orientation, so that the functional concentration of mRNA of the corresponding genes in the cells is either increased or reduced by hybridization with the antisense RNA.
  • the proliferation behavior of cells can be very quickly determined by e.g. the incorporation of labeled nucleotides into the DNA of the cells (see, for example, Savino and Dardenne, 1985, J. immunol. Methods 85: 221-6; Perros and Weightman, 1991, Cell Prolif. 24: 517-23; de Fries and Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Anal. 9: 89-95), by staining the cells with specific dyes (Schulz et al. (1994) J. Immunol.
  • Methods 167: 1-13) or by immunological methods (Frahm et al. (1998) J. Immunol. Methods 211: 43-50).
  • Migration can be easily carried out using the "Migration Index" test (Charvat et al., Supra) and comparable test systems (Benestad et al. (1987) Cell Tissue Kinet. 20: 109-19, Junge et al. (1993) J. Immunol. Methods 160: 73-9).
  • Suitable differentiation markers are e.g. Keratin 6, 10 and 14 as well as loricrin and involucrin (Rosenthal et al. (1992) J. Invest. Dermatol. 98: 343-50), the expression of which e.g. easy to detect using commonly available antibodies.
  • the changes in cell activities compared to a control experiment, in which cells were transfected with an empty expression vector, for example, can be used to investigate the efficiency of modulators.
  • test system can be based on the fact that at least one FGF-BP polypeptide which can be used according to the invention or functional variants thereof or nucleic acids coding therefor or variants thereof, or against T EP03 / 02122
  • Measurable usable polypeptides or functional variants thereof directed antibodies or antibody fragments are bound to a solid phase and at least one substance is tested for its pharmacological activity, for example binding or change in conformation.
  • Suitable systems such as affinity chromatography and fluorescence spectroscopy are known to the person skilled in the art.
  • a bond between an FGF-BP according to the invention and heparin has already been successfully demonstrated with the aid of heparin-copper affinity chromatography (Wang et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 46: 81-87).
  • the solid phase-bound polypeptides or functional variants thereof which can be used according to the invention or nucleic acids encoding them or a variant thereof or antibodies or antibody fragments which are directed against a polypeptide or a functional variant thereof which can be used according to the invention can also be part of an array.
  • Methods for producing such arrays using solid-phase chemistry and photolabile protective groups are known, for example, from US Pat. No. 5,744,305. These arrays can also be brought into contact with substances or substance libraries and tested for interaction, for example binding or change in conformation.
  • a substance to be tested can contain a detectable marker, for example the substance can be radioactively labeled, fluorescence-labeled or luminescence-labeled.
  • substances can be coupled to proteins that allow indirect detection, for example via enzymatic catalysis using a peroxidase assay with a chromogenic substrate or by binding a detectable antibody. Another possibility is to examine the array-bound protein complexes using mass specrometry (SELDI). Changes in the conformation of a polypeptide which can be used according to the invention by interaction with a test substance can be achieved, for example, by changing the fluorescence of an endogenous one Tryptophanrestes are detected in the polypeptide.
  • Pharmacologically active substances of the polypeptides which can be used according to the invention can also be nucleic acids which are obtained via selection methods, such as SELEX (see Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-50; Klug and Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20 : 97-107; Toole et al. (1996) US 5,582,981).
  • SELEX see Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-50; Klug and Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20 : 97-107; Toole et al. (1996) US 5,582,981).
  • SELEX selection methods
  • those molecules that bind to a polypeptide with high affinity (aptamers) that can be used according to the invention are typically isolated from a large pool of different, single-stranded RNA molecules by repeated amplification and selection.
  • Aptamers can also be synthesized and selected in their mirror image form, for example as L-ribonucleotide (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14 : 1112-5). Forms isolated in this way have the advantage that they are not degraded by naturally occurring ribonucleases and therefore have greater stability.
  • oligonucleotides are rapidly degraded by endo- or exonucleases, in particular by DNases and RNases occurring in the cell. It is therefore advantageous to modify the nucleic acid in order to stabilize it against degradation so that a high concentration of the nucleic acid in the cell is maintained over a long period of time (Beigelman et al. (1995) Nuclear Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz (1995) WO 95/11910; Macadam et al. (1998) WO 98/37240; Reese et al. (1997) WO 97/29116).
  • Such stabilization can be obtained by introducing one or more internucleotide phosphor groups or by introducing one or more non-phosphor internucleotides.
  • Suitable modified internucleotides are summarized in Uhlmann and Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) (see also Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz (1995) WO 95/11910; Macadam et al. (1998) WO 98/37240; Reese et al. (1997) WO 97/29116).
  • Modified internucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges in a nucleic acid which can be used in one of the uses according to the invention contain, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate, phosphorodithioate and / or phosphate ester, while non-phosphorus internucleotide analogs, for example siloxane bridges, carbonate bridges, carboxymethyl esters, acetamidate bridges and / or thioether bridges. It is also intended that this modification improve the shelf life of a pharmaceutical composition that can be used in one of the uses of the invention.
  • nucleic acid sequences according to the invention can reduce the expression of the corresponding genes in cells both in vivo and in vitro.
  • a single-stranded DNA or RNA is preferred for use as a probe or as an “antisense” oligonucleotide.
  • the effects of the modulation of an FGF-BP which can be used according to the invention or of the identified pharmacologically active substances which can be used according to the invention can be investigated by means of various test systems which determine the activity of the cells and cell assemblies in vitro and in vivo.
  • nucleic acids encoding the FGF-BP according to the invention can be contained in "knock-out" gene constructs or expression cassettes.
  • knock-out gene constructs are known to the person skilled in the art, for example, from US Patents 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 and US 5,750,825.
  • Transgenic non-human mammals the genome of which contains at least one “knock-out” gene construct that can be used according to the invention and / or at least one expression cassette that can be used according to the invention as described above, can be used to diagnose and / or prevent and / or treat wound healing disorders, in particular diabetes-associated wounds or for the identification of pharmacologically active substances
  • transgenic animals which contain one of the expression cassettes described above generally show, depending on the promoter used, a tissue-specific increased expression of the nucleic acids and / or polypeptides and can be used for the analysis of
  • an Activin A transgenic mouse exhibits improved wound healing (Münz et al. (1999) EMBO J.
  • transgenic mice 18: 5205-15
  • a transgenic mouse with a dominant negative KGF receptor exhibits delayed wound healing
  • the transgenic animals described above can be equipped with accelerated wound healing.
  • transgenic animals in particular transgenic mice
  • Processes for the production of transgenic animals are likewise known to those skilled in the art from DE 196 25 049 and US Pat. No. 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 and US 5,750,825 knows and encompass transgenic animals that, for example, via direct injection of expression vectors (see above) into embryos or spermatocytes, via the transfection of expression vectors into embryonic stem cells
  • Doetschman Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, pages 115 to 146 in Pinkert, 1994, supra
  • Wood Retrovirus-Mediated Gene Transfer, pages 147 to 176 in Pinkert, 1994, supra
  • Monastersky Gene Transfere Technology:
  • nucleic acids which can be used according to the invention are integrated into so-called “targeting” vectors or “knock-out” gene constructs (Pinkert, 1994, supra), after transfection of embryonic stem cells and homologous recombination, for example knock-out mice can be generated, which are generally known as heterozygous mice show reduced expression of the nucleic acid, while homozygous mice no longer show expression of the nucleic acid.
  • the animals produced in this way can also be used to analyze wound healing disorders.
  • the eNOS- Lee et al. (1999) Am. J. Physiol. 277: H1600-H1608
  • Nf-1 Atit et al. (1999) J. Invest.
  • FGF-BP protein according to the invention can, for example, also be used for screening, for identifying pharmacologically active substances or for testing the modulation efficiency of genetically therapeutically active vectors.
  • the present invention further relates to the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 and 3 or functional variants thereof and / or nucleic acids coding for FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 2 and 4 or a variant thereof, which can be used according to the invention, or against an FGF-BP polypeptide which can be used according to the invention or functional variants thereof, directed antibodies or antibody fragments and / or at least one cell expressing FGF-BP polypeptide, optionally combined or together with suitable additives and auxiliaries, for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of wound healing disorders which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, especially diabetes-associated wounds.
  • a diagnostic on the basis of the polymerase chain reaction (examples 1 and 2, PCR diagnostics, for example according to EP 0 200 362) or an RNase protection assay (see for example Sambrook et al ., supra chapter 7, page 7.71-7.78; Werner et al. (1992) Growth Factors and Receptors: A Practical Apachach 175-197; Werner (1998) Proc. Natl. Acad. Be. USA 89: 6896-6900).
  • These tests are based on the specific hybridization of a nucleic acid with its complementary counter strand, usually the corresponding mRNA or its cDNA.
  • nucleic acids which can be used according to the invention can also be modified here, as disclosed, for example, in EP 0 063 879.
  • a DNA fragment is preferably labeled by means of suitable reagents, for example radioactive with .beta.-P-dCTP or non-radioactive with biotin or digoxigenin, according to generally known methods and with isolated RNA which is preferably previously attached to suitable membranes made of, for example, nitrocellulose or Nylon was bound, incubated.
  • suitable reagents for example radioactive with .beta.-P-dCTP or non-radioactive with biotin or digoxigenin
  • isolated RNA which is preferably previously attached to suitable membranes made of, for example, nitrocellulose or Nylon was bound, incubated.
  • the amount of mRNA that was specifically labeled by the probe can thus be determined.
  • the amount of mRNA can also be determined directly in tissue sections with the aid of in situ hybridization (see, for example, Werner
  • the expression level of the respective gene in a tissue sample can be specifically measured in vitro, for example in order to be able to reliably diagnose a wound healing disorder (Table 3).
  • a wound healing disorder Table 3
  • Such a method is particularly suitable for the early prognosis of disorders or for determining a predisposition for the development of a wound healing disorder, characterized by a reduced amount of FGF-BP, in particular diabetes-associated wounds.
  • a diagnostic agent which can be used according to the invention for diagnosing skin diseases which are characterized by a reduced amount of FGF-BP comprises, for example, the use of at least one nucleic acid coding for FGF-BP or a functional variant thereof according to SEQ ID No. 2 and 4 and / or functional variants thereof as a probe, preferably as a DNA probe and / or as a primer.
  • a probe in the sense of the present invention dung is a defined DNA or RNA fragment, which is radioactive or chemically labeled and is used to localize specific nucleic acid sequences by hybridization.
  • a primer in the sense of the present invention is a short DNA sequence which contains a free 3 'hydroxyl group and binds to a complementary strand.
  • the primer is then the starting point for the copy of the complementary strand.
  • Another embodiment of the invention relates to the use of an antibody or antibody fragment, preferably a polyclonal or monoclonal antibody or antibody fragment for analysis, diagnosis, of wound healing disorders, which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, and its use for the identification of pharmacologically active substances, characterized in that an antibody-producing organism is immunized with a polypeptide which can be used according to the invention.
  • an antibody or antibody fragment preferably a polyclonal or monoclonal antibody or antibody fragment for analysis, diagnosis, of wound healing disorders, which are characterized by a reduced amount of FGF-BP, and its use for the identification of pharmacologically active substances, characterized in that an antibody-producing organism is immunized with a polypeptide which can be used according to the invention.
  • the method for producing an antibody or antibody fragment is carried out according to methods generally known to the person skilled in the art by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the polypeptide according to the invention or functional variants thereof, preferably with parts thereof, with at least 6 Amino acids in length, preferably with at least 8 amino acids in length, in particular with at least 12 amino acids in length, optionally in the presence of, for example, Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see, for example, Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349 ).
  • the polyclonal antibodies produced in the animal as a result of an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and purified, for example, by column chromatography.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).
  • so-called “anticalins” based on lipocalin can be used, for example (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 1898-1903).
  • the antibody or the antibody fragment which can be used according to the invention is directed against a polypeptide according to the invention and reacts specifically with the polypeptides according to the invention, the abovementioned parts of the polypeptide either being themselves immunogenic or rendered immunogenic or by coupling to suitable carriers, such as, for example, bovine serum albumin can be increased in their immunogenicity.
  • This antibody which can be used according to the invention is either polyclonal or monoclonal, a monoclonal antibody is preferred.
  • the term antibody or antibody fragment also means genetically engineered and, where appropriate, modified antibodies or anti-gene-binding parts thereof, such as, for example, chimeric Antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, bi- or oligo-specific antibodies, single-stranded antibodies, F (ab) - or F (ab) 2 - fragments (see, for example, EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
  • Antibodies against the FGF-BP according to the invention have already been successfully produced and used (Liu et al. (2001) Kidney Int., 59: 1717-1728; Sauter et al. (2001) Int. J. Cancer 92: 374- 381).
  • the substances can contain a detectable marker, for example the substance can be radioactively marked, fluorescence-marked or luminescence-marked.
  • substances can be coupled to enzymes that allow indirect detection, for example, as described above, via enzymatic catalysis using a peroxidase assay with a chromogenic substrate or by binding a labeled or detectable antibody.
  • the substances can then be brought into contact with a sample to be examined and thus the amount of a polypeptide or a functional variant thereof which can be used according to the invention or nucleic acid coding for this or a variant thereof or a polypeptide or a functional variant thereof which can be used according to the invention or a nucleic acid encoding this or a variant expressing it or an antibody directed against a polypeptide which can be used according to the invention or an antibody fragment in the sample.
  • the results of this sample which comes from an organism to be examined, can then be compared with the result of a sample, which comes from a healthy or diseased organism.
  • the invention further relates to the use of at least one polypeptide or a functional variant thereof which can be used according to the invention or nucleic acid coding therefor or a variant thereof or an antibody or an antibody fragment which is directed against a polypeptide or a functional variant thereof which can be used according to the invention. if combined or together with suitable additives and auxiliary substances, for the production of an array fixed on a carrier material for analysis in connection with wound healing disorders which are characterized by a lack of FGF-BP, in particular diabetes-associated, poorly healing wounds.
  • DNA chips and / or protein chips which have at least one nucleic acid, at least one polypeptide and / or comprise at least one antibody or antibody fragment as described above.
  • DNA chips are known, for example, from US Pat. No. 5,837,832.
  • the present invention further relates to the use of at least one FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3 or functional variants thereof and / or at least one nucleic acid coding for FGF-BP according to SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4 or functional variants thereof and / or antibodies or antibody fragments directed against an FGF-BP polypeptide or functional variants thereof and / or a cell expressing an FGF-BP polypeptide or a functional variant thereof for the production of a medicament for the treatment and / or prevention of diabetes-associated wound healing disorders or for the diagnosis of diabetes-associated wound healing disorders.
  • the nucleic acid coding for FGF-BP or functional variants can be in the form of an expression vector, in particular a gene therapy active men vector. If FGF-BP polypeptide or a functional variant thereof is used, it is preferably a recombinant polypeptide which is ideally obtained from bacteria such as E. coli, yeasts such as S. cerevisiae or Schizosaccharomyces pombe or viruses, in particular baculoviruses.
  • the diabetes-associated wound is particularly preferably a poorly healing wound, in particular a diabetic ulcer.
  • the invention further relates to a method for the treatment of wound healing disorders, in particular diabetes-associated wound healing disorders, which are not necessarily characterized by a reduced amount of FGF-BP.
  • the method comprises the step (i) administering to a patient a therapeutically effective amount of FGF-BP polypeptide, a nucleic acid coding for FGF-BP, and / or an antibody directed against an FGF-BP. If necessary, the amount of FGF-BP in a wound or on the edge of the wound can be determined before or after administration.
  • Table 2 shows the kinetics of the differential regulation of FGF-BP expression in the wound healing of normal and diabetic mice, determined by means of "Taq-Man" analysis, as an example of a wound healing disorder which is associated with a lack of FGF-BP.
  • Table 3 shows a comparison of the differential regulation of FGF-BP expression in three different wound healing states in humans (Taq-Man analysis) (normal wound healing, venous and diabetic ulcer) as an example of the selectively occurring in diabetic patients Predisposition to a wound healing disorder caused by a lack of FGF-BP.
  • Table 4 shows results of tensile strength measurements made on wounds treated with FGF-BP expression plasmid on diabetic rats.
  • Table 5 shows results of tear strength measurements made on wounds treated with FGF-BP polypeptide on diabetic rats.
  • polypeptide sequences of the murine and human FGF-BP are listed in accordance with SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4.
  • oligonucleotides used for the examples are listed in accordance with SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 12.
  • Example 1 Differential expression of the FGF-BP mRNA in human biopsies from healthy skin and wounds from healthy volunteers, as well as biopsies of venous and diabetic ulcers
  • the first experiment was to investigate the extent to which the expression of FGF-BP is regulated in various wound healing diseases.
  • skin samples were taken from 6 healthy subjects from untreated intact skin, from wounds 1 hour after wounding, from day 1 wounds, and from day 5 and day 15 wounds using 4 mm or 6 mm punches and biopsies were pooled at any time.
  • punch biopsies were taken from 6 patients with chronic venous ulcers as well as from 4 patients with diabetic ulcers simultaneously from intact skin as well as from the wound base and wound edge and then each group (intact skin, wound base, wound edge) was pooled for itself.
  • RNA was isolated from all biopsies.
  • RNAclean buffer AGS, Heidelberg
  • 2-mercaptoethanol 1/100 part by volume of 2-mercaptoethanol had been added
  • ADS RNAclean buffer
  • the RNA was then extracted by phenolization twice using water-saturated acidic phenol and in the presence of l-bromo-3-chloropropane.
  • An isopropanol and an ethanol precipitation were then carried out and the RNA was washed with 75% ethanol.
  • a DNase I digestion of the RNA was then carried out.
  • the cDNA was then produced from the extracted RNA. This was done in the presence of 1 x TaqMan RT buffer (Perkin Elmer), 5.5 mM MgCl 2 (Perkin Elmer), each 500 ⁇ M dNTPs (Perkin Elmer), 2.5 ⁇ M random hexamers (Perkin Elmer), 1.25 U / ⁇ l MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ⁇ l Perkin Elmer), 0.4 U / ⁇ l RNase Inhibitor (20 U / ⁇ l, Perkin Elmer), 20 ⁇ l RNA (50 ng / ⁇ l) and DEPC-treated water (ad 100 ⁇ l volume).
  • the stock solution for each triplet contained 37.5 ⁇ l of 2 x SYBR Master Mix, 0.75 ⁇ l of AmpErase UNG (1 U / ⁇ l) and 18.75 ⁇ l of DEPC-treated water for a total volume of 57 ⁇ l.
  • 1.5 ⁇ l of forward and backward primers (according to SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6) were added to 57 ⁇ l stock solution in a previously optimized concentration ratio.
  • each of the stock solution / primer mixture was mixed with 15 ⁇ l cDNA solution (2 ng / ⁇ l) and distributed over three wells.
  • a stock solution with primers for the determination of cyclophilin A (SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8) was prepared, mixed with a further 15 ⁇ l of the same cDNA solution and distributed over three wells.
  • cDNA solutions were prepared as a dilution series (4 ng / ⁇ l; 2 ng / ⁇ l; 1 ng / ⁇ l; 0.5 ng / ⁇ l and 0.25 ng / ⁇ l ). 15 ⁇ l of each of these cDNA solutions were mixed with 60 ⁇ l stock solution / primer mixture for the determination of cyclophilin and distributed over three wells.
  • a standard curve for human FGF-BP-PCR was also created; the same dilutions used for the standard cyclophilin curve were used.
  • a PCR approach without cDNA served as a control.
  • a standard curve was first created by plotting the Or values of the dilution series against the logarithm of the amount of cDNA in the PCR approach (RNA transcribed in ng) and determining the slope (s) of the straight line.
  • the numerical values were then normalized by setting the amount of cDNA from intact skin of healthy volunteers 1.
  • the results of this experiment show that a promising therapy for the wound healing disorder, in particular diabetes-associated wounds, can consist in locally increasing the amount and / or activity of the FGF-BP polypeptides and / or nucleic acids and thus achieving improved wound healing.
  • the results further show that the increased FGF-BP expression in ulcer patients, in particular at the wound edge, compared to intact normal skin of healthy patients, is still significantly below the expression values in wounds of healthy patients. It follows from this that patients, in particular ulcer patients, who do not show a reduced expression of FGF-BP per se, can also be treated with FGF-BP.
  • Example 2 Differential expression of FGF-BP in murine wounds
  • FGF-BP is indeed particularly suitable for the treatment, diagnosis and / or prevention of wound healing disorders, which are characterized by a deficiency in FGF-BP, in particular of diabetes-associated poorly healing wounds
  • the influence of FGF-BP became examined for wound healing in animal models.
  • diabetes-associated wounds that are not necessarily characterized by a lack of FGF-BP.
  • Confirmation of human data in animal models is a prerequisite for determining suitable times for the treatment, diagnosis and / or prevention of wound healing disorders that are characterized by a lack of FGF-BP, in particular of diabetes-associated wounds. This generally applies to all diabetes-associated wounds, including those that are not characterized by a reduced amount of FGF-BP.
  • mice Since mice have proven to be a suitable model system for investigating wound healing in humans, the expression of FGF-BP was determined in murine biopsies from different times of wound healing. Punch biopsies from wounds and intact skin from normal healing control mice (C57BL / 6) and diabetic mice (C57BI / Ks-db /) were performed at the time lh, 7h, 15h, 24h, 3 days, 5 days, 7 days and 14 days after the wound. db / Ola) won.
  • the biopsies were homogenized and RNA isolated as described in Example 1. This was followed by DNase digestion and rewriting in cDNA. Wound healing-relevant cDNAs were also quantified as described in Example 1.
  • primers with the sequence of SEQ JD No. 9 and SEQ ID No. 10 were selected based on the sequence of the FGF-BP (SEQ ID No. 4).
  • GAPDH was used as the reference gene in this experiment.
  • the PCR amplification was carried out using the sequence of the GAPDH gene (Gen Bank: M17851) with the sequence of the SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12 are used.
  • cDNA was amplified from 10 ng of reverse transcribed total RNA in a total volume of 25 ⁇ l per batch.
  • the PCR was carried out according to the manufacturer's instructions (PE Applied Biosystems, SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol, 1998).
  • the C T values were analyzed and the frequency of FGF-BP mRNA relative to GAPDH mRNA was calculated.
  • the results of the experiments are summarized in Table 2 and show that FGF-BP mRNA was significantly reduced (on average by a factor of 2.8) during wound healing during wound healing during the entire observation period in diabetic animals.
  • Example 3a Treatment of murine wounds with FGF-BP by gene therapy methods
  • FGF-BP farnesoid protein
  • SEQ ID No. 4 in male diabetic Sprague Dawley rats
  • the tensile strength of the wounds is examined, whereby a higher tensile strength reflects improved wound healing.
  • the animal model of the diabetic rat is an established model system for the investigation of diabetes-associated poorly healing wounds (Davidson, Arch. Dermatol. Res. (1998) 290: Sl-S 11).
  • a suitable expression vector for this experiment is constructed, for example, on the basis of the vector pMH (F. Hoffman-La Röche) by inserting the intron JJ of the insulin gene from the rat between the CMV promoter and the multiple cloning site in the HindlU interface ( pMHInt).
  • the FGF-BP cDNA according to the invention is then cloned into the modified expression vector pMHInt using the multiple cloning site.
  • the coding region of the FGF-BP cDNA according to SEQ ID No. 4 is amplified by means of a suitable PCR and then cut with restriction enzymes which permit “in-frame” ligation of the cDNA in the modified expression vector cut with the same restriction enzymes.
  • An expression plasmid pMHInt_FGF-BP is thus obtained, and pMHInt, which contains, for example, a luciferase gene (pMHJntLuc), is used as the control vector.
  • mice To induce diabetes, four rats with a body weight of 250-300 g are given a freshly prepared aqueous streptozotocin solution (Sigma) i.p. injected (50 mg / kg body weight). The animals' blood sugar is checked 7-9 days after induction. A blood sugar level of over 200 mg / dL serves as the lower limit for assessing the diabetic condition of the animals.
  • the four diabetic rats and the four non-diabetic control animals are then anesthetized with a mixture of 2% O 2 (2 l / min) and 1.25% isoflurane.
  • the back is depilated and a mark is placed on the back at four points per animal for later wounding.
  • These brands are, for example, each with 0.5 ⁇ g plasmid DNA that is attached to gold particles (BioRad) is bound with the "Helios Gene Gun" (BioRad) bombarded with 500 psi, two sites being bombarded with the FGF-BP expression vector ⁇ MHInt_FGF-BP and two sites with the control vector pMFflntLuc.
  • the determination of the mean value of the E / C values makes it possible to determine the changes in the tensile strength as a function of the FGF-BP according to the invention between diabetic and control animals.
  • An increased tensile strength of pMHInt_FGF-BP treated wounds in diabetic animals indicates that FGF-BP is suitable for the selective treatment of diabetes-associated, poorly healing wounds.
  • nucleic acids can be complexed with liposomes in order to facilitate penetration into the cell or the nucleic acid can be bound to a carrier matrix, for example collagen, which is then applied to the wound. It is possible for the nucleic acid to penetrate the skin cells.
  • viral vectors for example adenoviruses or retroviruses, can also be used, which then gain access to the cells via infection.
  • nucleic acids encoding human FGF-BP polypeptide according to SEQ ID No. 2 or variants thereof can also be used.
  • Example 3b Treatment of wounds with FGF-BP using gene therapy
  • the expression vector for pMHInt_FGF-BP was produced as described in Example 3a), starting from the vector pMH. PMHInt was used as the control vector.
  • rats with a body weight of 250-300 g were injected ip with a freshly prepared aqueous streptozotocin solution (Sigma) (50 mg / kg body weight).
  • the animals' blood sugar was checked 5, 10 and 17 days after induction.
  • a blood sugar level of over 200 mg / dL served as the lower limit for assessing the diabetic condition of the animals.
  • the wounds were set on day 10 after induction of the diabetic condition. 28 diabetic rats were anesthetized with a mixture of 2% O 2 (2 1 / min) and 1.25% isoflurane.
  • the back was depilated and a mark was placed on the back at four points per animal for later wounding.
  • These labels were each bombarded with 0.5 ⁇ g of plasmid DNA bound to gold particles (BioRad) using the "Helios Gene Gun” (BioRad) at 500 psi, 16 animals using the FGF-BP expression vector pMHInt_FGF-BP and 12 animals are shot with the control vector pMHInt. Subsequently, 1.9 cm long cuts were placed through the bombarded areas and the wounds were closed with wound clips. After 7 days, the tensile strength of the wounds is determined using a tensiometer (BTC-2000, SRLI, Ten) according to the manufacturer's instructions.
  • FGF-BP is particularly suitable for the treatment of diabetes-associated, poorly healing wounds.
  • Example 4a Treatment of wounds by in vivo application of FGF-BP polypeptides
  • the FGF-BP polypeptide which can be used according to the invention has an extracellular site of action and thus penetration into the cells is not necessary, the suitability of topically administered, recombinantly produced FGF-BP polypeptides for the treatment and or prevention of diabetes-associated poorly healing wounds for wound healing in tested in vivo.
  • FGF-BP polypeptides are produced using the baculovirus expression system (BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System, Life Technologies INC., Gaithersburg, MD).
  • BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System Life Technologies INC., Gaithersburg, MD
  • the cDNA of the FGF-BP according to SEQ ID No. 4 that can be used according to the invention is first via PCR amplified (see experiment 3) and provided with a (His) 6-tag on each side.
  • This modified cDNA is cloned into suitable restriction sites of the pFASTB AC HTb donor plasmid.
  • the plasmid is then transformed into the bacmid-containing DH10BAC E.co/i strain.
  • Isolated, recombinant bacmid DNA is then transfected into Sf-9 cells to generate corresponding baculoviruses. After five days, the cells are harvested, pelleted and lysed using 6 M guanidinium_HCl, 0.01 M HC1, 0.1 M sodium phosphate pH 8.0. The cell lysates are incubated on ice for one hour, cellular residues are centrifuged off and the supernatant is loaded onto a nickel-NTA Sepharose column (Qiagen, Hilden, Germany). The column is washed repeatedly with 30 mM sodium citrate, 300 mM sodium chloride and descending pH values of 8, 6.3, 5.9 and 5.7.
  • His-tagged FGF-BP is then eluted with 3x0.5 ml buffer at pH 4.5 and neutralized.
  • Recombinant FGF-BP polypeptide produced in this way is then formulated in various concentrations, for example in an inert hydrogel (2.3% modified methyl cellulose, 20% propylene glycol and 77.7% water) (Intra Site from Smith & Nephew).
  • FGF-BP polypeptides for the selective treatment of diabetes-associated, poorly healing wounds.
  • FGF-BP polypeptides according to SEQ ID No. 1 or functional variants thereof can also be used.
  • FGF-BP is effective in the prevention and / or treatment of diabetes-associated, poorly healing wounds.
  • the effect of FGF-BP is particularly suitable for these diabetes-associated wound healing disorders in comparison to the treatment of other wound healing disorders, since in the latter there is no incorrect regulation of FGF-BP expression.
  • the amount of FGF-BP, preferably of functionally active FGF-BP in the wound area should be increased.
  • a preferred indication to be treated is the diabetic ulcer.
  • Administration of a medicament containing FGF-BP is preferably topical, in particular by means of gene therapy (example 3). Administration can also be carried out particularly preferably by topical application of a recombinant FGF-BP polypeptide according to the use (Example 4), since the site of action of the FGF-BP polypeptide is extracellular and the penetration of the protein into cells is therefore not necessary.
  • Example 4b Treatment of wounds with FGF-BP using polypeptide
  • FGF-BP polypeptide is produced as described in Example 4a) using a baculovirus expression system (BAC-TO-BAC baculovirus expression system, Life Technologies INC., Gaithersburg, MD).
  • BAC-TO-BAC baculovirus expression system Life Technologies INC., Gaithersburg, MD.
  • the pure carrier solution in which the FGF-BP polypeptide is dissolved or, alternatively, a polypeptide that can be easily produced by means of the baculovirus expression system and has no influence on wound healing serves as a control.
  • a "housekeeping gene" such as GAPDH is suitable, for example.
  • rats with a body weight of 250-300 g are injected ip with a freshly prepared aqueous streptozotocin solution (Sigma) (50 mg / kg body weight).
  • a freshly prepared aqueous streptozotocin solution (Sigma) (50 mg / kg body weight).
  • the animals' blood sugar is checked.
  • a blood sugar level of over 200 mg / dL serves as the lower limit for assessing the diabetic condition of the animals.
  • the wounds are set. 28 diabetic rats are anesthetized with a mixture of 2% O 2 (2 1 / min) and 1.25% isoflurane. The back is depilated and a mark is placed on the back at four points per animal for later wounding.
  • a higher value means better tensile strength of the wound.
  • Each value is an average of the four wounds that are set for each animal.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Fibroblastenwachstumsfaktor-Bindeprotein (FGF-BP) Polypeptiden bzw. funktionellen Varianten dieser Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren bzw. funktionellen Varianten davon und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon exprimierenden Zelle zur Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten Wunden, sowie auf die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäss SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäss SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4 und/oder von gegen ein erfindungsgemäss verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteten Antikörpern oder Antikörperfragmenten und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon exprimierenden Zelle zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Aktivität oder Expression von FGF-BP steigern.

Description

2
28. Februar 2003 Switch Biotech AG S36968PC BÖ/EUsmi
Verwendung eines Fibroblastenwachstumsfaktor-Bindeproteins zur Behandlung und Diagnose von diabetischen Wundheilungsstörungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Fibroblasten- wachstumsfaktor-Bindeprotein (FGF-BP) Polypeptiden bzw. funktionellen Varianten dieser Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren bzw. funktionellen Varianten davon und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon exprimierenden Zelle zur Behandlung, Diagnose und/oder Präven- tion von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten Wunden, sowie auf die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und SEQ LD Nr. 4 und/oder von gegen ein erfindungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteten Antikörpern oder Antikörperfragmenten und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon exprimierenden Zelle zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Aktivität oder Expression von FGF- BP steigern.
Hautwunden gesunder Patienten heilen normalerweise ohne Probleme. Es sind jedoch eine Vielzahl zeitlicher und räumlicher Veränderungen der Zellzusammensetzung der Haut nötig, um vollständige Heilung des Gewebes zu erreichen. Dieser Prozess kann bis zu zwei Jahre andauern und ist bei nicht-foetalem Gewebe immer mit Narbenbildung verbunden. Dies weist auf die enorme Komplexität des Wundheilungsprozesses der Haut hin. Bei der Wundheilung können die zeitlich aufeinander folgenden, partiell überlappenden Phasen der Koagulation, Entzün- dung, Proliferation und Reorganisation unterschieden werden (The physiology of wound healing, 1998, Oxford Institute for continuing education). Während der Koagulation aggregieren Blutplättchen, die Wachstums- und Koagulationsfaktoren freisetzen. Es wird eine Fibrin-Matrix gebildet, die die Zellmigration in der Wunde ermöglicht. Anschließend kommt es ca. 5-7 Tage nach der Verletzung zu einer Entzündungsreaktion. Dabei wandern verschiedene Zelltypen, vor allem neutrophile Granulozyten und Monozyten in die Wunde ein und setzen Mediatoren der Entzündungsreaktion frei. Die Proliferationsphase dient der Neubildung des verletzten Gewebes und der Restrukturierung des neu gebildeten Gewebes. Die dabei beteiligten Prozesse umfassen vor allem die Neovaskularisierung, Fibroblastenproliferation und Reepithelialisierung durch Proliferation und Differenzierung verschiedenster Hautzellen und werden von verschiedensten Wachstumsfaktoren und/oder Kombinationen davon gesteuert. Beispielsweise wird die Vaskularisierung durch die Wachstumsfaktoren bFGF, VEGF und TGF-beta 1 und 2 unterstützt, die von zerstörten Endothelzellen bzw. Makrophagen ausgeschüttet werden. Verschiedenste Zelltypen sind an der Ausschüttung von Faktoren beteiligt, die die Proliferation von Keratinozyten steuern, wie zum Beispiel EGF, TGF-alpha, bFGF, aFGF und KGF. Die Fibroblasten wiederum sezernieren mehrere Wachstumsfaktoren, z.B. PDGF und TGF-beta, die die Synthese und Einlage- rung von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) wie Fibronektin, Lami- nin, Glykosaminoglykane und Kollagen regulieren. Während der Reorganisation des Gewebes kommt es zu einer Umordnung der ECM-Komponenten, insbesondere des Kollagens. Durch den ständigen Abbau von Kollagen und dessen Neusynthese kann die reepithelialisierte Wunde reifen und es kommt innerhalb von zwei Jahren zur Bildung einer flachen Narbe. Wiederum sind eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Chemoattraktanten für den koordinierten Umbau des Gewebes notwendig. So beeinflussen Interleukin 1, TNF-beta und Interferon- gamma die Sezernierung der ECM-Komponenten. Weiterhin sind TGF-beta, PDGF, VEGF und FGF essentiell für die Reorganisation. Dieses exakt abgestimmte, komplexe Zusammenspiel der bei der Wundheilung auftretenden physiologischen Prozesse verdeutlicht, dass verschiedenste Störungen zu Beeinträchtigungen des Wundheilungsprozesses führen können. Einige dieser Faktoren sind beispielsweise das Alter, Immunerkrankungen, Emährungs- mängel, Zinkmangel, Innervationsstörungen, Alkoholmissbrauch oder genetische Defekte. Starke Beeinträchtigungen des Wundheilungsprozesses können dann zu chronischen Wunden und schließlich zu Ulzera führen. Bislang sind jedoch nur wenig zufriedenstellende Therapien entwickelt worden, um bei chronischen Wundheilungsstörungen eingreifen zu können. Etablierte Therapieformen be- schränken sich auf physikalische Unterstützung der Wundheilung (z.B. Verbände, Kompressen, Gele), Ausschabung nekrotischen Gewebes und Transplantation von Hautgeweben, gezüchteten Hautzellen und/oder Matrixproteinen.
Da die Wachstumsfaktoren, wie oben aufgeführt, eine entscheidende Rolle für eine erfolgreiche Wundheilung und ein ästhetisches Ergebnis zu spielen scheinen, stellten in der Vergangenheit die Wachstumsfaktoren ein interessantes Objekt für die Therapieentwicklung dar. Da jedoch das korrekte Zusammenspiel der zahlreichen Wachstumsfaktoren von einer Vielzahl von Faktoren wie Menge, räumliche und zeitliche Verteilung sowie Kombination von Wachstumsfaktoren beeinflusst wird, gestaltet sich dieser Ansatz als äußerst kompliziert. So wurden in den letzten Jahren Wachstumsfaktoren zur Verbesserung der Wundheilung erprobt, bisher jedoch ohne die konventionelle Therapie entscheidend zu verbessern. Lediglich PDGF-BB ist zur Behandlung diabetischer Fußulzera zugelassen.
Ein bislang unbeachteter Aspekt bei Wundheilungsstörungen sind jedoch die pa- thogenen Hintergründe, die den jeweiligen Störungen zu Grunde liegen und aufgrund verschiedener molekularer Ursachen eine unterschiedliche Therapie erfordern. So werden üblicherweise venöse Ulzera molekular untersucht und stellvertretend für chronische und/oder schlecht heilende Wunden betrachtet. Unter chro- ni sehen Hautwunden werden jedoch sehr unterschiedliche Erkrankungen mit un- terschiedlichem pathogenem Hintergrund zusammengefasst. Im Allgemeinen werden als häufigste Vertreter chronischer Hautwunden diabetische Ulzera, venöse Ulzera, neuropathische Ulzera, arterielle Ulzera und Dekubitus Ulzera unterschieden. Dekubitus Ulzera sind durch längerfristige Druckeinwirkung bedingte, sehr tiefe Wunden, die mit Nekrose, Infektion und Mazeration des Gewebes einhergehen. Dagegen sind venöse Ulzera, die durch venöse Stasis hervorgerufen werden eher oberflächlich. Arterielle Ulzera werden dagegen häufig durch arterielle Verschlusskrankheiten verursacht. Diabetische Ulzera wiederum sind Ulzera die häufig bei Diabetes-Patienten vorkommen. Die Spät-Komplikationen der Dia- betes umfassen neben einer Vielzahl von Erkrankungen auch charakteristische Hautveränderungen wie häufige Infekte, trophische Störungen und Necrobiosis lipoidica. Diese Veränderungen können sich zu schlecht heilenden Ulzera entwickeln. So leiden z.B. 25% der Patienten mit Typ-U-Diabetes häufig an chronischen Ulzera (z.B. "diabetischer Fuß"), von denen etwa die Hälfte aufwändige stationäre Behandlungen erfordern und letztlich doch schlecht heilen. Allein der diabetische Fuß verursacht mehr Klinikaufenthalte als jede andere mit Diabetes assoziierte Komplikation. Die Zahl dieser Fälle bei Diabetes Typ I und JJ ist im Steigen begriffen und repräsentiert ca. 2,5% aller Klinikeinweisungen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen neuen Wirkstoff zu finden, der insbesondere die Heilung, Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, insbesondere von diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden entscheidend verbessert.
Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, dass diabetische Patienten im Gegensatz zu anderen Ulzera-Patienten selektiv zu einer verminderten Menge an FGF-BP neigen. Die in Beispiel 1 dargestellte Expressionsstudie der normalen Wundheilung zeigt, dass für eine normale Wundheilung eine erhöhte Expression von FGF-BP notwendig ist. Dies wird auch deutlich im Vergleich mit venösen Ulzera, wo eine permanente leichte Erhöhung der Expression von FGF-BP beo- bachtet wird. Hingegen besteht selektiv bei diabetischen Patienten eine Prädisposition für eine schlechtere Wundheilung, die durch eine verminderte Expression von FGF-BP gekennzeichnet ist. Dadurch lassen sich diabetische Ulzera gegenüber normalen Wunden und anderen Ulzera relativ gut abgrenzen.
Ebenso überraschend konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sich nicht nur diabetes-assoziierte Wunden, die durch eine verminderte Expression von FGF-BP gekennzeichnet sind, mit FGF-BP gut therapieren lassen, sondern dies trifft generell auf alle diabetes-assoziierten Wunden zu, also auch solche, deren FGF-BP Expressionsniveau nicht verringert ist. Dies hat den Vorteil, dass der FGF-BP Status einer Wunde vor Behandlungsbeginn nicht bestimmt werden muss, da sich jede diabetes-assoziierte Wunde mit FGF-BP therapieren lässt. Die in der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung dargestellten Gegenstände der Erfindung einschließlich aller Ausführungsformen betreffen somit nicht nur Wunden, insbe- sondere diabetes-assoziierte Wunden, die durch eine verringerte Menge an FGF- BP gekennzeichnet sind, sondern alle diabetes-assoziierten Wunden unabhängig von ihrer exprimierten FGF-BP Menge.
Diese Ergebnisse, die in den Beispielen genau erläutert werden, werden im Folgenden zusammengefasst:
Biopsien aus humanen diabetischen Ulzera wiesen die für FGF-BP kodierende mRNA in deutlich geringerer Konzentration auf als Biopsien venöser Ulzera oder Biopsien normal heilender Wunden. Dies belegt, dass sich insbesondere diabetes- assoziierte Wundheilungsstörungen durch eine für diese Erkrankungen spezifisch verminderte Menge der Expression des FGF-BP auszeichnen. Durch die Identifizierung einer Patientengruppe, die unerwartet einen Mangel an FGF-BP aufweist, besteht die Möglichkeit, FGF-BP, das Protein kodierende Nukleinsäure(n), gegen ein erfinderisch verwendbares Polypeptid oder funktionell Varianten davon gerichtete Antikörper und/oder das Protein exprimierende Zellen für eine erfolgreiche und effektive Therapie und Diagnose diabetes-assoziierter Wunden einzusetzen. Diese Resultate konnten auch in Mäusen nachvollzogen werden, wodurch sich ein geeignetes Tiermodell für die Therapieentwicklung ergab. So zeigt ein Vergleich der Wundheilung zwischen normalen Mäusen und diabetischen Mäusen, die eine schlechtere Wundheilung aufwiesen, dass das FGF-BP in diabetischen Mäusen während der Wundheilung relativ zu intakter Haut im Durchschnitt um den Faktor 2,8 schwächer exprimiert ist.
Die Aufgabe wird daher erfindungsgemäß durch die Verwendung eines oder mehrer FGF-BP Polypeptide oder diese kodierende Nukleinsäuren gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß der SEQ Nr. 1 und SEQ Nr. 3 oder funktionel- ler Varianten davon oder der dafür kodierenden Nukleinsäure(n) gemäß der SEQ Nr. 2 und SEQ Nr. 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente oder einer FGF-BP exprimierenden Zelle zur Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten Wunden. Eine bevorzugte diabetes-assoziierte schlecht heilende Wunde ist der diabetische Ulkus.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäu- re gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein erfindungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid exprimierenden Zelle zur Identifizierung pharmakolo- gisch aktiver Substanzen, die die Funktion und/oder die Expression des FGF-BP Polypeptids und/oder einer für FGF-BP Polypeptid kodierenden Nukleinsäure steigern zur Behandlung und/oder Prävention von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetische Wundheilungsstörungen. Eine bevorzugte Verwendung der genannten Substanzen und Zellen ist dabei die Herstellung eines Tests zur Auffindung von pharmakolo- gisch aktiven Substanzen in Zusammenhang mit Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetische Wundheilungsstörungen.
Das humane FGF-BP ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 17 kD welches als Monomer aber auch als Homodimer vorliegen kann. Es wurde ur- sprünglich aus Kulturmedium isoliert, welches durch humane epidermoide Karzinomzellen konditioniert worden war (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 5:16778- 16785). Weiterhin wurde eine starke Erhöhung der Expression von FGF-BP vor allem in frühen Stadien schwammartiger Karzinome, in normalen und immortali- sierten humanen Keratinozyten, sowie in Nierentubuli bei renalen Erkrankungen, wie z.B. FflV-assoziierter Nephropathie oder hämolytischem urämischem Syn- drom (HUS) beobachtet (Liu et al. (2001) Kidney Int., 59:1717-1728).
FGF-BP ist bekannt dafür, dass es FGF-1 (aFGF) und FGF-2 (bFGF) nicht- kovalent und reversibel bindet (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 5:16778-16785). FGF-1 und -2 gehören zur Familie der FGF Proteine, der über 20 verschiedene Proteine angehören und die in verschiedensten Geweben exprimiert werden. FGFs sind so genannte translozierenden Proteine, die unabhängig vom normalen Sekretionsweg sezerniert werden und an die extrazelluläre Matrix binden, wodurch sie einerseits vor Degradation geschützt werden und andererseits ein lokales Reser- voir an inaktivem Protein bilden, das eine strikte räumliche Regulation des FGF Signalweges erlaubt. Die Freisetzung von FGF aus der extrazellulären Matrix ermöglicht die Bindung von FGF an seinen Rezeptor. So wird beispielsweise bFGF von verschiedensten Zelltypen, wie Keratinozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen sezerniert und übt seinerseits, entweder autokrin oder parakrin, chemotaktische und itogene Einflüsse aus (Powers et al. (2000) Endocr. Relat. Cancer 7:165-197).
Gegenwärtig sind zwei Mechanismen für die Freisetzung der FGFs bekannt. Der erste Mechanismus beinhaltet die enzymatische Spaltung durch Plasmin oder He- paranase, der zweite die Bindung an FGF-BP als Carrierprotein. Die Anwesenheit von FGF-BP kann somit dazu beitragen, die Aktivität der FGFs zu erhöhen. Eine solche stimulierende Wirkung wurde bisher für Angiogenese und Proliferation exklusiv im Zusammenhang mit Tumorentstehung und -Wachstum nachgewiesen. So konnte gezeigt werden, dass rekombinantes FGF-BP ohne Kofaktoren direkt an bFGF binden, gleichzeitig die Affinität des bFGF für Heparin reduzieren und die Proliferation von 3T3 Fibroblasten und Endothelzellen stimulieren kann. Somit ist das FGF-BP in hohem Maße an der Entstehung und Progression von Tumoren beteiligt und wurde ausschließlich in diesem Zusammenhang diskutiert. Dies wird zusätzlich durch den beobachteten synergistischer Effekt von bFGF und FGF-BP auf die Angiogenese im „Chorioallantois-Membrane-Assay" bestätigt. Dieser parakrine Effekt konnte mittels Antikörper gegen FGF2 vollständig blockiert werden (Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40247-53; Aigner et al. (2001) Int. J. Cancer 92:510-517). Weiterhin führte die in vitro Ablation von FGF-BP mittels Ribozymen in Kolonkarzinomzellen zu einer verminderten Frei- setzung von biologisch aktivem bFGF (FGF2) sowie zu reduziertem Tumorwachstum und Angiogenese in xenotransplantierten Tumoren (Czubayko et al. (1997) Nat. Med. 3:1083-1084; WO 99/15703). Die tumorfördernde Wirkung von FGF-BP spiegelte sich auch in der Regulation der Transkripte wieder. So wurden FGF-BP Transkripte von Faktoren, die die Differenzierung steuern, wie z.B. Re- tinsäure herunterreguliert (Liaudet-Coopman et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:21303-21308). Hingegen wurden FGF-BP Transkripte von tumorwachstums- fördernden Faktoren, wie z.B. 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA), Serum und dem so genannten Epidermal Growth Factor (EGF) hochreguliert (siehe z.B. Harris et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:19130-19139).
Untersuchungen an Mäusen ergaben bisher, dass FGF-BP die Funktion der FGFs während der Embryogenese in der Haut stimuliert und in adulter Haut offenbar herunterreguliert wird. Erst in frühen Stadien der Karzinogenese wird eine starke Reexpression von FGF-BP in vivo und in vitro in der Haut beobachtet (Kurtz et al. (1997) Oncogene 14:2671-2681). Interessanterweise wurde jedoch bisher kein Zusammenhang zwischen FGF-BP und der Freisetzung von FGFs aus der extrazellulären Matrix zur Vermittlung von Proliferation und Angiogenese während gestörter Wundheilungsprozesse nachgewiesen oder nahe gelegt, obwohl eine wundheilungsfördernde Wirkung von aFGF und bFGF in verschiedensten Tier- modeilen gezeigt wurde (Quirinia&Viidik et al. (1998) Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg. 32:9-18; Fu et al. (1998) Lancet 352 : 1661-4 ; Okumura et al. (1996) Biol. Pharm. Bull. 19:530-5; Meilin et al. (1995) J. Invest. Dermatol. 104 :850-5). Im Gegenteil, FGFs, die in der Wundheilung eine Rolle spielen, werden gemass dem gegenwärtigen Stand der Technik hauptsächlich unspezifisch durch mechanische Verletzung der Zellen freigesetzt (McNeil et al. (1989) J. Cell Biol. 109:811-22).
Die überraschende, selektiv in diabetes-assoziierten Wunden verringerte Menge an FGF-BP führt jedoch zu einer völlig neuen Ausgangssituation: Die schlechtere Wundheilung diabetischer Patienten steht in Zusammenhang mit der ungenügenden lokalen Freisetzung der vorhandenen Reserven an FGF. Somit trägt die vorliegende Erfindung zur Überwindung dieses technischen Vorurteils, die schlechtere Wundheilung bei diabetischen Patienten sei in der verminderten Verfügbarkeit von FGF begründet, bei und eröffnet die Möglichkeit, die Aktivität von FGFs bei Wundheilungsstörungen, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden, durch lokale Gabe von FGF-BP entscheidend zu erhöhen.
Da eine erhöhte Expression von FGF-BP und die damit verbundene Regulation von FGF bislang experimentell nur mit der Entstehung und Progression von Tumorerkrankungen in Zusammenhang gebracht wurde, wurde die Gabe eines solchen Proteins und/oder Nukleinsäure zum Einsatz für die Behandlung von Krankheiten bisher gar nicht in Betracht gezogen. Die überraschende Identifikation von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekenn- zeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden, bietet jedoch erstmals die Möglichkeit FGF-BP, dieses Protein kodierende Nukleinsäuren), gegen FGF-BP gerichtete Antikörper und/oder Zellen, die dieses Protein exprimieren, zur Behandlung, Diagnose und/oder Prävention dieser Wundheilungsstörungen einzusetzen.
Die Wundheilung und deren krankhafte Störungen im Sinne der Erfindung sind abzugrenzen von Hauterkrankungen, die mit einer entarteten Zellentwicklung und Zelldifferenzierung einhergehen, insbesondere von Hautkrebs. Bei letzterer Erkrankung kommt es zur Transformation einzelner Zellen, die dadurch unkontrol- liert, autonom, d.h. von Interaktionen mit anderen Zelltypen isoliert zu proliferie- ren beginnen und dabei die pathologischen Veränderungen an die Tochterzellen vererben. Es handelt sich also um eine Erkrankung, die mit einem Verlust von Interaktionen, beispielsweise von Zeil-Zeil Adhäsion und von typischen Zelleigenschaften einhergeht. Hingegen beruhen Wundheilungsstörungen im Sinne der Erfindung auf Störungen von Hautzellen in ihrem physiologischen Kontext. So kann der Verlauf der Wundheilung durch verschiedenste endogene und exogene Faktoren moduliert sein. Bereits kleine Störungen der Interaktionen zwischen den unterschiedlichen Zelltypen der Dennis und Epidermis selbst, aber auch Wechselwirkungen mit anderen Geweben und Organen wie dem Blutgefäßsystem, dem Nervensystem und dem Bindegewebe, können zu gestörter Wundheilung gefolgt von Narbenbildung führen. Weiterhin können Infektionen, Alterung, Erkrankungen, wie Diabetes und Immunerkrankungen sowie Vitaminmängel den Wundhei- lungsprozess beeinträchtigen. Beispiele für gestörte Wundheilung sind Wunden diabetischer Patienten und Alkoholiker, mit Mikroorganismen infizierte Wunden, ischämische Wunden und Wunden von Patienten mit mangelnder Durchblutung und Venenstau. Besonders bevorzugte schlecht heilende Wunden sind diabetische, neuropathische, venösen und arterielle Ulzera, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden.
Der autonome Charakter der Krebserkrankungen zeigt sich auch auf therapeutischer Ebene. Im Falle nicht-metastasierender Tumore lässt sich Krebs chirurgisch behandeln ist. Diese physikalische Behandlungsmöglichkeit ist möglich, da zwischen Tumorzellen und den umliegenden Zellen und Geweben keine Interaktionen stattfinden, so das durch einfache Exzision des Tumors der Patient geheilt werden kann, während dies bei Wundheilungsstörungen im Sinne der Erfindung nicht möglich ist - die krankhaften Störungen der Zeil-Zeil und/oder Gewebe- Gewebe Interaktionen können nicht durch Herausschneiden betroffener Hautstellen behoben werden. Dass es sich bei den verglichenen Krankheiten um Krankheiten handelt, denen ein grundsätzlich unterschiedlicher Mechanismus zugrunde liegt, wird deutlich, wenn man die therapeutischen Ansätze vergleicht. Bei Krebserkrankungen und Krankheiten, die mit einer entarteten Zellproliferation einhergehen, ist die Therapie auf die Abtötung schnell wachsender Zellen z.B. mittels Cytostatika gerichtet. Diese toxischen Substanzen verhindern das Wachstum aktiv proliferierender Zellen während Zellen in der GO-Phase des Zellzyklus nicht be- einflusst werden. Hingegen zielt die Behandlung von Wundheilungsstörungen im Sinne der Erfindung auf die Modulation der Interaktionen zwischen den verschiedenen Zelltypen, wie z.B. durch die Beeinflussung der Migration, Proliferation und Differenzierung einzelner Zelltypen. Wundheilungsstörungen im Sinne der Erfindung können nicht durch generelle Inaktivierung proliferierender Zellen ge- heilt werden. Der methodische Ansatz zur Identifizierung der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren, die an der Wundheilung und deren Störungen im Sinne der Erfindung beteiligt sind unterscheidet sich deutlich von Verfahren, die geeignet sind Nukleinsäuren zu identifizieren, die an Prozessen der Krebserkrankungen beteiligt sind. Letztere können durch Analyse differentiell exprimierter Gene des vom Krebs betroffenen Zelltyps identifiziert werden. Ziel des Assays der vorliegenden Erfindung ist es jedoch vielmehr, durch Vergleich der Expression in kranken und gesunden Gewebebiopsien Gene zu identifizieren, die an den komplexen Prozesse der Wundheilung und deren krankhaften Störungen beteiligt sind. Zur Identifizierung von krebsrelevanten Gene wäre dieses Verfahren unge- eignet.
Unter „Wundheilung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist der Heilungspro- zess einer mechanischen Verletzung der Haut zu verstehen, wie z.B. Schnittwunden, Schürfwunden oder das Aufreiben der Haut beispielsweise durch andauernde Belastung, beispielsweise Dekubitus oder nekrotische Prozesse, beispielsweise Nekrobiosis lipoidica.
Beispiele für „Wundheilungsstörungen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Wunden diabetischer Patienten und Alkoholiker, mit Organismen oder Viren infizierte Wunden, ischämische Wunden, Wunden von Patienten mit arteriellen Verschlusskrankheiten oder venöser Insuffizienz, und Narben, bevorzugt überschießende Narben, insbesondere Keloide. Besonders bevorzugte schlecht heilende Wunden sind diabetische, neuropathische, venöse und arterielle Ulzera, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden.
Unter „diabetes-assoziierten Wunden" im Sinne der vorliegenden Erfindung, sind Hautwunden von nicht-menschlichen Säugetieren und Menschen mit Diabetes mellitus zu verstehen. Beispiele für solche Hautwunden sind durch Diabetes ver- ursachte Ulzera, beispielsweise Ulcus cruris arteriosum oder die Necrobiosis li- poidica.
Unter „Aktivität" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Interaktion zwi- sehen FGF-BP Polypeptiden selbst (Homodimere) aber auch zwischen FGF-BP Polypeptiden und verschiedenen anderen Molekülen, wie beispielsweise Perlecan (ein Heparansulfat-Proteoglycan), Heparin und FGF-Farnilienmitgliedern, wie z.B. FGF-1 oder FGF-2, sowie die dadurch hervorgerufenen physiologischen, funktionellen, Proliferations- und Differenzierungsveränderungen von Zellen und/oder Zellverbänden zu verstehen. Beispiele solcher Aktivitäten finden sich bei Mongiat et al. (2001), J. Biol. Chem. 276: 10263-10271 und Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40247-53.
Unter „Menge an FGF-BP" werden sowohl FGF-BP Polypeptide als auch FGF- BP kodierende Nukleinsäuren verstanden, wobei beide gemeinsam oder einzeln umfasst sind.
Unter einer „verringerten Menge an FGF-BP" im Sinne vorliegender Erfindung, ist sowohl eine verringerte Expression an FGF-BP Polypeptiden und FGF-BP kodierende Nukleinsäuren als auch eine verringerte Aktivität von FGF-BP Polypeptiden zu verstehen. Der Begriff umfasst ebenfalls FGF-Polypeptide und für FGF-BP kodierende Nukleinsäuren gemeinsam und jedes einzeln für sich.
Der Begriff "funktionelle Varianten" eines Polypeptids im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst Polypeptide, die beispielsweise wie die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide während Hauterkrankungen, die mit erniedrigten Spiegeln an FGF-BP einhergehen, reguliert werden. 2122
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„Funktionelle Varianten" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. mindestens 70%, vorzugsweise ca. mindestens 80%, insbesondere ca. mindestens 90%, vor allem ca. mindestens 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäurese- quenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 aufweisen. Unter „Sequenzidentität" versteht man dabei die Übereinstimmung (= % Positive) zwischen zwei Sequenzen, die im Falle von Polypeptidsequenzen beispielsweise mittels BlastP 2.0.1 und im Falle von Polynukleotidsequenzen beispielsweise mit BLASTN 2.0.14 bestimmt wird, wobei der Filter=off gesetzt ist und BLOSUM 62 ist (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).
Beispiele solcher funktioneilen Varianten sind demnach die zu einem erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptid homologen Polypeptide, die aus anderen Organismen als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren wie z.B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele von funktioneilen Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus kodiert werden. Weitere Beispiele für funktionelle Varianten sind beispielsweise auch Polypeptide, die von einer FGF-BP kodierenden Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-hautspezifischem Gewebe, z.B. Embryonalgewebe, isoliert werden, jedoch nach Expression in einer an der Wundheilung beteiligten Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen.
Um festzustellen, ob es sich bei einem Polypeptid um eine funktionelle Variante eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids handelt, kann mittels funktionaler Tests die Aktivität des zu prüfenden Polypeptids mit der Aktivität eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids verglichen werden. Unter der Vorraus- setzung, dass das zu prüfende Polypeptid die Anforderungen an eine funktionelle Variante auf der Ebene der Sequenzidentität erfüllt, handelt es sich bei dem zu prüfenden Polypeptid dann um eine funktionelle Variante, wenn dessen Aktivität T EP03/02122
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im funktionalen Test mit der des erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids ähnlich oder identisch ausfällt.
Diese funktionalen Tests umfassen beispielsweise die Applikation eines Expressi- onsvektors, der eine das zu prüfende Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält oder die Applikation des zu prüfenden Polypeptids selbst (Beispiel 4) oder eines gegen das zu prüfende Polypeptid gerichteten Antikörpers oder eines Antisense- Oligonukleotids auf Wunden. Nach Inkubation, beispielsweise eines Expressionsvektors, wird der Fortgang der Wundheilung bei Gabe der unterschiedlichen Ex- pressionsvektoren, enthaltend entweder eine das zu prüfende Polypeptid kodierende Nukleinsäure oder eine das erfindungsgemäß verwendbare Polypeptid kodierende Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor ohne Insert verglichen. Diese funktionalen Tests können beispielsweise auch auf die Aktivität des zu prüfenden Polypeptids bei Störungen der Wundheilung, zum Beispiel bei schlecht hei- lenden, Dexamethason-behandelten oder diabetischen Wunden von Tieren, angewandt werden. So führte beispielsweise die Applikation von PDGF-A und PDGF- B Polypeptiden auf schlecht heilende Wunden von Kaninchen zu vergleichbarer Verbesserung der Wundheilung (Tyrone, JW et al. (2000) J. Surg. Res. 93:230- 236).
Funktionelle Varianten des Polypeptids können auch Teile des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge sein. Umfasst sind auch N- und/oder C-terminale und/oder interne Deletionen des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids im Bereich von ca. 1- 60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne dass die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird. Die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, dass diese synthetisch hergestellt werden. So kann das gesamte Polypeptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Teile der erfindungsgemäßen Polypep- tide eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.
Erfindungsgemäß verwendbare Polypeptide können nach allgemein bekannten rekombinanten Verfahren hergestellt werden. Dabei wird das Polypeptid beispielsweise durch Expression der Nukleinsäuren nach SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon in einem geeigneten Expressionssystem nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Diese Expressionssysteme werden weiter unten erläutert. Als Zellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzelllinie Lepidopteran, z.B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind. So konnte das erfindungsgemäße FGF-BP bereits erfolgreich in Sf-9 Insektenzellen exprimiert werden ((Beispiel 4) Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40247-53).
Weiterhin können erfindungsgemäß verwendbare Polypeptide aus einem Organismus oder aus Gewebe oder Zellen isoliert und erfmdungsgemäß verwendet werden. So ist es beispielsweise möglich, erfindungsgemäß verwendbare Polypep- tide aus Säugetiergewebe, beispielsweise aus Haut oder aus Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, Serum, Speichel, Synovialflüssigkeit oder Wundflüssigkeit aufzureinigen. Weiterhin können aus Zellen, die erfindungsgemäß verwendbare Polypeptide exprimieren, Zelllinien hergestellt werden, die dann zur Isolierung von erfmdungsgemäß verwendbaren Polypeptiden verwendet werden können. Beispielsweise können Expressionsvektoren, enthaltend die erfmdungsgemäß P T/EP03/02122
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verwendbaren Nukleinsäuren, in Hautzellen, beispielsweise HaCaT Zellen transformiert werden. Die Expression kann beispielsweise konstitutiv oder induzierbar sein. So konnte das erfϊndungsgemäße FGF-BP Protein bereits aus durch Zelllinien konditioniertem Medium bzw. aus bovinem Brustdrüsengeweben erfolgreich gereinigt werden (Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:16-778-85; Wang et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 46:81-87; Lametsch et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:19469-19474).
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung der erfmdungsgemäßen FGF-BP Polypeptide, wobei die Varianten von SEQ ID Nr. 1 und/oder 3 bzw. SEQ ID Nr. 2 und/oder 4 Fusionsproteine bzw. für Fusionsproteine kodierende Nukleinsäuren sind. Erfindungsgemäß verwendbare Fusionsproteine können beispielsweise hergestellt werden, indem erfmdungsgemäß verwendbare Nukleinsäuren in einer geeigneten Zelle exprimiert werden.
Die Fusionsproteine selbst weisen bereits die Funktion eines Polypeptids der Erfindung auf oder sind erst nach Abspaltung des Fusionsanteils funktioneil. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von ca. 1-300, vorzugsweise ca. 1-200, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden Aminosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z.B. aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können. Weiterhin können auch virale Peptidsequenzen, wie zum Beispiel vom Bakteriophagen M13 verwendet werden, um so Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "phage display"- Verfahren zu erzeugen.
Weitere bevorzugte Beispiele für Peptidsequenzen für erfindungsgemäß verwendbare Fusionsproteine sind Peptide, die die Detektion der Fusionsproteine erleichtern. Hierzu zählen beispielsweise „Green-fluorescent-protein" (WO 95/07463) oder funktionelle Varianten davon. Zur Aufreinigung der vorangehend beschriebenen Proteine kann ein weiteres/weiterer Polypeptid ("tag") angefügt sein. Erfindungsgemäße Protein-tags erlauben beispielsweise die hochaffine Adsorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschließend gezielte Elution des adsorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Protein-tags sind ein (His)6-tag, ein Myc-tag, ein FLAG-tag, ein Hämagglutinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts-Chitin-binding-tag oder Maltose-binding protein (MBP)-tag. Diese Protein-tags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.
Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4, die für ein isolierbares funktionelles erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Vorläufer, z.B. mit einer Signalsequenz, kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
Es ist bekannt, dass Veränderungen in der Sequenz der vorangehend beschriebe- nen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes oder dass nicht translatierte Sequenzen beispielsweise am 5'- und/oder 3 '-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne dass deren Aktivität wesentlich verändert wird. Auch können die unten näher beschriebenen Modifikationen durchgeführt werden. Diese Erfindung umfasst deshalb auch so genannte „Varianten" der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren.
Unter "Varianten" der Nukleinsäuren sind alle DNA-Sequenzen zu verstehen, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine im Wesentlichen gleiche Aktivität aufweisen wie das von der Referenzsequenz kodierte Polypeptid.
Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung beispielsweise bei 60°C in 2,5 x SSC- Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt, und stabil bleibt.
Varianten der Nukleinsäure können auch Teile der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure mit mindestens 8 Nukleotiden Länge, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden Länge, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden Länge, besonders bevorzugt mit mindestens 30 Nukleotiden, vorzugsweise bevorzugt mit mindestens 42 Nukleotiden sein.
Bevorzugterweise handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren um DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, besonders bevorzugt eine doppelsträngige DNA. Weiterhin kann die Sequenz der Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet sein, dass sie mindestens ein Intron und/oder eine polyA- Sequenz aufweist. Die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren können auch in Form ihrer antisense-Sequenz vorliegen.
Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in Tabelle 1 beschrie- benen DNA Sequenzen und/oder anhand der in Tabelle 1 ebenfalls beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z.B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z.B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews 90:543-584). Unter „Expression" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die in einem bestimmten Zelltyp vorhandene Menge an FGF-BP Polypeptiden und/oder FGF-BP kodierenden Nukleinsäuren zu verstehen.
Unter dem Begriff "Regulation" wird beispielsweise die Erhöhung oder Erniedrigung der Polypeptidmenge oder diese kodierende Nukleinsäure verstanden, wobei diese Änderung beispielsweise auf transkriptioneller, translationeller, posttranskriptioneller und posttranslationeller Ebene stattfinden kann.
Für die Expression des betreffenden Gens ist im Allgemeinen eine doppelsträngi- ge DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt bei Eukaryonten mit dem ersten in einer Kozak Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15:8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt. Bei Prokaryonten beginnt dieser Bereich mit einer ein paar Nukleotide oberhalb des Start-Codon liegenden konservierten Sequenz von 6 Nukleotiden, die so genannte Shine-Dalgarno Sequenz (Shine & Dalgarno, 1975, Eur. J. Biochem. 57:221-30).
Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z.B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22:5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z.B. Bac lovirus- Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z.B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40- Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Im Allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Zelle geeignete Promotoren, wie z.B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z.B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL 1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:2674-2682; Mumberg, supra) und den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetierzellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierbare, gewebespezifische, zellzyklusspezifische oder Metabolismus-spezifische Expres- sion in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und oder Repressorsequenzen.
Beispiele für geeignete Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten er- möglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase HI erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40-Promotor oder LTR-Promotoren z.B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214:228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HTV.
Vorzugsweise erfolgt die Expression von wundheilungsrelevanten Genen unter der Kontrolle von gewebespezifischen Promotoren, wobei hautspezifische Promotoren wie beispielsweise der humane K10 Promotor (Bailleul et al. (1990) Cell 62:697-708), der humane K14 Promotor (Vassar et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1563-67) oder der bovine Cytokeratin IV Promotor (Fuchs et al. (1988) The biology of wool and hair (Hrsg.: G.E. Rogers, et al.), S. 287-309. Chapman und Hall, London/New York) besonders zu bevorzugen sind. Weitere Beispiele für Elemente, die gewebespezifische Expression in Eukaryon- ten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen konstitutiv exprimiert werden.
Beispiele für Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5:516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25A, cdc25B, cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F-1 bis E2F-5, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6). Die Verwendung von zellzyklusregulier- ten Promotoren ist besonders bevorzugt in Fällen, in denen die Expression der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder Nukleinsäuren auf proliferieren- de Zellen beschränkt werden soll.
Beispiele für regulierbare Elemente, die Metabolismus-spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukose- mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die gleichzeitig eine räumlich und zeitlich begrenzte Expression erlauben, sind Nukleinsäuren, die für eine Fusion zwischen der Sequenz für die ortsspezifische Rekombinase Cre und einem modifizierten Östrogenrezeptor unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors kodieren. Das resultierende, gewebespezifische zytoplasmatische Fusionsprotein kann durch Gabe des Östrogenanalogs Tamoxifen in den Zellkern translozieren und Rekombinationen erzeugen, die zu veränderter Genexpression führen (Feil et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:10887-90). Um die Einführung der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren und damit die Expression des FGF-BP Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die für FGF- BP kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktionelle Varianten hiervon in Form eines Expressionsvektors, insbesondere eines gentherapeutisch wirksamen Vektors eingesetzt werden. In weiteren Beispielen kann die für FGF-BP kodierende Nukleinsäure in einem „Shuttle" Vektor, Phage id, Cosmid, Plasmid oder als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.
Vorzugsweise enthält ein gentherapeutisch wirksamer Vektor wund- bzw. hautspezifische regulatorische Sequenzen, die funktioneil mit der vorangehend beschriebenen Nukleinsäure verbunden sind.
Für die gentherapeutische Anwendung der vorangehend beschriebenen Nuklein- säure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3 '-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Beispiel 3; Palmiter et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:478-482 ; Jackson (1993) Cell 74:9-14). „^ ,
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Unter einem „gen therapeutischen Vektor" im Sinne der vorliegenden Erfindung, ist eine Nukleinsäure zu verstehen, in die eine erfindungsgemäß verwendbare Nukleinsäure integriert werden kann und die anschließend in eine Zelle eingeschleust wird und in dieser die fehlende oder defekte Expression der erfindungs- gemäßen Nukleinsäure ergänzt oder ersetzt.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Adenovirusvektoren oder retroviralen Vektoren (Lindemann et al. (1997), Mol. Med. 3:466-76; Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2:549-58). Euka- ryotische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeutische Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation in Hautzellen eindringen kann (Hengge et al. (1996) J. Clin. Invest. 97:2911-6; Yu et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:370-5).
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, dass man die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension herstellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, dass eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Feigner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (l,2-Dioleyloxpropyl-3- trimethylammoniumbromid) und DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz bei der Transfektion verschiedener Zelllinien getestet (Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6982-6986; Gao und Huang (1991), Biochim. Bi- ophys. Acta 1189:195-203; Feigner et al. (1994) J. Biol. Chem. 2692550-2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[l-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwanz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17:784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8:213) oder beispielswei- se Liposomen (Uhlmann und Peymann (1990) supra).
Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren lässt sich dadurch erhalten, dass man die vorangehend beschriebene Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der so genannten "Gene Gun" in Ge- webe, bevorzugt in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting et al. (1998) J. invest. Dermatol. 111:183-8 ).
Eine weitere Ausführungsform eines gentherapeutisch wirksamen erfindungsgemäß verwendbaren Vektors lässt sich durch das Einbringen von "nackten" Ex- pressionsvektoren in eine biokompatible Matrix, beispielsweise eine Kollagenmatrix, herstellen. Diese Matrix kann in Wunden eingebracht werden, um die einwandernden Zellen mit dem Expressionsvektor zu transfizieren und die erf - dungsgemäßen Polypeptide in den Zellen zu exprimieren (Goldstein und Banadio, US 5,962,427).
Die Therapie von Wundheilungsstörungen, insbesondere diabetes-assoziierten Wunden, kann auf herkömmliche Weise, z.B. durch Verbände, Pflaster, Kompressen oder Gele erfolgen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. So ist es möglich, die geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie z.B. physiologische Koch- Salzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z.B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs etc., enthaltenden Arzneimittel topisch und lokal zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen. Die Verabreichung der er- findungsgemäßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Lipo- somenkomplexen bzw. Goldpartikelkomplexen ebenfalls topisch und lokal im Bereich der Wunde erfolgen. Weiterhin kann die Behandlung mittels eines transdermalen therapeutischen Systems (TTS) erfolgen, das eine zeitlich gesteuerte Abgabe der erfindungsgemäß verwendbaren Arzneimittel ermöglicht. Die Be- handlung mittels der erfindungsgemäß verwendbaren Arzneimittel kann aber auch über orale Dosierungsformen, wie z.B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Beispiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implantierten Dispositorien erfolgen. TTS sind zum Beispiel aus den EP 0 944398, EP 0916336, EP 0889723 oder EP 0852493 bekannt.
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die beschriebenen Nukleinsäuren in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeuti- sehe Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8, insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z.B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.
Die Verabreichung der beschriebenen Nukleinsäuren gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen Virusvektoren oder als Liposomenkomplexe bzw. Goldpartikelkomplex erfolgt üblicherweise topisch und lokal im Bereich der Wunde. Eine bevorzugte Ausführungsform eines Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, das Polypeptid selbst mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z.B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z.B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen (Beispiel 4). Diese Ausführungsform ist besonders viel versprechend bei vorliegender Erfindung, da es sich beim FGF-BP Polypeptid um ein sezerniertes Protein handelt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Arzneimittels gemäß vorliegender Erfindung besteht in der Verwendung eines gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid gerichteten Antikörpers, der die Aktivität des FGF-BP steigert oder unterstützt. Beispielsweise könnte ein solcher Antikörper die Freiset- zung von FGF positiv beeinflussen und zur Behandlung und Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, beitragen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Arzneimittels gemäß der vorlie- genden Erfindung besteht in der Transplantation autologer oder allogener Zellen, die das erfindungsgemäße FGF-BP Polypeptid exprimieren und sezemieren, mit Hilfe eines geeigneten Trägermaterials, z.B. so genannte Microcarrier, die aus biokompatiblen Materialien, wie beispielsweise einer Dextranmatrix, bestehen (US 5,980,888).
Ein weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zelle, die mit einem erfindungsgemäß verwendbaren Vektor oder knock-out Genkonstrukt zur Diagnose und/oder Behandlung und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden, sowie zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen transformiert ist. Zellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Zellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.
Zellen, die ein erfindungsgemäßes FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon oder gegen erfindungsgemäße FGF-BP Polypeptide oder funktionelle Varianten davon gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente exprimieren sind z.B. humane, nicht-embryonale, autologe oder allogene Zellen. Bevorzugt handelt es sich bei den genannten Zellen um Hautzellen, insbesondere Keratinozy- ten, Fibroblasten oder Endothelzellen.
Ein besonders bevorzugte erfindungsgemäß verwendbare transformierte Zelle ist eine transgene embryonale nicht-menschliche Stammzelle, die dadurch gekenn- zeichnet ist, dass sie mindestens ein erfindungsgemäß verwendbares knock-out Genkonstrukt und oder mindestens eine erfindungsgemäß verwendbare Expressionskassette, wie vorangehend beschrieben, enthält. Verfahren zur Transformation von Zellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel Elektroporation oder Mikroinjektion.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform gemäß vorliegender Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein erfindungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid exprimierenden Zelle zur Identifizierung pharmakologisch aktiver Substanzen, die die Funktion und/oder die Expression des FGF-BP Polypeptids und/oder einer für FGF-BP Polypeptid kodie- renden Nukleinsäure steigern zur Behandlung und/oder Prävention von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind. Die genannten pharmakologisch aktiven Substanzen können organische und anorganische Substanzen sein, die die Aktivität und/oder die Expression des FGF-BP Proteins und/oder DNA modulieren, insbesondere aktivieren. Die Verwendung dieser organischen oder anorganischen pharmakologisch aktiven Substanzen als Arzneimittel kann durch Applikation wie oben beschrieben erfolgen. Beispiele solcher aktivierender Substanzen finden sich bei Harris et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:10802-10811.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 oder einer funktionellen Variante davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein erfin- dungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid exprimierenden Zelle, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung eines Tests zur Auffindung von pharmakologisch aktiven Substanzen in Zusammenhang mit Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden.
Unter dem Begriff "pharmakologisch aktive Substanzen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammen- Setzungen und Stoffgemische zu verstehen, die mit den vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, Polypeptiden, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, unter geeigneten Bedingungen in Wechselwirkung treten können. Mögliche pharmakologisch aktive Substanzen sind einfache chemische organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, können aber auch Nukleinsäuren, Peptide, Proteine oder Komplexe davon umfassen. Die pharmakologisch aktiven Substanzen können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Funktion(en) der Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikörper in vivo oder in vitro beeinflussen oder auch nur an die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, Polypeptide, Antikörper oder Antikörperfragmente binden oder mit ihnen andere Wechselwirkungen kovalenter oder nicht- kovalenter Weise eingehen. Beispiele pharmakologisch aktiver Substanzen sind weiterhin organische Moleküle, die Substanzbibliotheken entstammen, die auf ihre pharmakologische Aktivität hin überprüft wurden.
Bevorzugte pharmakologisch aktive Substanzen gemäß vorliegender Erfindung sind solche, die aktivierend wirken.
In einer Ausführungsform umfassen die Tests zur Auffindung von pharmakolo- gisch aktiven Substanzen des erfindungsgemäßen FGF-BP Assays, die die Expression von Genen beeinflussen und dem Fachmann allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Sivaraja et al. (2001) US 6,183,956). So können Zellen, die FGF-BP exprimieren, beispielsweise Hautzellen, als Testsystem zur Analyse der Genexpression in vitro kultiviert werden, wobei Keratinozyten, Fibroblasten oder Endothelzellen zu bevorzugen sind. Ein mögliches Testsystem stellt dabei die menschliche Keratinozyten-Zelllinie HaCaT dar, die allgemein erhältlich ist. Die Analyse der Genexpression erfolgt beispielsweise auf der Ebene der mRNA oder der Proteine. Dabei wird die Menge an FGF-BP mRNA und/oder Protein nach Zugabe einer oder mehrerer Substanzen zur Zellkultur gemessen und mit der ent- sprechenden Menge in einer Kontrollkultur verglichen. Dies geschieht beispielsweise mit Hilfe von Hybridisierung einer antisense Sonde, mit der im Lysat der Zellen enthaltenen mRNA eines erfindungsgemäßen FGF-BP. Dabei kann die Hybridisierung beispielsweise über die Bindung eines spezifischen Antikörpers an den mRNA-Sondenkomplex quantifiziert werden (siehe Stuart & Frank, 1998, US 4,732,847). Dabei ist es möglich, die Analyse im Hochdurchsatzverfahren durch- zuführen und sehr viele Substanzen auf ihre Eignung als Modulator der Expression von FGF-BP zu analysieren (Sivaraja et al. (2001) US 6,183,956). Die zu analysierenden Substanzen können dabei aus Substanzbibliotheken (siehe z.B. DE 19816414, DE 19619373) entnommen werden, die mehrere tausend, oft sehr hete- rogene Substanzen enthalten können. Alternativ kann zunächst die Gesamt-RNA oder -mRNA aus Zellen isoliert werden und anschließend die absolute Menge oder der relative Anteil der mRNA von FGF-BP beispielsweise mit Hilfe der quantitativen RT-PCR (siehe EP 0 200 362; Wittwer , 1997, Bio Techniques 22:130-138; Morrison et al. (1998) Bio Techniques 24:954-62) oder des RNase Protection Assays (siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:A Labo- ratary Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 7; EP 0 063 879) bestimmt werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Analyse der Proteinmenge im Zelllysat mit Antikörpern dar, die spezifisch FGF-BP erkennen. Hier kann die Quantifizierung beispielsweise mit Hilfe eines ELISAs oder einer Westem Blots erfolgen, die allgemein bekannt sind. Um die Spezifität der Substanzen auf die Expression von FGF-BP zu vergleichen, kann der Einfluss der Substanzen auf die Expression des FGF-BP mit dem Einfluss auf die Expression anderer Gene, wie beispielsweise Gene des Stoffwechsels wie GAPDH oder Cyclophilin, verglichen werden. Besonders zu bevorzugen sind Assays, die geeignet sind Substanzen zu identifizieren, die die Expression von einem oder mehreren Kontrollgenen, wie beispielsweise GAPDH oder Cyclophilin, möglichst wenig beeinflussen (siehe z.B. WO 00/05416).
Eine weitere Ausführung vorliegender Erfindung betrifft die Verwendung von FGF-BP Polypeptiden zur Identifizierung pharmakologisch aktiver Substanzen, die die Aktivität von FGF-BP erhöhen, mit Hilfe von Screening- Verfahren. So gibt es beispielsweise das sogenannten "Two-Hybrid System" (Fields und Sternglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas und Brent, 1998 TB3TECH, 16, 355-363). Bei diesem Test werden Zellen mit Expressionsvektoren transfor- miert, die Fusionsproteine aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einer DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise Gal4 oder LexA exprimieren. Die transformierten Zellen enthalten außerdem ein Reportergen, dessen Promotor Bindungsstellen für die entsprechende DNA Bindungsdomäne enthalten. Durch Transformation eines weiteren Expressionsvektors, der ein zweites Fusionsprotein aus einem bekannten bzw. unbekannten Polypeptid mit einer Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Gal4 oder Herpes simplex Virus VP16 exprimiert, kann die Expression des Reportergens stark gesteigert werden, wenn das zweite Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid inter- agiert. Diese Expressionssteigerung kann man ausnutzen, um neue pharmakolo- gisch aktive Substanzen zu identifizieren, beispielsweise indem man zur Konstruktion des zweiten Fusionsproteins eine cDNA-Bibliothek aus sich regenerierendem Gewebe herstellt. Zudem lässt sich dieses Testsystem zur Rasteruntersuchung von Substanzen ausnutzen, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem Interaktor inhibieren. Solche Substanzen verrin- gern die Expression des Reportergens in Zellen, die Fusionsproteine des erfin- dungsgemäßen Polypeptids und der pharmakologisch aktiven Substanz exprimieren (Vidal und Endoh, 1999, Trends in Biotechnology, 17:374-81). So lassen sich schnell neue Wirkstoffe identifizieren, die zur Therapie von Störungen regenerativer Prozesse eingesetzt werden können. Die erfolgreiche Verwendung des erfin- dungsgemäßen FGF-BP in „Two-Hybrid"- Systemen wurde durch das „Fischen" des FGF-BP aus einer Keratinozyten -Bibliothek mit Perlecan als „Köder" bereits gezeigt (Mongiat et al, 2001, J. Biol. Chem. 276:10263-10271).
Ein bevorzugte Ausführungsform dieser erfindungsgemäß verwendbaren Testsys- teme besteht in der Verwendung von z.B. HaCaT-Zellen, die allgemein erhältlich sind, und des Expressionsvektors pCMV4 (Anderson et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:8222-9). Eine FGF-BP kodierende Nukleinsäure kann dabei sowohl in sense als auch in antisense Orientierung in die Expressionsvektoren integriert werden, so dass die funktionelle Konzentration an mRNA der entsprechenden Gene in den Zellen entweder erhöht, oder durch Hybridisierung mit der antisense-RNA ernied- T EP03/02122
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rigt wird. Nach der Transformation und Selektion stabiler Transformanden zeigen die Zellen in Kultur im Allgemeinen ein verändertes Proliferations-, Migrationsund/oder Differenzierungs verhalten im Vergleich zu Kontrollzellen. Dieses Verhalten in vitro ist häufig mit der Funktion der entsprechenden Gene bei regenera- tiven Prozessen im Organismus korreliert (Yu et al. (1997) Arch. Dermatol. Res. 289:352-9; Mils et al. (1997) Oncogene 14:15555-61; Charvat et al. (1998), Exp. Dermatol. 7:184-90; Werner (1998) Cytokine Growth Factor Rev. 9:153-65; Mythily et al. (1999) J. Gen. Virol. 80:1707-13) und lässt sich mit einfachen und schnell durchzuführenden Tests nachweisen, so dass man darauf basierend Test- Systeme für pharmakologisch aktive Substanzen aufbauen kann. So lässt sich das Proliferationsverhalten von Zellen sehr schnell durch z.B. den Einbau von markierten Nukleotiden in die DNA der Zellen (siehe z.B. Savino und Dardenne, 1985, J. immunol. Methods 85:221-6; Perros und Weightman, 1991, Cell Prolif. 24:517-23; de Fries und Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Anal. 9:89-95), durch Anfärbung der Zellen mit spezifischen Farbstoffen (Schulz et al. (1994) J. Immunol. Methods 167:1-13) oder über immunologische Verfahren (Frahm et al. (1998) J. Immunol. Methods 211:43-50) nachweisen. Die Migration lässt sich einfach durch den "Migration Index" Test (Charvat et al., supra) und vergleichbare Testsysteme (Benestad et al. (1987) Cell Tissue Kinet. 20:109-19, Junger et al. (1993) J. Immunol. Methods 160:73-9) nachweisen. Als Differenzierungsmarker eignen sich z.B. Keratin 6, 10 und 14 sowie Loricrin und Involucrin (Rosenthal et al. (1992) J. Invest. Dermatol. 98:343-50), deren Expression z.B. über allgemein erhältliche Antikörper leicht nachzuweisen ist. Die auf diese Weise identifizierten Veränderungen der Zellaktivitäten gegenüber einem Kontrollexperiment, bei dem Zellen beispielsweise mit einem leeren Expressionsvektor transfiziert wurden, können genutzt werden, um die Effizienz von Modulatoren zu untersuchen.
Weiterhin kann ein Testsystem darauf beruhen, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten davon, oder gegen erfindungsge- T EP03/02122
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maß verwendbare Polypeptide oder funktionelle Varianten davon gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente an eine Festphase gebunden sind und mindestens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität, beispielsweise Bindung oder Änderung der Konformation, hin untersucht wird, getestet werden. Geeignete Systeme wie die Affinitätschromatographie und Fluoreszenzspektroskopie sind dem Fachmann bekannt. So konnte eine Bindung zwischen einem erfindungsgemäßen FGF-BP und Heparin mit Hilfe von Heparin-Kupfer Affinitätschroma- topraphie bereits erfolgreich gezeigt werden (Wang et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 46:81-87).
Die Festphasen-gebundenen erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide oder funktioneilen Varianten davon oder diese kodierende Nukleinsäuren oder eine Variante davon oder gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente können auch Teil eines Arrays sein. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 bekannt. Diese Arrays können ebenfalls mit Substanzen oder Substanzbibliotheken in Kontakt gebracht werden und auf Interaktion, beispielsweise Bindung oder Konformationsänderung, getestet werden.
So kann beispielsweise eine zu testende Substanz einen detektierbaren Marker enthalten, beispielsweise kann die Substanz radioaktiv markiert, Fluoreszenzmarkiert oder Lumineszenz-markiert sein. Weiterhin können Substanzen an Proteine gekoppelt werden, die eine indirekte Detektion erlauben, beispielsweise über enzymatische Katalyse mittels eines Peroxidase-Assays mit einem chromogenen Substrat oder durch Bindung eines detektierbaren Antikörpers. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Array-gebundenen Proteinkomplexe per Mas- senspekrometrie zu untersuchen (SELDI). Änderungen der Konformation eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids durch Interaktion mit einer Testsub- stanz können beispielsweise durch Änderung der Fluoreszenz eines endogenen Tryptophanrestes im Polypeptid nachgewiesen werden. So konnte mit Hilfe von SELDI die Interaktion des erfindungsgemäßen FGF-BP mit bFGF nachgewiesen und anschießend in einem radioaktiven ELISA quantifiziert werden (Tassi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40247-53).
Pharmakologisch aktive Substanzen der erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide können auch Nukleinsäuren sein, die über Selektionsverfahren, wie beispielsweise SELEX (siehe Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-50; Klug und Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20:97-107; Toole et al. (1996) US 5,582,981) isoliert werden. Im SELEX- Verfahren werden typischerweise aus einem großen Pool unterschiedlicher, einzelsträngiger RNA Moleküle durch wiederholte Ampli- fikation und Selektion diejenigen Moleküle isoliert, die an ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid mit hoher Affinität binden (Aptamere). Aptamere können auch in ihrer spiegelbildlichen Form, beispielsweise als L-Ribonukleotid, syn- thetisiert und selektioniert werden (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:1112-5). So isolierte Formen haben den Vorteil, dass sie nicht von natürlich vorkommenden Ribonukleasen abgebaut werden und daher größere Stabilität besitzen.
Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so dass über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (Beigelman et al. (1995) Nu- cleic Acids Res. 23:3989-94; Dudycz (1995) WO 95/11910; Macadam et al. (1998) WO 98/37240; Reese et al. (1997) WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung einer oder mehrerer Internukleo- tid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht- Phosphor-Internukleotide erhalten werden. Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefasst (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; Dudycz (1995) WO 95/11910; Macadam et al. (1998) WO 98/37240; Reese et al. (1997) WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid- Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphoro- dithioat und/oder Phosphatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid- Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, dass diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besteht auch die Möglichkeit mit Hilfe des Einsatzes von antisense Oligonukleotiden (Zheng und Kernen y, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100:380-2; Nellen und Lichtenstein, 1993, Trends Biochem. Sei. 18:419-23; Stein (1992) Leukemia 6:967-74) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. (1998) Cell. Mol. Life Sei. 54:1175-202; Vaish, et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol. 15:921-2; Couture und Stinch- comb (1996) Trends Genet. 12:510-5) die Stabilität von Nukleinsäuren zu verringern und/oder die Translation von Nukleinsäuren zu inhibieren. So kann durch die erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuresequenzen beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligo- nukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt. Die Auswirkungen der Modulation eines erfindungsgemäß verwendbaren FGF- BP oder der erfindungsgemäß verwendbaren, identifizierten pharmakologisch aktiven Substanzen können durch verschiedene Testsysteme, die die Aktivität der Zellen und Zellverbände in vitro und in vivo bestimmen, untersucht werden.
Weiterhin können die das erfindungsgemäße FGF-BP kodierenden Nukleinsäuren in „knock-out" Genkonstrukten oder Expressionskassetten enthalten sein. Solche Knock-out Genkonstrukte sind dem Fachmann zum Beispiel aus den US-Patenten 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt.
Transgene nicht-menschliche Säugetiere, deren Genom mindestens ein erfindungsgemäß verwendbares „knock-out" Genkonstrukt und/oder mindestens eine erfindungsgemäß verwendbare Expressionskassette wie vorangehend beschrieben enthalten, können zur Diagnose und/oder Prävention und/oder Behandlung von Wundheilungsstörungen, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden oder zur I- dentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, verwendet werden. Transgene Tiere, die eine der vorangehend beschriebenen Expressionskassetten enthalten, zeigen in Abhängigkeit des verwendeten Promotors im allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression der Nukleinsäuren und/oder Polypepti- de und lassen sich zur Analyse von Wundheilungsstörungen verwenden. So weist beispielsweise eine Activin A transgene Maus eine verbesserte Wundheilung auf (Münz et al. (1999) EMBO J. 18:5205-15) während eine transgene Maus mit dominant negativem KGF Rezeptor eine verzögerte Wundheilung aufweist (Werner et al. (1994) Science 266:819-22). Darüber hinaus können vorangehend beschrie- bene transgene Tiere mit beschleunigter Wundheilung ausgestattet werden.
Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen, sind dem Fachmann ebenfalls aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 be- kannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von Expressionsvektoren (s.o.) in Embryonen oder Spermatozyten, über die Transfek- tion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen (Polites und Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Produktion, Seite 15 bis 68 in Pin- kert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, Seite 115 bis 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, Seite 147 bis 176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfere Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177 bis 220 in Pinkert, 1994, supra) oder über Isolation von Zellkernen aus differenzierten somati- sche Zellen, beispielsweise Fibroblasten, und anschliessendem Transfer in entkernte Oozyten (Mc Creath et al. (2000) Nature 405:1004-5) erzeugt werden können.
Werden die vorangehend beschriebenen erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren in sogenannte „Targeting" Vektoren oder „knock-out" Genkonstrukte integriert (Pinkert, 1994, supra), können nach Transfektion von embryonalen Stammzellen und homologer Rekombination beispielsweise knock-out Mäuse generiert werden, die im allgemeinen als heterozygote Mäuse verringerte Expression der Nukleinsäure zeigen, während homozygote Mäuse keine Expression der Nukleinsäure mehr aufweisen. Auch die so erzeugten Tiere lassen sich zur Analyse von Wundheilungsstörungen verwenden. So weisen beispielsweise die eNOS- (Lee et al. (1999) Am. J. Physiol. 277:H1600-H1608), Nf-1 (Atit et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:835-42) und Osteopontin (Liaw et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:967-71) knock-out Mäuse eine verschlechterte Wundheilung auf. Auch hier ist eine gewebespezifische Reduktion der Expression wundheilungsrelevanter Gene, beispielsweise in hautspezifischen Zellen unter Verwendung des Cre-loxP Systems (stat3 knock-out, Sano et al. (1999) EMBO J. 18:4657-68), besonders zu bevorzugen. So erzeugte transgene und knock-out Zellen oder Tiere des erfin- 2122
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dungsgemäßen FGF-BP Proteins können beispielsweise auch zur Rasteruntersuchung (Screening), zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen bzw. zum Austesten der Modulationseffizienz gentherapeutisch aktiver Vektoren verwendet werden.
Die mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendbaren Testverfahren identifizierten pharmakologisch aktiven Substanzen können, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung eines Di- agnostikums oder Arzneimittels zur Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, eingesetzt werden, insbesondere bei diabetes-assoziierten, schlecht heilenden Wunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäß verwendbaren FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder für FGF-BP Polypeptid kodierende Nukleinsäuren gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder eine Variante davon, oder gegen ein erfindungsgemäß verwendbares FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid exprimierenden Zelle, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung eines Di- agnostikums zur Diagnose von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden.
Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung anhand einer der beschriebenen Nukleinsäuren ein Diagnostikum auf der Basis der Polymeraseketten- reaktion (Beispiele 1 und 2, PCR-Diagnostik, z.B. gemäß EP 0 200 362) oder eines RNase-Protection-Assays (siehe z.B. Sambrook et al., supra Kapitel 7, Seite 7.71-7.78; Werner et al. (1992) Growth Factors and Receptors: A Practical Ap- proach 175-197; Werner (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:6896-6900) hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung einer Nukleinsäure mit ihrem komplementären Gegenstrang, üblicherweise der entspre- chenden mRNA oder ihrer cDNA. Die erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren können hierbei auch modifiziert sein, wie z.B. in EP 0 063 879 offenbart. Vorzugsweise wird ein solches DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z.B. radioaktiv mit ß- P-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin oder Digoxigenin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vor- zugsweise vorher an geeignete Membranen aus z.B. Nitrocellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde. Alternativ kann die Bestimmung der mRNA Menge auch direkt in Gewebeschnitten mit Hilfe der in situ Hybridisierung (siehe z.B. Werner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89:6896-900) erfolgen.
Mit Hilfe eines erfindungsgemäß verwendbaren Diagnostikums kann in vitro die Expressionsstärke des jeweiligen Gens in einer Gewebeprobe spezifisch gemessen werden, um beispielsweise eine Wundheilungsstörung sicher diagnostizieren zu können (Tabelle 3). Insbesondere eignet sich ein solches Verfahren zur frühzeitigen Prognose von Störungen bzw. zur Ermittlung einer Prädispositionen für die Entstehung einer Wundheilungsstörung, gekennzeichnet durch eine verringerte Menge an FGF-BP, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden.
Ein erfindungsgemäß verwendbares Diagnostikum zur Diagnose von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, umfasst beispielsweise die Verwendung mindestens einer für FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Variante hiervon kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 und/oder funktioneller Varianten hiervon als Sonde, vorzugsweise als DNA-Sonde und/oder als Primer. Eine Sonde im Sinne der vorliegenden Erfin- dung ist ein definiertes DNA oder RNA Fragment, welches radioaktiv oder chemisch markiert ist und zur Lokalisierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung verwendet wird. Ein Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine kurze DNA Sequenz, die eine freie 3' Hydroxylgruppe enthält und an einen Komplementärstrang bindet. Der Primer ist dann Ausgangspunkt für die Kopie des Komplementärstranges. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, die beschriebenen Nukleinsäuren, zum Beispiel durch die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer wundspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde zu erhalten (siehe z.B. J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Kapitel 8 Seite 8.1 bis 8.81, Kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und Kapitel 10 Seite 10.1 bis 10.67).
Als Sonde eignen sich beispielsweise DNA- oder RNA-Fragmente mit einer Län- ge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden, deren Sequenz gemäß der SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in Tabelle 1 angegebenen Datenbankeinträge abgeleitet werden kann.
Alternativ können anhand der abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen Oligonukleotide synthetisiert werden, die sich als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion eignen. Mit diesen können die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren oder Teile dieser aus cDNA, beispielsweise wundspezifischer cDNA, amplifiziert und isoliert werden (Beispiele 1 und 2). Als Primer eignen sich beispielsweise DNA- Fragmente mit einer Länge von ca. 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 15 bis 50 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 20 bis 30 Nukleotiden deren Sequenz aus den der SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in der Tabelle 1 angegebenen Datenbankeinträge abgeleitet werden kann. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder mo- noklonalen Antikörpers oder Antikörperfragments zur Analyse, Diagnose, von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, sowie seine Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper produzierender Organismus mit einem erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptid immunisiert wird.
Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid in einer verringerten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Erkrankung, insbesondere von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetes-assoziierte Wunden, zu erhalten. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.
Auch kann beispielsweise die lokale Injektion von monoklonalen Antikörpern gegen TGF beta 1 im Tiermodell die Wundheilung verbessern (Ernst et al. (1996) Gut 39:172-5).
Das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder funktioneller Varianten davon, vorzugsweise mit Teilen davon, mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge, gegebenenfalls in Anwesenheit von z.B. Freund's Adjuvans und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z.B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z.B. über Säulenchromatographie reinigen. Monoklo- nale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden. Als Alternative zu den klassischen Antikörpern können beispielsweise auf Lipocalin basierende sogenannte „Anticaline" verwendet werden (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:1898-1903). Die natürlichen Liganden- bindenden "Sites" der Lipocaline, wie z.B. das Retinol-bindende Protein oder das Bilin-bindende Protein können beispielsweise durch einen „kombinatorischen Protein Design" Ansatz in einer Weise verändert werden, dass sie an ausgewählte Haptene, beispielsweise an die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta 1482:337-50). Weitere bekannte „scaffolds" als Alternativen für Antikörper für die molekulare Erkennung sind bekannt (Skerra, J. Mol. Recognit., 2000, 13:167-187).
Der erfindungsgemäß verwendbare Antikörper oder das Antikörperfragment sind gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist und reagieren spezifisch mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Kopplung an geeignete Trä- ger, wie z.B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immuno- genität gesteigert werden können. Dieser erfindungsgemäß verwendbare Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff Antikörper oder Antikörperfragment versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenen- falls modifizierte Antikörper bzw. anti genbindende Teile davon, wie z.B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oli- gospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)2- Fragmente (siehe z.B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884). So wurden Antikörper gegen das erfin- dungsgemäße FGF-BP bereits erfolgreich hergestellt und verwendet (Liu et al. (2001) Kidney Int., 59:1717-1728; Sauter et al. (2001) Int. J. Cancer 92:374-381).
Um pharmakologisch aktive Substanzen als Diagnostikum zu verwenden, können die Substanzen einen detektierbaren Marker enthalten, beispielsweise kann die Substanz radioaktiv markiert, Fluoreszenz-markiert oder Lumineszenz-markiert sein. Weiterhin können Substanzen an Enzyme gekoppelt werden, die eine indirekte Detektion erlauben, beispielsweise wie oben beschrieben über enzymatische Katalyse mittels eines Peroxidase-Assays mit einem chromogenen Substrat oder durch Bindung eines markierten oder detektierbaren Antikörpers. Die Substanzen können dann mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden und so die Menge eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids oder einer funk- tionellen Variante davon oder dieses kodierende Nukleinsäure oder einer Variante davon, oder einer ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid oder einer funk- tionellen Variante davon oder einer dieses kodierende Nukleinsäure oder eine Variante davon exprimierenden Zelle oder eines gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid gerichteten Antikörpers oder eines Antikörperfragments in der Probe bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Probe, die einem zu untersuchenden Organismus entstammt, kann dann verglichen werden mit dem Ergebnis einer Probe, die einem gesunden oder kranken Organismus entstammt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids oder einer funktionellen Variante davon oder dieses kodierende Nukleinsäure oder eine Variante davon oder eines gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid oder eine funktionelle Vari- ante davon gerichteten Antikörpers oder eines Antikörperfragments, gegebenen- falls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Wundheilungsstörungen, die durch einen Mangel an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere diabetes-assoziierte, schlecht heilende Wunden.
Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 bekannt.
Zur Analyse in Zusammenhang mit Wundheilungsstörungen, die durch eine ver- ringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere von diabetes- assoziierte Wunden, können beispielsweise auch DNA-Chips und/oder Protein- Chips, die mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid und/oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, umfassen. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 be- kannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodie- renden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 4 oder funktioneller Varianten davon und/oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon exprimierenden Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von dia- betes-assoziierten Wundheilungsstörungen oder zur Diagnose von diabetes- assoziierten Wundheilungsstörungen.
Die für FGF-BP kodierende Nukleinsäure oder funktionelle Varianten kann dabei in Form eines Expressionsvektors, insbesondere eines gentherapeutisch wirksa- men Vektors, eingesetzt werden. Wird FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon verwendet, so handelt es sich vorzugsweise um ein rekombinantes Polypeptid, das idealerweise aus Bakterien wie E. coli, Hefen wie S. cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe oder Viren, insbesondere Baculoviren gewon- nen wird.
Das als Medikament oder Therapeutikum/ Arzneimittel verwendete FGF-BP Polypeptid, die für FGF-BP kodierende Nukleinsäure, der gegen das FGF-BP Polypeptid gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente werden systemisch oder lokal verabreicht, insbesondere lokal in die Wunde eingebracht und/oder topisch aufgetragen. Auch können das FGF-BP Polypeptid, die für FGF-BP kodierende Nukleinsäure, der gegen das FGF-BP Polypeptid gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente als auch deren Varianten und Derivate vorbeugend auf die nicht durch eine Wunde geschädigte Haut von Diabetespatienten aufgebracht werden, beispielsweise in Form einer geeigneten Salbe, Lotion, Öl oder Creme, um diabetes-assoziierten Wunden vorzubeugen.
Die diabetes-assoziierte Wunde ist besonders bevorzugt eine schlecht heilende Wunde, insbesondere ein diabetischer Ulkus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Wundheilungsstörungen, insbesondere diabetes-assoziierten Wundheilungsstörungen, die nicht notwendigerweise durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind. Das Verfahren umfasst den Schritt (i) Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge an FGF-BP Polypeptid, einer für FGF-BP kodie- renden Nukleinsäure, und/oder einen gegen ein FGF-BP gerichteten Antikörper oder Antikörperfragment an einen Patienten. Gegebenenfalls kann vor oder nach dem Verabreichen die Menge an FGF-BP in einer Wunde oder am Wundrand bestimmt werden.
Alle oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen sind auf das Verfahren anwendbar.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Tabellen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
TabeUen
Tabelle 1 zeigt die Auflistung der erfindungsgemäß verwendbaren FGF-BP Polypeptide und Nukleinsäuren.
Tabelle 2 zeigt die mittels „Taq-Man"-Analyse bestimmte Kinetik der diffe- renziellen Regulation der FGF-BP Expression bei der Wundheilung normaler und diabetischer Mäuse als Beispiel für eine Wundheilungsstörung, die mit einem Mangel an FGF-BP im Zusammenhang steht.
Tabelle 3 zeigt die mittels „Taq-Man"-Analyse bestimmte differenzielle Re- gulation der FGF-BP Expression in drei verschiedenen Wundhei- lungszuständen des Menschen im Vergleich (normale Wundheilung, venöser und diabetischer Ulkus) als Beispiel für die selektiv bei diabetischen Patienten auftretende Prädisposition für eine Wundheilungsstörung, die durch einen Mangel an FGF-BP verur- sacht wird.
Tabelle 4 zeigt Ergebnisse von Zerrißfestigkeitsmessungen, die an mit FGF- BP Expressionsplasmid behandelten Wunden an diabetischen Ratten durchgeführt werden. Tabelle 5 zeigt Ergebnisse von Zerrißfestigkeitsmessungen, die an mit FGF- BP Polypeptid behandelten Wunden an diabetischen Ratten durchgeführt werden.
Die Polypepüdsequenzen des murinen und humanen FGF-BP, sowie deren kodierende Nukleotidsequenzen sind gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 aufgeführt.
Die für die Beispiele verwendeten Oligonukleotide sind gemäß SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 12 aufgeführt.
Beispiele
Beispiel 1: Differenzielle Expression der FGF-BP mRNA in humanen Biopsien aus gesunder Haut und Wunden von gesunden Probanden, sowie Biopsien venö- ser und diabetischer Ulzera
In einem ersten Experiment sollte untersucht werden, inwieweit die Expression von FGF-BP in verschiedenen Wundheilungserkrankungen reguliert ist. Dazu wurden von 6 gesunden Probanden aus unbehandelter intakter Haut, aus Wunden 1 Stunde nach Wundsetzung, aus Tag 1- Wunden, sowie aus Tag 5- und Tag 15- Wunden mittels 4 mm bzw. 6 mm Stanzen Hautproben entnommen und Biopsien jedes Zeitpunktes gepoolt. Außerdem wurde von 6 Patienten mit chronischen venösen Ulzera, sowie von 4 Patienten mit diabetischen Ulzera Stanzbiopsien gleichzeitig sowohl von intakter Haut als auch vom Wundgrund und Wundrand entnommen und anschließend jede Gruppe (intakte Haut, Wundgrund, Wundrand) für sich gepoolt. Aus allen Biopsien wurde RNA isoliert. Dazu wurden die Biopsien in RNAclean Puffer (AGS, Heidelberg), dem 1/100 Volumenanteil 2-Mercaptoethanol zugesetzt worden war, unter Verwendung eines Dispersere homogenisiert. Anschließend wurde die RNA durch zweimaliges Phenolisieren mittels mit Wasser gesät- tigtem saurem Phenol und in Gegenwart von l-Bromo-3-Chloro-Propan extrahiert. Anschließend wurden eine Isopropanol- und eine Ethanol-Fällung durchgeführt und die RNA mit 75% Ethanol gewaschen. Danach wurde ein DNase I Verdau der RNA durchgeführt. Hierzu wurden 20 μg RNA (ad 50 μl mit DEPC- behandeltem Wasser) mit 5,7 μl Transkriptions-Puffer (Röche), 1 μl RNase Inhi- bitor (Röche; 40 U/μl) und 1 μl DNase I (Röche; 10 U/μl) 20 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde wiederum 1 μl DNase I zugegeben und weitere 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA phenolisiert, Ethanol-gefällt und gewaschen. Alle oben aufgeführten Schritte wurden mit DEPC (Diethylpyrocar- bonat)-behandelten Lösungen bzw. Flüssigkeiten, durchgeführt soweit diese keine reaktiven Aminogruppen enthielten.
Anschließend erfolgte die Herstellung von cDNA aus der extrahierten RNA. Dies erfolgte in Gegenwart von 1 x TaqMan RT-Puffer (Perkin Eimer), 5,5 mM MgCl2 (Perkin Eimer), je 500 μM dNTPs (Perkin Eimer), 2,5 μM Random Hexamere (Perkin Eimer), 1,25 U/μl MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μl Perkin Eimer), 0,4 U/μl RNase Inhibitor (20 U/μl, Perkin Eimer), 20 μl RNA (50 ng/μl) und DEPC-behandeltem Wasser (ad 100 μl Volumen). Nach Zugabe der RNA und guter Durchmischung wurde die Lösung auf zwei 0,2 ml Gefäße verteilt (je 50 μl) und die reverse Transkription in einem Temperatur-Cycler durchgeführt (10 min bei 25°C; 30 min bei 48°C und 5 min bei 95°C). Die nachfolgende Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels quantitativer PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mixes (Perkin Eimer), wobei für die Bestimmung der FGF-BP cDNA Menge eine Dreifachbestimmung durchgeführt wurde. Dazu wurden anhand der FGF-BP kodierenden SEQ ID Nr. 1 Primer gemäß der SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 ausgewählt. Als Referenz wurde Cyclophilin A (Gen 2122
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Bank: XM039526) verwendet, welches gemäß den Primern der Sequenz unter SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 amplifiziert wurde. Die Stammlösung für jedes Triplett enthielt bei 57 μl Gesamtvolumen 37,5 μl 2 x SYBR Master Mix, 0,75 μl AmpErase UNG (1 U/μl) und 18,75 μl DEPC-behandeltes Wasser. Pro Dreifach- bestimmung wurden zu 57 μl Stammlösung je 1,5 μl Vorwärts- und Rüchwärts- Primer (gemäß SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6) in einem zuvor optimierten Konzentrationsverhältnis hinzugefügt. Je 60 μl der Stammlösung/Primer- Mischung wurde mit 15 μl cDNA-Lösung (2 ng/μl) gemischt und auf drei wells verteilt. Parallel dazu wurde eine Stammlösung mit Primern zur Bestimmung von Cyclophilin A (SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8) hergestellt, mit weiteren 15 μl der gleichen cDNA-Lösung gemischt und auf drei wells verteilt.
Außerdem wurden, um eine Standardkurve für die Cyclophilin-PCR zu erstellen, verschiedene cDNA-Lösungen als Verdünnungsreihe hergestellt (4 ng/μl; 2 ng/μl; 1 ng/μl; 0,5 ng/μl und 0,25 ng/μl). Je 15 μl dieser cDNA-Lösungen wurden mit 60 μl Stammlösung/Primer-Mischung zur Bestimmung von Cyclophilin gemischt und auf drei wells verteilt. Ebenso wurde eine Standardkurve für die humane FGF-BP-PCR erstellt; dabei wurden dieselben Verdünnungen, die auch für die Cyclophilin-Standardkurve zum Einsatz kamen, verwendet. Als Kontrolle diente ein PCR Ansatz ohne cDNA. Zu jeweils 60 μl Stammlösung/Primer-Mischung von jeweils humanem FGF-BP und Cyclophilin wurden je 15 μl DEPC- Wasser gegeben, gemischt und jeweils auf drei wells verteilt. Die Amplifikation der Ansätze wurde im GeneAmp 5700 durchgeführt (2 min bei 50°C; 10 min bei 95°C, gefolgt von 3 Zyklen mit 15 sek bei 96°C und 2 min bei 60°C; danach 37 Zyklen mit 15 sek bei 95°C und 1 min bei 60°C). Die Auswertung erfolgte durch die Bestimmung der relativen Abundanz von FGF-BP in Bezug auf die Cyclophilin Referenz. Dazu wurde zuerst eine Standardkurve erstellt, indem die Or- Werte der Verdünnungsreihe gegen den Logarithmus der cDNA-Menge im PCR-Ansatz (in ng umgeschriebener RNA) aufgetragen wurden und die Steigung (s) der Geraden ermittelt wurde. Die Effizienz (E) der PCR ergibt sich dann wie folgt: E = 10"1 s - 1. Die relative Abundanz (X) der untersuchten cDNA Spezies FGF-BP (Y) in Bezug auf Cyclophilin ist dann: X=(l+Ecyc,ophilin)Cτ(Cyclophilin)/(l+Eγ)Cτ(Y). Anschließend wurden die Zahlenwerte normiert, indem die Menge an cDNA aus intakter Haut gesunder Probanden 1 gesetzt wurden.
Die relativen Änderungen der FGF-BP Expression in verschiedenen Wundhei- lungszuständen sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Es zeigt sich, dass in allen Wundheilungszuständen gesunder Probanden eine 2- bis 3-fach erhöhte FGF-BP Expression im Vergleich zu intakter Haut zu beobachten ist, während Patienten, die unter venösen, schlecht heilenden Ulzera leiden, eine generell erhöhte Expression an FGF-BP aufweisen. Im Gegensatz dazu exprimieren Patienten, die unter diabetischen, schlecht heilenden Ulzera leiden, generell zu wenig FGF-BP. Daraus ergibt sich, dass die Ursache für die schlechte Wundheilung diabetischer Patienten in einer generellen, jedoch für diese Erkrankung gegenüber beispielsweise venösen Wunden selektiven, verminderten Abundanz des FGF-BP begründet ist. Somit sind diabetische Patienten gegenüber gesunden Probanden und Patienten, die an venösen Ulzera leiden, durch einen Mangel an FGF-BP für eine schlechtere Wundheilung prädisponiert. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass eine Erfolg versprechende Therapie der Wundheilungsstörung, insbesondere diabetes- assoziierter Wunden, darin bestehen kann, die Menge und/oder Aktivität der FGF- BP Polypeptide und/oder Nukleinsäuren lokal zu erhöhen und damit eine verbesserte Wundheilung zu erreichen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die gegenüber intakter normaler Haut von gesunden Patienten erhöhte FGF-BP Expression in Ulkus Patienten, insbesondere am Wundrand, noch deutlich unter den Expres- sionswerten in Wunden gesunder Patienten liegen. Daraus ergibt sich, dass auch Patienten, insbesondere Ulkus Patienten, die nicht eine per se verringerte Expression von FGF-BP zeigen, mit FGF-BP behandelt werden können. Beispiel 2: Differenzielle Expression von FGF-BP in murinen Wunden
Um zu bestätigen, dass FGF-BP tatsächlich besonders zur Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch einen Mangel an FGF-BP kennzeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden geeignet ist, wurde der Einfluss von FGF-BP auf die Wundheilung in Tiermodellen untersucht. Besonders interessant sind daneben allgemein diabetes-assoziierte Wunden, die nicht zwangsläufig durch einen Mangel an FGF- BP gekennzeichnet sind. Die Bestätigung der humanen Daten in Tiermodellen ist eine Voraussetzung, um geeignete Zeitpunkte für die Behandlung, die Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch einen Mangel an FGF-BP gekennzeichnet sind, insbesondere von diabetes-assoziierten Wunden, zu ermitteln. Dies gilt generell für alle diabetes-assoziierten Wunden, auch solche, die nicht durch eine reduzierte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind. Da Mäuse sich als geeignetes Modellsystem für die Untersuchung der Wundheilung im Menschen erwiesen haben, wurde die Expression des FGF-BP in murinen Biopsien von verschiedenen Zeitpunkten der Wundheilung bestimmt. Dabei wurden zum Zeitpunkt lh, 7h, 15h, 24h, 3 Tage, 5 Tage, 7 Tage sowie 14 Tage nach Wundsetzung Stanzbiopsien aus Wunden und intakter Haut aus normal heilenden Kontrollmäusen (C57BL/6) und diabetischen Mäusen (C57BI/Ks-db/db/Ola) gewonnen.
Die Biopsien wurden homogenisiert und RNA isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Danach erfolgte ein DNase Verdau und das Umschreiben in cDNA. Die Quantifizierung wundheilungsrelevanter cDNAs erfolgte ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Für die spezifische Amplifikation von murinem FGF-BP wurden anhand der Sequenz des FGF-BP (SEQ ID Nr. 4) Primer mit der Sequenz der SEQ JD Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 ausgewählt. Als Referenzgen wurde in diesem Experiment GAPDH benutzt. Dazu wurden für die PCR-Amplifikation anhand der Sequenz des GAPDH Genes (Gen Bank: M17851) Primer mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 verwendet. Für die Quantifizierung wurden je Ansatz cDNA aus 10 ng revers transkribierter Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl amplifiziert. Die PCR wurde entsprechend den Angaben des Herstellers (PE Applied Biosystems, SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol, 1998) durchgeführt. Die CT- Werte wurden analysiert und daraus wurde die Häufigkeit von FGF-BP mRNA relativ zu GAPDH mRNA berechnet. Die Ergebnisse der Experimente sind in Tabelle 2 zusammengestellt und zeigen, dass während des gesamten Beobachtungszeitraums bei diabetischen Tieren FGF-BP mRNA während der Wundheilung relativ zu intakter Haut deutlich vermindert (im Schnitt um Faktor 2,8) exprimiert ist. Werden diese Ergebnisse mit den Daten der Wundheilungskinetik normaler Mäuse verglichen, zeigt sich, dass sich bei normalen Mäusen während der Wundheilung die relative Expression der FGF-BP mRNA während der Wundheilung praktisch nicht ändert. Diese Resultate verdeutlichen, dass sich die im Menschen beobachtete selektiv in diabetischen Patienten verminderte Expression des FGF-BP als Ursache für die Wundheilungsstörung dieser Patientengruppe auch auf die Maus übertragen lässt. Somit dient die diabetische Maus als Modell für die Etablierung therapierelevanter Daten, wie zum Beispiel geeignete Zeitpunkte und Darreichungsform.
Beispiel 3a: Behandlung muriner Wunden mit FGF-BP durch gentherapeutische Methoden
Um zu bestätigen, dass FGF-BP tatsächlich besonders zur Behandlung und/oder Prävention diabetes-assoziierter schlecht heilender Wunden geeignet ist, wird der Einfluss von FGF-BP auf die Wundheilung in vivo getestet. Dazu wird die Wundheilung nach Applikation der FGF-BP cDNA gemäß SEQ ID Nr. 4 in männlichen diabetischen Sprague Dawley Ratten verfolgt. Zur Quantifizierung der Wundheilung wird die Zerreißfestigkeit (tensile strength) der Wunden untersucht, wobei eine höhere Zerreißfestigkeit eine verbesserte Wundheilung widerspiegelt. Das Tiermodell der diabetischen Ratte ist ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung diabetes-assoziierter schlecht heilender Wunden (Davidson, Arch. Dermatol. Res. (1998) 290: Sl-S 11).
Zunächst wird für dieses Experiment ein geeigneter Expressionsvektor beispielsweise auf der Grundlage des Vektors pMH (F. Hoffman-La Röche) konstruiert, indem zwischen dem CMV Promotor und der Multiple Cloning Site in die HindlU Schnittstelle das Intron JJ des Insulingens aus der Ratte eingefügt wird (pMHInt). Unter Verwendung der Multiple Cloning Site wird dann die erfindungsgemäße FGF-BP cDNA in den modifizierten Expressionsvektor pMHInt kloniert. Hierzu wird der kodierende Bereich der FGF-BP cDNA gemäß SEQ ID Nr. 4 mittels geeigneter PCR amplifiziert und anschließend mit Restriktionsenzymen geschnitten, die eine „in-frame" Ligation der cDNA in den mit den gleichen Restriktions- enzymen geschnittenen, modifizierten Expressionsvektor erlauben. Somit wird ein Expressionplasmid pMHInt_FGF-BP erhalten. Als Kontrollvektor wird pMHInt verwendet, der beispielsweise ein Luziferase-Gen enthält (pMHJntLuc).
Zur Induktion der Diabetes wird vier Ratten mit einem Körpergewicht von 250 - 300g eine frisch hergestellte wässrige Streptozotocin-Lösung (Sigma) i.p. injiziert (50 mg/kg Körpergewicht). 7-9 Tage nach Induktion wird der Blutzucker der Tiere überprüft. Ein Blutzuckerspiegelwert von über 200 mg/dL dient als unterer Grenzwert für die Beurteilung des diabetischen Zustands der Tiere.
Die vier diabetischen Ratten sowie die vier nicht-diabetischen Kontrolltiere werden anschließend mit einer Mischung aus 2% O2 (2 1/min) und 1,25% Isofluran betäubt. Der Rücken wird enthaart und an vier Stellen pro Tier wird auf dem Rücken für die spätere Wundsetzung eine Marke gesetzt. Diese Marken werden beispielsweise mit jeweils 0,5 μg Plasmid DNA, die an Goldpartikeln (BioRad) ge- bunden ist, unter Verwendung der "Helios Gene Gun" (BioRad) mit 500 psi beschossen, wobei jeweils zwei Stellen mit dem FGF-BP-Expressionsvektor ρMHInt_FGF-BP und zwei Stellen mit dem Kontrollvektor pMFflntLuc beschossen werden. Dabei erfolgen jeweils ein Beschuss mit pMHInt_FGF-BP am anteri- oren und ein Beschuss am posterioren Ende der Marke. Anschließend werden 1 cm lange Schnittwunden durch die beschossenen Stellen hindurch gesetzt und die Wunden mit Wundklammern verschlossen. Nach 10 Tagen wird die Zerreißfestigkeit der Wunden unter Verwendung eines Tensiometers (BTC-2000, SRLI, Nashville) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Anschließend wird der Quotient (E/C-Wert) gebildet aus dem absoluten Wert der Zerreißfestigkeit einer mit pMHInt_FGF-BP beschossenen Wunde und dem absoluten Wert der Zerreißfestigkeit einer mit dem Kontrollvektor pMHIntLuc beschossenen Wunde desselben Tieres. Die Bestimmung des Mittelwertes der E/C-Werte erlaubt die Ermittlung der Änderungen der Zerreißfestigkeit in Abhängigkeit von erfmdungsgemä- ßem FGF-BP zwischen diabetischen und Kontrolltieren. Dabei deutet eine erhöhte Zerreißfestigkeit von pMHInt_FGF-BP behandelten Wunden in diabetischen Tieren auf eine Eignung von FGF-BP zur selektiven Behandlung von diabetes- assoziierten, schlecht heilenden Wunden.
Alternativ können natürlich auch andere Expressionsvektoren sowie andere Applikationsformen der Nukleinsäuren gewählt werden. So können Nukleinsäuren beispielsweise mit Liposomen komplexiert werden, um ein Eindringen in die Zelle zu erleichtern oder die Nukleinsäure kann an eine Trägermatrix, beispielsweise Kollagen, gebunden werden, die dann auf die Wunde appliziert wird. Ein Eindrin- gen der Nukleinsäure in die Hautzellen ist dabei möglich. Um die Schwierigkeit des Eindringens in die Zelle zu überwinden können auch virale Vektoren, beispielsweise Adeno- oder Retroviren, verwendet werden, die dann über Infektion Zugang zur Zellen erhalten. Ebenso können beispielsweise auch humanes FGF-BP Polypeptid kodierende Nukleinsäuren gemäß SEQ ID Nr. 2 oder Varianten davon verwendet werden.
Beispiel 3b: Behandlung von Wunden mit FGF-BP mittels Gentherapie
Der Expressionsvektor für pMHInt_FGF-BP wurde wie in Beispiel 3a) beschrieben, ausgehend von dem Vektor pMH, hergestellt. Als Kontrollvektor wurde pMHInt verwendet. Zur Induktion der Diabetes wurden Ratten mit einem Körpergewicht von 250 - 300g eine frisch hergestellte wässrige Streptozotocin- Lösung (Sigma) i.p. injiziert (50 mg/kg Körpergewicht). 5, 10 und 17 Tage nach Induktion wurde der Blutzucker der Tiere überprüft. Ein Blutzuckerspiegelwert von über 200 mg/dL diente als unterer Grenzwert für die Beurteilung des diabetischen Zustands der Tiere. Am Tag 10 nach Induktion des diabetischen Zustandes wurden die Wunden gesetzt. 28 diabetische Ratten wurden dazu mit einer Mi- schung aus 2% O2 (2 1/min) und 1,25% Isofluran betäubt. Der Rücken wurde enthaart und an vier Stellen pro Tier wurde auf dem Rücken für die spätere Wundsetzung eine Marke gesetzt. Diese Marken wurden mit jeweils 0,5 μg Plasmid DNA, die an Goldpartikeln (BioRad) gebunden ist, unter Verwendung der "Helios Gene Gun" (BioRad) mit 500 psi beschossen, wobei 16 Tiere mit dem FGF-BP- Expressionsvektor pMHInt_FGF-BP und 12 Tiere mit dem Kontroll vektor pMHInt beschossen werden. Anschließend wurden 1,9 cm lange Schnittwunden durch die beschossenen Stellen hindurch gesetzt und die Wunden mit Wundklammem verschlossen. Nach 7 Tagen wird die Zerreißfestigkeit der Wunden unter Verwendung eines Tensiometers (BTC-2000, SRLI, Nashville) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Je negativer der Druck (in [mmHg]), der an eine Wunde angelegt werden kann bevor sie zerreißt desto höher ist die Zerreißfestigkeit der Wunde. Die Ergebnisse des Versuchs sind für 16 Versuchtiere mit FGF-BP und 12 Kontrolltiere in Tabelle 4 gezeigt. Wegen der einfacheren Darstellung sind alle, im Versuchsergebnis negativen Druckwerte als positive Werte angegeben, wobei ein höherer Wert eine bessere Zerreißfestigkeit der Wunde be- deutet. Jeder Wert ist ein Mittelwert aus den vier Wunden, die pro Tier gesetzt wurden.
Es wurde beobachtet, dass die Wunden der Tiere die mit dem FGF-BP- Expressionsvektor pMHInt_FGF-BP beschossen worden waren mit einer mittleren Zerreißfestigkeit von 427 mmHg eine deutlich höhere Zeπeißfestigkeit aufwiesen als Wunden die mit Kontrollvektor beschossen wurden, die nur einen Durchschnittswert von 269 mmHg. Ein vergleichbares Ergebnis wurde erhalten wenn diabetische Ratten mit einem Expressionsvektor enthaltend humane FGF- BP cDNA gemäß SEQ ID Nr. 2 beschossen wurden.
Dies beweist eine besondere Eignung von FGF-BP zur Behandlung von diabetes- assoziierten, schlecht heilenden Wunden.
Beispiel 4a: Behandlung von Wunden durch in vivo Applikation von FGF-BP Polypeptiden
Da das erfindungsgemäß verwendbare FGF-BP Polypeptid einen extrazellulären Wirkungsort besitzt und somit ein Eindringen in die Zellen nicht notwendig ist, wird die Eignung topisch administrierter, rekombinant hergestellter FGF-BP Polypeptide zur Behandlung und oder Prävention diabetes-assoziierter schlecht heilender Wunden für die Wundheilung in vivo getestet.
Zunächst werden beispielsweise mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems (BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System, Life Technologies INC., Gaithersburg, MD) FGF-BP Polypeptide hergestellt. Dazu wird zunächst die cDNA des erfindungsgemäß verwendbaren FGF-BP gemäß SEQ ID Nr. 4 via PCR amplifiziert (siehe Experiment 3) und beidseits mit je einem (His)6-Tag versehen. Diese modifizierte cDNA wird in geeignete Restriktionsschnittstellen des pFASTB AC HTb Donor Plasmids kloniert. Anschließend wird das Plasmid in den Bacmid-enthaltenden DH10BAC E.co/i-Stamm transformiert. Isolierte, rekombi- nante Bacmid-DNA wird dann in Sf-9 Zellen transfektiert, um entsprechende Baculoviren zu generieren. Nach fünf Tagen werden die Zellen geerntet, pelletiert und mit Hilfe von 6 M Guanidinium_HCl, 0,01 M HC1, 0,1 M Natriumphosphat pH 8,0 lysiert. Die Zelllysate werden eine Stunde auf Eis inkubiert, zelluläre Ü- berreste abzentrifugiert und der Überstand auf eine Nickel-NTA Sepharose Säule (Qiagen, Hilden, Germany) geladen. Die Säule wird wiederholt mit 30 mM Natrium Citrat, 300 mM Natrium Chlorid und absteigenden pH Werten von 8, 6,3, 5,9 und 5,7 gewaschen. His-getagtes FGF-BP wird dann mit 3x0,5 ml Puffer mit pH 4,5 eluiert und neutralisiert. Auf diese Art hergestelltes, rekombinantes FGF-BP Polypeptid wird anschließend in verschiedenen Konzentrationen beispielsweise in einem inerten Hydrogel (2,3% modifizierte Methylzellulose, 20% Propy- len_Glykol und 77,7% Wasser) formuliert (Intra Site von Smith & Nephew).
Zur Induktion von Diabetes werden vier Ratten, wie in Experiment 3 beschrieben, mit Streptozotocin-Lösung behandelt. Vier dieser diabetischen Ratten sowie vier nicht-diabetische Kontrolltieren werden anschließend wie bereits beschrieben betäubt und enthaart. In die epilierte Rückenhaut eines Tieres werden dann mit Hilfe einer Biopsiestanze vier Wunden gestanzt. Auf zwei dieser Wunden werden in einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Wunde die formulierten FGF-BP Polypeptide, auf die verbleibenden zwei Wunden als Kontrolle lediglich die Trägersubstanz ohne FGF-BP topisch auf den Wundrand aufgetragen. Die Wunden werden einzeln mit einem semi-okklusiven Verband (OpSite) versorgt. Die Progression der Reepithelialisierung der Wunde wird photographisch während 10 Tagen dokumentiert (EPICAM) und mit dem Wert bei Tag 0 (sofort nach Verwundung) verglichen. Eine beschleunigte Reepithelialisierungsrate nach Applikation von FGF- BP Polypeptiden selektiv bei diabetischen Tieren deutet auf eine besondere Eig- nung der FGF-BP Polypeptide zur selektiven Behandlung von diabetes- assoziierten, schlecht heilenden Wunden hin.
Alternativ können auch andere Expressionssysteme, die die Herstellung eines korrekt gefalteten, biologisch aktiven FGF-BP Polypeptids erlauben, sowie andere Formulierungen oder auch die intradermale Injektion von Proteinen in geeigneten Trägerlösungen verwendet werden. Neben dem murinen Protein können auch humane FGF-BP Polypeptide gemäß SEQ ID Nr. 1 oder funktionelle Varianten davon eingesetzt werden.
Somit kann nachgewiesen werden, dass FGF-BP wirksam bei der Prävention und/oder Behandlung von diabetes-assoziierten, schlecht heilenden Wunden ist. Die Wirkung von FGF-BP ist besonderes geeignet für diese diabetes-assoziierten Wundheilungsstörungen im Vergleich zur Behandlung anderer Wundheilungsstö- rungen, da bei letzteren keine Fehlregulation der FGF-BP Expression vorliegt.
Zur Prävention und/oder Behandlung ist die Menge an FGF-BP, vorzugsweise an funktioneil aktivem FGF-BP im Wundbereich zu erhöhen. Eine bevorzugt zu behandelnde Indikation ist der diabetische Ulkus. Die Administration eines Medi- kaments enthaltend FGF-BP erfolgt vorzugsweise topisch, insbesondere mittels Gentherapie (Beispiel 3). Die Administration kann weiterhin besonders bevorzugt durch die topische Applikation eines rekombinanten, verwendungsgemäßen FGF- BP-Polypeptids erfolgen (Beispiel 4), da der Wirkort des FGF-BP Polypeptids extrazellulär ist und somit das Eindringen des Proteins in Zellen nicht nötig ist.
Beispiel 4b: Behandlung von Wunden mit FGF-BP mittels Polypeptid Zunächst wird FGF-BP Polypeptid wie in Beispiel 4a) beschrieben mittels Bacu- lovirus-Expressionssystem (BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System, Life Technologies INC., Gaithersburg, MD) hergestellt. Als Kontrolle dient die reine Trägerlösung in der das FGF-BP Polypeptid gelöst ist oder alternativ dazu ein Polypeptid, das mittels Baculovirus-Expressionssystem gut herstellbar ist und keinen Einfluss auf die Wundheilung ausübt. Geeignet ist beispielsweise ein „housekeeping gene" wie GAPDH.
Zur Induktion der Diabetes werden Ratten mit einem Körpergewicht von 250 - 300g eine frisch hergestellte wässrige Streptozotocin-Lösung (Sigma) i.p. injiziert (50 mg/kg Körpergewicht). 5, 10 und 17 Tage nach Induktion wird der Blutzucker der Tiere überprüft. Ein Blutzuckerspiegelwert von über 200 mg/dL dient als unterer Grenzwert für die Beurteilung des diabetischen Zustande der Tiere. Am Tag 10 nach Induktion des diabetischen Zustandes werden die Wunden gesetzt. 28 diabetische Ratten werden dazu mit einer Mischung aus 2% O2 (2 1/min) und 1,25% Isofluran betäubt. Der Rücken wird enthaart und an vier Stellen pro Tier wird auf dem Rücken für die spätere Wundsetzung eine Marke gesetzt. Diese Marken werden mit jeweils 50 μl einer Formulierung aus Trägersubstanz mit FGF-BP Polypeptid bzw. einer Formulierung aus Trägersubstanz zur Kontrolle bestrichen. Anschließend werden 1,9 cm lange Schnittwunden durch die bestrichenen Stellen hindurch gesetzt und die Wunden mit Wundklammern verschlossen. Alternativ dazu können auch zunächst die Wunden gesetzt werden, und anschließend mit FGF-BP Polypeptid bzw. der Kontrolle beschichtet werden. Die alternative Vorgehensweise hat den Vorteil, dass mehr FGF-BP Polypeptid bzw. Kontrolllösung in die einzelne Wunde gelangt. Nach 7 Tagen wird die Zerreißfestigkeit der Wunden unter Verwendung eines Tensiometers (BTC-2000, SRLI, Nashville) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Je negativer der Druck (in [mmHg]), der an eine Wunde angelegt werden kann, bevor sie zerreißt, desto höher ist die Zeπeißfestigkeit der Wunde. Die Ergebnisse des Versuchs sind für 16 Versuchtiere mit FGF-BP und 12 Kontroll tiere in Tabelle 5 gezeigt. Wegen der einfacheren Darstellung sind alle, im Versuchsergebnis negativen Druckwerte als T EP03/02122
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positive Werte angegeben, wobei ein höherer Wert eine bessere Zerreißfestigkeit der Wunde bedeutet. Jeder Wert ist ein Mittelwert aus den vier Wunden, die pro Tier gesetzt werden.
Es wird beobachtet, dass die Wunden der Tiere die mit dem FGF-BP Polypeptid behandelt werden mit einer mittleren Zerreißfestigkeit von 428 mmHg eine deutlich höhere Zerreißfestigkeit aufweisen als Wunden die nur mit der Kontrolllösung behandelt werden, die nur einen Durchschnittswert von 262 mmHg erreichen. Ein vergleichbares Ergebnis wird erhalten wenn diabetische Ratten mit ei- nem humanen FGF-BP Polypeptid gemäß SEQ BD Nr. 1 behandelt werden.
Alternativ können auch andere Expressionssysteme, die die Herstellung eines korrekt gefalteten, biologisch aktiven FGF-BP Polypeptids erlauben, sowie andere Formulierungen oder auch die intradermale Injektion von Proteinen in geeigneten Trägerlösungen verwendet werden.
Tabelle 1
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Tabelle 2
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Tabelle 3
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Tabelle 4
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Tabelle 5
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Claims

28. Februar 2003 SWITCH BIOTECH AG S36968PC BÖ/EL/hmü
Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 o- der SEQ ID Nr. 4 oder funktioneller Varianten davon und/oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon exprimierenden Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten Wundheilungsstörungen oder zur Diagnose von diabetes- assoziierten Wundheilungsstörungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für FGF- BP kodierende Nukleinsäure oder funktionelle Varianten davon in Form eines Expressionsvektors, insbesondere eines gentherapeutisch wirksamen Vektors, eingesetzt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das FGF-BP Polypeptid ein rekombinantes Protein, vorzugsweise aus Bakteri- en, Hefen oder Viren, insbesondere Baculoviren, ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das FGF-BP Polypeptid, die für FGF-BP kodierende Nukleinsäure, der gegen das FGF-BP Polypeptid gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder die ein FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Va- riante davon exprimierenden Zelle systemisch oder lokal verabreicht werden, insbesondere lokal in die Wunde eingebracht und/oder topisch aufgetragen werden.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche I bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die diabetes-assoziierte Wunde eine schlecht heilende Wunde, insbesondere ein diabetischer Ulkus, ist.
6. Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptides gemäß SEQ JD Nr. 1 und SEQ JD Nr. 3 oder funktioneller Varianten davon oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und SEQ JD Nr. 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder An- tikörperfragmente und/oder einer ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon exprimierenden Zelle, gegebenenfalls zusammen oder kombiniert mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen, zur Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure nach SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktionelle Varianten hiervon in Form eines Expressionsvektors, insbesondere eines gentherapeutisch wirksamen Vektors eingesetzt wird.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den genannten Zellen um humane, nicht-embryonale, autologe oder allo- gene Zellen handelt.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Hautzellen, insbesondere Keratinozyten, Fibroblasten oder Endothelzellen sind.
10. Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 oder funktioneller Varianten davon und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid expπmierenαen ^πe zur Identifizierung pharmakologisch aktiver Substanzen, die die Funktion und/oder die Expression des FGF-BP Polypeptids und/oder einer für FGF- BP Polypeptid kodierenden Nukleinsäure steigern zur Behandlung und/oder Prävention von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte
Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind.
11. Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 und/oder mindestens einer für FGF-BP kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 oder funktioneller Varianten davon oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP Polypeptid exprimierenden Zelle, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung eines Tests zur Auffindung von pharmakologisch aktiven Substanzen in Zusammenhang mit Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind.
12. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 6,7,10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, besonders bevorzugt eine doppelsträngige DNA ist.
13. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten davon, oder gegen FGF-BP Polypeptide oder funktionelle Varianten davon gerichtete Antikörper oder Antikörperfragmente an eine Festphase gebun- den sind, und mindestens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht wird. 4. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein FGF-BP Polypeptid von mindestens einer Zelle exprimiert wird und mindestens eine Substanz auf ihre phar- makologische Aktivität hin untersucht wird.
15. Verwendung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante von SEQ ID Nr. 1 und/oder 3 bzw. SEQ ID Nr. 2 und/oder 4 ein Fusionsprotein bzw. eine für ein Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure ist.
16. Verwendung mindestens eines FGF-BP Polypeptides gemäß SEQ ID Nr. 1 und 3 und/oder für FGF-BP Polypeptid kodierender Nukleinsäuren gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 und/oder gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter Antikörper oder Antikörperfragmente und/oder mindestens einer FGF-BP exprimierenden Zelle zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind. 7. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine für FGF-BP Polypeptid oder eine funktionelle Variante hiervon kodierenden Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 2 und 4 und/oder funktionelle Varianten hiervon als Sonde, vorzugsweise als DNA-Sonde und/oder als
Primer zur Diagnose von Hauterkrankungen, die durch eine verringerte Menge an FGF-BP gekennzeichnet sind, eingesetzt wird. 8. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein gegen ein FGF-BP Polypeptid oder funktionelle Varianten davon gerichteter An- tikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden. 9. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Wundheilungsstörung eine diabetes-assoziierte Wunde, insbesondere ein diabetischer Ulkus, ist.
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