DE60026347T2

DE60026347T2 - Anwendung von nicht menschliches SHIP2 'Knock-out' Säugtiere

Info

Publication number: DE60026347T2
Application number: DE60026347T
Authority: DE
Inventors: Christophe Erneux; Stephane Schurmans
Original assignee: Euroscreen SA
Current assignee: Ogeda SA
Priority date: 1999-11-03
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: US20040203087A1; CA2388180A1; ATE318511T1; US20050183146A1; EP1097713A1; US6703215B2; US6936452B2; ES2259293T3; EP1244433B1; WO2001032186A3; US7094546B2; US20040209342A1; CA2388180C; JP2003515532A; DE60026347D1; WO2001032186A2; EP1244433A2; US20020106713A1; DK1244433T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet des Diabetes. Insbesondere betrifft sie die Identifizierung von Genen und Proteinen, die für Diabetes verantwortlich sind und ihre Inhibitoren zur Verwendung in der Therapie.
Insulin ist das wichtigste Hormon, das an der Glukosehomöostase beteiligt ist. Das teilweise oder vollständige Fehlen der Insulinsekretion oder -wirkung führt zu einem beeinträchtigten Glukosemetabolismus und zu Diabetes.
Diabetes ist eine Hauptursache von Gesundheitsproblemen in der Welt. Der insulinunabhängige Diabetes mellitus (NIDDM, auch als Typ II-Diabetes bezeichnet) stellt eine der Hauptstörungen der öffentlichen Gesundheit hinsichtlich der Glukosehomöostase dar, die etwa 5% der allgemeinen Bevölkerung der Vereinigten Staaten betrifft. Die Ursachen der Hyperglykämie bei Nüchternheit und/oder der Glukoseintoleranz, die mit dieser Form von Diabetes assoziiert ist, sind nicht genügend verstanden.
In klinischer Hinsicht ist NIDDM eine heterogene Störung, die durch chronische Hyperglykämie gekennzeichnet ist, die zu progressiven mikro- und makrovaskulären Läsionen in den kardiovaskulären, Nieren- und visuellen Systemen führt sowie zu einer diabetischen Neuropathie. Aufgrund dessen kann die Erkrankung mit früher Morbidität und Mortalität assoziiert sein.
Auf dem Gebiet der Genomik wurden verschiedenste Mutationen in Genen, die zu Diabetesauffälligkeit führen, identifiziert, beispielsweise in der Familie der Hepatozyten-Nukleotidfaktorgene (HNF-1, HNF-4 und HNF-6) wie dies in den Dokumenten WO 98/11254 und WO 98/23780 beschrieben ist.
Die Rolle dieser Gene in biochemischen Reaktionswegen, welche die Synthese oder Sekretion von Insulin durch die β-Zellen der Langerhans'schen Inseln betreffen, wurde mittels der Phänotyp-Analyse von Knock-out-Mäusen identifiziert wobei diese Gene oder Teile davon aus deren Genom deletiert wurden.
Diese Knock-out-Säugetiere werden danach als Modelle für die Identifizierung neuer Verbindungen oder neuer Behandlungsverfahren verwendet, die verwendet werden könnten, um die Symptome, die von Diabetes resultieren, abzumildern.
Es ist auch möglich die entsprechenden identifizierten Gene zu verwenden, die in einer ausreichenden Menge in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen werden, um diese Erkrankung zu behandeln und/oder zu verhindern.
Allerdings besteht auf diesem Gebiet ein Bedarf für die Identifizierung neuer biologischer Zielreaktionswege, die verwendet werden könnten, um die Behandlung und/oder die Verhinderung von Diabetes zu verbessern.
Die Typ2 SH2-Domänen-enthaltende Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase oder SHIP2 ist eng mit der Phosphatidyl-Inositol 3'-Kinase- und Shc/ras/MAP-Kinase vermittelten Signalereignissen in Reaktion auf die Stimulation durch spezifische Wachstumsfaktoren verbunden.
Die Struktur der SH2-Domänen-haltigen Enzyme und das Aufweisen einer katalytischen Phosphatase-Aktivität wurde bereits von Pesesse et al. (1997 und 1998) und Erneux et al. (1998) beschrieben.
Es ist bekannt, dass die SH2-Domänen-haltigen Proteine eine Ähnlichkeit mit einer weiteren Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase aufweisen, die als das Molekül SHIP1 identifiziert wurde und ebenfalls eine 99%-ige Identität zu einer Sequenz zeigt, von der früher berichtet wurde (INPPL-1). INPPL-1 enthält allerdings keine SH2-Domäne.
Die neue Sequenz wird im Folgenden als das Molekül SHIP2 identifiziert. Die andere bekannte Inositol-5-Phosphatase SHIP1 war Objekt einer intensiven Forschung, weil sie möglicherweise an der negativen Signalweiterleitung von B-Immunzellen beteiligt ist und daher als ein Ziel verwendet werden könnte, nach neuen Molekülen zu suchen, die möglicherweise therapeutische und/oder prophylaktische Eigenschaften bei der Behandlung von verschiedenen immunvermittelten inflammatorischen oder allergischen Symptomen und Erkrankungen aufweisen.
Toshiyasusasaoka et al. (Diabetes Vol. 84, Nr. PPA 60 (1999) (XP 000905226)) beschreiben die Klonierung und Charakterisierung eines SHIP2-Moleküls der Ratte, das keine SAM-Domäne besitzt, die in humanem SHIP2 vorliegt. Sie zeigten, dass eine Überexpression des SHIP2-Moleküls eine Insulin-induzierte PKB-Aktivierung durch die 5-Inositolphosphatase-Aktivität von SHIP2 inhibiert. Die Autoren legen nahe, dass SHIP2 eine negative regulatorische Rolle in diversen biologischen Wirkungen von Insulin spielt und dass die duale Regulation des SHC-Grb2-Komplexes und des stromabwärts gelegenen Moleküls der PI3-Kinase mögliche Mechanismen des SHIP2-Moleküls bereitstellen, um an der Insulin-Signalweiterleitung teilzunehmen.
Allerdings wurden die genauen Funktionen der SH2-Domänen-enthaltenden Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2 noch nicht identifiziert.
Die internationale Patentanmeldung WO 97/12039 beschreibt die Aufreinigung und Isolierung der Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenz umfassen, welche die SH2-enthaltende Inositol-Phosphatase kodiert, einen Vektor, umfassend diese Sequenz, eine Zelle, die von diesem Vektor transformiert ist und ein aufgereinigtes und isoliertes SH2-enthaltendes Inositol-Phosphatase-Molekül, das von dieser Zelle exprimiert wird. Dieses Dokument beschreibt auch Antikörper, die gegen dieses Protein gerichtet sind, und ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die in der Lage ist, an dieses Protein zu binden.
Die Erfinder haben unerwartet entdeckt, dass ein Knock-out-Säugetier, vorzugsweise eine Knock-out-Maus, das eine teilweise oder vollständige Deletion (heterozygot oder homozygot) der SH2-Domänen-haltigen Polyphosphat-Inositol-5-Phosphatase SHIP2-Sequenz umfasst, gegenüber Insulin hypersensitiv ist (ernste postnatale Hypoglykämie und deregulierte Expression von Genen, die an der Glukoneogenese beteiligt sind).
Diese erhöhte Sensitivität ist so wichtig, so dass nach zwei oder drei Tagen nach der Geburt die homozygoten (SHIP2^–/–)-Mäuse an schwerer Hypoglykämie sterben und dass in heterozygoten (SHIP2^+/–)-Mäusen eine verschlechterte Glukosetoleranz beobachtet wird.
In vitro ist das Fehlen eines oder beider normaler Allele des SHIP2-Gens mit einer verstärkten Aktivierung von PKB, einem Effektor der PdtIns3-Kinase Kaskade, und der Reaktion der MAP-Kinase gegenüber Insulin assoziiert. Diese Ergebnisse stellen den ersten direkten Beweis dar, dass SHIP2 ein starker negativer Regulator von Insulin-Signalweiterleitung in vivo ist und damit ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Behandlung des Typ II-Diabetes.
Die vorliegende Anmeldung offenbart einen Inhibitor des Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2-Moleküls, vorzugsweise eines humanen Moleküls, wobei der Inhibitor gegen dieses Molekül gerichtet ist und in der Lage ist, seine Aktivität oder Expression zu reduzieren oder zu blockieren.
Ein erstes bevorzugtes Beispiel dieses Inhibitors ist eine Antisense-RNA (von 8 bis 50 Basen Länge, vorzugsweise von 10 bis 30 Basen Länge), die von der komplementären Sequenz der Boten-RNA hergestellt wird, die von der komplementären DNA der Sequenz des SHIP2-Moleküls abgeleitet werden kann, welche die Sequenz (die im Folgenden als SEQ ID NR: 1 identifiziert wird und von Erneux et al. (1998) identifiziert wurde) oder ihren komplementären Strang kodiert, und die spezifisch hybridisiert und seine Expression inhibiert. Die Inhibitoren können auch ein Molekül sein, das direkt oder indirekt die SHIP2-mRNA-Expression (Transkriptionsfaktoren) oder -Stabilität verringert.
Ein zweites Beispiel des Inhibitors ist ein mutiertes SHIP2-Molekül oder ein Teil davon von mehr als etwa 30, etwa 50, etwa 100 oder etwa 150 Aminosäuren (negativ-dominant), das die natürliche Aktivität von SHIP2 verhindern würde, indem das mutierte Molekül mit interagierenden Proteinen oder Rezeptoren kompetitiert, die an der Insulinherstellungskaskade beteiligt sind. Vorzugsweise umfasst das mutierte SHIP2-Molekül oder der Teil davon eine Mutation in der folgenden Aminosäuresequenz: RTNVPSWCDR, besonders eine oder mehrere Mutationen, vorzugsweise der folgenden Aminosäuren: S, C, N, D oder R dieser spezifischen SHIP2-Teilsequenz. Diese Mutation (n) betrifft/betreffen die katalytische Stelle des SHIP2-Moleküls (Phosphataseaktivität) wie in Erneux et al. (1998) beschrieben. Diese Mutationen würden üblicherweise dominant negative Effekte kreieren.
Andere Beispiele der Inhibitoren sind Substrate des SHIP2-Moleküls (das ein Enzym ist) und Analoga seiner Substrate wie das Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Triphosphat, das Inositol-1,3,4,5-Tetrakisphosphat, das Inositol-1,4,5-Triphosphat-Adenophostin oder jedes erhältliche Analogon der Inositolphosphat-Struktur, einschließlich der membrandurchgängigen Ester von Phosphatidylinositol-3,4,5-Triphosphat, die verwendet wurden, um das Phosphatidylinositol-3,4,5-Triphosphat durch Zellmembranen zu schleusen.
Der Inhibitor kann auch ein kompetitiver Inhibitor sein, beispielsweise das 2,3-Biphosphoglycerat, Thiol-blockierende Agenzien oder jeder beliebige Proteinphosphatase-Inhibitor wie die Okadansäure oder das Orthovanadat. Der Inhibitor kann auch ein spezifischer Anteil von mehr als etwa 30, etwa 50, etwa 100 oder etwa 150 Aminosäuren der Proteinstruktur des Enzyms sein, vorzugsweise ein Anteil, umfassend die SH2-Domäne (die ersten 110 Aminosäuren der Sequenz SEQ ID NR: 1), die Prolin-reiche Domäne (die letzten 351 Aminosäuren der Sequenz SEQ ID NR: 1) oder noch mehr bevorzugt Anteile der Sequenz, die in der Lage sind, mit der Rekrutierung des SHIP2-Moleküls an Plasmamembranen zu kompetitieren, wobei dessen Aktivität inhibiert wird.
Der Inhibitor könnte auch die Aktivität des SHIP2-Moleküls reduzieren oder blockieren, oder die Expression der SHIP2-mRNA-Expression reduzieren.
Der Inhibitor oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel oder den Inhibitor wie er in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, der in der Lage ist, die Aktivität des SHIP2-Moleküls zu reduzieren oder zu blockieren, umfasst, erhöht die Sensitivität eines Patienten (einschließlich eines Menschen) gegenüber Insulin und könnte vorteilhaft bei der Behandlung oder der Verhinderung von Typ II-Diabetes und assoziierten Erkrankungen verwendet werden.
Die vorliegende Anmeldung offenbart auch ein Verfahren, einen Kit oder Apparat für den Nachweis von bekannten oder unbekannten Verbindungen, die als Inhibitoren des Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2-Moleküls verwendet werden könnten. Das Verfahren umfasst die Schritte, die unbekannten Verbindungen einem Assay zu unterwerfen, der auf der Analyse der Aktivität des SHIP2-Moleküls basiert. Dieser Assay wird vorteilhaft mit einem molekularen Konstrukt ausgeführt, das die katalytische Domäne des SHIP2-Enzyms (hinsichtlich des entsprechenden humanen SHIP2-Moleküls, das in der hierin eingeschlossenen Sequenz SEQ ID NR: 1 identifiziert ist; diese reicht von der Aminosäure 427 bis 729, oder ein oder mehrere spezifische Teile der katalytischen Domäne), wobei das Konstrukt in einen Mikroorganismus exprimiert wird, vorzugsweise in E. coli, oder in einer Zelllinie, und der Assay die Mittel zur Quantifizierung der Hydrolyse von Inositol-1,3,4,5-Tetrakisphosphat und die Produktion von Inositol-1,3,4-Triphosphat umfasst. Die Expression von SHIP2 in E. coli-Bakterien wurde in Pesesse et al. 1998 beschrieben.
Der in der vorliegenden Anmeldung offenbarte Kit, Apparat und das Verfahren umfassen kommerziell erhältliche Substrate. Der Assay gemäß der Anmeldung könnte auch auf einer Quantifizierung der Hydrolyse von Phosphatidylinositol-3,4,5-Triphosphat beruhen, gefolgt von einer Dünnschicht-Chromatographie-Analyse.
Eine weitere Analyse möglicher Inhibitoren der Aktivität des SHIP2-Moleküls beruht auf der Inhibierung der Phosphorylierung von Tyrosin durch SHIP2, weil von dieser spezifischen Aktivierung gezeigt wurde, dass sie für den Aktivierungsprozess und die Insulin-sensitiven Reaktionswege wichtig ist. Das SHIP2-Molekül wird aufgereinigt und auf seine Phosphorylierung mittels Western-Blots-Analyse unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers getestet, der auch als ein Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnte.
Eine weitere Analyse möglicher Inhibitoren von SHIP2-Molekülen beruht auf der Reduktion oder Inhibierung der SHIP2-mRNA-Expression, weil eine reduzierte Expression von SHIP2-mRNA in vivo mit einer gesteigerten Insulin-Sensitivität assoziiert ist. Die SHIP2-Promotorregion oder die nicht-translatierten Regionen (5' oder 3') der SHIP2-cDNA werden mit einem Reportergen (Luziferase, CAT, ...) in einem Plasmidvektor verbunden und in kultivierte Zellen transfiziert. Die zu testenden Verbindungen werden zu den Zellen hinzugefügt, oder nicht, und die Reportergen-Aktivität wird aufgezeichnet, um Verbindungen herauszufinden, welche die Reportergen-Aktivität reduzieren, d. h. Verbindungen, die durch den Promotor, die 5'- oder 3'- nicht-translatierten Regionen der SHIP2-Sequenzen wirken, um die Produktion des Proteins zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines nicht-humanen Knock-out Säugers, der in seinem Genom homozygot oder heterozygot eine partielle oder vollständige Deletion der Nukleotidsequenz der Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2 umfasst, als ein Modell zur Untersuchung von Erkrankungen, wobei die Erkrankungen durch das Vorliegen einer Insulinhypersensitivität in einem Patienten verursacht werden, sowie als ein Modell zur Untersuchung der Behandlung der Erkrankungen in dem Patienten.
Die Erkrankung kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus schwerer Hypoglykämie des Neugeborenen und beeinträchtigter Glukosetoleranz des Erwachsenen ausgewählt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Patient human sein. Darüber hinaus kann der Knock-out-Säuger eine Maus sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines nicht-humanen Knock-out-Säugers, umfassend (homozygot oder heterozygot) eine partielle oder vollständige Deletion (in seinem Genom) der genetischen Sequenz, die das Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2-Enzym kodiert, wobei der Knock-out-Säuger gegenüber Insulin hypersensitiv ist, und der als ein Modell verwendet werden könnte, um Erkrankungen wie die schwere Hypoglykämie des Neugeborenen oder beeinträchtigte Glukosetoleranz des erwachsenen Menschen sowie ihre Behandlung zu untersuchen. Die genetische Sequenz kodiert das Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2-Molekül (Enzym), das im Folgenden als SEQ ID NR: 1 identifiziert ist und von Pesesse et al. (1997) beschrieben wurde.
Der nicht-humane Knock-out-Säuger ist vorzugsweise eine Knock-out-Maus, die durch dem Fachmann bekannte Techniken erhalten wurde. Der Säuger wird vorzugsweise mittels einer genetischen Modifikation erhalten, einer partiellen oder vollständigen Deletion der Wildtyp-Sequenz mittels der Integration einer fremden Nukleinsäuresequenz. Die genetisch modifizierte Sequenz wird in einen Vektor eingebaut oder elektroporiert und in eine embryonale Stammzelle (ES) wiedereingeführt, deren zelluläre Klone vor der Integration vorzugsweise in einem Swiss pseudo-trächtigen Morula-Embryo gemäß der von Carmeliet et al. (1996) beschriebenen Technik ausgewählt wurden, was danach die Selektion von Mäusen erlaubt, welche die heterozygote Modifikation der Wildtyp-Sequenz und, nach Kreuzung, homozygot genetisch modifizierter Mäuse erlaubt.
1 stellt die gezielte Disruption des SHIP2-Gens dar, (a, das Wildtyp-Allel (oben) und der Zielvektor (unten) sind dargestellt (Exons, geschlossene Kästchen) sowie die zwei Sonden, die in der Southern-Analyse verwendet wurden und die DNA-Fragmente, die nach Verdau mit EcoRI und BamHI erzeugt wurden. R: EcoRI; B: BamHI. b, Southern-Blot-Analyse wildtyptischer (+/+) und rekombinanter (+/–) ES-Zellen sowie der Nachkommenschaft einer heterozygoten Kreuzung. Genomische DNA wurde entweder mit EcoRI oder BamHI verdaut und mit der Sonde 1 hybridisiert. c, Northern-Blot-Analyse von mRNA (2 μg/Spur), die aus SHIP2^+/+-, SHIP2^+/–- und SHIP2^–/–-MEFs isoliert wurden, die mit einem SHIP2- oder Aktin-cDNA-Fragment der Maus als Sonden hybridisiert wurden. d, Western-Blot-Analyse von Proteinen (100 μg/Spur), die aus SHIP2^+/+-, SHIP2^+/–- und SHIP2^–/–-MEFs isoliert wurden, die mit einem Anti-SHIP2- Antikörper aus dem Kaninchen geprobt wurden. Ein einziges Signal bei 160 kDa wird beobachtet.)
2 stellt die beeinträchtigte Glukosehomöostase in SHIP2^–/–-Neugeborenen dar. (a, Blutglukose-(oben) und Plasmainsulin-(unten)Konzentrationen in 10 bis 15 Stunden alten SHIP2^+/+-, SHIP2^+/–- und SHIP2^–/–-Neugeborenen, denen innerhalb der ersten post-natalen Stunde Anti-Insulin-Ak injiziert wurden oder denen sie nicht injiziert wurden (1/800 in 0,9% NaCl, 100 μl pro Neugeborenem). Die Werte sind als Mittelwert +/– SEM ausgedrückt, die aus der Analyse von 9 SHIP2^+/+-, 8 SHIP2^+/–-, 8 SHIP2^–/–- und 6 Anti-Insulin-Ak-behandelten SHIP2^–/–-Mäusen gewonnen wurden. b, Mortalität von SHIP2^–/–-Neugeborenen (n = 22/Gruppe), denen entweder D-Glukose (7%, 100 μl pro Injektion während des ersten post-natalen Tags) oder ein neutralisierender Anti-Insulin-Ak aus dem Meerschweinchen (1/800 in 0,9% NaCl, 100 μl innerhalb der ersten post-natalen Stunde) injiziert wurde oder denen nichts injiziert wurde. Mann-Whitney-Tests zeigten, dass die Mortalität von unbehandelten und behandelten SHIP2^–/–-Mäusen signifikant unterschiedlich war (P < 0,001). Die Mortalität von SHIP2^–/–-Neugeborenen, die entweder mit normalem Meerschweinchen-Serum (1/800 in 0,9% NaCl, 100 μl pro Neugeborenem) oder 0,9% NaCl behandelt wurden, war nicht signifikant unterschiedlich von der von unbehandelten SHIP2^–/–-Mäusen (Daten nicht gezeigt). c. Northern-Blot-Analyse der PEPCK-, TAT-5'- und G-6-Pase-Expression in der Leber von 2 bis 3,5 Stunden alten SHIP2^+/+- und SHIP2^–/–-Neugeborenen, die mit einer einzelnen Injektion von Anti-Insulin-Ak aus Meerschweinchen innerhalb der ersten Stunde nach ihrer Geburt behandelt wurden oder Neugeborenen, die nicht behandelt wurden. Der Blot wurde mit einer 18S RNA-Antisense-Oligonukleotid-Sonde hybridisiert, um die gleichmäßige Beladung mit Gesamt-RNA zu kontrollieren.)
3 zeigt die gesteigerte Insulin-Sensitivität in adulten SHIP2^+/–-Mäusen. (a, Blutglukose-(oben) und Plasmainsulin-(unten)Konzentrationen in einem Glukosetoleranztest. Die Werte sind als der Mittelwert +/– SEM dargestellt, der von 6 SHIP2^+/+- (ausgefüllte Kreise) und SHIP2^+/– (ausgefüllte Quadrate) Mäusen erhalten wurde, die ein nicht unterscheidbares Körpergewicht aufweisen. *P < 0,05; **P < 0,01 (Student-T-Test). b, Blutglukose-Konzentrationen in einem Insulintoleranztest. Die Werte sind als der Mittelwert +/– SEM dargestellt, der von 10 SHIP2^+/+-(ausgefüllte Kreise) und SHIP2^+/–-(ausgefüllte Quadrate)Mäusen erhalten wurde. **P < 0,01; ***P < 0,001 (Student-T-Test). c, Northern- und Western-Blot-Analyse von Gesamt-RNA und Proteinen, die aus skelettalen Muskeln von 6–8 Wochen alten SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–- Mäusen isoliert wurden. Der Northern-Blot wurde mit einem cDNA-Fragment von SHIP2 oder einem 18S RNA-Antisense-Oligonukleotid der Maus als Sonden hybridisiert; es wurde ein Anti-SHIP2-Ak verwendet, um SHIP2-Protein nachzuweisen. d, GLUT4-Expression in skelettalen Muskeln von adulten SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen. Die Mäuse wurden über Nacht ausgehungert und injiziert (Insulin) oder nicht mit Insulin injiziert (basal). Die Plasmamembranreiche Fraktion wurde aus Myozyten isoliert, und GLUT4-Spiegel in dieser Fraktion wurden mittels Western-Blot bestimmt. Die Resultate repräsentieren drei separate Experimente. Die Menge von GLUT4 war in dem Gesamt-Lysat, das von SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Myozyten zubereitet wurde, ähnlich (Daten nicht gezeigt). e, Glykogensynthese in isolierten Soleus-Muskeln aus adulten SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen. Soleus-Muskeln wurden von über Nacht ausgehungerten männlichen SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen isoliert und 60 min. lang ohne oder mit (0,1–50 nM) Insulin und [³H]-3-Glukose (5 mM, 1 μCi/ml) inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Muskeln aufgelöst, und das Glykogen wurde präzipitiert und gezählt. Linke Abbildung: Die Werte sind als nmol Glukose dargestellt, die in Glykogen pro mg Muskelprotein eingebaut wurden, und sind als Mittelwerte +/– SEM von 7–8 Muskeln dargestellt (ausgenommen bei 0,1 nM, wo 4 Muskeln verwendet wurden). *P < 0,02, **P < 0,03 (Student-T-Test). Rechte Abbildung: Die Resultate sind als Prozent der maximalen Insulin-Wirkung dargestellt (bestimmt, indem die auf Insulin-beruhende Zunahme bei jeder Hormonkonzentration durch die maximale Zunahme der Insulin-Wirkung bei 50 nM geteilt wurde).)
Um die Funktionen des SHIP2-Moleküls in vivo zu charakterisieren, haben die Erfinder einen Mausstamm erzeugt und analysiert, dem gemäß des folgenden bevorzugten Verfahrens das SHIP2-Gen fehlt.
Produktion von SHIP2-defizienten Mäusen und Genotypisierung
Der Zielvektor wurde konstruiert, indem ein 7,3 kb langes genomisches Fragment, das die Exons 19–29 und das Polyadenylierungssignal des SHIP2-Gens der Maus enthält, durch eine Neomycin-Resistenzkassette ersetzt wurde (Schurmans et al. (1999)). Die Kassette wurde an ihrer 5'- beziehungsweise 3'-Region von einem 4,0 kb und einem 5,5 kb langen genomischen DNA-Fragment der Maus flankiert. R1 ES-Zellen wurden mit dem Zielplasmid, das mit SalI linearisiert wurde, elektroporiert. Homologe Rekombination am SHIP2-Lokus wurde mittels Southern-Blot bestätigt, und SHIP2^+/–-ES-Zellen wurden mit Morulae, die von CDI-Mäusen stammten, angesammelt. Die resultierenden chimären Mäuse übertrugen das mutante Allel an die Nachkommen. Zur Genotypisierung wurde eine Southern-Analyse mit spezifischen Sonden (die in 1a beschrieben sind) oder eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer ausgeführt, um das neo-Gen und ein spezifisches Exon zu amplifizieren, das in dem mutanten Allel deletiert ist.
Northern- und Western-Analyse
Boten-RNA wurde aus embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) unter Verwendung eines Fast-Track-Kits (Invitrogen) extrahiert, und Gesamt-RNA wurde aus der Leber Neugeborener und aus adulten skelettalen und Herz-Muskeln unter Verwendung des RNeasy-Mini-Kits (Quiagen) aufgereinigt. 2 μg/Spur mRNA oder 20 μg/Spur Gesamt-RNA wurde auf ein 1%-Agarosegel geladen und auf eine Nylonmembran übertragen. Die Membranen wurden mit cDNA-Fragmenten der Maus, die für SHIP2, TAT-5', C/EBPα, C/EBPβ, Aldolase B, Aktin oder G-6-Pase als Sonden hybridisiert. Antisense-Oligonukleotid-Sonden wurden für den Nachweis der PEPCK-mRNA (5'-CAGACCATTATGCAGCTGAGGAGGCATT-3') und der 18S-RNA (5'-GTGCGTACTTAGACATGCATG-3') verwendet (Lee et al. (1997)). Überstände von MEF-Homogenaten, die aus SHIP2^+/+-, SHIP2^+/–- und SHIP2^–/–-Embryos des Tages 13,5 isoliert wurden, wurden mittels Western-Blot analysiert. Proteine (100 μg/Spur) wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Die Absättigung, die Inkubation mit Anti-SHIP2-Antiserum aus dem Kaninchen und der ECL-Nachweis wurden wie bereits beschrieben ausgeführt (Bruyns et al. (1999)). Für die in vivo GLUT4-Expression wurden SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäuse (6–10 Wochen alt) über Nacht ausgehungert, anästhesiert, und ihnen wurde 1 mU/g (Körpergewicht) Insulin intravenös injiziert oder nicht injiziert. Nach 5 min. wurden die skelettalen Muskeln aus den hinteren Gliedmaßen entfernt. Eine Plasmamembran-reiche Fraktion und ein Gesamt-Lysat wurden aus Myozyten wie vorher beschrieben zubereitet (Simpson et al. (1983), Higaki et al. (1999)). Protein-Aliquots (100 μg) wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem Anti-GLUT4-Antikörper geblottet. Immunkomplexe wurden unter Verwendung von ¹²⁵I-Protein-A nachgewiesen.
Glukose- und Insulin-Toleranztest
SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäuse (6–10 Wochen alt) wurden mehr als 12 h lang ausgehungert, und ihnen wurde intraperitoneal entweder 1,5 mg/g (Körpergewicht) D-Glukose oder 1 mU/g (Körpergewicht) Insulin (Actrapid^TM, Novo Nordisc, Dänemark) injiziert. Blutproben wurden aus dem retro-orbitalen Sinus zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen. Die Blutglukose-Konzentration wurde enzymatisch bestimmt. Plasmainsulin-Spiegel wurden unter Verwendung eines Insulin-ELISA-Kit^TM für Ratten bestimmt (Mercodia AB, Uppsala, Schweden).
In vivo-Behandlungen mit Glukose oder Anti-Insulin-Antikörpern
Neugeborene erhielten entweder wiederholte intraperitoneale Injektionen von D-Glukose (7%, 100 μl pro Injektion) während der ersten 24 Stunden nach ihrer Geburt oder eine einzelne intraperitoneale Injektion von Anti-Schwein-Insulin polyklonalem Ak aus dem Meerschweinchen (1/800 in 0,9% NaCl, 100 μl; ref AB1295^TM, Chermicon Int Inc, Temecula, CA, USA) innerhalb der ersten post-natalen Stunde. Die neutralisierende Wirkung dieses Anti-Insulin-Antikörpers wurde nach Injektion in adulte Mäuse gezeigt, die mit Glukose beladen waren: Es wurden signifikant erhöhte Blutglukosespiegel nach 30 und 60 min. beobachtet, im Vergleich zu unbehandelten oder normalen Mäusen, die mit Serum von Meerschweinchen behandelt wurden.
Insulin-Ausschüttung aus Inselzellen der Bauchspeicheldrüse
Inseln der Bauchspeicheldrüse (Malaisse et al. (1984)), zubereitet unter Verwendung des Collagenase-Verfahrens aus den Bauchspeicheldrüsen von 3–4 Mäusen, wurden in Gruppen zu je 8 Inseln jeweils 90 min. bei 37°C in 1,0 ml eines Hepes- und Bikarbonat-gepufferten Mediums inkubiert, das 5 mg/ml bovines Serumalbumin und, soweit benötigt, 11,1 mM D-Glukose enthielt. Das in das Medium freigesetzte Insulin wurde mittels Radioimmunassay gemessen.
Analyse der Glykogen-Synthese in isolierten Soleus-Muskeln
Die zwei Soleus-Muskeln wurden schnell aus über Nacht ausgehungerten SHIP2^+/+- oder SHIP2^+/–-Mäusen isoliert und mittels ihrer Sehnen an rostfreie Stahlclips befestigt (Stenbit et al. (1996)). Alle Inkubationen wurden bei 37°C unter einer Atmosphäre von 95% O₂ : 5% CO₂ in 1 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer (pH 7,35), der mit 1% bovinem Serumalbumin (Fraction V, pH 7, Intergen) und 2 mM Pyruvat supplementiert wurde, ausgeführt. Nach einer 15-minütigen Prä-Inkubation ohne Insulin wurden die Muskeln 60 min. lang ohne oder mit den angegebenen Insulin-Konzentrationen in demselben Medium ohne Pyruvat, aber mit 3-[³H]-Glukose (5 mM, 1 μCi/ml) inkubiert. Danach wurden die Muskeln in 1 N NaOH aufgelöst und Aliquots der alkalischen Lösung wurde auf Whatmann-Papieren aufgetropft. Die Papiere wurden in eiskalten 60% Ethanol getaucht und vor der Zählung extensiv in 60% Ethanol (3 Waschschritte von 20 min. Länge) gewaschen. Alle Ergebnisse wurden pro mg Muskelprotein (bestimmt mittels des wohlbekannten Pierce-Assays) ausgedrückt.
Ergebnisse
Nach der Elektroporation von embryonalen Stammzellen (ES) mit dem Zielvektor haben die Erfinder Southern-Blots und zwei unterschiedliche Sonden und Restriktionsenzyme verwendet, um rekombinante Klone mit einer 7,3 kb langen genomischen DNA-Deletion auf einem Allel des SHIP2-Gens zu identifizieren (1a, b). Die Kreuzung chimärer Männchen mit C57BL/6-Weibchen resultierte in F1-heterozygoten(SHIP2^+/–)-Mäusen, die keine offensichtlichen Anomalien aufwiesen. Das Körpergewicht nach 8 Wochen, die Lebenserwartung und die spontane Tumorinzidenz unterschieden sich nicht signifikant von den Werten von Wildtyp-SHIP2^+/+-Mäusen. F1-SHIP2^+/–-Mäuse wurden anschließend geselbstet, und 182 lebensfähige Nachkommen wurden bei ihrer Geburt genotypisiert; von diesen waren 47 (26%) SHIP2^+/+, 94 (51%) SHIP2^+/– und 41 (22%) SHIP2^–/–. Diese Frequenzen liegen innerhalb der zu erwartenden Verteilung nach Mendel für die Weitergabe eines autosomalen Gens und legt nahe, dass die Disruption beider SHIP2-Allele keine embryonale Letalität verursacht. Embryonale Fibroblasten embryonaler Mäuse am Tag 13,5 (MEF) wurden analysiert, um die reduzierten Spiegel und das komplette Fehlen der SHIP2-mRNA (1c) oder -Proteins (1b) in SHIP2^+/–- beziehungsweise SHIP2^–/–-Mäusen zu bestätigen.
Zum Zeitpunkt der Geburt waren SHIP2^–/–-Mäuse phänotypisch nicht von ihren Wurfgeschwistern zu unterscheiden; die meisten von ihnen waren in der Lage, zu fressen, obwohl fortschreitend weniger effizient als SHIP2^+/+- oder SHIP2^+/–-Mäuse. Eine detaillierte Überwachung deckte auf, dass SHIP2^–/–-Mäuse während der ersten 24 Stunden ihres Lebens fortschreitend zyanotisch oder blass und lethargisch wurden. Einige Neugeborene SHIP2^–/–-Jungtiere zeigten Zeichen von respiratorischen Problemen und zeigten keine Gewichtszunahme (SHIP2^+/+: 1,60 +/– 0,02 g, SHIP2^+/–: 1,63 +/– 0,04 g und SHIP2^–/–: 1,20 +/– 0,01 g für einen typischen Wurf von 10 Neugeborenen, 18 Stunden nach der Geburt; Student-T-Test, P < 0,005), und starben innerhalb von 3 Tagen nach der Geburt. Die Ursache der respiratorischen Probleme, die in einigen SHIP2^–/–-Mäusen beobachtet wurde, war nicht in einem Fehlen von oberflächenaktivem Stoff oder einer anomalen Differenzierung der den oberflächenaktiven Stoff produzierenden Zellen begründet, da die Expression von Proteinen (SPA SP-B und SP-C), die mit oberflächenaktiven Stoffen assoziiert sind, und der TTF-1- oder C/EBP-Transkriptionsfaktoren in den Lungen von SHIP2^–/–-Mäusen normal war. Darüber hinaus deckte eine Hämatoxilin- und Eosinfärbung von SHIP2^–/–-Lunge, sowie des Gehirns, des Herzens, des Thymus, der Leber, des Magens, des Pankreas, der Niere, der Haut, des Muskels, der Milz, der Blase und von Schnitten des Dünn- und Dickdarms keine besonderen Anomalitäten auf.
In Neugeborenen ist eine ernste Hypoglykämie häufig mit zyanotischen Abschnitten, Apnoe, respiratorischen Problemen, Nahrungsmittelaufnahmeverweigerung und Somnolenz assoziiert. 2 und 8 Stunden nach dem Wurf wurde kein Unterschied in den Blutglukose-Konzentrationen bei den verschiedenen Genotypen beobachtet. Allerdings war die Blutglukose-Konzentration in SHIP2^–/–-Mäusen signifikant geringer als in SHIP2^+/–- und SHIP2^+/+-Mäusen, als sie zwischen 10 bis 15 Stunden nach der Geburt analysiert wurde (2a; Student-T-Test, P < 10^–6). Die Hypoglykämie war weder in Glykosuria noch in einer exzessiven Sekretion von Insulin durch die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse begründet: Plasmainsulin-Spiegel waren in SHIP2^–/–-Mäusen signifikant geringer als in SHIP2^+/–- und SHIP2^+/+-Mäusen (2a; Student-T-Test, P < 0,05). Die Histologie und Immunhistochemie von Inseln der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung von Anti-Insulin-, -Glukagon- und -Somatostatin-Antikörpern deckte keine Anomalitäten der Antigenexpression und -Verteilung in SHIP2^–/–-Mäusen auf. Um zu überprüfen, ob die Hypoglykämie die Ursache von post-natalem Tod war, wurde in SHIP2^–/–-Mäuse D-Glukose injiziert. Hypoglykämische SHIP2^–/–-Mäuse wurden transient für bis zu 96 Stunden mittels wiederholten Injektionen von D-Glukose während der ersten 24 Stunden nach der Geburt gerettet (2b). Etwa 10 Minuten nach jeder Injektion gewannen die SHIP2^–/–-Neugeborenen eine normale Hautfarbe wieder und waren weniger lethargisch als nicht-injizierte Mäuse. Ein verlängertes Überleben wurde auch beobachtet, wenn SHIP2^–/–-Mäusen innerhalb der ersten Stunde nach der Geburt ein neutralisierender Antikörper gegen Insulin injiziert wurde (2b). Darüber hinaus steigerte eine Anti-Insulin-Ak-Injektion in SHIP2^–/–-Mäuse signifikant die Glukose-Konzentrationen zum Zeitpunkt von 10–15 Stunden nach der Geburt, im Vergleich zu nicht-injizierten Mäusen (2a, Student-T-Test, P < 0,0002). Diese Daten zeigen an, dass die Hypoglykämie in SHIP2^–/–-Mäusen nicht durch eine verstärkte Produktion von Insulin oder verringerten Glukagon-Spiegeln verursacht ist, sondern eher das Ergebnis einer verstärkten Sensitivität gegenüber Insulin ist.
Die Leber spielt bei der Geburt eine wichtige Rolle in der Glukose-Homöostase: Sie stellt dem Blut mittels der Glukoneogenese Glukose bereit. Während dieses kritischen Zeitraums wird die Transkription von mehreren hepatischen Enzymen, die an der Glukoneogenese beteiligt sind, in Reaktion auf hormonelle und diätetische Bedingungen aktiviert. Eine Störung der Glukagon- oder Insulin-Signalkaskaden bei oder knapp vor der Geburt resultiert in einem verspäteten oder vorzeitigen Auftreten dieser Enzyme und in einer neonatalen Hypoglykämie oder einem Diabetes. Die Expression von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK), einem Schlüsselenzym der Glukoneogenese, war in der Leber von SHIP2^–/–-Mäusen, im Vergleich zu SHIP2^+/+-Mäusen, sehr gering oder sie fehlte gänzlich (2c). Die Injektion von einem neutralisierenden Anti-Insulin-Ak in SHIP^–/–-Mäuse stellte eine normale Expression der PEPCK mRNA wieder her (2c). Die Expression von hepatischer Tyrosin-Aminotransferase (TAT-5') und Glukose-6-Phosphatase (G-6-Pase), zwei weiterer glukoneogener Enzyme, die nach der Geburt ebenfalls induziert sind, war ebenfalls abgeschwächt, obwohl zu einem geringeren Ausmaß als PEPCK (2c). Die Spiegel von C/EBP-, C/EBP- und Aldolase B-mRNA waren von der Mutation nicht betroffen. Daher führt das Fehlen von SHIP2 zu einer verringerten Expression von mehreren Schlüsselenzymen der Glukoneogenese, was zur Hypoglykämie in Neugeborenen SHIP2^–/–-Mäusen beiträgt. Es ist wichtig zu betonen, dass trotz der geringen Insulinspiegel, die in mutanten Mäusen gefunden wurden, die Expression von PEPCK induziert wurde, wenn Insulin früh nach der Geburt neutralisiert wird. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass SHIP2^–/–-Leberzellen in vivo eine verstärkte Sensitivität gegenüber Insulin besitzen.
Da SHIP2 ein wichtiger negativer Regulator der Insulinsensitivität in vivo ist und da der Verlust von SHIP2 zu einer letalen Hypoglykämie in neugeborenen Mäusen führt, wurde untersucht, ob verringerte Mengen der SHIP2-Expression in SHIP2^+/–-Mäusen (1c, 1d, 3c) die Insulinsensitivität verändern würde. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den basalen Blutglukose- oder Plasmainsulin-Spiegeln zwischen adulten SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen, entweder nach einer Aushungerung über Nacht (3a) oder wenn sie frei gefüttert wurden (Glukosespiegel in frei-gefütterten Mäusen: 9,8 +/– 0,5 mM versus 8,8 +/– 0,2 mM in SHIP2^+/+- beziehungsweise SHIP2^+/–-Mäusen; Insulinspiegel in frei-gefütterten Mäusen: 1,17 +/– 0,29 μg/l versus 0,96 +/– 0,16 μg/l in SHIP2^+/+- beziehungsweise SHIP2^+/–-Mäusen). Allerdings resultierte die Injektion von D-Glukose in einer schnelleren Glukose-Clearance in SHIP2^+/–- als in SHIP2^+/+-Mäusen: Die Glykämie war zu allen Zeitpunkten in SHIP2^+/–-Mäusen signifikant geringer (3a). Die gesteigerte Glukose-Clearance in SHIP2^+/–-Mäusen war keine Folge einer erhöhten Freisetzung von Insulin: 30 Minuten nach Glukoseverabreichung waren die Insulinspiegel in SHIP2^+/–-Mäusen ebenfalls signifikant geringer als in Wildtyp-Mäusen (3a). Darüber hinaus war die Freisetzung von Insulin aus isolierten Inseln der Bauchspeicheldrüse in Reaktion auf Glukose in SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen nicht signifikant unterschiedlich. Insulinhypersensitivität wurde gezeigt, als den Mäusen Insulin injiziert wurde, dies bedeutet, dass 30 und 60 min. nach der Injektion in SHIP2^+/–-Mäusen eine signifikant schwerere Hypoglykämie beobachtet wurde als in SHIP2^+/+-Mäusen (3b).
Insulin stimuliert den Glukosetransport und die Speicherung von Glukose als Glykogen in skelettalen Muskeln durch die Translokation des GLUT4-Glukosetransporters aus intrazellulären Speichern auf die Zelloberfläche (Czech et al. (1999)) und durch die Aktivierung der Glukogensynthase. Der Verlust eines SHIP2-Allels resultierte in einer reduzierten SHIP2-mRNA und -Proteinexpression in skelettalen Muskelzellen (3c). Nach einer Aushungerung über Nacht war die Menge des GLUT4-Transporters in der Myozyten-Plasma-Membranfraktion gering, aber in SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäusen ähnlich (3d). Allerdings waren, wenn SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Mäuse mit Insulin versehen wurden, die GLUT4-Spiegel in der Plasmamembran in skelettalen Muskeln von SHIP2^+/–-Mäusen höher, was mit der erhöhten Glukose-Clearance übereinstimmt, die in diesen Mäusen gefunden wurde. Die Glykogensynthese in Reaktion auf eine Insulinstimulierung, die sowohl eine Aktivierung der Glukoseaufnahme als auch der Glukogensynthase widerspiegelt, wurde in isolierten Soleus-Muskeln aus SHIP2^+/–- und SHIP2^+/+-Mäusen analysiert (3e). Unter basalen Bedingungen oder in Gegenwart von maximal-stimulierenden Insulin-Konzentrationen (2 und 50 nM) wurde in SHIP2^+/+- und SHIP2^+/–-Muskeln eine ähnliche Glykogensynthese beobachtet. Allerdings resultierte die Stimulierung mit niedrigeren, physiologischen Insulin-Konzentrationen (0,1 oder 0,3 nM) in einer signifikant höheren Glykogensynthese in SHIP2^+/–-Muskeln als in SHIP2^+/+-Muskeln (3e). Wenn die Insulin-Dosis-Reaktionskurve in % der maximalen Insulinwirkung dargestellt wird, verlagert sie sich in Richtung der geringeren Insulin-Konzentrationen in SHIP2^+/–-Mäusen, im Vergleich zu SHIP2^+/+-Mäusen (3e). Zusammengenommen zeigen die Daten, dass die Insulinsensitivität in skelettalen Muskeln von heterozygoten Mäusen, die nur eine verringerte Menge des SHIP2-Proteins exprimieren, signifikant erhöht ist.
Das Auftreten des im Erwachsenenalter auftretenden Diabetes mellitus ist dramatisch angestiegen, und die Erkrankung ist ein vorrangiges Problem des Gesundheitswesens. Die Resistenz gegenüber der stimulatorischen Wirkung von Insulin auf die Glukoseverwertung ist ein Schlüsselmerkmal der Erkrankung in den meisten Formen des im Erwachsenenalter auftretenden (Typ II oder des Insulin-unabhängigen) Diabetes und trägt zu der Morbidität bei, die mit dem autoimmunen (Typ I oder Insulin-abhängigen) Diabetes zusammenhängt. Es ist außerordentlich wichtig, die molekularen Mechanismen, die den Insulin-Signalweg regulieren, besser zu verstehen. Daten, die aus genetisch modifizierten Mäusen gewonnen werden, identifizieren SHIP2 als einen kritischen und essentiell negativen Regulator des Insulin-Signalwegs und der Insulin-Sensitivität in vivo. Daher ist SHIP2 ein neuartiges therapeutisches Ziel für die Behandlung von Typ II-Diabetes und ein Kandidatengen, das zu der Prädisposition für diese Erkrankung führt.
LITERATURANGABEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines nicht-humanen Knock-out Säugers, der in seinem Genom homozygot oder heterozygot eine partielle oder vollständige Deletion der Nukleotidsequenz der Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase SHIP2 umfasst, als ein Modell zur Untersuchung von Erkrankungen, wobei die Erkrankungen durch das Vorliegen einer Insulinhypersensitivität in einem Patienten verursacht werden, sowie als ein Modell zur Untersuchung der Behandlung der Erkrankungen in dem Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung aus schwerer Hypoglykämie des Neugeborenen und beeinträchtigter Glukosetoleranz des Erwachsenen ausgewählt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Patient ein Mensch ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Knock-out Säuger eine Maus ist.