JP6942036B2 - 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー - Google Patents
脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP6942036B2 JP6942036B2 JP2017230639A JP2017230639A JP6942036B2 JP 6942036 B2 JP6942036 B2 JP 6942036B2 JP 2017230639 A JP2017230639 A JP 2017230639A JP 2017230639 A JP2017230639 A JP 2017230639A JP 6942036 B2 JP6942036 B2 JP 6942036B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- dido1
- acid sequence
- cerebral infarction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 title claims description 78
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 title claims description 75
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title description 94
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 title description 94
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title description 31
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title description 3
- 102100032501 Death-inducer obliterator 1 Human genes 0.000 claims description 112
- 101000869896 Homo sapiens Death-inducer obliterator 1 Proteins 0.000 claims description 111
- 102100038642 Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2 Human genes 0.000 claims description 88
- 101000957590 Homo sapiens Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2 Proteins 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 80
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 44
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 claims description 24
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 14
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims description 10
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 8
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 238000012767 chemiluminescent enzyme immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 14
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 78
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 78
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 73
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 72
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 25
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 7
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 6
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 6
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 6
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 6
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 5
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 5
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 101150069308 CPSF2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000422842 Chamaecyparis pisifera Species 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 3
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 3
- 101150067101 DIDO1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101100387345 Homo sapiens DIDO1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 2
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- -1 etc. Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006449 Class 8 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010044226 Class 8 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010076130 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000011591 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100027700 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA2 Human genes 0.000 description 1
- 101710081796 Death-inducer obliterator 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031242 Deoxyhypusine synthase Human genes 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000650600 Homo sapiens DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA2 Proteins 0.000 description 1
- 101000844963 Homo sapiens Deoxyhypusine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101000728117 Homo sapiens Plasma membrane calcium-transporting ATPase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001092206 Homo sapiens Replication protein A 32 kDa subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000963987 Homo sapiens SH3 domain-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000825071 Homo sapiens Sclerostin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029743 Plasma membrane calcium-transporting ATPase 4 Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100040119 SH3 domain-binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022432 Sclerostin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012352 Spearman correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003727 cerebral blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 201000009925 nephrosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012946 outsourcing Methods 0.000 description 1
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 206010038464 renal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は疾患の検出手段に関する発明であり、より具体的にはＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はこれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体をバイオマーカーとして検出することによる、脳梗塞の発症リスクの把握手段に関する発明である。
脳梗塞は、直接死に至る場合も多く、たとえ死に至らなくともその後の長いリハビリを余儀なくされ、寝たきりになる原因の第一位である。患者本人やその家族にとって負担が重いものであり、社会的にも国民医療費の増大につながり、その発症の予防は重要な課題である。もし、脳梗塞の微細な兆候を把握し、その後の脳梗塞の発症を予測できるなら、発症前の治療や生活習慣の改善により、脳梗塞発症を予防できる可能性が極めて高い。
そこで、脳梗塞の病状把握のために、Ｈｓｐ６０（非特許文献１）、ＲＰＡ２（非特許文献２），ＳＯＳＴＤＣ１（非特許文献３）が報告されている。また、脳梗塞に関連する疾患バイオマーカーとしては、動脈硬化のｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＨＤＬ）−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＬＤＬ）−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ （ＴＣ）（非特許文献４）、アディポネクチン（非特許文献５）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（非特許文献６）、ＡＴＰ２Ｂ４（非特許文献７）、ＢＭＰ−１（非特許文献７）、ＤＨＰＳ（非特許文献８），ＳＨ３ＢＰ５（非特許文献９），心血管障害のｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（非特許文献１０）、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−１（非特許文献１１）、ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（非特許文献１２）、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｓｐｓ）（非特許文献１３）、糖尿病のｉｎｓｕｌｉｎ（非特許文献１４）、ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ （ＨｂＡ１ｃ）（非特許文献１５）、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）（非特許文献１６）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＩＡ−２（非特許文献１７）等が知られている。
Kramer J, Harcos P, Prohaszka Z, Horvath L, Karadi I, Singh M, Csaszar A, Romics L, Fust G. Frequencies of certain complement protein alleles and serum levels of anti-heat-shock protein antibodies in cerebrovascular diseases. Stroke 2000; 31: 2648-2652.
Machida T, Kubota M, Kobayashi E, Iwadate Y, Saeki N, et al. Identification of stroke-associated-antigens via screening of recombinant proteins from the human expression cDNA library (SEREX). J Translat Med 2015; 13: 71.
Goto K, Sugiyama T, Matsumura R, Zhang XM, Kimura R, et al. Identification of cerebral infarction-specific antibody markers from autoantibodies detected in patients with systemic lupus erythematosus. J Mol Biomark Diagnos 2015; 6: 2.
Libby P, Ridker PM, Hansson GK. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature 2011; 473: 317-325.
Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N, Hara K, Ueki K, Tobe K. Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J Clin Invest 2006; 116: 1784-1792.
Nakanishi N, Okamoto M, Yoshida H, Matsuo Y, Suzuki K, et al. Serum uric acid and risk for development of hypertension and impaired fasting glucose or type II diabetes in Japanese male office workers. Eur J Epidemiol 2003; 18: 523-530.
Hiwasa T, Machida T, Zhang XM, Kimura R, Wang H, et al. Elevated levels of autoantibodies against ATP2B4 and BMP-1 in sera of patients with atherosclerosis-related diseases. Immunome Res 2015; 11: 097.
Nakamura R, Tomiyoshi G, Shinmen N, Kuroda H, Kudo T, et al. An anti-deoxyhypusine synthase antibody as a marker of atherosclerosis-related cerebral infarction, myocardial infarction, diabetes mellitus, and chronic kidney disease. SM Atheroscler J 2017; 1: 1001.
Hiwasa T, Tomiyoshi G, Nakamura R, Shinmen N, Kuroda H, et al. Serum SH3BP5-specific antibody level is a biomarker of atherosclerosis.Immunome Res 2017; 13: 2.
Liang KP, Kremers HM, Crowson CS, Snyder MR, Therneau TM, Roger VL, Gabriel SE. Autoantibodies and the risk of cardiovascular events. J Rheumatol 2009; 36: 2462-2469.
Montecucco F, Vuilleumier N, Pagano S, Lenglet S, Bertolotto M, Braunersreuther V, Pelli G, Kovari E, Pane B, Spinella G, Pende A, Palombo D, Dallegri F, Mach F, Roux-Lombard P. Anti-apolipoprotein A-1 auto-antibodies are active mediators of atherosclerotic plaque vulnerability. Eur Heart J 2011; 32: 412-421.
Fesmire J, Wolfson-Reichlin M, Reichlin M. Effects of autoimmune antibodies anti-lipoprotein lipase, anti-low density lipoprotein, and anti-oxidized low density lipoprotein on lipid metabolism and atherosclerosis in systemic lupus erythematosus. Rev Bras Reumatol 2010; 50: 539-551.
Carbone F, Nencioni A, Mach F, Vuilleumier N, Montecucco F. Evidence on the pathogenic role of auto-antibodies in acute cardiovascular diseases. Thromb Haemost 2013; 109: 854-868.
Palmer JP, Asplin CM, Clemons P, Lyen K, Tatpati O, Ragh, PK, Paquette TL. Insulin antibodies in insulin-dependent diabetics before insulin treatment. Science 1983; 222: 1337-1339.
Rollins KE, Varadhan KK, Dhatariya K, Lobo DN. Systematic review of the impact of HbA1c on outcomes following surgery in patients with diabetes mellitus. Clin Nutr 2015; S0261-5614: 00082-5.
Baekkeskov S, Aanstoot H, Christgau S, Reetz A, Solimena MS, Cascalho M, Folli F, Richter-Olsen H, DeCamilli P. Identification of the 64K autoantigen in insulin dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature 1990; 347: 151-156.
Payton MA, Hawkes CJ, Christie MR. Relationship of the 37,000- and 40,000-M(r) tryptic fragments of islet antigens in insulin-dependent diabetes to the protein tyrosine phosphatase-like molecule IA-2 (ICA512). J Clin Invest 1995; 96: 1506-1511.
Libby P, Ridker PM, Hansson GK. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature 2011; 473: 317-325.
脳梗塞等の脳血管障害は日本人の死因の第４位を占め、寝たきりになる原因の第１位となっている。脳梗塞を一度発症すると、たとえ死に至らなくとも長いリハビリと薬の服用を余儀なくされる。従って、発症を未然に防ぐことが第一であり、そのためのさまざまなリスクファクターが同定され、高血圧、高脂血症、糖尿病、喫煙習慣、及び血液検査の中性脂肪、悪玉コレステロール値、低アディポネクチン値等さまざまなものが知られている（非特許文献１８、５）。しかし、糖尿病等は治療が難しく、一方で、血液検査項目が異常値でもただちに脳梗塞を発症するわけではない。リスクファクターを組み合わせた発症予測も試みられているが、まだ十分とは言えない。
本発明者らは、体液中のＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体レベルを測定することにより、脳梗塞の発症につながる兆候を的確に把握することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明において「脳梗塞」とは、脳の血管が動脈硬化により狭くなり、血栓が詰まることによって酸素や栄養が欠乏するために脳神経細胞が障害を受ける疾患、である。
本発明は、第一に、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞の発症に関するデータ取得方法（以下、本発明のデータ取得方法ともいう）を提供する。
本発明のデータ取得方法における測定対象である体液抗体を捕捉する基礎である、抗原としてのＤＩＤＯ１蛋白質は、death inducer-obliterator 1とも称されるＤＩＤＯ１蛋白質の、１から６までのスプライシングバリアント（アクセッションナンバーは１から６までそれぞれＮＭ＿０２２１０５．４、ＮＭ＿０８０７９６．３、ＮＭ＿０８０７９７．３、ＮＭ＿０３３０８１．２、ＮＭ＿００１１９３３６９．１、ＮＭ＿００１１９３３７０．１がＮＣＢＩに登録されている）の一つである。ＤＩＤＯ１スプライシングバリアント４遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示す通りである。ＤＩＤＯ１蛋白質のスプライシングバリアント１と２は５６２アミノ酸、スプライシングバリアント３と６は１１８９アミノ酸、スプライシングバリアント４と５は２２４０アミノ酸から成る。ＤＩＤＯ１の最長のスプライシングバリアント４のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。後述する実施例で抗原として用いたＤＩＤＯ１蛋白質はＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）であり、この領域はＤＩＤＯ１すべてのスプライシングバリアントで共通する配列である。また、同じく実施例で抗原として用いたＤＩＤＯ１ペプチドは５４３−５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）であり、この領域はＤＩＤＯ１スプライシングバリアント３から６に共通する配列である。ＤＩＤＯ１の蛋白質抗原でもペプチド抗原でも類似の結果を得ていることから、体液抗体が認識するＤＩＤＯ１蛋白質は異なるスプライシングバリアントを識別しているものではないと考えられる。即ち、本発明のＤＩＤＯ１とは特定のスプライシングバリアントに限定されるものではない。
ＣＰＳＦ２蛋白質は、別名cleavage and polyadenylation specific factor 2、又はＣＰＳＦ１００と称され、アクセッションナンバー「ＮＭ＿０１７４３７」としてＮＣＢＩに登録されている。ＣＰＳＦ２遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列は、配列番号５と６に示す通りである。
本発明のデータ取得方法の別の表現として、例えば、「生体から分離された体液サンプル中の、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞発症の把握方法」が挙げられる。
さらに、本発明は、第二に、本発明のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。
本発明のデータ取得用キットの別の表現として、例えば、「生体から分離された体液サンプル中の、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞発症の把握方法を行うためのキット」が挙げられる。
本発明により、ＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体、をバイオマーカーとして用いることによって、脳梗塞発症のリスクを的確に把握する手段が提供される。これにより脳梗塞発症の予防を行うこと、及び、脳梗塞の治療動機が提供される。さらに、脳梗塞発症につながる動脈硬化関連疾患の的確な病状把握を行うことができる。
（１）本発明のデータ取得方法
（ａ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
（ａ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
（ｂ）体液抗体捕捉抗原
本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎であるＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列である配列番号２、及びＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列である配列番号６は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。配列番号２のアミノ酸配列の一部を体液抗体捕捉抗原として用いる場合は、配列番号２のアミノ酸配列から７−１１８９個、及び配列番号６のアミノ酸配列から７−７８２個の連続したアミノ酸配列を選んで体液抗体捕捉抗原とすることが可能であり、ＤＩＤＯ１の全てのスプライシングバリアントにおいて共通する配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことが好ましい。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７−３０個程度が好適であり、さらに好適には１０−２０個程度である。
本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎であるＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列である配列番号２、及びＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列である配列番号６は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。配列番号２のアミノ酸配列の一部を体液抗体捕捉抗原として用いる場合は、配列番号２のアミノ酸配列から７−１１８９個、及び配列番号６のアミノ酸配列から７−７８２個の連続したアミノ酸配列を選んで体液抗体捕捉抗原とすることが可能であり、ＤＩＤＯ１の全てのスプライシングバリアントにおいて共通する配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことが好ましい。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７−３０個程度が好適であり、さらに好適には１０−２０個程度である。
また、これらのアミノ酸配列の全部又は一部のうち、１０％以下の個数のアミノ酸残基（小数点以下は切り捨て）が、改変（欠失、置換、又は、追加）されていてもよい。ただし、目的の体液抗体（ＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体）の捕捉が可能であること、すなわち、アミノ酸残基を改変した体液抗体捕捉抗原候補が、例えば、本明細書の実施例の手法と同様の手法で体液抗体の捕捉を行った場合に、その捕捉抗体レベルから、目的とする脳梗塞発症のリスク把握が可能であることが必要である。
「欠失」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、対象となるアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。Ｎ末端とＣ末端における新たな１個以上のアミノ酸残基の付加も、この「付加」の概念に含まれる。これらの「付加」されたアミノ酸残基の個数が「アミノ酸付加の個数」として数えられる。
体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチドのアミノ酸配列の好適な具体例として、ＤＩＤＯ１蛋白質由来としては、例えば、配列番号４（ＡＭＡＡＳＫＫＴＡＰＰＧＳＡＶＧＫＱ）が挙げられ、ＣＰＳＦ蛋白質由来としては、例えば、配列番号７（ＣＰＳＦ２−６０７: ＱＶＲＬＫＤＳＬＶＳＳＬＱＦＣ）が挙げられる。なお、これらの捕捉ペプチドのアミノ酸配列の改変可能な個数は、上記の基準より１個である。
所定のアミノ酸配列の体液抗体捕捉抗原は、常法に従って確保することが可能である。具体的には、例えば、配列番号１に示すＤＩＤＯ１遺伝子の塩基配列、又は配列番号６に示すＣＰＳＦ２遺伝子に基づいて、これらの塩基配列の全部若しくは一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物を、ＤＩＤＯ１遺伝子、又はＣＰＳＦ２遺伝子の全部若しくは一部として得て、これを用いてｐＧＥＸ−４Ｔ等の原核細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択し、さらにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の薬物を添加することにより所定のＤＩＤＯ１遺伝子、又はＣＰＳＦ２遺伝子の全部若しくは一部の発現を誘導し、発現されたＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の全部若しくは一部を、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
特に、ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の一部の配列を持つペプチド（典型的には、上記のアミノ酸残基数７−３０個の体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチド）は、公知のペプチドの化学合成法に従い容易に製造することが可能である。ペプチド合成に関しては、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法として、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能である。
ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の全部若しくは一部としては、市販品を用いることも可能である。市販品には、既製品はもとより、注文に応じて製造される外注品も含まれる。
また、これらの体液抗体捕捉抗原として用いられる蛋白質又はペプチド（体液抗体捕捉のための本質部分）には、必要に応じて適宜修飾構造を付加することができる。例えば、後述するように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法において用いられる、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）−融合化蛋白質又はペプチドや、ビオチン融合化蛋白質又はペプチドとすること等も可能である。
（ｃ）脳梗塞の発症に関するデータ取得方法について
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部（以下、「ＤＩＤＯ１抗原」ともいう）、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部（以下、「ＣＰＳＦ２抗原」ともいう）、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、及び／又は、ＣＰＳＦ２抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部（以下、「ＤＩＤＯ１抗原」ともいう）、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部（以下、「ＣＰＳＦ２抗原」ともいう）、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、及び／又は、ＣＰＳＦ２抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
具体的には、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、生体から分離された体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
被験試料におけるＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原に対する体液抗体レベルの標準値は、頭部ＭＲＩ検査において脳梗塞の兆候等の異常が認められない者からなる対照の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原に対する当該体液抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
当該体液抗体レベルの測定は、例えば、上述した体液抗体捕捉抗原（蛋白質、及びペプチドを含む。すなわち「ＤＩＤＯ１抗原」と「ＣＰＳＦ２抗原」）の固定化物に生体から分離された体液サンプルを接触させ、当該生体から分離された体液サンプル内のＤＩＤＯ１蛋白質に対する抗体、又はＣＰＳＦ２蛋白質に対する抗体（共に体液抗体）の当該体液抗体捕捉抗原との抗原抗体反応に基づく結合をシグナルとして検出することにより、行うことができる。具体的には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量測定を行うことができる。ここに例示したいずれの定量測定手段も、定量標的物質を生体から分離された体液サンプル中の抗体とした場合の、確立した定量測定手段である。
例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法では、ＧＳＴ−融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ−融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）を体液抗体捕捉抗原とする場合は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−結合ドナービーズを用い、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１ペプチド又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２ペプチドを体液抗体捕捉抗原とする場合はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−結合ドナービーズを用い、体液抗体捕捉抗原、血液サンプル、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させたアクセプタービーズを混合し、数時間から数日、室温でインキュベートし、形成された抗原抗体複合体に６８０ｎｍの光を照射し、発生した５２０−６２０ｎｍの光を検出することにより、所望の体液抗体の定量を行うことができる。間接蛍光抗体法では、所定の体液抗体捕捉抗原を固定化したプロテインアレイに生体から分離された体液サンプルを接触させて、形成された体液抗体捕捉抗原−抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又はＣＰＳＦ２体液抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質に対する体液抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、体液抗体捕捉抗原をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、生体から分離された体液サンプルを接触させて、生じた体液抗体捕捉抗原−抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又は同ＣＰＳＦ２体液抗体複合体を、二次抗体を用いて検出することにより定量測定を行うことができる。比濁法や比朧法では、生体から分離された体液サンプルと体液抗体捕捉抗原を接触させることにより形成された体液抗体捕捉抗原−抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又は同ＣＰＳＦ２体液抗体複合体を、濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子と生体から分離された体液サンプルとを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体をラテックス粒子に結合した体液抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、体液抗体捕捉抗原の結合磁性粒子と生体から分離された体液サンプルを接触させて、磁性粒子上に体液抗体捕捉抗原−抗ＣＰＳＦ２抗体複合体、又は同ＤＩＤＯ１抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量測定を行うことができる。
ここに「ＤＩＤＯ１抗原」と「ＣＰＳＦ２抗原」という、「生体から分離されたサンプル中の、これらの抗原に対する抗体をバイオマーカーとして測定・定量するための２種類の抗原」は、共に脳梗塞の発症リスクに対するバイオマーカーを検出する、という面において共通するが、それぞれに独自の特徴を有しており、これらを単独又は組み合わせて用いることにより、様々な状況対応した的確な脳梗塞の発症についてのデータを取得することができる。
第１に、「ＤＩＤＯ１抗原」に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの上昇を測定することにより、特に慢性腎臓病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得を行うことができる。「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」は、腎障害が３ヶ月以上持続した腎疾患であり、罹患者は、脳卒中や心筋梗塞等の心血管病のリスクが高いことが知られている。さらに、急性期脳梗塞発症の直前で抗ＤＩＤＯ１体液抗体レベルは急上昇する反面、慢性期脳梗塞では当該抗体レベルは低下する特徴を有している。
すなわち、慢性腎臓病患者に対して定期的に「ＤＩＤＯ１抗原」に対する体内抗体レベルをモニタリングすることにより、当該患者における脳梗塞の発症の予測を確度良く行うことができる。また、同時に脳梗塞の発症が極めて差し迫っていることを示す指標でもあるので、このバイオマーカーが高値の場合には、腎臓病の治療や血圧管理等による早急な予防対策を講ずる必要を示すものでもある。さらに、急性脳梗塞発症後のこのバイオマーカー値の低下をモニタリングすることにより、慢性期への移行を確認することも可能である。
第２に、「ＣＰＳＦ２抗原」に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの上昇を測定することにより、特に糖尿病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得を行うことができる。糖尿病の治療により、他のバイオマーカー値が低下する場合であっても、このＣＰＳＦ２に対する体液抗体値が高値であれば、依然として脳梗塞の発症の高いリスクが存在することを示すものである。また、上記の「ＤＩＤＯ１抗原」に対する抗体レベルの上昇に比べると、脳梗塞発症の継続的なリスクに鋭敏に反応する傾向が認められ、無症状であって「ＣＰＳＦ２体液抗体の亢進」が認められた脳梗塞前段階に対して、リスクファクターを減ずる措置、例えば、食事指導、運動指導、禁煙指導等の生活習慣改善指導を行うことにより、脳梗塞のリスクを減少させることが可能である。
これらのそれぞれ特徴のある２種類の脳梗塞発症バイオマーカーを組み合わせて用いることにより、糖尿病や慢性腎臓病等の動脈硬化関連疾患患者における脳梗塞発症のリスクを、短期的にも、長期的にも把握することが可能である。また、特定の病態や症状に着目して、各々のバイオマーカーに絞り込んで単独で用いることにより、多数のバイオマーカーを用いる場合に比べて医療費の節約を行うことができると同時に、患者個人に合わせた脳梗塞発症のリスクを的確に把握することができる。
（２）本発明のキットについて
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ−融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ−融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ−結合アクセプタービーズの組、あるいは、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１抗原又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２抗原（ペプチド）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ−結合アクセプタービーズの組を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ−融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ−融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ−結合アクセプタービーズの組、あるいは、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１抗原又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２抗原（ペプチド）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ−結合アクセプタービーズの組を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を固定化したプレート、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＥＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための、本発明のキットの構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を結合させた磁性粒子と、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。
ここに挙げたこれらのキットの構成はあくまでも例示であり、他の定量測定手段を行うためのキットも本発明キットの範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、本発明のキットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査に応じた他の要素を加味することも可能である。
以下、本発明の実施例を開示する。
［製造例と解析手法］
＜本実施例において用いた抗原蛋白質又はペプチド＞
（１）抗原蛋白質又はペプチドのリスト
本実施例においては、下記の抗原蛋白質又はペプチドを用いた。
＜本実施例において用いた抗原蛋白質又はペプチド＞
（１）抗原蛋白質又はペプチドのリスト
本実施例においては、下記の抗原蛋白質又はペプチドを用いた。
（ａ）ＤＩＤＯ１
・「ＤＩＤＯ１蛋白質」（配列番号３）：ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がＧＳＴ修飾されたＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）
・「ＤＩＤＯ１ペプチド」（配列番号４）：上記ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された５４３−５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）のペプチド
図１に、ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）を一文字表示で示し、ＤＩＤＯ１ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）に相当する部分に下線を施した。
・「ＤＩＤＯ１蛋白質」（配列番号３）：ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がＧＳＴ修飾されたＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）
・「ＤＩＤＯ１ペプチド」（配列番号４）：上記ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された５４３−５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）のペプチド
図１に、ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）を一文字表示で示し、ＤＩＤＯ１ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）に相当する部分に下線を施した。
（ｂ）ＣＰＳＦ２
・「ＣＰＳＦ２ペプチド」（配列番号７）：ＣＰＳＦ２のＤＮＡ（配列番号５）がコードする全長蛋白質（配列番号６）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された６０７−６２０番目のアミノ酸配列（配列番号７）のペプチド
図２に、ＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）を一文字表示で示し、ＣＰＳＦ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）に相当する部分に下線を施した。
・「ＣＰＳＦ２ペプチド」（配列番号７）：ＣＰＳＦ２のＤＮＡ（配列番号５）がコードする全長蛋白質（配列番号６）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された６０７−６２０番目のアミノ酸配列（配列番号７）のペプチド
図２に、ＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）を一文字表示で示し、ＣＰＳＦ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）に相当する部分に下線を施した。
（２）抗原蛋白質又はペプチドの調製
上記リストの抗原蛋白質とペプチドは下記の要領で調製した。
上記リストの抗原蛋白質とペプチドは下記の要領で調製した。
（ａ）ＤＩＤＯ１蛋白質の発現と精製
ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。それを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲ法により、ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端領域（２７５アミノ酸；配列番号３）を増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＤＩＤＯ１を作製し、ＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認した。さらに、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＤＩＤＯ１を大腸菌ＢＬ−２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、ＤＩＤＯ１ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ−ＤＩＤＯ１蛋白質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＤＩＤＯ１蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。それを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲ法により、ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端領域（２７５アミノ酸；配列番号３）を増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＤＩＤＯ１を作製し、ＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認した。さらに、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＤＩＤＯ１を大腸菌ＢＬ−２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、ＤＩＤＯ１ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ−ＤＩＤＯ１蛋白質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＤＩＤＯ１蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
（ｂ）ペプチドの設計
ＣＰＳＦ２蛋白質の公開されているアミノ酸配列（配列番号６）からウェブ公開のエピトープ検索サイトプログラムＰｒｏＰｒｅｄ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて抗体認識部位を検索した。その結果、当該エピトープ候補の配列、ＣＰＳＦ２−５４７〜５５０、ＣＰＳＦ２−６０７〜６２０、ＣＰＳＦ２−７１２〜７２５を得た。なお、各候補の数字は配列番号６においてエピトープ候補として選ばれたアミノ酸の番号：例えば、５４７〜５５０であれば、配列番号６の５４７〜５５０番の一連のアミノ酸配列からなるペプチドを表す。これらのエピトープ候補の各ペプチドを、Ｎ端にビオチン化修飾を持つペプチドとして、Ｆｍｏｃ法を用いて合成し、抗体レベルの解析によりＣＰＳＦ２−６０７〜６２０（配列番号７）を選別し、上記の「ＣＰＳＦ２ペプチド」として用いた。
ＣＰＳＦ２蛋白質の公開されているアミノ酸配列（配列番号６）からウェブ公開のエピトープ検索サイトプログラムＰｒｏＰｒｅｄ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて抗体認識部位を検索した。その結果、当該エピトープ候補の配列、ＣＰＳＦ２−５４７〜５５０、ＣＰＳＦ２−６０７〜６２０、ＣＰＳＦ２−７１２〜７２５を得た。なお、各候補の数字は配列番号６においてエピトープ候補として選ばれたアミノ酸の番号：例えば、５４７〜５５０であれば、配列番号６の５４７〜５５０番の一連のアミノ酸配列からなるペプチドを表す。これらのエピトープ候補の各ペプチドを、Ｎ端にビオチン化修飾を持つペプチドとして、Ｆｍｏｃ法を用いて合成し、抗体レベルの解析によりＣＰＳＦ２−６０７〜６２０（配列番号７）を選別し、上記の「ＣＰＳＦ２ペプチド」として用いた。
ｂＣＰＳＦ２−６０７: biotin-ＱＶＲＬＫＤＳＬＶＳＳＬＱＦＣ（配列番号７）
ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）についても、上記のＣＰＳＦ２と同様に検索し、ＤＩＤＯ１−５４３〜５６０、ＤＩＤＯ１−５６８〜５８５、ＤＩＤＯ１−６４３〜６５８、及びＤＩＤＯ１−８０２〜８１９のＮ末端にビオチン化修飾を持つ未精製品を合成し、抗体レベルの解析により、脳梗塞に最もよく反応したｂＤＩＤＯ１−５４３〜５６０を選別し、上記の「ＤＩＤＯ１ペプチド」とした。その構造は以下のとおりである。
ｂＤＩＤＯ１−５４３：biotin-ＡＭＡＡＳＫＫＴＡＰＰＧＳＡＶＧＫＱ（配列番号４）
＜ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析＞
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）は、具体的には、３８４穴マイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅTM，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行った。各ウェルに、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１％ ｃａｓｅｉｎ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍｇ／ｍＬ ｄｅｘｔｒａｎ−５００，０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ−３００）で１００倍希釈した血清を２．５μＬ、及び、抗原となるＧＳＴ、又はＤＩＤＯ１蛋白質（１０μｇ／ｍＬ）、あるいはビオチン化ペプチド（ＤＩＤＯ１ペプチド又はＣＰＳＦ２ペプチド）（４００ｎｇ／ｍｌ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。６−８時間室温でインキュベートした後、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）、及び、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−、又はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）をＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。１−１４日間、室温で放置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生じた光子の数を測定して、「Ａｌｐｈａ Ｃｏｕｎｔ」とした。ＤＩＤＯ１蛋白質の場合はコントロールのＧＳＴを、上記ビオチン化ペプチドの場合は緩衝液コントロールの値を差し引いて、ＣＰＳＦ２、又はＤＩＤＯ１抗原に特異的な抗体レベルを算出した。
［実施例１］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ａＣＩ）患者における検討
急性期脳梗塞（ａＣＩ）とは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
急性期脳梗塞（ａＣＩ）とは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
健常者（ＨＤ）、ＴＩＡ患者、及びａＣＩ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質、及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した。健常者の血清サンプルはポートスクエア柏戸クリニックにおいて頭部ＭＲＩ検査で異常の認められない被験者から得た。ＴＩＡとａＣＩの患者血清は千葉県立佐原病院、千葉労災病院、千葉市立青葉病院、及び千葉メディカルセンターにおいて入手した。
検討結果を図３と表１に示す。図３の内容は、図面の簡単な説明において記した。表１は、図３に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表１の上から、健常者サンプルの平均値、ＳＤ、カットオフ値（平均値＋２ＳＤ）、全サンプル数、カットオフ値以上を示す陽性サンプル数、陽性率、及び、ＴＩＡ患者とａＣＩ患者サンプルの平均値、ＳＤ、全サンプル数、カットオフ値以上を示す陽性サンプル数、陽性率、及び、健常者サンプルと患者サンプルを比較した時のＰ値を示す。Ｐ値が０．０５以下、又は陽性率が１０％以上の値を太字で示した。
表１において、カットオフ値を健常者サンプルの平均値＋２ＳＤに設定した時のＤＩＤＯ１蛋白質に対する、ＨＤ、ＴＩＡ、ａＣＩの血清サンプルにおける抗体レベルの陽性率は、それぞれ０．０％、１１．７％、９．５％であり、一方、ＣＰＳＦ２ペプチドに対する同抗体レベルの陽性率は、それぞれ４．１％、６．５％、９．５％、であったことが分かる。すなわち、図３と表１において、ＤＩＤＯ１蛋白質、及びＣＰＳＦ２ペプチドの抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩのどちらの患者血清においても有意に高かったことを示している。
［実施例２］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者と糖尿病（ＤＭ）患者における検討
ＡＭＩ患者とＤＭ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
ＡＭＩ患者とＤＭ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
検討結果を図４と表２に示す。図４の内容は、図面の簡単な説明において記した。表２は、図４に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表中の項目は、表１について説明した通りである。
上記の検討の結果、ＡＭＩ患者とＤＭ患者におけるＤＩＤＯ１抗体レベルは、ＨＤに比べて有意な差を認めなかった（図４ａ、表２）。一方、ＣＰＳＦ２抗体は、ＤＭ患者においてＨＤに比べ有意な高値を示したが、ＡＭＩ患者では健常者と比較して有意な差を認めなかった（図４ｂ、表２）。
［実施例３］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における検討
健常者（ＨＤ）とＣＫＤ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
健常者（ＨＤ）とＣＫＤ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
検討結果を図５と表３に示す。図５の内容は、図面の簡単な説明において記した。表３は、図５に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表中の項目は、表１について説明した通りである。また、「Ｔｙｐｅ １−ＣＫＤ」は糖尿病性腎症、「Ｔｙｐｅ ２−ＣＫＤ」は腎硬化症を、「Ｔｙｐｅ ３−ＣＫＤ」は糸球体腎症を示す。
上記の検討の結果、ＤＩＤＯ１抗体レベルはいずれのタイプのＣＫＤにおいてもＨＤに比べ有意な高値を示し（図５ａ、表３）、特にＴｙｐｅ １−ＣＫＤにおいて大きな差を示した。一方、ＣＰＳＦ２抗体はいずれのタイプのＣＫＤにおいてもＨＤと比べて有意な差は認められなかった（図５ｂ、表３）。
［実施例４］ ＲＯＣ解析結果
上記実施例１−３により、各疾患についてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により得られたＤＩＤＯ１血清抗体レベル及びＣＰＳＦ２に対する血清抗体レベルを、さらにＲＯＣ解析して得たａｒｅａｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値、９５％ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＣＩ）、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値について、表４（表４−１：ＤＩＤＯ１、表４−２：ＣＰＳＦ２）に示した。表４−１と表４−２において、ＲＯＣ解析により得られた数字は、上から順番にＡＵＣ値、９５％ ＣＩ、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値を示す。表４−１において、例えば、「ＤＩＤＯ１ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１蛋白質に対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示し、「ＤＩＤＯ１−ｐｅｐ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１ペプチドに対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示している。
上記実施例１−３により、各疾患についてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により得られたＤＩＤＯ１血清抗体レベル及びＣＰＳＦ２に対する血清抗体レベルを、さらにＲＯＣ解析して得たａｒｅａｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値、９５％ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＣＩ）、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値について、表４（表４−１：ＤＩＤＯ１、表４−２：ＣＰＳＦ２）に示した。表４−１と表４−２において、ＲＯＣ解析により得られた数字は、上から順番にＡＵＣ値、９５％ ＣＩ、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値を示す。表４−１において、例えば、「ＤＩＤＯ１ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１蛋白質に対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示し、「ＤＩＤＯ１−ｐｅｐ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１ペプチドに対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示している。
ＤＩＤＯ１蛋白質に対する血清抗体値は表４−１に示す通りに、ＣＫＤに対して著しく高いＡＵＣ値を示した。ＴＩＡとａＣＩについても有意な高値を示したが、ＡＭＩとＤＭに対しては有意差を認めなかった。同様にＤＩＤＯ１ペプチドに対する血清抗体値もＴＩＡ及びａＣＩに対して高いＡＵＣ値を示した。
ＣＰＳＦ２ペプチドによるＣＰＳＦ２血清抗体値は表４−２に示す通りに、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＤＭに対して高いＡＵＣを示したが、ＡＭＩやＴｙｐｅ １−ＣＫＤとＴｙｐｅ ３−ＣＫＤに対しては有意差を認めず、Ｔｙｐｅ ２−ＣＫＤについてもわずかな有意差を認めたのみであった。
［実施例５］ 血清抗体レベルと被験者データの相関解析
（１）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルと被験者データについて、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析（対応のない２群のデータについての、母集団分布の同一性の検定手法）を行った。
（１）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルと被験者データについて、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析（対応のない２群のデータについての、母集団分布の同一性の検定手法）を行った。
具体的には、千葉県立佐原病院において採取された８５１血清サンプルについて、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドを抗原とした場合の、これらに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定して、得られた測定値と被験者のデータの間における上記検定を行った。
被験者データは、性別、現在の症状［無し（ＨＤ）、びまん性白質軟化（ＤＳＷＭＨ）、無症候性脳梗塞（ａｓｙｍｐｔ−ＣＩ）、ＴＩＡ、ａＣＩ、慢性期脳梗塞（ｃＣＩ）、糖尿病（ＤＭ)、高血圧症（ＨＴ)、心血管障害（ＣＶＤ)、脂質異常症（Ｌｉｐｉｄｅｍｉａ)］、及び生活習慣（喫煙習慣、飲酒習慣）、を群として用いた。
結果を表５（表５−１、表５−２、表５−３）に示す。表５−１、表５−２、表５−３には、群ごとのサンプル数、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原とＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベル（アルファカウント）の平均値とＳＤ、そして各群と対照群におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析によるＰ値を示した。
表５−１、表５−２、表５−３に示す通りに、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原に対する血清抗体レベルは、ＤＩＤＯ１蛋白質抗原に対する血清抗体レベルと同様に、ａＣＩに対して最も高値を示した。また、ＴＩＡやｃＣＩでも有意差を認めた。また、高血圧症、心血管障害、脂質異常症と有意な相関を認めたが、糖尿病や性別とは無関係であった。また、生活習慣では喫煙習慣と強い相関が認められたが、飲酒習慣とは無関係であった。
一方、ＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する抗体レベルは、ａＣＩのみならず、ｃＣＩでも高度に有意な差を示した。さらにＴＩＡやａｓｙｍｐｔ−ＣＩでも有意差を示した。このことは、ＣＰＳＦ２抗体は脳梗塞に関係する微細な異変をも感知するものであると推定された。さらに他疾患ではＤＭ、ＨＴには対応していたが、ＬｉｐｉｄｅｍｉａやＣＶＤでは有意差が認められなかった。生活習慣では喫煙習慣と相関していたが、飲酒習慣とは無関係であった。
（２）Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルにおける上記血清抗体レベルと、被験者データについて、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析（２変数間に、どの程度、順位づけの直線関係（単純増加あるいは単純減少関係）があるかを数値で表す分析）を行った。被験者データは、年齢、身長、体重、ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ （ＢＭＩ）、最大頸動脈内膜中膜肥厚（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍａｘ ＩＭＴ）、血液検査データ〔ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ）、ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）｝、ｔｏｔａｌ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ｔＢｉｌ）、ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＣＨＥ）、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（γ−ＧＴＰ）、ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ）、ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ）、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｒａｔｉｏ（ｅＧＦＲ）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（ＵＡ）、ａｍｙｌａｓｅ(ＡＭＹ)、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ−ＣＨＯ）、ＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ−Ｃ）、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、ｓｏｄｉｕｍ （Ｎａ）、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Ｋ）、ｃｈｌｏｒｉｎｅ（Ｃｌ）、ｃａｌｃｉｕｍ(Ｃａ)、ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ＩＰ)、ｉｒｏｎ(Ｆ)、Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＲＰ)、ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＬＤＬ−Ｃ）、ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／白血球（ＷＢＣ）、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／赤血球（ＲＢＣ）、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ(ＨＧＢ)、ｈａｍａｔｏｃｒｉｔ(ＨＣＴ)、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ／平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ／平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）、Ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＲＤＷ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ／血小板（ＰＬＴ）、ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ（ＭＰＶ）、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（ＰＣＴ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＰＤＷ）、ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ （ＢＳ）、ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）〕、血圧（ＢＰ）、及び喫煙期間（年数）、を用いた。
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルにおける上記血清抗体レベルと、被験者データについて、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析（２変数間に、どの程度、順位づけの直線関係（単純増加あるいは単純減少関係）があるかを数値で表す分析）を行った。被験者データは、年齢、身長、体重、ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ （ＢＭＩ）、最大頸動脈内膜中膜肥厚（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍａｘ ＩＭＴ）、血液検査データ〔ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ）、ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）｝、ｔｏｔａｌ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ｔＢｉｌ）、ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＣＨＥ）、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（γ−ＧＴＰ）、ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ）、ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ）、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｒａｔｉｏ（ｅＧＦＲ）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（ＵＡ）、ａｍｙｌａｓｅ(ＡＭＹ)、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ−ＣＨＯ）、ＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ−Ｃ）、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、ｓｏｄｉｕｍ （Ｎａ）、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Ｋ）、ｃｈｌｏｒｉｎｅ（Ｃｌ）、ｃａｌｃｉｕｍ(Ｃａ)、ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ＩＰ)、ｉｒｏｎ(Ｆ)、Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＲＰ)、ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＬＤＬ−Ｃ）、ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／白血球（ＷＢＣ）、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／赤血球（ＲＢＣ）、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ(ＨＧＢ)、ｈａｍａｔｏｃｒｉｔ(ＨＣＴ)、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ／平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ／平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）、Ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＲＤＷ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ／血小板（ＰＬＴ）、ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ（ＭＰＶ）、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（ＰＣＴ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＰＤＷ）、ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ （ＢＳ）、ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）〕、血圧（ＢＰ）、及び喫煙期間（年数）、を用いた。
表６（表６−１、表６−２）は、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原及びＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベルと被験者データの相関解析結果を示している。これらの表では、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルについて、群ごとのサンプル数、ＤＩＤＯ１ペプチド、及びＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベル（アルファカウント）のＳｐｅｒａｍａｎの相関解析により得られた順位相関係数（ｒ）とＰ値を示した。
表６−１、表６−２に示す通り、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析の結果、ＤＩＤＯ１血清抗体レベルとＣＰＳＦ２血清抗体レベルはいずれも、年齢、ｍａｘ ＩＭＴ、ＣＲＰ、喫煙期間と相関し、身長、体重、ＡＬＢ、ＴＰとは逆相関していることがわかった。また、ＤＩＤＯ１血清抗体レベルはＢＰに相関していた、一方で、ＣＰＳＦ２血清抗体レベルはＡ／Ｇ、ＡＬＴ、ｔＢＩＬ、Ｔ−ＣＨＯ、ＬＤＬ−Ｃに逆相関を示した。これらの結果から、ＤＩＤＯ１とＣＰＳＦ２の血清抗体バイオマーカーはいずれも、年齢、ＩＭＴ、喫煙習慣に関係し、動脈硬化を反映していると考えられるが、一方で、ＤＩＤＯ１血清抗体バイオマーカーは高血圧に、またＣＰＳＦ２血清抗体バイオマーカーは血中蛋白質の減少やコレステロールの減少を反映しているとも考えられる。
［実施例６］ 多目的コホートサンプル解析
対象は、１９９０年、及び１９９３年に岩手県二戸、秋田県横手、長野県佐久、沖縄県中部、茨城県水戸、新潟県長岡、高知県中央東、長崎県上五島、沖縄県宮古の９保健所管内在住であった４０−６９歳の男女のうち、多目的コホート（ＪＰＨＣ：Ｊａｐａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ−ｂａｓｅｄ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ）研究に参加し、血漿が保存されている約３万人である。
対象は、１９９０年、及び１９９３年に岩手県二戸、秋田県横手、長野県佐久、沖縄県中部、茨城県水戸、新潟県長岡、高知県中央東、長崎県上五島、沖縄県宮古の９保健所管内在住であった４０−６９歳の男女のうち、多目的コホート（ＪＰＨＣ：Ｊａｐａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ−ｂａｓｅｄ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ）研究に参加し、血漿が保存されている約３万人である。
追跡開始から２００８年までの間に急性期脳梗塞（ａＣＩ）の発症があった症例を「症例群」、その時点で脳梗塞を発症していない生存者を「対照群」として、各症例について性別、年齢、地域をマッチさせ、無作為に１例の対照を選び出し、症例２０２人、対照２０２人の合計４０４人を同定した。ＤＩＤＯ１抗原（ＤＩＤＯ１蛋白質とＤＩＤＯ１ペプチド）と、ＣＰＳＦ２抗原（ＣＰＳＦ２ペプチド）のそれぞれに対する血漿抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、四分位とａＣＩ発症との関連を、条件付きロジスティックモデルにより分析した。
結果を表７に表す。
その結果、ＤＩＤＯ１蛋白質に対する血漿抗体レベルはａＣＩ発症と強い関連を示した。血漿抗体レベルの最も低い群に対し、第２四分位でのａＣＩ発症の条件付オッズ比（９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）は３．９９ (１．９３−８．２３)、第３四分位では３．４０ (１．６２−７．１３)、最も高い群では４．０２ (１．９４−８．３５)であった。ＤＩＤＯ１ペプチドに対する血漿抗体レベルもＤＩＤＯ１蛋白質抗原と同様の結果を示したが、オッズ比はやや低かった。また、ＣＰＳＦ２ペプチドに対する血漿抗体レベルもａＣＩ発症と関連を示し、条件付きオッズ比はそれぞれ１．１９ (０．６３−２．２３)、１．６６ (０．８９−３．０９)、２．４１ (１．３３−４．３７)であった。この結果は、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルはａＣＩの発症予測に有用なバイオマーカーであることを意味している。
［実施例のまとめ］
ＤＩＤＯ１体液（血清又は血漿）抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＣＫＤの患者体液において高値を示し、ＡＭＩとＤＭの患者体液においては有意な上昇は認められなかった。
ＤＩＤＯ１体液（血清又は血漿）抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＣＫＤの患者体液において高値を示し、ＡＭＩとＤＭの患者体液においては有意な上昇は認められなかった。
特に、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルはＣＫＤにおいて０．８を越す高いＡＵＣ値を示したことから、腎不全と高血圧によく対応するバイオマーカーである。ＤＩＤＯ１体液抗体レベルは、脳梗塞では、ｃＣＩやＴＩＡよりａＣＩに大きな差を示したことから、腎不全からａＣＩを発症する人を識別している。さらにＤＩＤＯ１体液抗体レベルは、ａｓｙｍｐｔ−ＣＩには反応しないことから、急性期脳梗塞発症の直前で急増するバイオマーカーである。このバイオマーカーが高値の人は、脳梗塞発症が極めて差し迫っていると推定されるので、腎臓病の治療や血圧管理により早急な予防対策が必要である。
また、ｃＣＩではＤＩＤＯ１体液抗体レベルが下がることから、これを治療後のモニタリングにも適用できる。
一方、ＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ＣＫＤにはあまり関係せず、ＡＭＩ、ＤＭ、ａＣＩ及びＴＩＡに良く反応しており、特にＤＭの原因によるａＣＩとＡＭＩを識別している。ＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ＤＭバイオマーカーであるＨｂＡ1ｃやＢＳには相関が認められない。これは、多くの患者は治療を受けているためにこれらのバイオマーカー値が減少している故と考えられる。従って、他のＤＭバイオマーカー値が下がっていても、このＣＰＳＦ２体液抗体レベルが高値であれば、脳梗塞発症のリスクは依然として下がっていないと推定される。さらに、血中総蛋白質やアルブミンの減少が見られ、コレステロール値の低下が観察される場合にも、このバイオマーカーが高値であれば、脳梗塞発症のリスクは下がっていないと推定される。
ａＣＩの患者体液サンプルは、脳梗塞の発症後２週間以内に採取したものであり、発症後に新しく自己抗体が出現する可能性は低いことから、ＤＩＤＯ１体液抗体とＣＰＳＦ２体液抗体は、脳梗塞の発症前から存在していたと考えられる。従って、このバイオマーカーは動脈硬化症の発症予測にも適用可能である。
より実際的なＪＰＨＣコホートサンプルの解析においても、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ａＣＩの発症者において有意に高く、脳梗塞予測に有用なバイオマーカーとなることが示された。
上述したように、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、それぞれ腎臓病と糖尿病という異なる基礎疾患に対応している。即ち、これらのバイオマーカーは腎臓病や糖尿病等の基礎疾患を持つ人の中において、脳梗塞を発症する人を識別できる。さらに、これらのＤＩＤＯ１体液抗体バイオマーカーとＣＰＳＦ２体液抗体バイオマーカーを併用することにより、広範囲の脳梗塞発症の高リスク者を前もって検出することが可能となる。
例えば、ａＣＩの前段階と言われるＡｓｙｍｐｔ−ＣＩやＴＩＡの段階からａＣＩが近づくに従って、徐々に上昇するＣＰＳＦ２体液抗体バイオマーカーと、ａＣＩの直前になって急増するＤＩＤＯ１体液抗体バイオマーカーを合わせて評価すれば、どの程度の危険が差し迫っているかを推定することが可能である。さらにこれらのバイオマーカー測定により、糖尿病や腎臓病等の原因をも予測することが可能で、ハイリスクの人はそれぞれの原因に対応した早急な予防措置が必要となるであろう。
脳梗塞は将来寝たきりになる原因の第一位であり、その発症を予測することにより発症予防が可能になれば、社会的に大きな意味を持つ。本発明のデータ取得方法とこれを具現化する本発明キットの使用により、脳梗塞の発症リスクを、病態個別的に、又は、総合的に検出することが可能であり、それぞれの状況に応じた予防措置や治療措置を講じることができるので、その産業上の利用価値は非常に大きい。
Claims (11)
- ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２のアミノ酸配列）又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質（配列番号６のアミノ酸配列）又はその一部、に対する生体から分離された血液サンプル中の抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部に対する生体から分離された血液サンプル中の抗体レベルの測定による脳梗塞の発症に関するデータ取得は、慢性腎臓病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得であることを特徴とする、請求項１に記載の脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部に対する生体から分離された血液サンプル中の抗体レベルの測定による脳梗塞の発症に関するデータ取得は、糖尿病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７−２２４０個であり、配列番号６のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７−７８２個であることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７−３０個であることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部は、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部は、配列番号４に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載のデータ取得方法。
- 配列番号６のアミノ酸配列の一部は、配列番号７に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列又はその一部、並びに／或いは、配列番号６のアミノ酸配列又はその一部は、１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、又は、追加されていることを特徴とする、請求項１−８のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 抗体レベル測定法は、ＥＬＩＳＡ法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、又は、ＣＬＥＩＡ法であることを特徴とする、請求項１−９のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 血液サンプルは、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項１−１０のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017230639A JP6942036B2 (ja) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー |
| PCT/JP2018/043090 WO2019107256A1 (ja) | 2017-11-30 | 2018-11-22 | 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー |
| EP18883195.2A EP3719497A4 (en) | 2017-11-30 | 2018-11-22 | BODY FLUID ANTIBODY BIOMARKERS FOR HIGHLY SENSITIVE DETECTION OF THE HAZARD OF A BRAIN INFARK ONCE |
| US16/768,187 US20210373032A1 (en) | 2017-11-30 | 2018-11-22 | Body fluid antibody biomarker for highly sensitive detection of risk of onset of cerebral infarction |
| CN201880077624.XA CN111615631B (zh) | 2017-11-30 | 2018-11-22 | 以高灵敏度检测脑梗塞的发病风险的体液抗体生物标志物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017230639A JP6942036B2 (ja) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019100811A JP2019100811A (ja) | 2019-06-24 |
| JP6942036B2 true JP6942036B2 (ja) | 2021-09-29 |
Family
ID=66664508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017230639A Active JP6942036B2 (ja) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210373032A1 (ja) |
| EP (1) | EP3719497A4 (ja) |
| JP (1) | JP6942036B2 (ja) |
| CN (1) | CN111615631B (ja) |
| WO (1) | WO2019107256A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114594273B (zh) * | 2022-05-09 | 2024-02-27 | 上海众启生物科技有限公司 | 一种脑梗塞生物标记物及其应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596476B1 (en) * | 1989-12-22 | 2003-07-22 | Abbott Laboratories | Hepatitis C assay |
| RU2123704C1 (ru) * | 1995-03-21 | 1998-12-20 | Евгений Иванович Гусев | Способ диагностики острой церебральной ишемии |
| US20090178145A1 (en) * | 2005-05-11 | 2009-07-09 | The Procter & Gamble Company | Methods and targets for identifying compounds for regulating angiogenesis |
| US20090047689A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-02-19 | John Kolman | Autoantigen biomarkers for early diagnosis of lung adenocarcinoma |
| EP2376655B1 (en) * | 2008-11-14 | 2019-10-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Genetic variants underlying human cognition and methods of use thereof as diagnostic and therapeutic targets |
| JP2011045334A (ja) * | 2009-08-28 | 2011-03-10 | Kyushu Univ | 細胞老化関連因子 |
| CA2774173A1 (en) * | 2009-09-14 | 2011-03-17 | Banyan Biomarkers, Inc. | Micro-rna, autoantibody and protein markers for diagnosis of neuronal injury |
| JP2011211989A (ja) * | 2010-04-01 | 2011-10-27 | Kurume Univ | 悪性神経膠腫患者の予後予測方法 |
| US20140148350A1 (en) * | 2010-08-18 | 2014-05-29 | David Spetzler | Circulating biomarkers for disease |
| JP6312302B2 (ja) * | 2014-01-06 | 2018-04-18 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 脳梗塞の診断マーカー |
| KR102525734B1 (ko) * | 2014-11-07 | 2023-04-27 | 후지쿠라 가세이 가부시키가이샤 | 데옥시하이푸신·신타제 유전자를 지표로서 사용하는 동맥 경화 및 암의 검출 방법 |
| JP6788256B2 (ja) * | 2016-02-15 | 2020-11-25 | 国立大学法人金沢大学 | 冠動脈イベント予測のための方法及び試薬 |
| JP6499342B2 (ja) * | 2018-03-19 | 2019-04-10 | 隆樹 日和佐 | 脳梗塞の診断マーカー |
-
2017
- 2017-11-30 JP JP2017230639A patent/JP6942036B2/ja active Active
-
2018
- 2018-11-22 US US16/768,187 patent/US20210373032A1/en active Pending
- 2018-11-22 CN CN201880077624.XA patent/CN111615631B/zh active Active
- 2018-11-22 EP EP18883195.2A patent/EP3719497A4/en active Pending
- 2018-11-22 WO PCT/JP2018/043090 patent/WO2019107256A1/ja unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019100811A (ja) | 2019-06-24 |
| CN111615631B (zh) | 2024-04-23 |
| EP3719497A4 (en) | 2021-08-25 |
| WO2019107256A1 (ja) | 2019-06-06 |
| EP3719497A1 (en) | 2020-10-07 |
| CN111615631A (zh) | 2020-09-01 |
| US20210373032A1 (en) | 2021-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5226749B2 (ja) | 炎症症状のマーカー | |
| US11136626B2 (en) | Biomarkers for the diagnosis of lacunar stroke | |
| RU2733471C2 (ru) | Способ прогнозирования риска развития хронического заболевания почек | |
| EP3710831A1 (en) | Markers for the diagnosis and treatment of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and advanced liver fibrosis | |
| JP2014525593A (ja) | 心臓血管リスクを予測するための診断分析 | |
| JP6942036B2 (ja) | 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー | |
| KR102365805B1 (ko) | 동맥 경화의 검출 방법 | |
| AU2014236152B2 (en) | Methods and compositions for diagnosing preeclampsia | |
| WO2005079410A2 (en) | Biological profiles and methods of use | |
| Ragusa et al. | Cardiac troponins: Mechanisms of release and role in healthy and diseased subjects | |
| CA2996903C (en) | Method of determining risk of an adverse cardiac event | |
| WO2022075113A1 (ja) | 動脈病変を検出し、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を検出する、体液抗体バイオマーカー | |
| Bomze et al. | Severe Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) is Associated With Elevated Serum Immunoglobulin (Ig) A and Antiphospholipid IgA Antibodies. | |
| Devi et al. | KIDNEY INJURY MOLECULE 1 (KIM 1) AND NEUTROPHIL GELATINASE ASSOCIATED LIPOCALIN (NGAL) AS PREDICTIVE DIAGNOSTIC MARKERS OF RENAL DYSFUNCTION IN PATIENTS UNDERGOING MAJOR SURGERY | |
| Sripad et al. | Relationship between free T3 and ICU mortality: A prospective observation | |
| KR20220112204A (ko) | 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법 | |
| Metz et al. | Serum markers for type II diabetes mellitus | |
| Panachamnong et al. | Clusterin as a Blood Biomarker for Diagnosis of Mild Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease | |
| Nisi | Predictive Ability of NGAL as a Marker of Renal Damage: evaluation of Multiple Clinical Settings | |
| WO2013096534A1 (en) | Congestive heart failure biomarkers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180130 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201030 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210413 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210527 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210831 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210907 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6942036 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |