CN114835808B - 可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法 - Google Patents

可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法 Download PDF

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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法。本发明提供了抗体、由其制备成的阻断剂及其制备方法。抗体重链CDR3具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；其轻链CDR3具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；其重链CDR1和CDR2分别具有如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；其轻链CDR1和CDR2分别具有如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的氨基酸序列。该抗体或阻断剂可定向消除假阳性，提高血清学检测的准确性。

Description

可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法。
背景技术
免疫实验，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫(RIA)、化学发光免疫(CLIA)、金免疫层析(GICA)、生化免疫等，多见干扰物质，影响检测结果。干扰因素比较多，既有待测物依赖性的，如与待测物有交叉反应的物质、嗜异性抗体、人类抗动物抗体、自身抗体、钩状效应等，又有待测物非依赖性的，如抗凝剂、溶血、脂血、人抗试剂成份抗体等。
对医院检验科医生来说，遇到异常检测结果，与患者临床表现通常是完全不符时，要熟知可能存在的干扰因素。内源性干扰熟知的同时，要清楚外源性干扰(如：标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等)，并知道如何避免外源性干扰。
对检验试剂研发人员来说，试剂研发过程中，最简单、最有效的方法，就是在检测系统中添加阻断剂，直接阻断干扰物质与检测系统中抗体或抗原的结合。消除干扰是免疫检测产品研发中的重要任务。
阻断剂是一类用在体外诊断检测实验中，可以消除或降低免疫分析干扰的生物活性制剂。阻断剂在体外诊断检测上的应用可以有效地减少免疫分析干扰带来的假阳性或假阴性的错误检测结果。在体外诊断试剂使用过程中，易受到患者样本中内源性抗体或其它结合免疫球蛋白的干扰，这些干扰统称为免疫分析干扰。易受到干扰的检测主要包括双抗体夹心检测、竞争性检测以及lgM捕获检测。目前已知的干扰物主要有异嗜性抗体(Heterophile Antibody,HA)、类风湿因子(Rheumatoid Factors,RF)以及人抗动物抗体(Human Anti-Animal Antibody,HAAA)等。被动型阻断剂含有普通动物免疫球蛋白及其他组分，通过提供代结合位点阻止干扰抗体与捕获抗体或检测抗体结合。主动型阻断剂能够特异性消除HA和RF等异嗜性抗体干扰，使用浓度低，阻断效果强。
异嗜性抗体在免疫检测实验的临床标本中非常普遍，一般大家会选用商品化厂家提供的相对通用的阻断剂(如鼠单抗库中筛选鼠抗体，或兔抗体库/山羊抗体库/绵羊抗体库/人抗体库等筛选的兔抗体/山羊抗体/绵羊抗体/人抗体等，或鼠血清、兔血清、山羊血清、绵羊血清、人血清等或鼠多抗、兔多抗、山羊多抗、绵羊多抗、人多抗等)，但大都不能达到最理想的状态。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法，该抗体或阻断剂可提高血清学检测的准确性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了抗体，其重链CDR3：
(I)、具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；和/或
其轻链CDR3：
(II)、具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；和/或
(III)、具有如(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
(IV)、具有与(I)～(III)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个～10个。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抗体的重链CDR1和CDR2：
(V)、分别具有如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
和/或
其轻链CDR1和CDR2：
(VI)、分别具有如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；和/或
(VII)、具有如(V)或(VI)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(V)或(VI)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
(VIII)、具有与(V)～(VII)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个～10个。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抗体的重链：
(IX)、具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；和/或
其轻链：
(X)、具有如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；和/或
(XI)、具有如(IX)～(X)任意所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(IX)～(X)任意所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
(XII)、具有与(IX)～(XI)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个～10个。
本发明还提供了上述抗体在制备阻断剂中的应用。
本发明还提供了阻断剂，包括上述抗体，以及可接受的辅料和/或助剂。
本发明还提供了上述阻断剂在免疫学检测中阻断非特异性反应中的应用。
本发明还提供了阻断剂的筛选方法，包括如下步骤：
对免疫学检测的试剂中抗体的重链或轻链进行突变，获得不能与待测靶标反应的失活抗体，获得所述阻断剂；
所述突变包括CDR3突变；
所述突变还包括CDR1和/或CDR2突变。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法中所述免疫学检测包括酶联免疫吸附、放射免疫分析、化学发光免疫分析或金标免疫层析。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法中所述抗体包括鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体或羊单克隆抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法包括以下步骤：
步骤(a)、获得抗体序列；
步骤(b)、对步骤(a)所述抗体序列的轻链和/或重链进行突变，获得突变抗体；
步骤(c)、对步骤(b)所述突变抗体进行筛选，选出不能与待测靶标反应的失活抗体，获得所述阻断剂。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法中所述表达可根据试剂用量选择瞬时表达或稳定细胞株表达。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法中所述表达可采用哺乳动物细胞表达系统，包括CHO表达系统或293表达系统。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法还包括对突变抗体进行SPA纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法还包括对抗体进行交联处理。
在本发明的一些具体实施方案中，上述筛选方法还包括通过纯化后，根据阻断特性，进行相应的改造；所述改造包括交联。
本发明还提供了试剂盒，包括上述抗体、上述阻断剂或采用上述方法获得的阻断剂，以及可接受的辅料和/或助剂。
本发明还提供了反应装置，包被有上述抗体、上述阻断剂或采用上述方法获得的阻断剂，以及可接受的部件。
在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒和/或反应装置中所述阻断剂的使用量为20μg以上/人份。
本发明所述的一种可定向消除假阳性的阻断剂的制备方法：通过对引起假阳性的特异性抗体的轻链或者重链的CDR1～CDR3区域进行突变，特别是CDR3区域，筛选出无活性的抗体(即不能与靶标有反应性)，作为阻断剂添加至反应体系中。
本发明的可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法有如下效果：
使用本发明的制备方法所制备的抗体：1、HRP-羊抗鼠IgG+IgM，cTnI+C包被酶免板检测结果为0.046、0.045，较酶稀阴性对照低，说明该方法可以筛选出无活性抗体；2、对无活性抗体进行磁微粒化学发光，结果低于0.007，远低于假阳性样品最低值0.266、低于一般阻断剂最低值0.011，说明该方法制得的抗体/阻断剂的阻断效果好；3、免疫乳胶比浊结果显示，该方法制得的抗体/阻断剂数值最大值0.59，远低于假阳性结果的最小值7.94，说明该方法制得的抗体/阻断剂的阻断效果好。
具体实施方式
本发明公开了可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以鼠单抗为例的具体操作方法：
1、鼠单抗细胞株，调取其抗体对应细胞株中的重链、轻链基因，并测序确认。选择轻、重链CDR1～CDR3区域氨基酸进行突变，可突变1个以上；
2、突变后的轻、重链进行重组瞬转表达；
3、抗体表达后进行SPA纯化，与靶标反应性的鉴定，剔除有反应性的，留下无反应性(即失活的)；
4、筛选无反应性的抗体启动构建稳转细胞株；
5、抗体表达后进行SPA纯化，再次与靶标进行反应性的鉴定，剔除有反应性的，留下无反应性(即失活的)；
6、按浓度≥20μg/人份配入样品稀释液/酶稀释液等中，用假阳性标本，确定最终所需浓度。
本发明提供的检测试剂、检测试剂盒所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、cTnI鼠单抗细胞株，调取其抗体对应细胞株中的重链、轻链基因，突变前抗体可变区氨基酸序列：
重链(SEQ ID No.1)：
EVQLVESGGDLVTPGGSLKLSCTASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTFYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAIYYCTRRGAFDGEKALDYWGQGTSVTVSS
轻链(SEQ ID No.2)：
DIQMNQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQRADGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTVPYTFGGGTRLEIK
并测序确认CDR1～CDR3。其中，
重链：
CDR1序列(SEQ ID No.3)：GFTFSNYA
CDR2序列(SEQ ID No.4)：ISSGGTYT
CDR3序列(SEQ ID No.5)：TRRGAFDGEKALDY
轻链：
CDR1序列(SEQ ID No.6)：QDISSY
CDR2序列(SEQ ID No.7)：FTS
CDR3序列(SEQ ID No.8)：QQGNTVPYT
2、选择重链CDR3区域氨基酸进行突变，获得10个突变株；对突变株进行瞬转表达，表达后抗体经过SPA亲和纯化，共获得10个突变株；
3、包被重组cTnI抗原，纯化所获得的突变重组表达抗体，二抗酶标进行ELISA间接反应，与靶标反应性的鉴定，剔除有反应性的，留下无反应性，即失活的抗体。根据酶免板检测结果判定，阴性对照0.047左右，检测值小于0.05基本可判定无活性。根据如表1所示的阳性对照检测值(2.1左右)、阴性对照检测值(0.047左右)，通过数据对比，可知cTnI抗体突变4(下文简称突变4)、cTnI抗体突变9(下文简称突变9)无活性，即筛选到2个无反应性的突变抗体。
表1突变抗体
实施例2
实施例1筛选到的2个无反应性的抗体(突变4、突变9)，按20μg/人份配入酶稀释液中，检测假阳性样本，确定可阻断的突变细胞株。
1、磁微粒化学发光——突变抗体，消除假阳性效果：
对制备的阻断剂进行阻断效果评价，本实验采用安图生物磁微粒化学发光cTnI试剂盒半成品，酶结合物为重新配置(未添加阻断剂)。无阻断剂抗体的组为对照组，添加阻断剂(突变4、突变9)，为实验组。其中校准品、试剂配套的阳性、阴性内控盘说明实验有效性。对假阳性样本A1、B1、B3、B5、C1进行检测，结果如表2所示，添加阻断剂的假阳样品发光数值较无阻断剂抗体实验组明显下降，浓度值达到阴性水平，说明突变4、9有很好的阻断性能，可以完全消除假阳性。
表2磁微粒cTnI阻断剂评价
2、免疫乳胶比浊——突变抗体消除假阳性效果：
采用安图生物-肌钙蛋白I(cTnI)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)半成品，其中R1组分未添加阻断剂，R1-不加阻断剂和R1加入无关抗体两个组为对照组，实验组将阻断剂(突变4、突变9)添加至试剂盒中的试剂R1中，参考试剂盒说明书对假阳性样本A1、B1、B3、B5、C1进行检测。
结果表明(数据见表3)：
1、假阳性样本在不加阻断剂的情况下检测数据皆>2，根据试剂盒说明书的判断标准即判为假阳；
2、在加入无关抗体(鼠IgG)后数据仍皆>2，即无法消除假阳；
3、加入20μg/人份的突变4、突变9至试剂R1中进行检测后，检测结果皆<1，判定为阴性，说明突变4、突变9阻断性能较好。
表3免疫乳胶比浊结果
最终选择一个消除非常彻底的突变抗体4，其可变区氨基酸序列为：
重链(SEQ ID No.9)：
EVQLVESGGDLVTPGGSLKLSCTASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTFYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAIYYCTAAGAFDGEKALDYWGQGTSVTVSS
轻链(SEQ ID No.10)：
DIQMNQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQRADGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTVAATFGGGTRLEIK
突变4的CDR序列如下：
重链：
CDR1序列(SEQ ID No.11)：GFTFSNYA
CDR2序列(SEQ ID No.12)：ISSGGTYT
CDR3序列(SEQ ID No.13)：TAAGAFDGEKALDY
轻链：
CDR1序列(SEQ ID No.14)：QDISSY
CDR2序列(SEQ ID No.15)：FTS
CDR3序列(SEQ ID No.16)：QQGNTVAAT
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> 可定向消除假阳性的阻断剂及其制备方法
<130> MP21032675
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Gly Ala Phe Asp Gly Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Val Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 6
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1 5
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<212> PRT
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65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Val Ala Ala
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1 5
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gln Gly Asn Thr Val Ala Ala Thr
1 5

Claims (7)

1.抗体，其特征在于，包括重链和轻链；
所述重链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述轻链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；
所述重链的CDR1和CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
所述轻链的CDR1和CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体在制备阻断剂中的应用。
4.阻断剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的抗体，以及可接受的辅料和/或助剂。
5.如权利要求4所述的阻断剂在免疫学检测中阻断非特异性反应中的应用。
6.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的抗体或如权利要求4所述的阻断剂，以及可接受的辅料和/或助剂。
7.反应装置，其特征在于，包被有如权利要求1至3任一项所述的抗体或如权利要求4所述的阻断剂、以及可接受的部件。
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